Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Summary

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Abstract

Produkty naturalne stanowią bogate źródło związków terapeutycznych z zastosowaniami w wielu chorobach, szczególnie w nowotworach. Wykorzystując te biomolekuły jako strukturalne szablony podczas odkrywania leków, naukowcy osiągnęli zarówno szybsze harmonogramy rozwoju, jak i poprawę skuteczności biologicznej w porównaniu z w pełni syntetycznymi związkami. Szlak syntezy białek stał się ważnym celem dla produktów naturalnych, zwłaszcza biorąc pod uwagę jego udział w trudnych do leczenia nowotworach. Silny inhibitor syntezy białek, cykloheksymid, pochodzący ze Streptomyces griseus, ilustruje potencjał naturalnych związków w tej dziedzinie. W miarę jak te pochodne produktów naturalnych są rozwijane w cząsteczki przypominające leki, potwierdzenie ich aktywności hamującej syntezę białek pozostaje kluczowym krokiem walidacyjnym. Głównym celem jest zapewnienie przyjaznego studentom licencjackiego protokołu umożliwiającego szybką ocenę aktywności hamowania związków związkowych. Protokół wykorzystuje fluorescencyjne podłoże oraz zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej do systematycznego wykrywania i mierzenia właściwości hamujących tych naturalnych produktów. Badanie obejmowało związki pochodzące z dwóch gatunków roślin: Pinus sylvestris i Psoralea corylifolia. Stosując cykloheksimid jako inhibitor referencyjny, oba produkty naturalne wykazywały różne poziomy hamowania syntezy białek.

Introduction

Synteza białek obejmuje ściśle regulowane procesy: transkrypcję i translację. Podczas transkrypcji kopiowane są sekwencje DNA genów, tworząc mRNA posłańca (mRNA). Enzym polimeraza RNA pracuje w celu rozdzielenia podwójnej helisy DNA i wykorzystuje jedną nić jako przewodnik do budowy dopasowanej cząsteczki mRNA. Gdy mRNA jest w pełni uformowane, przemieszcza się z jądra do cytoplazmy w celu translacji. Translacja zachodzi w rybosomie, gdzie mRNA służy jako szablon do składania aminokwasów w łańcuch polipeptydowych. Ten łańcuch polipeptydowy po opuszczeniu tunelu wyjściowego rybosomu zostaje złożony w białko funkcjonalne. Transkrypcja jest regulowana głównie przez czynniki transkrypcyjne, modyfikacje chromatyny oraz regulacyjne RNA, natomiast translacja jest regulowana przez czynniki inicjacyjne, szlaki sygnalizacyjne i mechanizmy stabilności RNA. Te systemy regulacyjne pozwalają komórkom skutecznie utrzymywać funkcje komórkowe i reagować na stres lub uszkodzenia¹.

Zdecydowana większość nowotworów u ludzi — około 85% — objawia się jako guzy lite². Chociaż guzy te mogą się znacznie różnić pod względem cech i zachowań, mają tendencję do wspólnych cech fizjologicznych i wzorców, takich jak zwiększona synteza białek, niezależnie od etiologii czy pozycji anatomicznej³. Komórki nowotworowe dysregulują syntezę białek, przejmując mechanizmy translacyjne, aby wspierać wysokie zapotrzebowanie energetyczne i niekontrolowany wzrost. To przeprogramowanie jest wynikiem dysregulacji niemal wszystkich głównych onkogennych szlaków sygnalizacyjnych, co sprzyja przetrwaniu komórek, ich proliferacji i przerzutom, jednocześnie hamując szlaki śmierci komórkowej⁴. W komórkach nowotworowych mechanizmy tworzenia rybosomów wchodzą w nadzwyciężoną ekspresję, umożliwiając zwiększaną produkcję białek i szybki podział komórek. Ponieważ ta zwiększona synteza białek jest kluczowa dla przeżycia w raku, leczenie ukierunkowane i blokujące ten proces wykazują obiecujące możliwości jako potencjalne terapie⁵. Dlatego badania koncentrujące się na specyficznych dla raka czynnikach translacyjnych, unikalnym składzie rybosomalnym lub zmienionych szlakach sygnalizacyjnych regulujących syntezę białek mogłyby przynieść bardziej ukierunkowane inhibitory z lepszymi oknami terapeutycznymi.

