Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą superrodzinę receptorów transbłonnych, odpowiedzialną za przekształcanie bodźców zewnętrznych w kaskady sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, co prowadzi do specyficznych odpowiedzi biologicznych. Są one kluczowymi celami farmakologicznymi, przy czym około 30% leków na rynku działa na GPCR¹. Wiązanie ligandów GPCR indukuje zmiany konformacyjne receptora, ułatwiając interakcje z heterotrymerowymi białkami G i/lub kinazami GPCR (GRK) oraz β-arrestinami, inicjując tym samym sygnalizację lub internalizację receptorów².

Białka G heterotrymeryczne pełnią rolę głównych wewnątrzkomórkowych przetworników sygnalizacji GPCR i składają się z trzech podjednostek: G_α, G_β oraz G_γ. Heterotrimery te klasyfikuje się na cztery rodziny – G_i/o, G_s, G_q oraz G_12/13 – na podstawie podtypu G_α , z których każdy aktywuje odrębne szlaki sygnalizacyjne: podtyp G_i/o hamuje cyklazę adenylanową, G_S ją stymuluje, G_q aktywuje fosfolipazę C-β, a G_12/13 reguluje GTPazy rodziny Rho.

Aktywacja GPCR prowadzi do ich konformacyjnych przekształceń, umożliwiając szybkie zaangażowanie białek G w ramach kinetyki poniżej sekund. Proces ten wywołuje zmiany konformacyjne białka G, sprzyjając wymianie GDP-GTP w podjednostce_{G α}. Wiązanie GTP dodatkowo zmienia konformację podjednostki G_α, skutkując jej dysocjacją od dimeru_{G βγ}, umożliwiając propagację sygnału. Białka G są zatem kluczowe w modulacji specyficzności i dynamiki czasowej odpowiedzi komórkowych poprzez regulację różnorodnych białek efektorowych, takich jak cyklaza adenylanowa czy kanały ^{jonowe 3,4,5}.

Protokół ten określa pomiar aktywacji lub inaktywacji białka G za pomocą biosensorów opartych na bioluminescencji rezonansowej (BRET) podczas stymulacji ligandem GPCR w żywych komórkach. Zainspirowany pionierskimi badaniami nad biosensorami białek G ^6,7,8,9, system G-CASE (czujniki aktywności tri-cistronowej białka G), wprowadzony przez Schihadę i ^in.10, opiera się na BRET pomiędzy oznakowanymi podjednostkami G_α i G_βγ i oferuje uproszczene podejście wymagające jedynie jednej transfekcji plazmidów. Ta cecha zwiększa czułość i łagodzi wyzwania związane z współtransfekcją wielu plazmidów kodujących trzy podjednostki (G_α, G_β i G_γ) heterotrymerycznego białka G. Czujniki te zostały udostępnione komercyjnie grupom badawczym akademickim (zobacz Tabelę materiałów).

BRET oferuje znaczące przewagi nad Försterowym Rezonansem Transferem Energii (FRET). W BRET transfer energii zachodzi pomiędzy bioluminescencyjnym dawcą a akceptorem fluorescencyjnym bez potrzeby stosowania zewnętrznych źródeł światła. Ta wewnętrzna bioluminescencja zmniejsza problemy związane z FRET, takie jak autofluorescencja i rozpraszanie światła, co skutkuje niższym sygnałem tła i poprawą czułości testu ^6,7,11.

Brak zewnętrznego wzbudzenia w BRET minimalizuje efekty fotobielenia i fototoksyczności, prowadząc do niższych sygnałów tła w porównaniu z FRET. W konsekwencji testy BRET najczęściej wykazują zwiększoną czułość, co pozwala na pomiar aktywacji białka G konstytutywnie aktywnych GPCR. Zwiększona czułość testów BRET ułatwia wykrywanie subtelnych interakcji biologicznych, co jest szczególnie cenne w badaniach farmakologicznych, gdzie precyzyjne pomiary aktywności receptorów są kluczowe.

