Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68463

⸱

7 listopada 2025

 ,  ,  ,  , 
1CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Streszczenie

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą rodzinę receptorów transbłonowych, odgrywając kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej poprzez przekształcanie bodźców zewnętrznych w odpowiedzi wewnątrzkomórkowe. Aktywacja GPCR prowadzi do zmian konformacyjnych, które umożliwiają interakcje z heterotrymerowymi białkami G. Po aktywacji podjednostkaG α przechodzi wymianę GDP-GTP, oddzielając się od dimeraG βγ i wywołując kaskady sygnalizacyjne w dalszej fazie. Aby badać aktywację białka G za pośrednictwem GPCR, biosensory oparte na bioluminescencji rezonansowej (BRET) są bardzo czułym i nieinwazyjnym podejściem. Czujniki aktywności trysystronicznej oparte na białkach G (biosensory G-CASE), opracowane przez Schihadę i in., wykrywają dysocjację heterotrimerów jako wskaźnik aktywacji i umożliwiają monitorowanie aktywności GPCR w czasie rzeczywistym za pomocą pojedynczej transfekcji plazmidów, przezwyciężając ograniczenia podejść ko-transfekcyjnych. Testy BRET oferują kilka zalet w porównaniu z technikami opartymi na fluorescencji, takich jak niższy poziom szumu tła, zmniejszenie fotoblajchowania oraz zwiększona czułość. W tym protokole biosensory G-CASE oparte na BRET były stosowane w komórkach żywych i płytkach 96-dołkowych. Konkretnie oceniamy aktywność receptora β2-adrenergicznego (β2-AR) oraz receptora kannabinoidowego typu 1 (CB1R) pod kątem aktywacji białka G. Korzystając z komórek dzikich typu HEK 293T przejściowo transfekowanych β2-AR oraz komórek HEK293T stabilnie wyrażających CB1R, potwierdzono odporność biosensorów G-CASE GS iG i3 . Protokół ten wspiera zastosowanie tego podejścia w badaniach farmakologicznych oraz wysokoprzepustowym przesiewaniu GPCR, aby lepiej zrozumieć zdolność ligandów do aktywowania określonych szlaków, na przykład poprzez sygnalizację stronniczą, co ułatwia odkrywanie nowych związków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią największą superrodzinę receptorów transbłonnych, odpowiedzialną za przekształcanie bodźców zewnętrznych w kaskady sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, co prowadzi do specyficznych odpowiedzi biologicznych. Są one kluczowymi celami farmakologicznymi, przy czym około 30% leków na rynku działa na GPCR1. Wiązanie ligandów GPCR indukuje zmiany konformacyjne receptora, ułatwiając interakcje z heterotrymerowymi białkami G i/lub kinazami GPCR (GRK) oraz β-arrestinami, inicjując tym samym sygnalizację lub internalizację receptorów2.

Białka G heterotrymeryczne pełnią rolę głównych wewnątrzkomórkowych przetworników sygnalizacji GPCR i składają się z trzech podjednostek: Gα, Gβ oraz Gγ. Heterotrimery te klasyfikuje się na cztery rodziny – Gi/o, Gs, Gq oraz G12/13 – na podstawie podtypu Gα , z których każdy aktywuje odrębne szlaki sygnalizacyjne: podtyp Gi/o hamuje cyklazę adenylanową, GS ją stymuluje, Gq aktywuje fosfolipazę C-β, a G12/13 reguluje GTPazy rodziny Rho.

Aktywacja GPCR prowadzi do ich konformacyjnych przekształceń, umożliwiając szybkie zaangażowanie białek G w ramach kinetyki poniżej sekund. Proces ten wywołuje zmiany konformacyjne białka G, sprzyjając wymianie GDP-GTP w podjednostceG α. Wiązanie GTP dodatkowo zmienia konformację podjednostki Gα, skutkując jej dysocjacją od dimeruG βγ, umożliwiając propagację sygnału. Białka G są zatem kluczowe w modulacji specyficzności i dynamiki czasowej odpowiedzi komórkowych poprzez regulację różnorodnych białek efektorowych, takich jak cyklaza adenylanowa czy kanały jonowe 3,4,5.

