Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Summary

Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.

Abstract

Aptamery fluorescencyjne oparte na DNA (FLAP) są obiecujące dla testów bioanalitycznych, ponieważ zapewniają tani odczyt sygnału fluorescencyjnego bez konieczności znakowania reporterów sygnałów kwasów nukleinowych za pomocą fluoroforów i / lub wygaszaczy, w przeciwieństwie do konwencjonalnych sond hybrydyzacyjnych stosowanych do natychmiastowego wykrywania kwasów nukleinowych. Zamiast tego FLAP niekowalencyjnie wiążą ligandy barwnikowe , które wykazują z natury niską fluorescencję w roztworach wodnych, ale stają się silnie emitujące po związaniu FLAP. Protokół ten opisuje algorytm projektowania dzielonych czujników aptamerowych (SLAS) wykorzystujących DAP-10-42, najbardziej wydajny system DNA FLAP zgłoszony do tej pory. Po wyposażeniu w sekwencje kwasów nukleinowych komplementarne do celu kwasu nukleinowego, SLAS jest obiecującym narzędziem do analizy kwasów nukleinowych, pozwalającym na wykrywanie specyficznych dla sekwencji celów kwasów nukleinowych z selektywnością do jednego nukleotydu, aby umożliwić analizę substytucji pojedynczych nukleotydów (SNS). SLAS oferują tę zaletę, że bezznacznikowy odczyt sygnału oparty na fluorescencji, który można zmierzyć za pomocą konwencjonalnego spektrofotometru fluorescencyjnego opartego na kuwecie, przenośnego fluorometru lub obserwować wizualnie po wzbudzeniu za pomocą ręcznego źródła światła. Podejście SLAS jest korzystne dla zastosowań biosensorycznych w diagnostyce chorób, monitorowaniu środowiska i badaniach biomolekularnych.

Introduction

Analiza kwasów nukleinowych przy użyciu sond hybrydyzacyjnych jest rutynowo wykonywana w celu wykrycia i ilościowego określenia określonych sekwencji DNA/RNA¹. Jedną z najbardziej udanych sond hybrydyzacyjnych jest sonda Molecular Beacon (MB), która jest DNA w kształcie spinki do włosów
oligonukleotyd znakowany fluoroforem i wygaszaczem na przeciwległych końcach ^2,3. Błyskawicznie (bez konieczności wymywania kompleksu sonda-tarcza z nadmiaru sondy) wykrywa obecność sekwencji kwasu nukleinowego komplementarnej do fragmentu pętli sondy i jest powszechnie stosowany w ilościowym PCR (qPCR). Konieczność kowalencyjnego dołączenia dwóch barwników - fluoroforu i wygaszacza - do sekwencji oligonukleotydowej sondy zwiększa koszty, szczególnie gdy potrzebna jest nowa sonda MB ukierunkowana na nową sekwencję kwasu nukleinowego. Alternatywnie, sonda MB może być używana jako reporter sygnału w formacie wieloskładnikowej (podzielonej sondy hybrydyzacyjnej), w której dwa nieznakowane oligonukleotydy oddziałują zarówno z celem, jak i reporterem sondy MB⁴. Podejście sondy wieloskładnikowej zwiększa selektywność rozpoznawania kwasów nukleinowych i poprawia wiązanie sondy z celami strukturalnymi ^5,6,7, Niemniej jednak podejście to nie eliminuje potrzeby kowalencyjnego znakowania reportera za pomocą fluoroforu⁸.