Te biosensory można przetłumaczyć na wysokoprzepustowe badania przesiewowe na płytkach 96-dołkowych lub 384-dołkownych, co niedawno wykazali Scott-Dennis i in., gdzie opracowano metodę wykorzystującą te biosensory w testie membranowym 384-dołków do analizy aktywności receptorów kannabinoidowych CB1R i CB2R¹². Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie tych biosensorów w płytach 96-dołkowych w komórkach żywych poprzez pomiar aktywności β2-AR jako prototypowego GPCR klasy A, który wiąże białko_G-s oraz CB1R, należącego do GPCR klasy A i aktywującego białko z rodziny_{G i/o} . Zweryfikowano zastosowanie dwóch biosensorów G-CASE: G_s i_{G i3} w komórkach HEK 293T z GPCR zarówno przejściowo (z β2-AR), albo stabilnie ekspresjonalnie (z CB1R).

Ważne jest, aby zauważyć, że eksperyment ten można przeprowadzić na różnych liniach komórkowych, co pokazuje wszechstronność i odporność tej techniki w różnych kontekstach komórkowych. Dzięki temu metoda może być stosowana w różnorodnych modelach eksperymentalnych, co czyni ją cennym narzędziem do badania sygnalizacji GPCR w różnych warunkach fizjologicznych i farmakologicznych. Rysunek 1 ilustruje zasadę czujników aktywności białek G opartych na BRET.

Rysunek 1: Zasada czujników aktywności białek G opartych na BRET. Czujniki białka G składają się z trzech podjednostek: G_α, natywnego G_β oraz G_γ. Podjednostka_{G α} jest zrośnięta z małą i jasną nanoLucyferazą (Nluc), natomiast podjednostka_{G γ} jest oznaczona N-terminalnie z okrągło permutowaną Wenus (cpVenus¹⁷³). Geny kodujące te inżynieryjne podjednostki białek G są łączone w jeden plazmid. Wiązanie ligandów z GPCR indukuje zmiany konformacyjne GPCR, sprzyjając rekrutacji białka G i późniejszą dysocjację, a następnie hydrolizę GTP. To rozłączenie zakłóca transfer energii między partnerami, skutkując spadkiem sygnału BRET. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Siew na płytach wiertowych (dzień 1)

UWAGA: Przestrzegaj wszystkich protokołów hodowli komórkowej w sterylnym laminarnym kapturze, aby utrzymać warunki sterylne. Białe płytki z przezroczystym płaskim dnem służą do śledzenia wzrostu komórek i żywotności. Użyj pełnej białej płytki studni, aby uniknąć naklejki w kroku 3.2.1.

1. Powłoka płyty studni
   UWAGA: Do ominięcia tego etapu można użyć płyt powlekanych wstępnie.
   1. Wlej do wielokanałowego zbiornika około 6 mL sterylnie filtrowanego roztworu poli-L-lizyny (PLL) (0,01%). Za pomocą pipety wielokanałowej napełnij każdą wgłębienie mikropłytki z 96 białymi studniami 60 μL PLL.
   2. Umieść mikropłytkę w ciemnym miejscu i inkubuj przez 20 minut.
   3. Podczas inkubacji należy przygotować komórki zgodnie z krokami 1.2.1-1.2.3.
   4. Aspiruj roztwór PLL pipetą wielokanałową i przechowuj go w 4 °C w probówce o pojemności 15 mL.
   5. Umyj płytkę trzy razy DPBS, aby usunąć wolne PLL, które mogą powodować degradację komórek.
2. Przygotowanie komórek i powłoka
   1. Hodować komórki HEK293 w zmodyfikowanym podłożu Eagle Dulbecco, uzupełnionym o 10% surowicę płodową bydła (FBS), 100 U/mL penicylinę oraz 100 μg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C w 5%_CO2.
      UWAGA: FBS jest dodawany do podłoża hodowlanego, aby dostarczyć niezbędnych składników odżywczych i czynników wzrostu niezbędnych do prawidłowej żywotności komórek.
   2. Usuń podłoże i przepłucz komórki 2 mL DPBS.
   3. Dodaj 0,5 mL trypsyny i inkubuj przez 3-5 minut w 37 °C, aby odłączyć komórki.
   4. Dodaj 4,5 mL DMEM do kolby, aby zneutralizować trypsynę, a następnie pipetuj w górę i w dół wielokrotnie, aby odłączyć komórki i je ponownie zawiesować.
   5. Przenieś odłączone ogniwa do probówki 15 mL i wiruj przez 5 minut w temperaturze 1000 x g (w temperaturze pokojowej, RT).
   6. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulek w 2 mL DMEM.
   7. Policz komórki komorą liczącą Malasseza i przygotuj 9 mL przy 300 000 komórek/mL. Umieść je w wielokanałowym zbiorniku i zasiew mikropłytę z 96 dołkami, wlewając 100 μL na odwór pipetą wielokanałową (końcowa gęstość 30 000 komórek/odwiert).
   8. Inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 °C, 5%_CO2 przez około 24 godziny.
      UWAGA: Komórki powinny osiągać około 70%-80% zbiegu, aby przeprowadzić efektywną transfekcję.