Protokół ten określa pomiar aktywacji lub inaktywacji białka G za pomocą biosensorów opartych na bioluminescencji rezonansowej (BRET) podczas stymulacji ligandem GPCR w żywych komórkach. Zainspirowany pionierskimi badaniami nad biosensorami białek G 6,7,8,9, system G-CASE (czujniki aktywności tri-cistronowej białka G), wprowadzony przez Schihadę i in.10, opiera się na BRET pomiędzy oznakowanymi podjednostkami Gα i Gβγ i oferuje uproszczene podejście wymagające jedynie jednej transfekcji plazmidów. Ta cecha zwiększa czułość i łagodzi wyzwania związane z współtransfekcją wielu plazmidów kodujących trzy podjednostki (Gα, Gβ i Gγ) heterotrymerycznego białka G. Czujniki te zostały udostępnione komercyjnie grupom badawczym akademickim (zobacz Tabelę materiałów).

BRET oferuje znaczące przewagi nad Försterowym Rezonansem Transferem Energii (FRET). W BRET transfer energii zachodzi pomiędzy bioluminescencyjnym dawcą a akceptorem fluorescencyjnym bez potrzeby stosowania zewnętrznych źródeł światła. Ta wewnętrzna bioluminescencja zmniejsza problemy związane z FRET, takie jak autofluorescencja i rozpraszanie światła, co skutkuje niższym sygnałem tła i poprawą czułości testu 6,7,11.

Brak zewnętrznego wzbudzenia w BRET minimalizuje efekty fotobielenia i fototoksyczności, prowadząc do niższych sygnałów tła w porównaniu z FRET. W konsekwencji testy BRET najczęściej wykazują zwiększoną czułość, co pozwala na pomiar aktywacji białka G konstytutywnie aktywnych GPCR. Zwiększona czułość testów BRET ułatwia wykrywanie subtelnych interakcji biologicznych, co jest szczególnie cenne w badaniach farmakologicznych, gdzie precyzyjne pomiary aktywności receptorów są kluczowe.

Te biosensory można przetłumaczyć na wysokoprzepustowe badania przesiewowe na płytkach 96-dołkowych lub 384-dołkownych, co niedawno wykazali Scott-Dennis i in., gdzie opracowano metodę wykorzystującą te biosensory w testie membranowym 384-dołków do analizy aktywności receptorów kannabinoidowych CB1R i CB2R12. Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie tych biosensorów w płytach 96-dołkowych w komórkach żywych poprzez pomiar aktywności β2-AR jako prototypowego GPCR klasy A, który wiąże białkoG-s oraz CB1R, należącego do GPCR klasy A i aktywującego białko z rodzinyG i/o . Zweryfikowano zastosowanie dwóch biosensorów G-CASE: Gs iG i3 w komórkach HEK 293T z GPCR zarówno przejściowo (z β2-AR), albo stabilnie ekspresjonalnie (z CB1R).

Ważne jest, aby zauważyć, że eksperyment ten można przeprowadzić na różnych liniach komórkowych, co pokazuje wszechstronność i odporność tej techniki w różnych kontekstach komórkowych. Dzięki temu metoda może być stosowana w różnorodnych modelach eksperymentalnych, co czyni ją cennym narzędziem do badania sygnalizacji GPCR w różnych warunkach fizjologicznych i farmakologicznych. Rysunek 1 ilustruje zasadę czujników aktywności białek G opartych na BRET.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Zasada czujników aktywności białek G opartych na BRET. Czujniki białka G składają się z trzech podjednostek: Gα, natywnego Gβ oraz Gγ. PodjednostkaG α jest zrośnięta z małą i jasną nanoLucyferazą (Nluc), natomiast podjednostkaG γ jest oznaczona N-terminalnie z okrągło permutowaną Wenus (cpVenus173). Geny kodujące te inżynieryjne podjednostki białek G są łączone w jeden plazmid. Wiązanie ligandów z GPCR indukuje zmiany konformacyjne GPCR, sprzyjając rekrutacji białka G i późniejszą dysocjację, a następnie hydrolizę GTP. To rozłączenie zakłóca transfer energii między partnerami, skutkując spadkiem sygnału BRET. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Siew na płytach wiertowych (dzień 1)

UWAGA: Przestrzegaj wszystkich protokołów hodowli komórkowej w sterylnym laminarnym kapturze, aby utrzymać warunki sterylne. Białe płytki z przezroczystym płaskim dnem służą do śledzenia wzrostu komórek i żywotności. Użyj pełnej białej płytki studni, aby uniknąć naklejki w kroku 3.2.1.