Ponieważ produkty naturalne (NP) są znane ze swojej szerokiej aktywności biologicznej, opracowanie selektywnych inhibitorów syntezy białek do leczenia nowotworów z wykorzystaniem ich rusztowania jest obiecującym podejściem ^6,7. NP mogą celować w różne składniki mechanizmu syntezy białek, od wiązania rybosomów po zakłócenia czynników inicjacyjnych czy procesy wydłużania, co czyni je nieocenionymi punktami wyjścia w rozwoju leków do inhibitorów syntezy białek w guzach litych⁶. Możliwość szybkiego przesiewania związków pod kątem pożądanej aktywności stanowi kluczowy punkt wejścia dla platform odkrywania leków, które chcą efektywnie identyfikować trafienia NP. Zazwyczaj wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków wykorzystują testy fluorescencji, aby szybko zawęzić wybór cząsteczek kandydatów na ołów⁸.

Naukowcy na całym świecie polegają na technikach opartych na fluorescencji jako kluczowych narzędziach do analizy systemów biologicznych. Te podejścia są szeroko stosowane do badania procesów komórkowych, umożliwiając badaczom śledzenie interakcji biomolekularnych^{w czasie rzeczywistym}. W połączeniu z bioortogonalnymi reakcjami klikowej chemii metody te umożliwiają precyzyjną wizualizację syntezy białek¹⁰. Prezentowany test syntezy białek fluorescencyjnych to nieradioaktywna technika oceny syntezy białek, wykorzystująca O-propargyl-puromycynę (OPP), przepuszczalny dla komórek alkinowy analog puromycyny. Po leczeniu komórkowym OPP zostaje włączony na końcu C wydłużających się łańcuchów polipeptydowych, powodując przerwanie translacji. Te białka skrócone znakowane alkinami są następnie wykrywane za pomocą chemii klikowej katalizowanej miedzią sprzężonej z 5 FAM-azydami.

Ten test fluorometryczny jest cennym narzędziem badawczym i dostępną metodą biologii chemicznej do kształcenia studentów studiów licencjackich. Dzięki zapewnieniu dostępnego, wydajnego protokołu z minimalnym przetwarzaniem danych, zapewnia studentom praktyczne doświadczenie w nowoczesnych technikach odkrywania leków i przyspiesza proces odkrywania leków. Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na nowe inhibitory syntezy białek, takie podejście wyposaża studentów licencjackich w znaczące możliwości badawcze, jednocześnie przyczyniając się do postępu w terapii onkologicznej.

Protocol

1. Przygotowanie odczynników z zestawu

UWAGA: Odpowiednio wymieszać, odkręcać i trzymać wszystkie odczynniki na lodzie do czasu użycia.

1. Zorganizować i pozyskać zestaw hamujący syntezę białek, bufor PBS, pożywkę do hodowli komórkowej, płytki obtraktowane hodowlą, stożkowe rurki do wirówki polipropylenowej o pojemności 15 mL, rurki wirówki o pojemności 2 mL, pipety p10, p20, p200 i p1000 oraz odpowiednie końcówki.
2. Przygotuj bufor do mycia.
   1. Rozmroź bufor 10x w temperaturze 37 °C, obejmując fiolkę w dłoni. Używaj ciepła ciała w dłoniach do rozmrażania i często sprawdzaj, czy rozmrażanie jest zakończone.
   2. Rozcieńcz 10x zapasy bufora płukania w stosunku 1:10 w wodzie zdejonizowanej w rurce wirówki. Mieszaj przez inwersję lub ponowną suspensję przez pipetowanie w górę i w dół. Przechowywać w lodzie do czasu użycia.
3. Rozmraź roztwór utrwalający w temperaturze pokojowej. Przechowywać w lodzie do czasu użycia.
4. Przygotuj bufor permeabilizacyjny.
   1. Rozmroź 10-krotny bufor permeabilizacyjny w temperaturze 37 °C, chwytając fiolkę w dłoni. Używaj ciepła ciała w dłoniach do rozmrażania i często sprawdzaj, czy rozmrażanie jest zakończone.
   2. Rozcieńcz 10x zapas 1:10 w wodzie dejonizowanej w rurce wirówki. Mieszaj składniki przez odwrócenie lub ponowne zawieszenie pipetowaniem w górę i w dół. Przechowywać w lodzie do czasu użycia.
5. Rozmrozić 400x białkowy znak, 100x fluorescencyjny azyd, 100x cykloheksymid, barwnik DNA i 20x reduktor w temperaturze pokojowej. Trzymaj na lodzie w ciemnym środowisku podczas użytkowania. Przykryj barwniki folią lub przechowuj je w lodówce o temperaturze 2°C, gdy nie są używane.