2. Transfekcja plazmidów (dzień 2)

UWAGA: Transfekcję komórek można wykonać pierwszego dnia na komórkach zawieszonych przed nałożeniem na płatek, podczas kroku 1.2.7, a zbieranie danych w trzecim dniu.

1. Rozcieńcz 10 μg pożądanego DNA plazmidów (np. 5 μg receptora β2-adrenergicznego i 5 μg G_s(short)-CASE w komórkach HEK wt lub tylko 10 μg G_i3-CASE w komórkach HEK CB1) oraz 20 μL lipofektaminy w rurkach zawierających 500 μL ośrodka Opti-MEM. Inkubuj w RT przez 5 minut.
   1. Dla kontroli ujemnej zastąpić receptor β2-adrenergiczny pustym plazmidem pcDNA 3.1 przy tym samym stężeniu. Połącz roztwory w jednej probówce i wymieszaj, aby uzyskać mieszaninę transfekcyjną (1 mL).
2. Inkubuj mieszankę transfekcyjną w RT przez 20 minut.
3. Dodaj 10 μL mieszanki transfekcyjnej od kroku 2.2 kropelkami do każdego dołka i delikatnie kołysać płytą tam i z powrotem, aby zapewnić pełne wymieszanie.
   UWAGA: Końcowe stężenie DNA wynosi 100 ng na dołek.
4. Mikropłytkę inkubuj w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%_CO2 przez 24 godziny.

