Artykuł metodologiczny

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68469

⸱

17 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Streszczenie

Kinaza tyrozynowa 3 podobna do FMS (FLT3), kinaza tyrozynowa receptora klasy III, wykazuje częstość mutacji około 30% u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML) i stanowi krytyczny cel terapeutyczny. Jako reprezentatywne inhibitory FLT3 typu I i typu II, gilterytynib i chizartynib (AC220) są klinicznie stosowane w leczeniu AML z mutacją FLT3.

Gilterytynib hamuje zarówno aktywowane, jak i inaktywowane białka FLT3, z dodatkowym hamowaniem celów AXL, aby pomóc w przezwyciężeniu oporności. AC220 hamuje aktywowany FLT3. Test kometarny był systematycznie stosowany do ilościowego określania i porównywania wzorców uszkodzeń DNA indukowanych przez inhibitory FLT3 typu I i typu II w zmutowanych komórkach. Wyniki eksperymentów ujawniły, że uszkodzenia DNA spowodowane przez AC220 były znacznie wyższe niż te spowodowane przez gilterytynib. W przypadku silnych uszkodzeń DNA, inhibitory FLT3 można łączyć z inhibitorami naprawy uszkodzeń DNA, aby celować w defekty naprawy DNA. Wyniki stanowią eksperymentalne wsparcie dla racjonalnej strategii łączenia leków ukierunkowanych na uszkodzenia DNA.

Wprowadzenie

Ostra białaczka szpikowa (AML) stanowi klonalne zaburzenie hematopoetycznych komórek macierzystych definiowane przez patologiczną ekspansję niezróżnicowanych komórek progenitorowych szpiku, co prowadzi do zahamowania układu krwiotwórczego i niewydolności szpiku kostnego. Nieodłączna heterogeniczność molekularna AML stanowi poważne wyzwanie terapeutyczne1. Szczególne znaczenie kliniczne mają mutacje kinazy tyrozynowej 3 (FLT3) podobne do FMS, które stanowią jedną z najczęstszych zmian genetycznych w AML, występującą w około 30% przypadków i wykazują silną korelację z niekorzystnymi wynikami klinicznymi2. Kinaza tyrozynowa receptora FLT3 ulega aktywacji w błonie plazmatycznej, pośrednicząc w kaskadach sygnałowych PI3K/AKT i RAS/MAPK, podczas gdy wariant zmutowany FLT3-ITD jest zatrzymywany w retikulum endoplazmatycznym, indukując trwałą fosforylację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji 5 (STAT5). Te zmiany genetyczne napędzają leukemogenezę poprzez wiele mechanizmów onkogennych, głównie poprzez dysregulację transdukcji sygnału, niekontrolowaną sygnalizację proliferacyjną i oporność apoptotyczną3.

AC220 i gilterytynib, jako typowe inhibitory FLT3, hamują proliferację komórek i indukują apoptozę poprzez hamowanie ekspresji FLT3, ale o różnych mechanizmach działania. Gilterytynib (inhibitor typu I) nie tylko obejmuje szersze spektrum mutacji aktywujących FLT3, ale także hamuje kinazę tyrozynową AXL, która jest blisko spokrewniona z FLT3. Poprzez podwójne hamowanie, gilterytynib może blokować wzrost komórek rakowychw bardziej kompleksowy sposób4. AC220 (inhibitor typu II) wywiera działanie hamujące poprzez konkurencyjne wiązanie z aktywowaną konformacją kinazy, specyficznie ukierunkowaną na kieszeń wiążącą ATP z wysoką swoistością5. To hamowanie może prowadzić do zatrzymania cyklu komórkowego i zwiększonego stresu replikacji DNA.

