Artykuł metodologiczny

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

DOI:

10.3791/68498

⸱

22 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy multimodalną konfokalną mikrospektroskopię Ramana (RS) oraz tomograficzną mikroskopię fazową (TPM) do szybkiego fenotypowania morfochemicznego komórek raka piersi u człowieka (MDA-MB-231). Wykorzystując nieperturbacyjny charakter tych zaawansowanych technik mikroskopowych, uzyskaliśmy szczegółowe dane morfomolekularne z żywych, pozbawionych znaczników komórek w ich naturalnym środowisku fizjologicznym. Opracowano wolne od uprzedzeń człowieka potoki przetwarzania danych w celu analizy hiperspektralnych obrazów Ramana (obejmujących tryby Ramana od 600 cm-1 do 1800 cm-1, które w unikalny sposób charakteryzują szeroki zakres wiązań molekularnych i struktur subkomórkowych), a także danych morfologicznych z trójwymiarowych tomogramów indeksu refrakcji (zapewniających pomiary objętości komórki, powierzchni, śladu i sferyczności w rozdzielczości nanometrów, obok suchej masy i gęstości). Poprzez systematyczne rozbijanie bogatych szczegółów pojedynczych komórek, które dostarczają RS i TPM, pokazujemy, w sposób ilościowy, zalety takiej metody mikroskopii multimodalnej do fenotypowania komórek nowotworowego raka piersi. Nasze narzędzia zapewniają również dalszy wgląd w informacje subkomórkowe bez użycia jakichkolwiek etykiet. Na koniec badamy i omawiamy wszelkie unikalne lub skorelowane informacje, które zawierają zestawy danych pochodzące z RS i TPM. Wierzymy, że nasze narzędzia i potoki analizy danych ilościowych mogą zrewolucjonizować zadania fenotypowania w badaniach biomedycznych, gdy potrzebna jest szybka i niezakłócająca metoda na żywych komórkach w hodowli, z potencjałem do przyszłego przełożenia na zastosowania kliniczne i diagnostyczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka komórek i fenotypowanie są kluczowymi aspektami badań biomedycznych1. Umiejętność charakteryzowania komórek zarówno na poziomie morfologicznym, jak i molekularnym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji, różnicowania i patologii komórek 1,2,3. Jest to szczególnie interesujące w dziedzinie onkologii, gdzie dokładne profilowanie komórek jest niezbędne do diagnozowania guza, określania stadium choroby i ostatecznie identyfikacji celów terapeutycznych2. Tradycyjne metody charakteryzacji komórek nie są w stanie zapewnić dynamiki czasowej i zwykle opierają się na technikach inwazyjnych, takich jak barwienie lub znakowanie, które mogą zakłócać natywny stan komórek i wprowadzać potencjalne odchylenia w danych4. W związku z tym coraz bardziej poszukiwane są nieinwazyjne strategie zapewniające dokładne i dokładne fenotypowanie żywych komórek w ich naturalnym, niezakłóconym stanie.

W tym kontekście, bezznacznikowe metody obrazowania multimodalnego zrewolucjonizowały badania nad biologią komórki, łącząc uzupełniające się modalności w celu uchwycenia zarówno informacji morfologicznej, jak i molekularnej 2,5. Podejścia te pozwalają na zintegrowaną i nieinwazyjną charakterystykę komórek, której poszczególne tradycyjne techniki nie zawsze są w stanie zapewnić 2,5,6. Na przykład, chociaż techniki mikroskopowe, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, są szeroko stosowane w morfologicznym i funkcjonalnym obrazowaniu komórek, mają one nieodłączne ograniczenia. Metody fluorescencyjne często cierpią z powodu fotowybielania, fototoksyczności i małych ilości cząsteczek, na które można celować, co ogranicza potencjał analityczny4. Ponadto podejścia te często wymagają użycia egzogennych etykiet lub barwników, które mogą zakłócić natywny stan komórki lub prowadzić do artefaktów7.