3. Pozyskiwanie danych (Dzień 3)

1. Przygotowanie ligandów
   UWAGA: Bufor Hank's Balanced Salt Solution (HBSS): NaCl 140 mM, chlorek potasu 5 mM, chlorek wapnia 1 mM, heptahydrat siarczanu magnezu 0,4 mM, chlorek magnezu heksahydrat 0,5 mM, fosforan sodu dibazowy dihydrat 0,3 mM, fosforan potasu monozasadowy 0,4 mM, D-glukoza (dekstroza) 6 mM, wodorowęglan sodu 4 mM, pH 7,4, filtrowane 0,22 μm.
   1. Przygotuj roztwór zapasowy o najwyższym możliwym stężeniu w odpowiednim rozpuszczalniku rozpuszczalnym dla różnych ligandów (w tym protokole izoproterenol przygotowuje się w H₂₀mQ oraz WIN-55,212-2 w DMSO).
      UWAGA: Stężenie roztworu zapasowego ligandu należy dostosować w zależności od rozpuszczalności i znanej stałej dysocjacji (K_d) liganda.
   2. Z tego zapasu przygotuj rozcieńczenie seryjne ligandów w zakresie około K_d ligandu, wynoszące 10 μL w odpowiednim rozpuszczalniku rozpuszczalnym. Przechowuj to seryjne rozcieńczenie w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W zależności od ligandu, zakres rozcieńczenia seryjnego można zamrozić i rozmrozić nawet dziesięć razy, zanim nastąpi degradacja. Przygotuj roztwór zawierający wyłącznie rozpuszczalnik używany do rozpuszczania ligandów, aby uwzględnić stan pojazdu (w tym protokole H₂₀lub DMSO).
   3. Dla każdego stężenia ligandu i nośnika wykonaj rozcieńczenie 1/100 w HBSS, dodając 1,3 μL każdego stężenia do całkowitej objętości 130 μL. Skutkuje to końcowym stężeniem pojazdu 1% w HBSS.
      UWAGA: Ten ostateczny zakres rozcieńczeń jest stosowany w eksperymentach poprzez dodanie 10 μL, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μL na dołek. Skutkuje to końcowym stężeniem 0,1% pojazdu we wszystkich odwiertach. Objętość 130 μL odpowiada ilości potrzebnej do wypełnienia jednego rzędu płyty z 96 dołkami: (10 x 12) ± 10%. Każdy rząd odpowiada innej koncentracji ligandów, a ostatni rząd służy jako kontrola nośnika.
   4. Przygotuj 980 μL rozcieńczenia Furimazyny 1/100 z roztworu zapasowego (9,8 μL w 970,2 μL HBSS, aby uzyskać łączną objętość 980 μL).
      UWAGA: Przygotuj świeży roztwór furimazyny i pozwól mu wysiągać przez co najmniej 3 minuty. Następnie dodaj ją tuż przed zakupem. Nie powinno się go przygotowywać zbyt wcześnie, ponieważ sygnał ma okres półtrwania około 120 minut w temperaturze pokojowej. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można stosować długotrwałe pochodne furimazyny, takie jak wiwazyna i endurazyna. Te podłoża utrzymują stabilny sygnał BRET do 48 godzin.
2. Odczyty tablic
   UWAGA: Użyj czytnika płyt wielomodowych. Dostosuj pomiar do badanych warunków oraz liczby powtórzeń. Tutaj pozyskiwanie danych dzieli się na trzy odczyty po 4 kolumny, co odpowiada 32 studniom. Wszystkie odczyty wykonywane są za pomocą górnej optyki z przezroczystą pokrywą, aby zapobiec parowaniu buforu. Przed wszystkimi pomiarami dostosuj wzmocnienie pomiarowe. W tym badaniu wzmocnienie ustalono na poziomie 3600. Możliwe jest uniknięcie ręcznego dodawania ligandów, stosując automatyczny wtryskiwacz lub system strzykawki, który jest dostępny w wielu czytnikach płytek.
   1. Usuń medium z pierwszych 4 kolumn płyty z 96 dołkami. Przepłucz każdy dołek 100 μL HBSS i dodaj 80 μL HBSS. Przyklej białą naklejkę na spód talerza. To poprawia pomiary fluorescencji i/lub bioluminescencji.
   2. Rejestrowanie widm luminescencji białka G: Włóż płytkę z 96 dołkami do czytnika płytek. Rejestruj emisję cpVenus¹⁷³ za pomocą monochromatora 535/30 nm i mierz emisję luminescencji między 500 a 600 nm z rozdzielczością 2 nm.
      UWAGA: To nagranie jest kontrolą mające na celu zapewnienie emisji fluorescencji podczas wzbudzenia cpWenus¹⁷³ .
   3. Rejestracja widm luminescencji białka G: Rejestruj intensywność emisji Nluc za pomocą monochromatora 450/40 nm i mierz emisję luminescencji między 400 nm a 600 nm z rozdzielczością 5 nm.
      UWAGA: To nagranie ma na celu zabezpieczenie, że przed dodaniem podłoża Nluc, furimazyny, nie zostanie emitowana bioluminescencja.
   4. Wyjmij płytkę z czytnika i dodaj 10 μL wcześniej przygotowanego roztworu furimazyny (krok 3.1.4.) do każdego dołka przy pomocy pipety wielokanałowej.
   5. Powtórz krok 3.2.3.
      UWAGA: To nagranie jest kontrolą mające na celu zapewnienie emisji bioluminescencji przy dodaniu furimazyny. Po tym pomiarze należy bezpośrednio przejść do kroku 3.2.6, aby zapobiec zmianom sygnału spowodowanym spożyciem i/lub degradacją furimazyny. Zmiany sygnału BRET mogą wystąpić w wyniku spożycia i/lub degradacji furimazyny oraz procesów regulacyjnych kończących odpowiedź wywołaną stymulacją agonistów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można stosować inhibitory GRK (CMPD101) i inhibitory internalizacji (dynasore) lub komórki edytowane genowo pozbawione GRK lub arrestinów.
   6. Rejestracja bazalnego BRET białka G: Przed dodaniem ligandu GPCR, należy zapisać intensywność emisji Nluc i^{cpVenus 173} za pomocą monochromatora 450/40 nm i 535/30 nm. Mierz 3 cykle po 60 sekund z czasem pomiaru 0,30 s (całkowity czas odczytu to 3 minuty).
      UWAGA: Zwiększenie czasu interwału pomiarowego do 0,90 s zwykle znacznie poprawia stosunek sygnału do szumu, ale skutkuje znacznie dłuższym czasem odczytu. Eksperymentator powinien zdecydować, czy ważniejsza jest wyższa rozdzielczość czasowa, czy lepszy stosunek sygnału do szumu.
   7. Usuń płytkę z czytnika płytek i dodaj odpowiednio 10 μL wcześniej przygotowanego zakresu rozcieńczenia ligandu GPCR (krok 3.1) do każdej dołki jednej kolumny przy pomocy pipety wielokanałowej. Stosuj tę samą procedurę dla pozostałych 3 kolumn.
   8. Rejestracja BRET indukowanego ligandem białka G: Rejestruj intensywność emisji Nluc i cpVenus¹⁷³ przy użyciu monochromatora 450/40 nm i 535/30 nm, odpowiednio. Zmierz 16 cykli po 60 s z czasem interwału pomiaru 0,30 s (całkowity czas odczytu to 16 min).
      UWAGA: Ustaw parametry pomiarowe, aby mierzyć studnie w kolumnach. Duplikaty odczytywane są z różnicą czasu wynoszącą 2,4 s.
   9. Powtórz krok 3.2. przez kolejne cztery kolumny dwa razy.