2. Kontrola znakowania i komórki eksperymentalne

UWAGA: Protokół ten został opracowany przy użyciu stabilnych, przylegających komórek nabłonkowego raka piersi MDA-MB-231. Można użyć dowolnych linii komórek przylegających. Wszystkie poniżej wymienione kroki wykorzystują płytę z 96 dołkami, a wszystkie objętości i stężenia są obliczane dla dwóch związków testowych i dwóch kontrolnych o objętości roboczej 100 μL.

1. Hodowanie komórek ssaków przylegających
   UWAGA: Komórki powinny być przepuszczane przed osiągnięciem 80-90% konfluencji, aby utrzymać zdrowy, wykładniczy wzrost i zapobiec hamowaniu lub różnicowaniu kontaktu.
2. Rozmroź fiolkę z komórkami krioprezerwacji do temperatury pokojowej, a następnie rozcieńcz odpowiednim medium.
3. Wiruj zawiesinę, aby rozpylić komórki i zasysać supernatant. Ponownie zawiesić pellet w świeżym medium i przenieść go do nowej kolby o odpowiedniej gęstości komórek.
4. Gdy komórki są w 80% zbiegnięte, usuń podłoże i aspiruj medium starego wzrostu z kolby. Następnie płucz komórki sterylnym PBS, aby usunąć surowicę resztkową, która hamuje trypsynę. Dodaj roztwór trypsyny-EDTA, aby pokryć warstwę komórkową i inkubuj przez 3-5 minut lub do momentu odłączenia się komórek w temperaturze 37 °C.
5. Dodaj kompletne medium zawierające surowicę, aby inaktywować trypsinę, następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki, delikatnie wymieszaj i policz komórki.
6. Komórki nasienne na płytkach przesiewowych rozcieńczają komórki w odpowiednim stosunku podziału (np. 1:3 lub 1:5) do świeżych kolb z nowym medium i inkubują (zazwyczaj 37 °C, 5%_CO2), aby uzyskać pożądane stężenie komórek.
   UWAGA: W przypadku opisanego tutaj eksperymentu linia komórkowa została pokryta w temperaturze 2 × 10^°4 na dołek (płytka 96-dołkowa) i inkubowana w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.

3. Dodawanie związków

1. Przygotuj mieszankę główną A.
   1. Oznacz rurkę wirówki jako "A". Pipeta 598,5 μL podłoża hodowlanego i 1,5 μL białka do "A". Ponownie zawiesij mieszankę, aby zapewnić jednorodność, pipetując w górę i w dół.
2. Przygotuj mieszankę master B.
   1. Oznacz rurkę wirówki jako "B". Pipeta 1,5 μL białkowego znaku, 6,6 μL cykloheksymidu oraz 591,9 μL medium hodowlanego do "B". Ponownie zawiesij mieszankę, aby zapewnić jednorodność, pipetując w górę i w dół.
3. Lecz komórki pożądanymi związkami (Rysunek 1), kontrolą dodatnimi i negatywnymi.
   1. Usuń komórki z inkubatora i usuń podłoże za pomocą aspiracji. Przechyl płytkę i zasysaj z boku dołka zamiast w środku, aby zapobiec zakłóceniom komórek.
   2. Pipeta włóż 1 μL substancji testowej do odwiertu i 1 μL pojazdu testowego (0,1% v/v DMSO) do odwiertu. W przypadku badań podwójnych dodaj każdą próbkę do drugiego dołka i powtórz ten proces. Do tych otworów dodaj 99 μL mieszanki głównej A. Delikatnie pipetuj pod kątem w stronę boku, aby zapobiec zakłóceniom kinetycznym komórek.
      UWAGA: Maksymalne stężenie DMSO w badaniach przesiewowych złożonych zależy od typu komórki i testu, ale ogólne wytyczne to: 0,1-0,5% DMSO – ogólnie bezpieczne dla większości testów komórkowych o minimalnej toksyczności oraz 1% – DMSO – maksymalnie i akceptowalne dla wielu typów komórek w testach krótkoterminowych.
   3. Pipeta 100 μL mieszanki B do dwóch wgłębień. Pipetę podkładaj pod kątem do boku dołka, aby zapobiec zakłóceniu komórek.
   4. Delikatnie stuknij w płytę, aby uzyskać włączenie pożądanych składników do komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 0,5-2 godziny.