Fluorescencyjne zapalane aptamery (FLAP)⁹ to aptamery, które mają powinowactwo do barwników wrażliwych na środowisko o niskiej fluorescencji (fluorogenów), w których wiązanie przez FLAP zwiększa fluorescencję kolektora fluorogenowego. W przeciwieństwie do znakowanych fluorescencyjnie sond i reporterów sygnałowych, FLAP nie wymagają kowalencyjnego znakowania elementów czujnikowych jednym lub kilkoma barwnikami, a tym samym oferują przewagę w postaci detekcji fluorescencji bez znaczników¹⁰. Jest to szczególnie ważne na etapie optymalizacji, kiedy trzeba przetestować dziesiątki konstruktów kwasów nukleinowych, aby osiągnąć zadowalającą wydajność testu. Co więcej, testy FLAP można zoptymalizować, dostosowując stężenie czujnika fluorogenu i/lub FLAP, a nie zmieniając konstrukcję czujnika. Zalety te mogą być znaczące dla niskobudżetowych laboratoriów badawczych i dydaktycznych. Panele DNA FLAP są szczególnie obiecujące jako reporterzy sygnałów wieloskładnikowych sond hybrydyzacyjnych określanych jako czujniki Split Light-up Aptamer Sensors (SLASs)¹¹. Najbardziej wydajnym DNA FLAP zgłoszonym do tej pory jest DAP-10-42, który został pierwotnie wybrany w celu wzmocnienia fluorescencji barwników dapoksylosulfonylopochodnych¹², z rozwiązłą zdolnością do wiązania i wzmacniania fluorescencji różnych barwników arylowo-metanowych (np. Auramina O, AO; fiolet krystaliczny, CV)¹³. DAP-10-42 został przekształcony w SLAS do wykorzystania do analizy kwasów nukleinowych 13,14,15.

Celem opisanej tutaj metody jest umożliwienie specyficznej dla sekwencji analizy interesujących nas celów kwasu nukleinowego przy użyciu bezznacznikowych nici SLAS i barwnika fluorogenicznego jako składnika buforowego. Protokół ten opisuje algorytm projektowania SLAS w oparciu o DAP-10-42 i podkreśla wydajność SLAS w zakresie wysoce selektywnego wykrywania sekwencji kwasów nukleinowych różniących się zaledwie pojedynczym nukleotydem.

Test wykrywania kwasów nukleinowych SLAS wymaga dwóch specjalnie zsyntetyzowanych niezmodyfikowanych oligonukleotydów DNA stosowanych w końcowym stężeniu 0,5-1 μM w celu uzyskania maksymalnej wydajności. Opisany tutaj protokół wykorzystuje dostępny na rynku barwnik Auramina O (AO) jako fluorogen. Końcowe stężenie AO w teście waha się od 1 do 10 μM, aby zapewnić wysokie wzmocnienie fluorescencji w obecności określonego celu kwasu nukleinowego nad ślepą próbą (brak celu; Rysunek uzupełniający 1). Niezbędnymi składnikami buforu do oznaczania są jony potasu i magnezu (rysunek uzupełniający 2). Jony potasu (1,25-40 mM) stabilizują proponowaną domenę G-quadruplex FLAP używaną jako reporter sygnału. Jony magnezu (2,5-50 mM) zmniejszają odpychanie ujemnie naładowanych grup fosforanowych podczas oddziaływań SLAS-cel. Temperatura testu SLAS z wykorzystaniem zgłoszonych sekwencji dla dziedziny raportowania sygnału nie powinna przekraczać 28 °C, aby uniknąć utraty wydajności¹⁶.

SLAS jest kompatybilny z jednoniciowymi celami kwasów nukleinowych, takimi jak amplikony DNA asymetrycznego PCR lub izotermiczna reakcja amplifikacji DNA (np. Amplifikacja polimerazy rekombinazy, RPA¹⁷), produkty RNA z amplifikacji za pośrednictwem transkrypcji (TMA) lub amplifikacji opartej na sekwencji kwasów nukleinowych (NASBA)¹⁸ oraz natywne cząsteczki RNA, takie jak miRNA, rRNA lub ncRNA). Zmiany w sekwencji nukleotydowej celu aż do pojedynczego nukleotydu można wykryć przy użyciu podejścia SLAS^13,14.

