Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aptamery fluorescencyjne oparte na DNA (FLAP) są obiecujące dla testów bioanalitycznych, ponieważ zapewniają tani odczyt sygnału fluorescencyjnego bez konieczności znakowania reporterów sygnałów kwasów nukleinowych za pomocą fluoroforów i / lub wygaszaczy, w przeciwieństwie do konwencjonalnych sond hybrydyzacyjnych stosowanych do natychmiastowego wykrywania kwasów nukleinowych. Zamiast tego FLAP niekowalencyjnie wiążą ligandy barwnikowe , które wykazują z natury niską fluorescencję w roztworach wodnych, ale stają się silnie emitujące po związaniu FLAP. Protokół ten opisuje algorytm projektowania dzielonych czujników aptamerowych (SLAS) wykorzystujących DAP-10-42, najbardziej wydajny system DNA FLAP zgłoszony do tej pory. Po wyposażeniu w sekwencje kwasów nukleinowych komplementarne do celu kwasu nukleinowego, SLAS jest obiecującym narzędziem do analizy kwasów nukleinowych, pozwalającym na wykrywanie specyficznych dla sekwencji celów kwasów nukleinowych z selektywnością do jednego nukleotydu, aby umożliwić analizę substytucji pojedynczych nukleotydów (SNS). SLAS oferują tę zaletę, że bezznacznikowy odczyt sygnału oparty na fluorescencji, który można zmierzyć za pomocą konwencjonalnego spektrofotometru fluorescencyjnego opartego na kuwecie, przenośnego fluorometru lub obserwować wizualnie po wzbudzeniu za pomocą ręcznego źródła światła. Podejście SLAS jest korzystne dla zastosowań biosensorycznych w diagnostyce chorób, monitorowaniu środowiska i badaniach biomolekularnych.
Wprowadzenie
Analiza kwasów nukleinowych przy użyciu sond hybrydyzacyjnych jest rutynowo wykonywana w celu wykrycia i ilościowego określenia określonych sekwencji DNA/RNA1. Jedną z najbardziej udanych sond hybrydyzacyjnych jest sonda Molecular Beacon (MB), która jest DNA w kształcie spinki do włosów
oligonukleotyd znakowany fluoroforem i wygaszaczem na przeciwległych końcach 2,3. Błyskawicznie (bez konieczności wymywania kompleksu sonda-tarcza z nadmiaru sondy) wykrywa obecność sekwencji kwasu nukleinowego komplementarnej do fragmentu pętli sondy i jest powszechnie stosowany w ilościowym PCR (q....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projekt sensora opartego na rozdzielnym aptamerze emitującym światło (SLAS) z wykorzystaniem DAP-10-42 jako raportora sygnału
- Zaprojektuj sekwencje dwóch niemodyfikowanych nici oligonukleotydów DNA tworzących SLAS. Wykorzystaj fragment zawierający nukleotydy (nts) 4,6-39 DAP-10-42 (Tabela 1, Rysunek 1A).
- Przekształć sekwencję łodygi 1 (nts 1-8 i 36-42) w łodygę 1', usuwając wybrzuszenie reszty tyminy w pozycji nt 5, skracając łodygę do 4 bp (nts 4,6-8 i 36-39) i dodając terminalną parę zasad C-G (Rysunek 1A, krok 1). Dodatkowo jedna z nici SLAS zawier....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wydajność SLAS z wykorzystaniem rdzenia DAP-10-42 jako reportera sygnału została zademonstrowana przy użyciu sondy zaprojektowanej do badania fragmentu genu NANOGP8, który jest istotny dla progresji wielopostaciowego glejaka (GBM), agresywnej postaci nowotworu mózgu21. Wykazano, że fragment ten zawiera SNS w ładunku DNA egzosomów pochodzących z komórek nowotworowych2. W związku z tym system SLAS został dostosowany do miejsca SNS w tym genie. W niniejszym protokole,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W raportowanym protokole krytyczne kroki obejmują (i) projekt SLAS; (ii) temperaturę testu; (iii) obecność kationów metali jedno- i dwuwartościowych (K+ iMg2+); (iv) stężenia pasm SLAS.