Gilterytynib wiąże się z niskim ryzykiem wystąpienia oporności i jest wskazany do monoterapii w nawrotowej/opornej na leczenie AML z mutacją FLT3. AC220 jest skuteczny i selektywny w przypadku mutacji FLT3-ITD, z dobrymi wskaźnikami odpowiedzi klinicznej, ale jest nieskuteczny w przypadku mutacji FLT3-TKD i może być oporny na mutacje FLT3-TKD z powodu wtórnych mutacji FLT3-TKD (np. D835 lub F691L) na rozwój oporności. Inhibitory te zyskały na znaczeniu w terapiach AML w oparciu o wykazaną skuteczność kliniczną i ulepszone wskaźniki terapeutyczne6. Jednak kliniczne stosowanie tych leków jest utrudnione ze względu na nabytą oporność i efekty niezamierzone. Długotrwałe stosowanie AC220 w warunkach klinicznych prowadzi do oporności spowodowanej mutacjami FLT3-TKD, podczas gdy długotrwałe stosowanie gilterytynibu może mieć ograniczenia w przypadku mutacji złożonych (np. FLT3-ITD w połączeniu z TKD), nawet jeśli nie prowadzi do oporności z powodu mutacji FLT3-TKD 7,8.

Te dwie klasy inhibitorów FLT3 wywierają podwójny efekt terapeutyczny poprzez pośrednie wywoływanie stresu replikacyjnego poprzez hamowanie FLT3 i blokadę proliferacyjnego szlaku sygnałowego - sygnalizacji RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5. Blokada proliferacji komórek zwykle prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, zaburzeń metabolicznych (rozregulowania homeostazy redoks), a ostatecznie do apoptozy 9,10. Mechanizm ten ostatecznie generuje zmiany w DNA, które aktywują kompensacyjne adaptacje naprawy DNA w opornych populacjach komórek. Test kometarny umożliwia ilościowe porównanie specyficznych dla inhibitorów profili uszkodzeń DNA w komórkach z mutacją FLT3. To eksperymentalne podejście dostarcza kluczowych informacji dla opracowania racjonalnych terapii skojarzonych, które wykorzystują podatność na uszkodzenia DNA, pokonując w ten sposób nabytą oporność terapeutyczną.

Współczesne metodologie wykrywania uszkodzeń DNA obejmują analizę immunohistochemiczną, elektroforezę fragmentów DNA w żelu agarozowym, reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), z których każda wykazuje wysoką czułość analityczną i swoistość11. Podejścia te są jednak ograniczone znacznymi wymaganiami finansowymi, wydłużonym czasem przetwarzania i rygorystycznymi warunkami eksperymentalnymi. Podkreśla to konieczność przyjęcia strategii wykrywania, które równoważą precyzję analityczną z prostotą obsługi.

Test komety jest szeroko stosowany w toksykologii środowiskowej i ocenie genotoksyczności ze względu na jego doskonałą czułość, dostępność techniczną, wizualizację ilościową uszkodzeń DNA i szerokie zastosowanie w systemach biologicznych12,13. Ustalono trzy główne warianty metodologiczne: alkaliczny test kometaryczny do wykrywania pęknięć jedno/dwuniciowych, neutralny test kometaliczny do analizy pęknięć dwuniciowych oraz test kometarny modyfikowany enzymatycznie do identyfikacji specyficznych zmian w DNA. 14

Zasada metodologiczna obejmuje: (1) indukcję pęknięć nici DNA poprzez leczenie eksperymentalne; (2) Rozpuszczanie błon komórkowych i jądrowych za pośrednictwem buforu lizy, umożliwiające dyfuzję białek cytoplazmatycznych / jądrowych i RNA do buforu elektroforezy, podczas gdy DNA o dużej masie cząsteczkowej pozostaje unieruchomione w matrycy agarozowej; (3) Denaturacja alkaliczna (pH > 13) indukująca odwijanie DNA i uwalnianie uszkodzonych fragmentów DNA; (4) Elektroforetyczna migracja anodowa rozdrobnionego DNA napędzana polem elektroforycznym, tworząca charakterystyczną morfologię komety, z nienaruszonym DNA zachowującym sferyczną strukturę nukleoidową15,16. Kwantyfikacja uszkodzeń DNA jest osiągana poprzez komputerową analizę procentowego DNA ogona (TDP), zapewniając precyzyjny pomiar wpływu genotoksycznego w rozdzielczości pojedynczej komórki17.