Protocol

1. Projekt czujnika aptamerowego Split Light-up (SLAS) z DAP-10-42 jako reporterem sygnału

1. Zaprojektuj sekwencje dwóch niezmodyfikowanych nici oligonukleotydowych DNA tworzących SLAS. Użyj fragmentu zawierającego nukleotydy (nts) 4,6-39 DAP-10-42 (tabela 1, rysunek 1A).
2. Przekształć sekwencję pnia 1 (nts 1-8 i 36-42) na pień 1', usuwając wybrzuszoną pozostałość tyminy w pozycji nt 5, skracając trzon do 4 pz (nts 4,6-8 i 36-39) i dodając końcową C-G bp (Rysunek 1A, krok 1). Dodatkowo jedna z nici SLAS zawiera nts 9-29 sekwencji rdzeniowej DAP-10-42, podczas gdy inna nić SLAS zawiera nts 30-35 sekwencji.
3. Rozszerz 3'-końcową sekwencję fragmentu zawierającego nts 9-29 za pomocą d(GGTCAT), a 5'-końcową sekwencję fragmentu nts 30-35 za pomocą d(ATGACC), aby utworzyć trzon 6-bp 2 (Rysunek 1A, krok 2).
   UWAGA: Pary zasad T4-A39, A6-T38, C7-G37 i G8-C36 trzpienia 1 w DAP-10-42 są wymagane do funkcji podświetlania aptameru. Sekwencja trzonu 1' może być modyfikowana tylko na końcu bp i może być parą zasad G-C, A-T, T-A lub przedłużona o 1-2 pary zasad w razie potrzeby. Sekwencja rdzenia 2 jest dowolna i można ją zmienić. Zaleca się jednak, aby stabilność termodynamiczna trzonu 2 została zachowana, chyba że temperatura badania zostanie podniesiona powyżej 28 °C. Skrócenie lub w inny sposób destabilizacja trzonu 2 zapobiega przedwczesnemu wiązaniu barwnika bez celu, jeśli zaobserwuje się wysokie tło testu fluorescencyjnego opartego na SLAS. Dopuszczalny jest również podział sekwencji nukleotydowej DAP-10-42 między nts 28-29, 27-28 lub 26-27 zamiast nts 29-30 (ryc. 1B).
4. Aby dostosować zaprojektowane SLAS do celu lub zainteresowania kwasem nukleinowym, rozszerz łodygę 1' sekwencjami DNA komplementarnymi do fragmentów wiążących cel-cel (ramiona) za pomocą łączników d (TT) (Figura 1A, krok 3). W ten sposób uzyskuje się sekwencje nici SLAS-U i SLAS-S tworzących sondę.
5. Spraw, aby ramię wiążące cel SLAS-S było komplementarne z 7-10-nt fragmentem celu zawierającym miejsce SNS, a ramię wiążące cel SLAS-U – komplementarne do 15-25-nt fragmentu celu sąsiadującego z ramieniem wiążącym cel SLAS-S (Tabela 1).
   UWAGA: Jest opcjonalne, czy podłączyć ramię powiązania docelowego SLAS-S do nt 4 lub nt 39 sekwencji DAP-10-42 (odpowiednio rysunek 1, ramię 1 lub ramię 2).
6. Oceń temperaturę topnienia (T_m) dupleksów między obiektem zainteresowania a ramionami wiążącymi cel SLAS-S i SLAS-U przy użyciu serwera internetowego UNAFold (unafold.org)¹⁹.
   1. Kliknij zakładkę DINAMelt u góry strony internetowej; przejdź do Aplikacje i wybierz Hybrydyzacja topnienia w dwóch stanach (rysunek uzupełniający 3A). Na stronie Hybrydyzacja topnienia dwustanowego wprowadź jedną z oddziałujących sekwencji w lewym polu, a drugą w prawym polu (rysunek uzupełniający 3B). Upewnij się, że obie sekwencje są w kolejności od 5 do 3 stóp. Można wprowadzić więcej niż jedną parę sekwencji oddziałujących na interakcję, oddzielając je średnikami.
   2. U dołu strony należy wskazać temperaturę testu (22 °C), stężenia kationów jednowartościowych i dwuwartościowych (odpowiednio 20 mM i 25 mM) w celu dopasowania do warunków testu. Należy wskazać stężenie oddziałujących sekwencji.
   3. Naciśnij przycisk Wyślij (rysunek uzupełniający 3B). Obserwuj wyniki, które obejmują zmianę energii Gibbsa, zmianę entalpii i zmianę entropii wiązania, a także wartości T_m dla odpowiednich dupleksów (rysunek uzupełniający 3B).
   4. Upewnij się, że wartości T_m dla dupleksów między w pełni dopasowanym celem (M) a ramionami wiążącymi cel SLAS-S i SLAS-U są wyższe od temperatury testu, która w obecnym protokole wynosi 22 °C. W tym przypadku wartości T_m wynosiły odpowiednio 32,2°C i 74,4 °C (rysunek uzupełniający 3C).
   5. Upewnij się, że dupleks między SLAS-S a niedopasowanym celem (MM) zawierającym SNS ma T_m poniżej temperatury testu. Zapewnia to wysoką selektywność rozpoznawania sondy-celu, zapobiegając sygnalizowaniu obecności docelowego analitu kwasu nukleinowego przez fluorogen AO, jeśli zawiera on SNS we fragmencie wiążącym SLAS (Figura 2). W tym przypadku T_m wynosił 21,3 °C (rysunek uzupełniający 3C), co było wystarczające do odróżnienia niedopasowania od dopasowanego kompleksu.
   6. Dostosuj sekwencje ramion wiążących tarczę, skracając lub wydłużając fragmenty uzupełniające tarczę, jeśli to konieczne, aby spełnić wskazane wymagania dotyczące stateczności.
7. Uzyskaj zaprojektowane nici SLAS-S i SLAS-U od dowolnego komercyjnego dostawcy dostarczającego oligonukleotydy DNA na zamówienie lub zsyntetyzuj nici DNA we własnym zakresie za pomocą zautomatyzowanego syntezatora oligonukleotydów.