  1. Powłoka płyty studni
    UWAGA: Do ominięcia tego etapu można użyć płyt powlekanych wstępnie.
    1. Wlej do wielokanałowego zbiornika około 6 mL sterylnie filtrowanego roztworu poli-L-lizyny (PLL) (0,01%). Za pomocą pipety wielokanałowej napełnij każdą wgłębienie mikropłytki z 96 białymi studniami 60 μL PLL.
    2. Umieść mikropłytkę w ciemnym miejscu i inkubuj przez 20 minut.
    3. Podczas inkubacji należy przygotować komórki zgodnie z krokami 1.2.1-1.2.3.
    4. Aspiruj roztwór PLL pipetą wielokanałową i przechowuj go w 4 °C w probówce o pojemności 15 mL.
    5. Umyj płytkę trzy razy DPBS, aby usunąć wolne PLL, które mogą powodować degradację komórek.
  2. Przygotowanie komórek i powłoka
    1. Hodować komórki HEK293 w zmodyfikowanym podłożu Eagle Dulbecco, uzupełnionym o 10% surowicę płodową bydła (FBS), 100 U/mL penicylinę oraz 100 μg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C w 5%CO2.
      UWAGA: FBS jest dodawany do podłoża hodowlanego, aby dostarczyć niezbędnych składników odżywczych i czynników wzrostu niezbędnych do prawidłowej żywotności komórek.
    2. Usuń podłoże i przepłucz komórki 2 mL DPBS.
    3. Dodaj 0,5 mL trypsyny i inkubuj przez 3-5 minut w 37 °C, aby odłączyć komórki.
    4. Dodaj 4,5 mL DMEM do kolby, aby zneutralizować trypsynę, a następnie pipetuj w górę i w dół wielokrotnie, aby odłączyć komórki i je ponownie zawiesować.
    5. Przenieś odłączone ogniwa do probówki 15 mL i wiruj przez 5 minut w temperaturze 1000 x g (w temperaturze pokojowej, RT).
    6. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulek w 2 mL DMEM.
    7. Policz komórki komorą liczącą Malasseza i przygotuj 9 mL przy 300 000 komórek/mL. Umieść je w wielokanałowym zbiorniku i zasiew mikropłytę z 96 dołkami, wlewając 100 μL na odwór pipetą wielokanałową (końcowa gęstość 30 000 komórek/odwiert).
    8. Inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez około 24 godziny.
      UWAGA: Komórki powinny osiągać około 70%-80% zbiegu, aby przeprowadzić efektywną transfekcję.

2. Transfekcja plazmidów (dzień 2)

UWAGA: Transfekcję komórek można wykonać pierwszego dnia na komórkach zawieszonych przed nałożeniem na płatek, podczas kroku 1.2.7, a zbieranie danych w trzecim dniu.

  1. Rozcieńcz 10 μg pożądanego DNA plazmidów (np. 5 μg receptora β2-adrenergicznego i 5 μg Gs(short)-CASE w komórkach HEK wt lub tylko 10 μg Gi3-CASE w komórkach HEK CB1) oraz 20 μL lipofektaminy w rurkach zawierających 500 μL ośrodka Opti-MEM. Inkubuj w RT przez 5 minut.
    1. Dla kontroli ujemnej zastąpić receptor β2-adrenergiczny pustym plazmidem pcDNA 3.1 przy tym samym stężeniu. Połącz roztwory w jednej probówce i wymieszaj, aby uzyskać mieszaninę transfekcyjną (1 mL).
  2. Inkubuj mieszankę transfekcyjną w RT przez 20 minut.
  3. Dodaj 10 μL mieszanki transfekcyjnej od kroku 2.2 kropelkami do każdego dołka i delikatnie kołysać płytą tam i z powrotem, aby zapewnić pełne wymieszanie.
    UWAGA: Końcowe stężenie DNA wynosi 100 ng na dołek.
  4. Mikropłytkę inkubuj w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 24 godziny.