4. Zakończenie eksperymentu i płukanie komórek

1. Usuń podłoże przez aspirację. Przechyl płytkę i zasysaj z boku dołka zamiast w środku, aby zapobiec zakłóceniom komórek.
2. Dodaj 100 μL buforu PBS do każdego dołka i wiruj płytę w 900 × g przez 5 minut.
3. Usuń bufor PBS przez aspirację.

5. Fiksacja i permeabilizacja

1. Dodaj 100 μL roztworu utrwalającego do każdej dołki. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemnym środowisku.
2. Usuń roztwór utrwalający przez aspirację. Przechyl płytę i zasysaj z boku studni zamiast na środku.
3. Płucz komórki 100 μL buforu i usuwaj bufor przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy.
4. Dodaj 100 μL buforu permeabilizacyjnego do każdego dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
5. Usuń bufor permeabilizacyjny przez aspirację. Przechyl płytę i zasysaj z boku studni zamiast na środku.

6. Reakcja białkowa i barwienie

1. Przygotuj mieszankę koktajli reakcyjnych.
   1. Dodaj 651 μL buforu PBS, 7,0 μL 100x miedziowego odczynnika, 7 μL azydu fluorescencyjnego oraz na koniec 35 μL środka redukującego do rurki wirówki. Ponownie zawiesij tę mieszankę, aby zapewnić jednorodność.
      UWAGA: Stosuj się dokładnie do tej kolejności przy dodawaniu odczynników. Użyj w ciągu 15 minut od przygotowania.
2. Dodaj 100 μL koktajlu reakcji do każdego dołku. Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym środowisku, aby zapobiec fotobieleniu.
3. Ogniwa wirówkowe na 900 × g przez 5 minut. Zrównoważ wirówkę, dodając puste talerze, aby równomiernie rozłożyć ciężar. Usuń mieszankę przez aspirację.
4. Płucz komórki 100 μL buforu i usuwaj bufor przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy.

7. Barwienie DNA

1. Przygotuj 1-krotne rozcieńczenie całkowitego barwienia DNA i dodaj 100 μL do każdego dołku. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemnym środowisku, aby zapobiec fotobieleniu.
2. Wiruj płytę w 900 × g przez 5 minut. Zrównoważ wirówkę, dodając puste talerze, aby równomiernie rozłożyć ciężar. Usuń mieszankę przez aspirację.
3. Płucz komórki 100 μL buforu i usuwaj bufor przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy.
4. Ponownie zawiesz komórki 100 μL schłodzonego buforu PBS, aby przygotować je do obrazowania.

8. Obrazowanie

1. Włóż płytkę do czytnika tablic.
2. Ustaw powiększenie na 20x.
3. Przeanalizuj barwienie jądra za pomocą kanału GFP 469/525 nm. Używaj automatycznego binowania i autofocusa, aby poprawić wyniki obrazowania.
4. Przeanalizuj aktywną syntezę białek za pomocą kanału Texas Red 586/647nm. Używaj automatycznego binowania i autofocusa, aby poprawić wyniki obrazowania.

Results

Test ten wykorzystał fluorescencję do wizualizacji i ilościowej zdolności różnych naturalnych produktów do hamowania syntezy białek. Cykloheksimid (CHX) to znany inhibitor syntezy białek, którego sposób działania polega na zakłócaniu procesu translokacji podczas wydłużania¹¹. W tym badaniu wykryto żywe komórki za pomocą zielonego, fluorescencyjnego barwnika jądrowego. OPP to pochodna puromycyny, która kowalencyjnie wiąże się z młodymi białkami¹². Linia komórkowa MDA-MB-231 ...

Discussion

Protokół ten zapewnia fluorometryczną metodologię przesiewania do testowania produktów naturalnych i małych cząsteczek w celu oceny ich zdolności do hamowania syntezy białek. Prostota tego protokołu pozwala studentom naukowcom na poprawne wdrożenie go, co pozwala im wnosić istotny wkład w wiedzę naukową. Protokół wymaga podstawowego zrozumienia metod i technik biologicznych, a kroki wymagają starannego wykonywania, aby zapewnić dokładne i wiarygodne wyniki.

Na przykład krok protokołu 2.1 wymag...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Biotek Cytation 1 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Agilent	BTCYT1V
Związek 1 (Dehydroabietylamina, CAS 1446-61-3)	Enamine	EN300-7409771
Związek 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific	75004271
Ibidi Gmbh – płyta 96-dołowa	Ibidi	80826
Linie komórkowe MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
Fosforanowa buforowana sól fizjologiczna pH 7,4	ATCC	ATCC 30-2200
Zestaw do analizy syntezy białek (zielony)	Abcam	Ab239725