Rysunek 1: Konwersja fluorescencyjnego świecącego aptameru (FLAP) DAP-10-42 na czujnik aptamerowy z dzielonym światłem (SLAS). orazStruktura drugorzędowa DAP-10-42¹² jest przewidywana przez aplikację do fałdowania DNA UNAFold Web Server¹⁹ w temperaturze 22 °C, 20 mM Na⁺, 25 mM Mg²⁺. Aptamer ma strukturę drugorzędową spinki do włosów z rdzeniem, który prawdopodobnie składa się w motyw G-quadruplex stabilizowany przez trzpień 1. Aby DAP-10-42 został przekształcony w SLAS, (1) trzon 1 aptameru jest skracany do 4 pz i otoczony dodatkowym G-C pz, aby uzyskać trzon 1'; (2) sekwencja rdzenia jest podzielona między nts 29 i 30, przy czym strony 3' i 5' miejsca podziału są rozszerzone sekwencjami komplementarnymi odpowiednio d (GGTCAT) i d (ATGACC), aby utworzyć rdzeń 2; (3) Trzon 1' jest rozszerzony o sekwencje komplementarne do sąsiednich fragmentów celu będącego przedmiotem zainteresowania - ramion wiążących cel, z łącznikiem d(TT) między ramionami wiążącymi cel a domeną raportowania sygnału sondy. (B) Rdzeń może być również podzielony między nts 28-29, 27-28 lub 26-27 bez znaczącej utraty sygnału i / lub zwiększenia krotności fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Mechanizm generowania sygnału SLAS. SLAS składa się z dwóch nici - SLAS-U i SLAS-S - oraz barwnika fluorogenicznego (np. Auramina O; AO). W przypadku braku interesującego celu kwasu nukleinowego, obie nici są w stanie zdysocjowanym i nie są w stanie związać barwnika; Nie obserwuje się żadnego sygnału (środek). W obecności w pełni dopasowanego celu M, zarówno SLAS-U, jak i SLAS-S hybrydyzują z sąsiednim fragmentem M , aby zbliżyć do siebie fragmenty rdzenia. Pozwala to na wytworzenie miejsca wiązania barwnika. Wiązanie AO zwiększa jego fluorescencję, która jest mierzona jako odczyt sygnału fluorescencyjnego (po lewej). W obecności niedopasowanego docelowego MM zawierającego substytucję pojedynczego nukleotydu (SNS) we fragmencie oddziałującym z SLAS-S, tylko SLAS-U może hybrydyzować z celem MM , podczas gdy SLAS-S jest w stanie dysocjacji. Zapobiega to tworzeniu się miejsca wiązania barwnika i nie obserwuje się żadnego sygnału (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wzmocnienie docelowej sekwencji