3. Pozyskiwanie danych (Dzień 3)

  1. Przygotowanie ligandów
    UWAGA: Bufor Hank's Balanced Salt Solution (HBSS): NaCl 140 mM, chlorek potasu 5 mM, chlorek wapnia 1 mM, heptahydrat siarczanu magnezu 0,4 mM, chlorek magnezu heksahydrat 0,5 mM, fosforan sodu dibazowy dihydrat 0,3 mM, fosforan potasu monozasadowy 0,4 mM, D-glukoza (dekstroza) 6 mM, wodorowęglan sodu 4 mM, pH 7,4, filtrowane 0,22 μm.
    1. Przygotuj roztwór zapasowy o najwyższym możliwym stężeniu w odpowiednim rozpuszczalniku rozpuszczalnym dla różnych ligandów (w tym protokole izoproterenol przygotowuje się w H20mQ oraz WIN-55,212-2 w DMSO).
      UWAGA: Stężenie roztworu zapasowego ligandu należy dostosować w zależności od rozpuszczalności i znanej stałej dysocjacji (Kd) liganda.
    2. Z tego zapasu przygotuj rozcieńczenie seryjne ligandów w zakresie około Kd ligandu, wynoszące 10 μL w odpowiednim rozpuszczalniku rozpuszczalnym. Przechowuj to seryjne rozcieńczenie w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W zależności od ligandu, zakres rozcieńczenia seryjnego można zamrozić i rozmrozić nawet dziesięć razy, zanim nastąpi degradacja. Przygotuj roztwór zawierający wyłącznie rozpuszczalnik używany do rozpuszczania ligandów, aby uwzględnić stan pojazdu (w tym protokole H20lub DMSO).
    3. Dla każdego stężenia ligandu i nośnika wykonaj rozcieńczenie 1/100 w HBSS, dodając 1,3 μL każdego stężenia do całkowitej objętości 130 μL. Skutkuje to końcowym stężeniem pojazdu 1% w HBSS.
      UWAGA: Ten ostateczny zakres rozcieńczeń jest stosowany w eksperymentach poprzez dodanie 10 μL, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μL na dołek. Skutkuje to końcowym stężeniem 0,1% pojazdu we wszystkich odwiertach. Objętość 130 μL odpowiada ilości potrzebnej do wypełnienia jednego rzędu płyty z 96 dołkami: (10 x 12) ± 10%. Każdy rząd odpowiada innej koncentracji ligandów, a ostatni rząd służy jako kontrola nośnika.
    4. Przygotuj 980 μL rozcieńczenia Furimazyny 1/100 z roztworu zapasowego (9,8 μL w 970,2 μL HBSS, aby uzyskać łączną objętość 980 μL).
      UWAGA: Przygotuj świeży roztwór furimazyny i pozwól mu wysiągać przez co najmniej 3 minuty. Następnie dodaj ją tuż przed zakupem. Nie powinno się go przygotowywać zbyt wcześnie, ponieważ sygnał ma okres półtrwania około 120 minut w temperaturze pokojowej. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można stosować długotrwałe pochodne furimazyny, takie jak wiwazyna i endurazyna. Te podłoża utrzymują stabilny sygnał BRET do 48 godzin.
  2. Odczyty tablic
    UWAGA: Użyj czytnika płyt wielomodowych. Dostosuj pomiar do badanych warunków oraz liczby powtórzeń. Tutaj pozyskiwanie danych dzieli się na trzy odczyty po 4 kolumny, co odpowiada 32 studniom. Wszystkie odczyty wykonywane są za pomocą górnej optyki z przezroczystą pokrywą, aby zapobiec parowaniu buforu. Przed wszystkimi pomiarami dostosuj wzmocnienie pomiarowe. W tym badaniu wzmocnienie ustalono na poziomie 3600. Możliwe jest uniknięcie ręcznego dodawania ligandów, stosując automatyczny wtryskiwacz lub system strzykawki, który jest dostępny w wielu czytnikach płytek.