Multimodalne platformy obrazowania, które łączą w sobie zalety wielu metod obrazowania, przewyższają te ograniczenia, umożliwiając pozyskiwanie różnych typów danych z żywych komórek bez konieczności znakowania. Integracja spektroskopii Ramana (RS) z innymi metodami obrazowania, takimi jak mikroskopia z kontrastem fazowym lub tomograficzna mikroskopia fazowa (TPM), jest obiecującą strategią przezwyciężania ograniczeń pojedynczych technik. Rzeczywiście, obrazowanie multimodalne zapewnia głębsze zrozumienie fenotypów komórkowych, zwłaszcza w złożonych warunkach biologicznych i patologiach, takich jak rak, gdzie właściwości molekularne i strukturalne mają kluczowe znaczenie dla dokładnej charakterystyki 2,5.

Bezznacznikowy RS doskonale nadaje się do obrazowania chemicznego komórek8. Wykrywając molekularne mody wibracyjne, RS dostarcza biochemicznych odcisków palców, które mogą ujawnić dogłębne informacje o składzie molekularnym komórek 9,10,11. Widma Ramana uzyskane z próbek biologicznych zawierają informacje o różnych biomolekułach, takich jak lipidy, białka, kwasy nukleinowe i metabolity, które odgrywają istotną rolę w zrozumieniu molekularnej natury komórek 9,12. Jedną z głównych zalet RS jest to, że jest nieinwazyjny, co pozwala na scharakteryzowanie żywych komórek w ich naturalnym stanie bez zmiany ich stanu fizjologicznego.

Pomimo wielu zalet, RS ma również pewne ograniczenia. Rzeczywiście, chociaż RS dostarcza szczegółowych informacji molekularnych, nie pozwala na ilościowe informacje na temat morfologii lub struktury komórek2. W tym miejscu kluczową rolę odgrywają uzupełniające techniki obrazowania, takie jak TPM.

TPM jest formą ilościowego obrazowania fazowego (QPI)13,14 i umożliwia wizualizację wysokorozdzielczych, bezznacznikowych informacji ilościowych o morfologii komórek 15,16. TPM różni się od tradycyjnych technik mikroskopowych tym, że nie wymaga środków kontrastowych; zamiast tego działa poprzez pomiar przesunięć fazowych wynikających ze zmian współczynnika załamania światła (RI) próbki17. Przesunięcia fazowe dostarczają informacji o właściwościach strukturalnych komórki, w tym o jej objętości, powierzchni, kształcie i strukturze wewnętrznej 2,18. TPM może osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną, do poziomu nanometrów, a zatem jest idealną techniką do rejestrowania szczegółów morfologicznych żywych komórek w wysokiej rozdzielczości. Co więcej, możliwość rekonstrukcji tomogramów 3D RI umożliwia wizualizację struktur subkomórkowych w ich środowisku vivo18, dostarczając dokładniejszych informacji w porównaniu z projekcjami 2D. Jednak jednym z głównych ograniczeń TPM jest brak jego swoistości chemicznej, ponieważ dostarcza on przede wszystkim informacji o morfologii i rozkładzie fazowym komórki, bez możliwości rozróżnienia odrębnych składników chemicznych lub identyfikacji cech biochemicznych.

Połączenie RS i TPM w technice multimodalnej zapewnia korzyści w fenotypowaniu komórek. Podczas gdy RS pozwala na bogate informacje molekularne, TPM dodaje aspekt strukturalny, umożliwiając szczegółową analizę morfologii komórek. Ostatnio połączenie RS z TPM zostało z powodzeniem wykazane w kilku badaniach skoncentrowanych na badaniach nad rakiem 2,19,20. Na przykład wcześniejsze prace wykazały, że jednoczesna rejestracja spektroskopii Ramana z danymi z holograficznej mikroskopii fazowej może dostarczyć uzupełniających informacji molekularnych i morfologicznych, umożliwiając rozróżnienie różnych typów komórek i etapów rozwoju nowotworu2. Badania te podkreśliły moc obrazowania multimodalnego w zwiększaniu dokładności fenotypowania komórek, szczególnie w kontekście raka, gdzie cechy molekularne i strukturalne komórek są ściśle związane z ich złośliwością i zachowaniem 2,20.