W badaniu wykorzystano systematyczne ramy eksperymentalne w celu porównania zróżnicowanych genotoksycznych skutków gilterytynibu i AC220 w zwalidowanych komórkach 32D z mutacją FLT3. Projekt eksperymentalny składał się z dwóch głównych elementów: (i) ustanowienia modelu uszkodzenia DNA specyficznego dla mutacji FLT3 oraz (ii) ilościowej oceny uszkodzeń DNA wywołanych przez lek za pomocą metodologii alkalicznego testu kometowego. Linia komórkowa 32D z mutacją FLT3 była utrzymywana w standardowych warunkach in vitro przed ekspozycją na seryjnie rozcieńczane inhibitory FLT3. Żywotność komórek oceniano za pomocą testów CCK-8, a następnie obliczono wartości połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50) za pomocą analizy regresji nieliniowej. Jako próg indukcji uszkodzenia DNA wybrano pięciokrotną wartość IC50 . Komórki poddane działaniu leku pobrano i osadzono w agarozie o niskiej temperaturze topnienia na szkiełkach w celu późniejszej analizy. Separację elektroforetyczną przeprowadzono przy napięciu 24 V (~0,74 V/cm) i ciśnieniu 300 mA przez 30 minut w buforze alkalicznym, podczas którego fragmentaryczne DNA migrowało anodowo, tworząc charakterystyczną morfologię komety, podczas gdy nienaruszone DNA zachowywało sferyczną konfigurację nukleoidu. Kwantyfikacja uszkodzeń DNA została osiągnięta za pomocą skomputeryzowanego projektu oprogramowania do analizy obrazu (CASP) mierzącego moment warkoczący, przy czym zwiększone wartości momentu ogona Olive były bezpośrednio skorelowane z zakresem fragmentacji DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Budowa modelu uszkodzeń DNA w komórkach 32D z mutacjami FLT3-ITD 18