    1. Usuń medium z pierwszych 4 kolumn płyty z 96 dołkami. Przepłucz każdy dołek 100 μL HBSS i dodaj 80 μL HBSS. Przyklej białą naklejkę na spód talerza. To poprawia pomiary fluorescencji i/lub bioluminescencji.
    2. Rejestrowanie widm luminescencji białka G: Włóż płytkę z 96 dołkami do czytnika płytek. Rejestruj emisję cpVenus173 za pomocą monochromatora 535/30 nm i mierz emisję luminescencji między 500 a 600 nm z rozdzielczością 2 nm.
      UWAGA: To nagranie jest kontrolą mające na celu zapewnienie emisji fluorescencji podczas wzbudzenia cpWenus173 .
    3. Rejestracja widm luminescencji białka G: Rejestruj intensywność emisji Nluc za pomocą monochromatora 450/40 nm i mierz emisję luminescencji między 400 nm a 600 nm z rozdzielczością 5 nm.
      UWAGA: To nagranie ma na celu zabezpieczenie, że przed dodaniem podłoża Nluc, furimazyny, nie zostanie emitowana bioluminescencja.
    4. Wyjmij płytkę z czytnika i dodaj 10 μL wcześniej przygotowanego roztworu furimazyny (krok 3.1.4.) do każdego dołka przy pomocy pipety wielokanałowej.
    5. Powtórz krok 3.2.3.
      UWAGA: To nagranie jest kontrolą mające na celu zapewnienie emisji bioluminescencji przy dodaniu furimazyny. Po tym pomiarze należy bezpośrednio przejść do kroku 3.2.6, aby zapobiec zmianom sygnału spowodowanym spożyciem i/lub degradacją furimazyny. Zmiany sygnału BRET mogą wystąpić w wyniku spożycia i/lub degradacji furimazyny oraz procesów regulacyjnych kończących odpowiedź wywołaną stymulacją agonistów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można stosować inhibitory GRK (CMPD101) i inhibitory internalizacji (dynasore) lub komórki edytowane genowo pozbawione GRK lub arrestinów.
    6. Rejestracja bazalnego BRET białka G: Przed dodaniem ligandu GPCR, należy zapisać intensywność emisji Nluc icpVenus 173 za pomocą monochromatora 450/40 nm i 535/30 nm. Mierz 3 cykle po 60 sekund z czasem pomiaru 0,30 s (całkowity czas odczytu to 3 minuty).
      UWAGA: Zwiększenie czasu interwału pomiarowego do 0,90 s zwykle znacznie poprawia stosunek sygnału do szumu, ale skutkuje znacznie dłuższym czasem odczytu. Eksperymentator powinien zdecydować, czy ważniejsza jest wyższa rozdzielczość czasowa, czy lepszy stosunek sygnału do szumu.
    7. Usuń płytkę z czytnika płytek i dodaj odpowiednio 10 μL wcześniej przygotowanego zakresu rozcieńczenia ligandu GPCR (krok 3.1) do każdej dołki jednej kolumny przy pomocy pipety wielokanałowej. Stosuj tę samą procedurę dla pozostałych 3 kolumn.
    8. Rejestracja BRET indukowanego ligandem białka G: Rejestruj intensywność emisji Nluc i cpVenus173 przy użyciu monochromatora 450/40 nm i 535/30 nm, odpowiednio. Zmierz 16 cykli po 60 s z czasem interwału pomiaru 0,30 s (całkowity czas odczytu to 16 min).
      UWAGA: Ustaw parametry pomiarowe, aby mierzyć studnie w kolumnach. Duplikaty odczytywane są z różnicą czasu wynoszącą 2,4 s.
    9. Powtórz krok 3.2. przez kolejne cztery kolumny dwa razy.