Pomimo niedawnych postępów w dziedzinie obrazowania multimodalnego nadal istnieją wyzwania, którym należy sprostać, w szczególności w zakresie przetwarzania i analizy danych21. Duże ilości danych, które uzyskuje się za pomocą multimodalnych technik obrazowania, mogą być kłopotliwe do analizy, a w celu wydobycia istotnych informacji konieczne jest zastosowanie prostych procedur. Aby sprostać temu wyzwaniu, należy ustanowić przyjazne dla użytkownika potoki przetwarzania danych, aby poradzić sobie ze złożonością danych i zminimalizować stronniczość człowieka w analizie. Takie procesy produkcyjne mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia dokładności i odtwarzalności wyników oraz możliwego przełożenia tych podejść na zastosowania kliniczne i diagnostyczne.

Celem niniejszej pracy jest zilustrowanie potencjału łączenia RS z TPM w celu bezznacznikowego, szybkiego i nieperturbacyjnego fenotypowania żywych pojedynczych komórek nowotworowych. Łącząc te dwa solidne podejścia do obrazowania, zapewniamy kompleksową i ilościową charakterystykę właściwości molekularnych i morfologicznych ludzkich komórek raka piersi (MDA-MB-231). Prace podkreślają również znaczenie ustanowienia potoków przetwarzania danych wolnych od uprzedzeń ludzkich, aby zapewnić poprawność i wiarygodność informacji uzyskanych z multimodalnych zestawów danych. W tym miejscu staramy się stworzyć solidną platformę do fenotypowania komórek rakowych, którą można uogólnić na inne typy komórek. Wszechstronność i czułość tego podejścia sprawiają, że jest ono potencjalnym kandydatem do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, od podstawowych badań biologii komórki po diagnostykę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Umieść komórki MDA-MB-231 na kwarcowych szalkach Petriego.
    1. Płytka MDA-MB-231 ludzkich komórek raka piersi na 3,5 cm kwarcowych płytkach Petriego ze szklanym dnem.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO2 aż do całkowitego związania się z powierzchnią (co najmniej 12 godzin po wysianiu).
  2. Umyj komórki i przygotuj się do pomiaru.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, gdy przylgną one do szalki Petriego.
    2. Delikatnie umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia resztek pożywki.
    3. Dodać świeżą pożywkę do hodowli komórkowych i utrzymywać komórki pokryte pożywką przez cały czas trwania procedury pomiarowej, aby zapewnić ich żywotność.
      UWAGA: Jako pożywkę hodowlaną w tym badaniu wykorzystano DMEM / F-12 bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną (100 IU / ml) - streptomycyną (100 μg / ml).

2. Wysokowydajny system mikroskopu Ramana

UWAGA: Szczegóły techniczne domowego mikroskopu Ramanowskiego, wykorzystywanego w obecnych pracach dotyczących obrazowania żywych komórek MDA-MB-231, zostały opisane poprzednio22. Krótko mówiąc, zastosowany, specjalnie zbudowany, wysokowydajny system mikroskopu Ramana składa się z lasera Ti-Sapphire o długości fali 785 nm, pompowanego przez laser o długości fali 532 nm (rysunek 1A). Laser wzbudzenia Ramana o długości fali 785 nm jest sprzężony z odwróconym korpusem mikroskopu fluorescencyjnego IX83, z wzbudzeniem skierowanym na próbkę przez obiektyw zanurzony w wodzie UPLSAPO60× 1,2 NA za pomocą lustra dichroicznego 749 nm. Polaryzator dostraja średnią moc lasera w tylnym porcie mikroskopu. Obrazowanie w jasnym polu jest możliwe dzięki sprzężeniu światła białego w podobny sposób. System przełącza się między trybami Ramana i jasnego pola, automatycznie zmieniając filtry dichroiczne. System łączy w sobie skanowanie galvo-mirror i stage w celu uzyskania wysokiej przepustowości obrazowania. Niestandardowy skrypt MATLAB współdziała z oprogramowaniem sterującym mikroskopem typu open source, płytą akwizycji danych (DAQ) i systemami wykrywania sygnałów, aby zautomatyzować proces akwizycji danych. Wstecznie rozproszone światło Ramana jest zbierane przez ten sam obiektyw, podczas gdy światło widzialne jest filtrowane przez zwierciadło dichroiczne 785 nm i kierowane do spektrografu NIR i detektora urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Ta konfiguracja umożliwia wielowymiarowe obrazowanie, przechwytywanie jasnego pola, fluorescencji i sygnałów Ramana w różnych pozycjach i stosach z 2,22.