  1. Odzyskiwanie komórek
    1. Za pomocą kleszczy szybko przenieś kriokonserwowane zmutowane komórki 32D FLT3-ITD (przechowywane w temperaturze -80 °C). Pobrać kriowiale za pomocą kleszczy i natychmiast zanurzyć je w łaźni wodnej o regulowanej temperaturze (37 °C ± 0,5 °C) dokładnie na 60 sekund, aby zakończyć kontrolowane rozmrażanie.
      UWAGA: Podczas rozmrażania należy z przerwami potrząsać kriowialiami w łaźni wodnej, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.
    2. Odwirować kriokonserwowane próbki w temperaturze 150 × g przez 5 minut w temperaturze 25 °C ± 1 °C. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą sterylnych pipet serologicznych, zachowując osad komórkowy.
    3. Dodać 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej (RPMI 1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 1% penicyliny/streptomycyny) do probówki do kriokonserwacji. Przeprowadzić delikatne rozcieranie przez 10 kolejnych cykli pipetowania (objętość 1 ml), aby zapewnić całkowite ponowne wymieszanie. Przenieść zawiesinę komórkową do naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i dodać 7 ml kompletnej pożywki, aby uzyskać końcową objętość 8 ml.
    4. Delikatnie poruszyć naczynie hodowlane pięcioma ruchami poziomymi i pięcioma ruchami obrotowymi. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37,0 °C ± 0,2 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95%. Inkubować przez 24 godziny przed przetwarzaniem eksperymentalnym.
  2. Ocena żywotności komórek
    1. Wybierz do eksperymentu zmutowane komórki 32D FLT3-ITD w logarytmicznej fazie wzrostu o dobrym statusie komórkowym.
      UWAGA: Komórki w logarytmicznej fazie wzrostu mają zwykle krótki cykl podziału i wysoką częstotliwość podziałów komórkowych.
      1. Obserwuj morfologię i stan wzrostu komórek 32D z mutacją FLT3-ITD za pomocą mikroskopu elektronowego. Upewnij się, że spełnione są kryteria progów proliferacji komórkowej: Szukaj komórek che, które mają postać pojedynczej kuleczki o gładkich krawędziach, jednolitej dyspersji, niewielu agregatach, jednolitym rozmiarze komórki, nienaruszonej integralności błony plazmatycznej i szczątkach komórkowych < 5%.
    2. Użyj licznika komórek, aby określić stężenie zawiesiny komórek.
      UWAGA: Wymieszaj zawiesiny komórek (10 kolejnych cykli pipetowania przy użyciu sterylnych końcówek o pojemności 1 ml przy maksymalnej prędkości pipety 50%).
    3. Standaryzacja zawiesiny komórek do 2,0 × 105 komórek/ml w kompletnej pożywce wzrostowej przy użyciu iteracyjnego rozcieńczania. Za pomocą pipety dozować 50 μl porcji do studzienek centralnych (B2-G7) 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. Napełnij studzienki peryferyjne (A1-H12) 100 μl sterylnego PBS, aby utrzymać wilgotność i zminimalizować efekt parowania krawędzi.
    4. Przygotowanie pożywki zawierającej inhibitor FLT3: Wybierz dziewięć studzienek na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i oznacz je zgodnie z drabinką stężeń inhibitora FLT3 (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 i 1000 nM). Dodać 400 μl kompletnej pożywki do studzienek oznaczonych 10,0 μM i 200 μl kompletnej pożywki do pozostałych studzienek.
      1. Rozcieńczenie gilterytynibu: Dodać 4 μl 100 μM odczynnika gilterytynibu (gilterytynib w dimetylosulfotlenku) do każdej z studzienek oznaczonych 1000 nM za pomocą pistoletu do pipet i dokładnie wymieszać roztwór. Pobrać pipetą 200 μl 1000 nM gilterytynibu do studzienek oznaczonych 500 nM i wymieszać; następnie odpipetować 200 μl 500 nM gilterytynibu do studzienek oznaczonych 250 nM i wymieszać. Za każdym razem należy pobrać 200 μl poprzedniego rozcieńczenia do następnego dołka i wymieszać do uzyskania pożądanego stężenia.
      2. Rozcieńczenie AC220: Dodać 4 μl 100 μM odczynnika AC220 (AC220 w dimetylosulfotlenku) do każdej z studzienek oznaczonych 1000 nM za pomocą pistoletu do pipet. Postępuj zgodnie z krokiem 1.2.4.1 dla pozostałych studzienek.