4. Analiza danych

UWAGA: Zbieraj dane z każdego odczytu w osobnych plikach arkuszy kalkulacyjnych.

  1. Odczyty sterujące
    1. Zrób wykres intensywności emisji względem długości fali.
  2. Odczyty bazalnego BRET
    1. Dla każdego otworu oblicz stosunek BRET dla trzech odczytów. Stosunek BRET definiuje się jako emisja akceptor/emisja dawcy.
      figure-protocol-1
    2. Dla każdego odwiertu oblicz średnią trzech stosunków BRET przed dodaniem ligandów. Ta wartość nazywana jest bazalnym stosunkiem BRET przed stymulacją ligandu: stosunekbazalny.
    3. Aby normalizować wcześniejsze stosunki BRET wszystkich odwiertów, dla każdego z trzech pomiarów odpowiednio odejmij wartość wskaźnika BRET obliczoną od odwiertów sterujących pojazdu od stosunku BRET w odpowiednim czasie pomiaru.
      UWAGA: Analizowane dane odpowiadają punktom czasowym przed dodaniem ligandów. Ponieważ znane są studnie, w których dodaje się ligand, można odpowiednio zidentyfikować studnie sterujące pojazdem.
  3. Odczyty BRET indukowane przez ligandy białka G
    1. Dla każdego otworu oblicz współczynnik BRET dla każdego odczytu, zgodnie z opisem w sekcji 4.2.1. Te wartości nazywanesą stymulacją stosunkową.
    2. Aby ilościowo określić zmiany wywołane ligandem, oblicz ΔBRET dlakażdego stymulatora Ratio każdej studni jako procent powyżej bazalu. Do tego użyj odpowiedniego Ratiobazalnego wcześniej obliczonego w sekcji 4.2.2.
      figure-protocol-2
    3. Oblicz wartość ΔBRET(%), aby znormalizować wartości ΔBRET dla każdego dołka. Aby to zrobić, odejmij odpowiednie wartości ΔBRET pojazdu.
    4. Aby zobrazować kinetykę ΔBRET w arkuszu kalkulacyjnym, dodaj trzy bazalne odczyty BRET znormalizowane w kroku 4.2.3. przed odpowiadającymi wartościami ΔBRET(%) obliczonymi dla każdego odwiertu w sekcji 4.3.3.
    5. Pobierz wykres poprzednich danych względem czasu odczytu, aby uzyskać wykres kinetyczny.
    6. Gdy osiągniesz plateau, bierz wartości ΔBRET(%) w wybranym czasie i zestawiaj je względem stężenia użytego ligandu, ponieważ każda studnia odpowiada innemu stężeniu ligandów. Otrzymuje się krzywą dawka-odpowiedź.
      UWAGA: Plateau zwykle osiąga się około 5 minut po stymulacji ligandów. W tym protokole wartości uzyskane po 15-minutowej stymulacji ligandów są wykreślane na wykresie. Aby porównać dane z różnych eksperymentów, dostosuj czas w zależności od kinetyki aktywacji.
    7. Wykonaj wykres wcześniejszych danych w oprogramowaniu analitycznym i dopasuj za pomocą trzyparametrowego dopasowania dawka-odpowiedź sigmoidalna na podstawie następującego równania:
      figure-protocol-3
      gdzie X to stężenie użytego ligandu, Y to wartości ΔBRET(%), Top i Bottom to plateau, a EC50 to stężenie ligandów wymagane do osiągnięcia 50% maksymalnego efektu. Pozwala to na uzyskanie Emax oraz EC50.
    8. Porównaj dane z warunków kontrolnych za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya. Wyniki są uznawane za istotne na poziomie p < 0,05.