1. Amplifikuj fragment genu, który ma być analizowany za pomocą testu SLAS. W przypadku amplifikacji PCR lub RPA należy użyć warunków asymetrycznych (np. z dodanym starterem do przodu w 10-krotnym nadmiarze w stosunku do startera odwrotnego), aby wygenerować amplikon jednoniciowy. Aby amplifikować fragment 126 nt z genu NANOGP8 za pomocą Linear After The Exponential (LATE) PCR²⁰, należy użyć sekwencji starterowych wymienionych w Tabeli 2. W tym przypadku zastosowano jednoniciową matrycę DNA (Matryca NANOGP8 lub Matryca G1423C, Tabela 2) odpowiadającą 126-ntowemu fragmentowi genu. Szablon został zsyntetyzowany na zamówienie przez firmę Integrated DNA Technologies, Inc.
   1. Przygotować 100 μl reakcji PCR, mieszając 10 μL 10x Standardowy bufor reakcyjny Taq, 2 μL 10 mM mieszanki dNTP (aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mM), 10 μL 10 μM startera do przodu i 10 μL 1 μM do odwróconego startera (dla końcowego stężenia 1 μM i 0,1 μM, odpowiednio), 0,5 μl polimerazy DNA Taq 5U/μL, matryca DNA i woda wolna od nukleaz. W przypadku kontrolki bez szablonu dodaj wodę zamiast szablonu.
   2. Stosować następujące warunki termocyklu: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 1 minutę; 45 cykli (1) denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s, (2) wyżarzania gruntu w temperaturze 60 °C przez 30 s, (3) przedłużania podkładu w temperaturze 68 °C przez 30 s; i końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 5 min.
      UWAGA: Techniki amplifikacji oparte na transkrypcji, takie jak NASBA¹⁸ , mogą być używane zamiast PCR lub RPA, zwłaszcza jeśli dostępna jest matryca RNA do amplifikacji. NASBA generuje jednoniciowy amplikon RNA o stężeniu produktu końcowego w zakresie mikromolowym, które jest wystarczająco wysokie, aby można go było zastosować w dalszym teście SLAS bez stężenia produktu.
2. Wytrącić amplifikowane próbki etanolem, dodając 0,1x objętość 3 M octanu sodu (pH 5,5) i 3 razy objętość etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę, odwirowywać w temperaturze 12 000-18 000 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
3. Umyj osad 70% etanolem, ponownie odwiruj i ponownie wyrzuć supernatant. Wysuszyć osad na powietrzu i rozpuścić w 10 μl wody wolnej od nukleaz, która ma być użyta w teście SLAS.

3. Test fluorescencji z wykorzystaniem SLAS

1. Przygotuj roztwory podstawowe AO (0,1 mM w DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM w wodzie wolnej od nukleaz, 10x), SLAS-U (10 μM w wodzie wolnej od nukleaz, 10x) i 4x bufor testowy (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl₂, 80 mM KCl).
   UWAGA: Jony potasu są niezbędne do stabilizacji przypuszczalnego motywu G-quadruplex aptameru, który jest częścią miejsca wiązania barwnika. Zaledwie 1 mM KCl (przy 25 mM MgCl₂) w 1x buforze testowym wystarczy, aby zapewnić ~14-krotne wzmocnienie fluorescencji w obecności określonego celu M nad próbą ślepą (próbka bez celu; Rysunek uzupełniający 2B). Jony magnezu stabilizują oddziaływania nici kwasu nukleinowego (między SLAS-S, SLAS-U a celem). Stężenie^Mg2+ w 1x buforze testowym powinno wynosić co najmniej 5 mM (przy 20 mM KCl; Rysunek uzupełniający 2C, D). Roztwór podstawowy AO (~1 mM) przygotowuje się w DMSO. Stężenia zapasów SLAS-S i SLAS-U są dowolne i mogą być dostosowywane w razie potrzeby, o ile końcowe stężenia nici są utrzymane (patrz uzasadnienie wyboru końcowego stężenia SLAS w Dyskusji).
   UWAGA: AO jest szkodliwy w przypadku połknięcia, toksyczny w kontakcie ze skórą i podejrzewa się, że powoduje raka. Podczas pracy z rozwiązaniami AO należy zawsze nosić rękawice. Ważenie AO i przygotowywanie jego roztworów podstawowych powinno odbywać się pod maską chemiczną.
2. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą wszystkie składniki oznaczania z wyjątkiem celu. Obliczyć objętość mieszanki wzorcowej (V_mix), mnożąc objętość próbki (60 μl) przez liczbę próbek plus jedna (n+1):
   