        UWAGA: Upewnij się, że podstawowy roztwór inhibitora FLT3 w pipecie został całkowicie przeniesiony do studzienek, aby uniknąć resztek roztworu. Upewnij się, że roztwór jest dobrze wymieszany przed przystąpieniem do rozcieńczania.
    5. Inkubacja: Dozować pożywkę zawierającą inhibitor FLT3 do wyznaczonych studzienek (50 μl/studzienkę) za pomocą pipety. Utrzymywać 96-dołkową płytkę w fizjologicznych warunkach hodowli (37,0 °C ± 0,2 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) dokładnie przez 72 godziny ± 15 minut.
    6. Podwielokrotność 10 μl odczynnika CCK-8 do wszystkich studzienek doświadczalnych i ślepej próby kontrolnej za pomocą pipety. Chronić płytkę przed światłem i inkubować ją w warunkach normoksyjnych (37 °C, 5% CO2 ) przez 2,0 H ± 10 min.
      UWAGA: Dozuj odczynnik z niską prędkością pipety z końcówką o głębokości zanurzenia 2 mm, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas dodawania próbki, aby zapobiec zakłóceniom odczytów średnicy zewnętrznej.
    7. Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Zapisz wyniki.
    8. Obliczyć % inhibicji zgodnie ze wzorem obliczeniowym IC50 :
      Hamowanie (%) = Equation for MTT assay analysis, showing optical density (OD) measurement calculation formula. × 100%
      Studzienka eksperymentalna leku oznacza studzienki komórkowe poddane działaniu leku. Kontrola komórkowa dobrze oznacza studzienki komórkowe, które nie były leczone lekiem. Ślepe studzienki kontrolne wskazują tylko podłoże bez komórek.
    9. Analizuj znormalizowane dane dawka-odpowiedź za pomocą regresji nieliniowej, wykorzystując czteroparametrowy model logistyczny. Kliknij przycisk Dopasowanie krzywej, aby dopasować krzywą. Wyprowadź połówkę maksymalnego stężenia hamującego (IC50) ze zbieżności modelu (R2 > 0,98, reszta sumy kwadratów < 0,15) i oblicz 95% przedziały ufności za pomocą 1000-iteracyjnego ponownego próbkowania bootstrap.
  3. Eksperyment uszkodzenia DNA komórek 32D z mutacją FLT3-ITD indukowaną przez inhibitor FLT3
    1. Wybierz zmutowane komórki 32D FLT3-ITD wykazujące gwałtowny wzrost (czas podwojenia populacji < 24 godziny) do oceny uszkodzeń DNA.
    2. Policz komórki (szczegółowe informacje znajdują się w kroku 1.2.2).
    3. Wysiew komórek: Dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 1 × 106 komórek na naczynie, używając naczynia o średnicy 6 cm i 4 ml zawiesiny komórek na szalkę.
    4. Przygotować trzy kontrpróby dla każdego stężenia inhibitora: 55 nM gilterytynib: 4 ml pożywki + 2,2 μl 100 μM podstawy, 0,15 nM AC220: 4 ml pożywki + 6 μL 100 nM podstawy. Roztwory należy mieszać wirowo i równoważyć je w temperaturze 37 °C przez 15 minut; Delikatnie potrząśnij probówkami, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie. Odessać oryginalną pożywkę i zastąpić ją 4 ml na naczynie świeżo przygotowanej pożywki zawierającej inhibitory za pomocą sterylnych pipet serologicznych.
    5. Inkubować leczone komórki w warunkach fizjologicznych (37 °C, 5% CO2 , 95% wilgotności) w określonych odstępach czasu (0, 2, 4, 6 H). Natychmiast przeprowadź kontrolę czasu zerowego w celu oceny uszkodzeń DNA na linii bazowej.
    6. Test wykluczania błękitu trypanowego
      1. Odwirować zebrane komórki pod ciśnieniem 150 × g przez 1 minutę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml pożywki hodowlanej.
      2. Odpipetować 100 μl zawieszonych komórek do plastikowej probówki wirówkowej, dodać 100 μl barwnika trypanowego (2x), delikatnie wymieszać i barwić przez 3 min.
      3. Policz komórki (szczegółowe informacje znajdują się w kroku 1.2.2).
      4. Oblicz żywotność komórek w następujący sposób:
        %Przeżycie komórki = Cell viability calculation formula; equation for assessing viable cell proportion in sample analysis. × 100%
        UWAGA: Tylko próbki o żywotności ≥90% zostały przetworzone do testu komety.