figure-protocol-4
Rysunek 2: Kluczowe kroki przeprowadzenia testu BRET. Przegląd trzech głównych kroków eksperymentalnych opisanych w tym protokole (siewowanie komórek, transfekcja komórek oraz pozyskiwanie sygnału BRET) oraz szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący pozyskiwania danych. Przygotowanie eksperymentalne: Pierwszego dnia komórki są zasiewane na białej, 96-dołowej płytce z PLL, z płaskim, przezroczystym dnem, o gęstości 30 000 komórek/dołek. Drugiego dnia komórki są transfekowane wybranym czujnikiem białka G wraz z badanymi plazmidami GPCR lub pcDNA3.1. Po 24-godzinnej inkubacji aktywność czujnika białka G jest mierzona za pomocą odczytów bioluminescencji i fluorescencji po dodaniu ligandów. Pozyskiwanie danych: Po płukaniu komórek przez HBSS do dołków dodaje się 80 μL HBSS, a emisję fluorescencji cpVenus173 mierzy się w zakresie od 500 nm do 600 nm za pomocą monochromatora 535/30 nm (1). Następnie bioluminescencja Nluc jest mierzona między 400 nm a 600 nm za pomocą monochromatora 450/40 nm, zarówno przed (2), jak i po (3) dodaniu furimazyny. Na koniec, sygnał BRET dla aktywności białek G bazalnych i indukowanych ligandem mierzy się za pomocą monochromatorów 450/40 nm i 535/30 nm, odpowiednio, odpowiednio w ciągu 3 minut (3 cykle po 60 s z interwałem pomiarowym 0,30 s) (4) i 16 minut (16 cykli po 60 s z interwałem pomiarowym 0,30 s) (5). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Uogólniony schemat przygotowania i wykonania eksperymentu jest szczegółowo opisany na Rysunku 2. Aktywację białek rodziny i/o G-s lub G po aktywacji ligandów dwóch GPCR oceniono za pomocą biosensorów G-CASE. Najpierw zbadano prototypową rodzinę GPCR A, β2-AR transfekowany przejściowo w komórkach HEK 293T. Gdy do komórek WT HEK ekspresujących β2-AR wraz z czujnikiem białka G(short)-CASE) zastosowano agonistę (tj. izoproterenol), zaobserwowano zależny od stężen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie biosensorów BRET do pomiaru aktywacji białek G w czasie rzeczywistym w komórkach żywych w odpowiedzi na stymulację GPCR za pomocą określonych ligandów. Dzięki zastosowaniu zasady transferu energii bioluminescencyjnego dawca i akceptora, podejście to umożliwia wykrywanie zmian konformacyjnych i dysocjację heterotrymerowych białek G po aktywacji receptorów, zapewniając solidną i czułą platformę do badania sygnalizacji GPCR. Protokół ten może być adaptowany i stosowany do różnych rod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Komórki HEK-CB1 były darem od M. Guzmana (Uniwersytet Complutense, Madryt, Hiszpania), a plazmid receptora β2 był darem od D. Perraisa (IINS, Interdyscyplinarny Instytut Neurobiologii, Bordeaux, Francja). Gi3-CASE i Gs(short)-CASE zostały podarowane przez Gunnara Schulte (plazmid addgene # 168122; Addgene plasmid # 168124). Niektóre ilustracje powstały przy użyciu BioRender.com. Prace te są wspierane przez francuskie Ministerstwo Wyższego Nadzoru i Badań oraz finanse od francuskich narodowych agencji badawczych (ANR) PolyFADO (ANR-21-CE44-0019), AlzCaBan (ANR-24-CE44-4647) oraz SCHIZOLIP (ANR-22-CE44-0034).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowany 96-dołkowy płytka hodowla, biała z przezroczystym płaskim dnem, z pokrywką, Greiner bio-oneDutscher655983
BrightMax ClearLine White FilmDutscher760245
ClarioSTAR LVFBMG Labtech
Dimetylsulfotlenek (DMSO)SigmaD4540
DPBS Modified (DPBS), bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, ciekły, filtrowany sterylnie, odpowiedni do pracy w ogniwkachSigma D8537
Dulbecco' zmodyfikowanego Eagle' s medium (DMEM) GlutaMAXSigmaD0822Ciepło w 37 stopniach; C kąpieli wodnej przed użyciem
Serum bydła płodu (FBS)Sigma F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-WenusAddgene168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Prezent od Gunnara Schulte
Galphas (krótka izoforma)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-WenusAddgene168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Prezent od Gunnara Schulte
HEK-293T stabilnie wyrażający CB1R (HEK CB1)Miły prezent od M. Guzmana (Uniwersytet Complutense, Madryt, Hiszpania)
HEK-293T typu dzikiego (HEK wt)
IzoproterenolSigmaI6504Rozpuszczony w H20 i przechowywany w – 20 & f; C
Lipofektamina 2000Invitrogen 11668019
Opti-MEM I Suplement GlutaMAX o obniżonej ilości surowicyFischer11564506
Flaga beta-2-receptora receptora adrenergicznego pcDNA3 FLAG C-terDar od D. Perrais (IINS, Bordeaux)
pcDNA3.1-(pusty)-TAGAddgene138209
Penicylina/streptomycynaSigma P4333
Roztwór poli-L-lizyny (PLL)SigmaRNBL7086
Trypsin-EDTA Sigma T3924
WYGRANA 55,212-2Cayman Chemicals10009023Rozpuszczony w DMSO i przechowywany w – 20 & f; C

Bibliografia

  1. Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Zhang, M., et al. G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).
  3. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. protein pathways. Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).
  5. Hepler, J. R., Gilman, A. G. G proteins. Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).
  6. Van Unen, J., et al. A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells. PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).
  7. Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
  8. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2411 (2001).
  9. Galés, C., et al. Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes. Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).
  10. Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors. Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).
  11. Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors. Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).
  12. Scott-Dennis, M., et al. Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors. Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).
  13. Violin, J. D., et al. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics. J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).
  14. Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics. Life Sci. 38, 309-315 (1985).
  15. Thomas, B. F., et al. Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists. J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).
  16. Schihada, H., et al. Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias. J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68463

Tagi

Aktywno GPCRtest BRETobrazowanie ywych kom rekaktywacja bia ka Gsygnalizacja stronnicza ligandup ytka 96 do kowakom rki HEK293Treceptor beta2 adrenergicznyreceptor kannabinoidowy CB1
Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.