   Liczba próbek n powinna obejmować niezbędne kontrole ujemne i dodatnie.
3. Połączyć 0,25x V_mix μL 4x buforu testowego, 0,1x V_mix μL 0,1 mM AO, 0,1x V_mix μL 10 μM SLAS-S i 0,1x V_mix μL 10 μM SLAS-S. Dodać wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości tak, aby zmieściła się w docelowej objętości dodanej w kroku 3.4. Odwirować i krótko odwirować mieszankę główną. Podwielokrotność 50 μl roztworu wzorcowego wymieszać z n probówkami na próbki.
   UWAGA: Objętość próbki można regulować w zależności od charakterystyki przyrządu wykorzystywanego do wykrywania sygnału fluorescencyjnego. Objętość mieszanki wzorcowej, która jest podawana do probówek z próbkami, może być dostosowana w oparciu o objętość docelową dodaną w kroku 3.4. Objętość wody wolnej od nukleaz dodawanej w celu przygotowania mieszanki wzorcowej powinna być odpowiednio dostosowana. Na przykład, jeśli próbka zawierająca wzorzec jest dodawana w ilości 10% (V/V) końcowej objętości próbki, do mieszanki głównej należy dodać wodę do_mieszanki głównej do 0,9x V.
4. Użyć jednej próbki jako kontroli niedocelowej (ślepa próba) i jednej próbki jako kontroli dodatniej. Dodać 10 μl próbki zawierającej tarczę do mieszanki wzorcowej (50 μl), aby uzyskać końcową objętość próbki 60 μl zawierającą 10–1000 nM celu. Do ślepej próby użyj wody wolnej od nukleaz (10 μl) zamiast celu. Do kontroli pozytywnej należy użyć syntetycznego oligonukleotydu DNA zawierającego docelową sekwencję (np. cel M, tabela 1). Dodać 10 μL kontrolnej 0,6-3 μM, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1-0,5 μM.
   UWAGA: Wysoka fluorescencja w tej kontroli pozytywnej zapewnia, że test działa zgodnie z oczekiwaniami, nawet jeśli zaobserwuje się negatywny sygnał dla badanych nieznanych próbek.
5. Wymieszać próbki i odwirować za pomocą mikrowirówki. Próbki należy inkubować w temperaturze 22 °C przez 10–60 minut. Sygnał wzrasta tylko o <15% między 40 minutami a 60 minutami (ilustracja 3).
6. Zmierzyć fluorescencję próbek przy długości fali 540 nm po wzbudzeniu przy długości fali 475 nm za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego.
   UWAGA: Możliwe jest użycie przenośnego fluorometru, który mierzy fluorescencję w cienkościennych probówkach do PCR. Fluorometr musi być wyposażony w filtry wzbudzenia i emisji odpowiednie do wykrywania fluorescencji AO. Przykładem odpowiedniego filtra wzbudzenia jest filtr krótkoprzepustowy 495 nm. Przykładem odpowiedniego filtra emisji spalin jest 510-580 nm. Alternatywnie, sygnał można obserwować wizualnie po wzbudzeniu fluorescencji AO w próbce za pomocą źródła światła UV lub niebieskiego.
   UWAGA: Jeśli używany jest UV lamp, noś okulary chroniące przed promieniowaniem UV.

Rysunek 3: Zależność czasowa generacji sygnału dla SLAS-29U/30S. Próbkę zawierającą AO, SLAS-29U i SLAS-30S analizowano przy użyciu trybu kinetycznego spektrofotometru fluorescencyjnego (wzbudzenie przy 475 nm, emisja przy 540 nm, szczeliny wzbudzenia/emisji 5 nm) przez 60 minut. Po 5 minutach (oznaczonych strzałką) do próbki dodano cel M . Dane są uśrednione z dwóch niezależnych badań. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Wydajność SLAS wykorzystującego rdzeń DAP-10-42 jako reporter sygnału została zademonstrowana przy użyciu sondy zaprojektowanej do badania fragmentu genu NANOGP8 ważnego dla progresji glejaka wielopostaciowego (GBM), agresywnej postaci raka mózgu²¹. Doniesiono, że ten fragment zawiera SNS w ładunku DNA egzosomów pochodzących z komórek rakowych²². W związku z tym SLAS został dostosowany do miejsca SNS genu. Syntetyczne cele DNA M lub MM naśladujące...