2. Przygotowanie odczynnika i przygotowanie próbki komórki

  1. Równoważyć roztwór do lizy (zawierający 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO) w temperaturze 4 °C ± 0,5 °C przez 30 minut w lodówce.
  2. Rozpuść niskotopliwą agarozę (LMA) w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie przechowuj ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby zapobiec zestaleniu.
  3. Przygotować alkaliczny bufor do elektroforezy (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) przez zważenie 12 g NaOH za pomocą wagi elektronicznej, pipetowanie 2 ml 500 mM roztworu EDTA, a następnie dodanie ddH2O w celu uzupełnienia do 1 l buforu.
  4. Pobieranie komórek
    1. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesiny komórkowe o masie 800 × g przez 5 minut. Odessać supernatanty za pomocą filtracji próżniowej.
      1. Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze 1 ml, a następnie wykonać 10 pionowych inwersji.
      2. Policz komórki jak w kroku 1.2.
      3. Odwirować zawiesinę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml o masie 150 × g przez 5 minut, aby usunąć całe podłoże. Ponownie zawiesić umyte komórki w bezwapniowym PBS do ~5,0 × 105 komórek/ml.

3. Procedura oznaczania komety

  1. Wcześniej przygotuj preparaty testowe komet i próbki komórek. Za pomocą pipety przygotować mieszaninę agarozy LMA i zawiesiny komórek (5 × 105 komórek/ml) w probówkach o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszać. Dozować 55 μl porcji mieszaniny agarozy i komórek na szkiełka komety za pomocą pipety umieszczonej pod kątem 45°, zachowując odległość 2 mm od powierzchni szkiełka. Umieścić szkiełka pokryte mieszaniną w temperaturze 4 °C na 30 minut, aby uniknąć światła.
    UWAGA: Podczas dodawania mieszaniny LMA i komórek do szkiełek testowych komety, należy dozować zawiesinę powoli i równomiernie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków i zapewnić jednorodny rozkład żelu.
  2. Zanurzyć zestalone szkiełka w wstępnie schłodzonym roztworze do lizy (zawierającym 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO) i przeprowadzać lizę przez ≥1 H w temperaturze 4 °C w warunkach ochrony przed światłem.
  3. Po lizie wyjmij szkiełko z lizatu i użyj pistoletu do pipet, aby zassać jak najwięcej płynu wokół łopatki. Następnie umieścić szkiełko w alkalicznym buforze do elektroforezy (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) i wstępnie zrównoważyć przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, uważając, aby nie dopuścić do światła.
  4. Elektroforeza: Umieść szkiełka w komorze do elektroforezy i dodaj wystarczającą ilość alkalicznego roztworu elektroforetycznego, aby zanurzyć szkiełka. Przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 24 V (odpowiednik 0,74 V/cm) stałym prądem (300 mA) przez 30 minut przy użyciu wstępnie zrównoważonego buforu (4 °C) w celu zminimalizowania uszkodzeń DNA.
  5. Neutralizacja: Po elektroforezie za pomocą pistoletu do pipet odessać alkaliczny roztwór elektroforezy ze szkiełka, zanurzyć szkiełka na 2 x 5 min wdH2O, a następnie zanurzyć je w 70% etanolu na 5 min. Suszyć szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  6. Barwienie: Nałożyć 100 μl podwielokrotności 1x barwnika kwasem nukleinowym YeaRed na dołek i inkubować przez 30 minut w temperaturze otoczenia w warunkach ochrony przed światłem. Nadmiar plamy usunąć poprzez delikatne spłukiwanie wodne, a następnie suszenie termiczne w temperaturze 37 °C.
  7. Obrazowanie: Wykonaj wizualizację fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 4x, z cyfrową akwizycją obrazu przeprowadzoną w znormalizowanych warunkach ekspozycji.