Projektowanie SLAS
Projektując nici SLAS, należy wziąć pod uwagę stabilność termodynamiczną kompleksów utworzonych przez nici SLAS-S i SLAS-U przy braku celów oraz w obecności celu specyficznego lub niespecyficznego (jeśli potrzebne jest różnicowanie SNS). Stabilność .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Fundusze z UCF Office of Undergraduate Research (OUR) dla AK są bardzo cenione. Prace nad optymalizacją warunków LATE-PCR dla genu NANOGP8 są wspierane przez Florida Cancer Innovation Fund (grant MOABC).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Auramina O | MP Biomedycyna | 195064 | barwnik fluorogenny używany do raportowania sygnałów |
| Fluorometr Cary'ego Eclipse'a | Technologie Agilent | G9800A | do pomiaru sygnału fluorescencyjnego próbek |
| Sulftlenek dimetylu | MP Biomedycyna | 196055 | rozpuszczalnik do przygotowania roztworów podstawowych Auraminy O |
| Oligonukleotydy DNA (startery, nici SLAS, syntetyczna matryca do PCR) | Identyfikator IDT | N/A | wykonane na zamówienie i odsolone przez sprzedawcę, używane bez dalszego oczyszczania |
| Mieszanka dNTP, 10 mM | ThermoFisher Naukowy | Czynnik R0191 | dla reakcji LATE PCR |
| Chlorek magnezu | Invitrogen powiedział: | AM9530G | składnik bufora; potrzebne do poprawnego powiązania nici sondy z analizowanym celem |
| Probówki do mikrowirówek (1,5 ml ) | Marka rybacka | 02-681-320 | tworzywo sztuczne do przygotowania próbki |
| Mikropipety (0,1-2,5 i mikro; L) | Eppendorph powiedział: | K56877G | służy do przygotowania próbki |
| Mikropipety (100-1000 i mikro; L) | Eppendorph powiedział: | K13160F | służy do przygotowania próbki |
| Mikropipety (20-200 i mikro; L) | Eppendorph powiedział: | J05253M | służy do przygotowania próbki |
| Mikropipety (2-20 i mikro; L) | Eppendorph powiedział: | G24675G | służy do przygotowania próbki |
| Mini wirówka | Corning | 6770 | Służy do wirowania próbek |
| Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC) | ThermoFisher Naukowy | Zobacz materiał AM9932 | Służy do próbek w teście PCR i SLAS |
| Probówki do PCR (0,5 ml) | Invitrogen powiedział: | Zobacz materiał AM9932 | do pomiaru fluorescencji za pomocą fluorometru Quantus |
| Końcówki do pipet (20-200 i mikro; L) | Firma VWR | 76322-150 | tworzywo sztuczne do przygotowania próbki |
| Końcówki do pipet (1-10 μl) | Firma VWR | 76322-528 | tworzywo sztuczne do przygotowania próbki |
| Chlorek potasu | Invitrogen | AM9640G | składnik bufora; potrzebne do prawidłowego zagięcia domeny aptamerowej światła fluorescencyjnego sondy |
| Fluorometr Quantus | Preparat Promega | E6150 powiedział: | przenośny, tani fluorometr, który może być używany do pomiarów fluorescencji |
| Kuweta kwarcowa | Starna | 16.50F-Q-10/Z15 | do stosowania do pomiaru fluorescencji za pomocą fluorometru Cary Eclipse |
| Polimeraza DNA Taq ze standardowym buforem Taq | Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii | Zobacz materiał M0273S | do amplifikacji fragmentu genu, który ma być analizowany za pomocą testu SLAS |
| Bufor Tris-HCl (pH 7,4) | Produkty biologiczne Boston | Przekaźnik R-314 | Składnik bufora |
| Lampa UV | Promieniowanie UVP | 95-0016-14 | wzbudzenie AO do obserwacji sygnału wizualnego |
| Mieszalnik wirowy | Firma VWR | 10153-838 | służy do mieszania próbek |
Bibliografia
- Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
- Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