Discussion

W raportowanym protokole krytyczne kroki obejmują (i) projekt SLAS; (ii) temperaturę testu; (iii) obecność kationów metali jedno- i dwuwartościowych (K⁺ i^Mg2+); (iv) stężenia pasm SLAS.

Projektowanie SLAS
Projektując nici SLAS, należy wziąć pod uwagę stabilność termodynamiczną kompleksów utworzonych przez nici SLAS-S i SLAS-U przy braku celów oraz w obecności celu specyficznego lub niespecyficznego (jeśli potrzebne jest różnicowanie SNS). Stabilność ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auramina O	MP Biomedycyna	195064	barwnik fluorogenny używany do raportowania sygnałów
Fluorometr Cary'ego Eclipse'a	Technologie Agilent	G9800A	do pomiaru sygnału fluorescencyjnego próbek
Sulftlenek dimetylu	MP Biomedycyna	196055	rozpuszczalnik do przygotowania roztworów podstawowych Auraminy O
Oligonukleotydy DNA (startery, nici SLAS, syntetyczna matryca do PCR)	Identyfikator IDT	N/A	wykonane na zamówienie i odsolone przez sprzedawcę, używane bez dalszego oczyszczania
Mieszanka dNTP, 10 mM	ThermoFisher Naukowy	Czynnik R0191	dla reakcji LATE PCR
Chlorek magnezu	Invitrogen powiedział:	AM9530G	składnik bufora; potrzebne do poprawnego powiązania nici sondy z analizowanym celem
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml )	Marka rybacka	02-681-320	tworzywo sztuczne do przygotowania próbki
Mikropipety (0,1-2,5 i mikro; L)	Eppendorph powiedział:	K56877G	służy do przygotowania próbki
Mikropipety (100-1000 i mikro; L)	Eppendorph powiedział:	K13160F	służy do przygotowania próbki
Mikropipety (20-200 i mikro; L)	Eppendorph powiedział:	J05253M	służy do przygotowania próbki
Mikropipety (2-20 i mikro; L)	Eppendorph powiedział:	G24675G	służy do przygotowania próbki
Mini wirówka	Corning	6770	Służy do wirowania próbek
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał AM9932	Służy do próbek w teście PCR i SLAS
Probówki do PCR (0,5 ml)	Invitrogen powiedział:	Zobacz materiał AM9932	do pomiaru fluorescencji za pomocą fluorometru Quantus
Końcówki do pipet (20-200 i mikro; L)	Firma VWR	76322-150	tworzywo sztuczne do przygotowania próbki
Końcówki do pipet (1-10 μl)	Firma VWR	76322-528	tworzywo sztuczne do przygotowania próbki
Chlorek potasu	Invitrogen	AM9640G	składnik bufora; potrzebne do prawidłowego zagięcia domeny aptamerowej światła fluorescencyjnego sondy
Fluorometr Quantus	Preparat Promega	E6150 powiedział:	przenośny, tani fluorometr, który może być używany do pomiarów fluorescencji
Kuweta kwarcowa	Starna	16.50F-Q-10/Z15	do stosowania do pomiaru fluorescencji za pomocą fluorometru Cary Eclipse
Polimeraza DNA Taq ze standardowym buforem Taq	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0273S	do amplifikacji fragmentu genu, który ma być analizowany za pomocą testu SLAS
Bufor Tris-HCl (pH 7,4)	Produkty biologiczne Boston	Przekaźnik R-314	Składnik bufora
Lampa UV	Promieniowanie UVP	95-0016-14	wzbudzenie AO do obserwacji sygnału wizualnego
Mieszalnik wirowy	Firma VWR	10153-838	służy do mieszania próbek