4. Przetwarzanie danych

  1. Wykonaj ilościową analizę obrazu, aby określić standardowe parametry komety, w tym DNA warkocza (%), moment warkocza oliwkowego i długość warkocza (μm).
    1. Otwórz interfejs oprogramowania (Rysunek 5).
    2. Zaimportuj obraz do oprogramowania, kliknij przycisk Plik, a następnie kliknij przycisk Wybierz plik , aby zaimportować obraz, który chcesz przeanalizować do oprogramowania. Następnie przytrzymaj przycisk myszy i przeciągnij, aż pojawi się niebieskie pole. Przeciągnij niebieskie pole, aby upewnić się, że komórka, którą chcesz przeanalizować, jest w nim zamknięta. Opcja Dopasuj na rysunku może służyć do dostosowywania położenia ramki w taki sposób, aby obejmowała całą komórkę (Rysunek 5).
    3. Przed rozpoczęciem analizy kliknij przycisk Uruchom, a następnie kliknij przycisk Analiza. Wyniki analizy pojedynczej komórki zostaną wyświetlone po prawej stronie w sekcji "Profile". Po przeanalizowaniu każdej komórki kliknij przycisk Zapisz. Parametry, które można wykryć, są wyświetlane po prawej stronie "Profili", a wartości liczbowe różnych parametrów są wyświetlane na dole. Na koniec kliknij Plik | Eksport wyników. Uzyskane wyniki obejmują HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment i OliveTailMoment.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test kometarny był systematycznie stosowany do ilościowego określania zróżnicowanych profili uszkodzeń DNA indukowanych przez gilterytynib i AC220 w liniach komórkowych z mutacją FLT3. Analizy wykazały, że różnica w uszkodzeniach DNA między populacjami komórek nieleczonych gilterytynibem i AC220 nie była statystycznie istotna (P > 0,05). Zależne od dawki zwiększenie wartości Tail DNA (%) i Olive Moment Tail (OMT) osiągnęło istotność statystyczną (P < 0,05) po 2-6 godzinach ekspozycji. OMT oznacza iloczyn % DNA w og...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test komety stanowi znaczący postęp w metodologiach oceny genotoksyczności. Technika ta oferuje wyraźne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami dzięki dostępności technicznej, rozdzielczości pojedynczej komórki i bezpośredniej wizualizacji wzorców uszkodzeń za pomocą elektroforetycznych profili migracji. W ramach rozwoju terapeutycznego AML test kometa umożliwia systematyczną ocenę profili genotoksycznych potencjalnych czynników podczas docelowych faz walidacji, dostarczając krytycznych danych farmakodynamiczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Innowacyjny Zespół Badawczy ds. Nauki i Technologii Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (2021), Program Centrum Badań nad Technologią Inżynieryjną Jiangsu Vocational College (2023), Program Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych Prowincji Zhejiang (2025KY1861), Podstawa Klucza Nauk Przyrodniczych Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu w Chinach (Grant nr 24KJA310008), Programy Wyższej Szkoły Zdrowia Zawodowego w Suzhou (Grant Nr. SZWZYTD202201, szwzy202406) oraz Projekt Państwowego Kluczowego Laboratorium Medycyny i Ochrony przed Promieniowaniem Uniwersytetu Soochow (GZK12023013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 mln EDTABeyotimeZobacz materiał ST066
1x barwnik kwasu nukleinowego YeaRedYeasen powiedział:Numer katalogowy 10202ES
KOMÓRKA 32DCobioerCBP60995
Zobacz materiał AC220CelMolZobacz materiał T2066 TGL
Zestaw do liczenia komórek-8Dojindo powiedział:CK04 powiedział:
Płytka do liczenia komórekQiuJing powiedział:XB-K-25
Inkubator CO2Thermo51032872
Projekt oprogramowania do oznaczania komety (CASP)
Zestaw do oznaczania komety Trevigen powiedział:4250-050-TYS.
Cytat 5BioTek16280004
FBS (Sieć UsługowaPATELNIAZobacz materiał ST30-3302
GilterytynibCelMolZobacz materiał T4409 TGL
GraphPad Pryzmat 9.0
Wirówka szybkoobrotowaThermo  Zobacz materiał 9AQ2861 powiedział:
Pipety L-1000XLS+Rainin17014382
Pipety L-20XLS+Rainin17014392
zbiornik ciekłego azotuMvecryoge powiedział:YDS-175-216
Fotometr mikropłytkowy Multiskan FCThermo1410101
Na2OHDAMAO (Język DAMAO)1588
PBSSolarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał P1020
Roztwór penicyliny i streptomycyny, 100xBeyotimeZobacz materiał C0222
RPMI 1640 średniGibco (firma Gibco)C22400500BT
Trójokularowy mikroskop żywych komórekMotic1.1001E+12
Zamrażarka niskotemperaturowaWłosyV118574

Bibliografia

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki z mutacj FLT3ostra bia aczka szpikowainhibitory typu Iinhibitory typu IIocena genotoksyczno citerapia skojarzonaelektroforeza w warunkach zasadowych

Powiązane artykuły