4. Analiza danych

UWAGA: Zbieraj dane z każdego odczytu w osobnych plikach arkuszy kalkulacyjnych.

1. Odczyty sterujące
   1. Zrób wykres intensywności emisji względem długości fali.
2. Odczyty bazalnego BRET
   1. Dla każdego otworu oblicz stosunek BRET dla trzech odczytów. Stosunek BRET definiuje się jako emisja akceptor/emisja dawcy.
      
   2. Dla każdego odwiertu oblicz średnią trzech stosunków BRET przed dodaniem ligandów. Ta wartość nazywana jest bazalnym stosunkiem BRET przed stymulacją ligandu: stosunek_bazalny.
   3. Aby normalizować wcześniejsze stosunki BRET wszystkich odwiertów, dla każdego z trzech pomiarów odpowiednio odejmij wartość wskaźnika BRET obliczoną od odwiertów sterujących pojazdu od stosunku BRET w odpowiednim czasie pomiaru.
      UWAGA: Analizowane dane odpowiadają punktom czasowym przed dodaniem ligandów. Ponieważ znane są studnie, w których dodaje się ligand, można odpowiednio zidentyfikować studnie sterujące pojazdem.
3. Odczyty BRET indukowane przez ligandy białka G
   1. Dla każdego otworu oblicz współczynnik BRET dla każdego odczytu, zgodnie z opisem w sekcji 4.2.1. Te wartości nazywane_{są stymulacją} stosunkową.
   2. Aby ilościowo określić zmiany wywołane ligandem, oblicz ΔBRET dla_{każdego stymulatora} Ratio każdej studni jako procent powyżej bazalu. Do tego użyj odpowiedniego Ratio_bazalnego wcześniej obliczonego w sekcji 4.2.2.
      
   3. Oblicz wartość ΔBRET(%), aby znormalizować wartości ΔBRET dla każdego dołka. Aby to zrobić, odejmij odpowiednie wartości ΔBRET pojazdu.
   4. Aby zobrazować kinetykę ΔBRET w arkuszu kalkulacyjnym, dodaj trzy bazalne odczyty BRET znormalizowane w kroku 4.2.3. przed odpowiadającymi wartościami ΔBRET(%) obliczonymi dla każdego odwiertu w sekcji 4.3.3.
   5. Pobierz wykres poprzednich danych względem czasu odczytu, aby uzyskać wykres kinetyczny.
   6. Gdy osiągniesz plateau, bierz wartości ΔBRET(%) w wybranym czasie i zestawiaj je względem stężenia użytego ligandu, ponieważ każda studnia odpowiada innemu stężeniu ligandów. Otrzymuje się krzywą dawka-odpowiedź.
      UWAGA: Plateau zwykle osiąga się około 5 minut po stymulacji ligandów. W tym protokole wartości uzyskane po 15-minutowej stymulacji ligandów są wykreślane na wykresie. Aby porównać dane z różnych eksperymentów, dostosuj czas w zależności od kinetyki aktywacji.
   7. Wykonaj wykres wcześniejszych danych w oprogramowaniu analitycznym i dopasuj za pomocą trzyparametrowego dopasowania dawka-odpowiedź sigmoidalna na podstawie następującego równania:
      
      gdzie X to stężenie użytego ligandu, Y to wartości ΔBRET(%), Top i Bottom to plateau, a EC₅₀ to stężenie ligandów wymagane do osiągnięcia 50% maksymalnego efektu. Pozwala to na uzyskanie E_max oraz EC₅₀.
   8. Porównaj dane z warunków kontrolnych za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya. Wyniki są uznawane za istotne na poziomie p < 0,05.

Rysunek 2: Kluczowe kroki przeprowadzenia testu BRET. Przegląd trzech głównych kroków eksperymentalnych opisanych w tym protokole (siewowanie komórek, transfekcja komórek oraz pozyskiwanie sygnału BRET) oraz szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący pozyskiwania danych. Przygotowanie eksperymentalne: Pierwszego dnia komórki są zasiewane na białej, 96-dołowej płytce z PLL, z płaskim, przezroczystym dnem, o gęstości 30 000 komórek/dołek. Drugiego dnia komórki są transfekowane wybranym czujnikiem białka G wraz z badanymi plazmidami GPCR lub pcDNA3.1. Po 24-godzinnej inkubacji aktywność czujnika białka G jest mierzona za pomocą odczytów bioluminescencji i fluorescencji po dodaniu ligandów. Pozyskiwanie danych: Po płukaniu komórek przez HBSS do dołków dodaje się 80 μL HBSS, a emisję fluorescencji cpVenus¹⁷³ mierzy się w zakresie od 500 nm do 600 nm za pomocą monochromatora 535/30 nm (1). Następnie bioluminescencja Nluc jest mierzona między 400 nm a 600 nm za pomocą monochromatora 450/40 nm, zarówno przed (2), jak i po (3) dodaniu furimazyny. Na koniec, sygnał BRET dla aktywności białek G bazalnych i indukowanych ligandem mierzy się za pomocą monochromatorów 450/40 nm i 535/30 nm, odpowiednio, odpowiednio w ciągu 3 minut (3 cykle po 60 s z interwałem pomiarowym 0,30 s) (4) i 16 minut (16 cykli po 60 s z interwałem pomiarowym 0,30 s) (5). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Uogólniony schemat przygotowania i wykonania eksperymentu jest szczegółowo opisany na Rysunku 2. Aktywację białek rodziny i/o G-s lub G po aktywacji ligandów dwóch GPCR oceniono za pomocą biosensorów G-CASE. Najpierw zbadano prototypową rodzinę GPCR A, β2-AR transfekowany przejściowo w komórkach HEK 293T. Gdy do komórek WT HEK ekspresujących β2-AR wraz z czujnikiem białka G(short)-CASE) zastosowano agonistę (tj. izoproterenol), zaobserwowano zależny od stężenia spadek sygnału BRET, co wskazuje na aktywację białka G(Rysunek 3B). Wartości ΔBRET spadały wraz z koncentracją ligandów aż do osiągnięcia nasycenia, z plateau obserwowanym około 5 minut po stymulacji ligandu. Dla porównania, komórki WT HEK transfekowane pustym plazmidem pcDNA3.1 oraz sensor białka Gs(short)-CASE wykazały odwrotną, ale niską i nieistotną odpowiedź na stymulację izoproterenolem (Rysunek 3B). W tym protokole wartości uzyskane po 15 minutach stymulacji ligandów są wykreślane. Aby zapewnić spójność wyników i niezależność od wyboru czasu, należy przetestować inne punkty czasowe, aby upewnić się, że równowaga została osiągnięta. Dodatkowo, aby porównać wyniki w różnych eksperymentach, dobór czasu powinien być dostosowany do kinetyki aktywacji każdego eksperymentu.

Aby wygenerować sigmoidalne krzywe dawka-odpowiedź pokazane na Rysunku 3C, wartości ΔBRET zmierzone 15 minut po stymulacji (gdy plateau jest ustabilizowane) zostały narysowane względem różnych stężeń ligandów. Zaobserwowany EC50 (9,4 nM ± 2,1 nM) mieści się w zakresie znanych wartości Kd dla izoproterenolu (13 nM ± 6 nM)13,14 (rysunek 3C,D). Wyniki te pokazują skuteczność czujników G-CASE w ocenie aktywacji białka G z obserwowaną odpowiedzią specyficznie związaną z obecnością β2-AR.

Rysunek 3: Ocena czujnika białka Gw komórkach WT HEK. Kinetyczne odczyty ΔBRET po dodaniu izoproterenolu agonisty do komórek WT HEK transfekowanych czujnikiem białkaG-s oraz β2-AR(A) lub pcDNA3.1 (B). (C) Krzywe dawka-odpowiedź uzyskane przez dopasowanie wartości ΔBRET (%) po 15-minutowej stymulacji ligandów przy różnych stężeniach ligandów. (D) Porównanie maksymalnych wartości ΔBRET między kontrolnymi komórkami pcDNA3.1 i β2-AR stymulowanymi izoproterenolem. Statystyczna różnica względem warunków pcDNA3.1 została zbadana za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya (**p < 0,01). Dane pokazują średnią ± SEM trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w duplikacie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Po drugie, biosensory zostały przetestowane w komórkach HEK CB1, linii komórkowej HEK 293T stabilnie ekspresującej CB1R. Komórki te zostały tymczasowo transfekowane czujnikiem białkaG i3-CASE. Stymulacja agonistą CB1R WIN-55,212-2 wywołała sygnał ΔBRET zależny od stężenia, wskazujący na aktywację szlaku Gi3 (rysunek 4A). Dla porównania, komórki WT HEK transfekowane czujnikiem białkaG i3-CASE i stymulowane w tych samych warunkach nie wykazały żadnej odpowiedzi, co potwierdza specyficzność aktywacji CB1R (Rysunek 4B). Plateau osiągnięto około 5 minut po aktywacji ligandu. Odpowiadająca krzywa dawka-odpowiedź podkreślała zależną od stężenia odpowiedź ΔBRET wywołaną stymulacją WIN-55,212-2 w komórkach HEK-CB1, podczas gdy w komórkach HEK wt nie zaobserwowano takiej odpowiedzi (rysunek 4C). Obserwowane EC50 (112 nM ± 25 nM) mieści się w zakresie znanych EC50 receptora dla WIN-55,212-2 (354 nM ± 62 nM)15 (rysunek 4C, D). Na koniec, porównanie wartości ΔBRET uzyskanych 15 minut po stymulacji agonistycznej z 10 μM WIN-55,212-2 w HEK CB1, a komórki HEK wt ilustrują zależną od CB1R aktywację szlaku sygnalizacyjnego Gi3 (Rysunek 4D).

Rysunek 4: Ocena czujnika białka Gi3 w komórkach HEK CB1. Kinetyczne odczyty ΔBRET po dodaniu agonisty WIN-55,212-2 do komórek wt HEK CB1 (A) lub HEK (B). Krzywe dawka-odpowiedź uzyskane przez dopasowanie wartości ΔBRET (%) po 15 minutach stymulacji ligandów do stężenia ligandu (C). Porównanie maksymalnych wartości ΔBRET między kontrolnymi komórkami HEK wt i HEK CB1 stymulowanymi WIN-55.212-2 (D). Statystyczna różnica względem warunków wt HEK została zbadana za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya (****p < 0,0001). Dane pokazują średnią ± SEM pięciu niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w duplikacie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.