  1. Procedura obrazowania ramanowskiego
    1. Przygotowanie próbki i zachowanie warunków fizjologicznych
      1. Umieścić próbkę w inkubatorze na etapie laboratoryjnym, aby utrzymać warunki fizjologiczne. Upewnij się, że inkubator jest ustawiony na 37 °C, z regulacją sprzężenia zwrotnego w czasie rzeczywistym w celu kontroli temperatury.
      2. Utrzymuj poziom wilgotności w komorze na poziomie >95% za pomocą wewnętrznej wanny obwodowej wypełnionej wodą destylowaną. Ustaw sterownik gazu CO2 tak, aby mieszał 5% CO2 z 95% powietrzem i dostarczał go do komory inkubatora.
    2. Zautomatyzowane zarządzanie zanurzeniem w wodzie
      1. Włącz domowy automatyczny podajnik zanurzeniowy w wodzie, aby dostarczać wodę do soczewki obiektywu z natężeniem przepływu 2 μl/min za pomocą pomp strzykawkowych i igieł strzykawkowych przyklejonych do końcówki obiektywu.
      2. Regularnie sprawdzaj poziom wody, aby uniknąć parowania i zapewnić spójne warunki obrazowania podczas wszystkich pomiarów.
    3. Akwizycja danych ze spektroskopii Ramana
      1. Włącz laser pompy i dostosuj jego moc, aby uzyskać moc lasera na płaszczyźnie próbki 75 mW.
      2. Otwórz oprogramowanie Micro-manager do sterowania mikroskopem o otwartym kodzie źródłowym. W ustawieniach konfiguracji wybierz BF i kliknij Live po lewej stronie okna oprogramowania, aby wyświetlić obraz w jasnym polu. Wybierz żądaną pojedynczą komórkę, z której zostanie uzyskane widmo Ramana. Następnie kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć wizualizację jasnego pola.
      3. Ustaw współrzędną Z płaszczyzny obrazowania Ramana, maksymalizując liczbę sygnałów w kamerze CCD.
      4. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie sterujące kamerą CCD (LightField); w ustawieniach eksperymentu ustaw czas ekspozycji na 1.5 s. Następnie kliknij przycisk Uruchom na pasku narzędzi Eksperyment i włącz wiązkę laserową.
      5. Następnie dostosuj pozycję Z, aby zmaksymalizować liczbę sygnałów w obszarze odcisków palców od 600 cm-1 do 1800 cm-1 , aby zoptymalizować wizualizację pików Ramana związanych z sygnaturami biologicznymi. Następnie wyłącz laser i kliknij przycisk Stop (Zatrzymaj ) na pasku Experiment (Eksperyment ) w oprogramowaniu kamery CCD i wyjdź z oprogramowania.
        UWAGA: Zaobserwowano, że zmaksymalizowane zliczenia sygnału Ramana w kamerze CCD są zgodne z położeniem wzdłuż osi Z pokrywającym się z +8 μm w stosunku do płaszczyzny obrazowania, która nie wykazywała żadnych śladów pików Ramana związanych z komórkami, ze względu na ognisko leżące dość wewnątrz kwarcu. Ta wartość może się różnić w zależności od typu i stanu komórki.
    4. Rozpocznij proces akwizycji danych za pomocą skryptu MATLAB, który automatycznie obsłuży kanały Ramana w pomiarach wielowymiarowych i zapisze hiperspektralne dane Ramanowskie.
    5. Ustaw pole widzenia na 50 × 50 μm2, 40 × 40 pikseli, przy czym każdy obszar piksela odpowiada 1,25 × 1,25 μm2. Ustaw czas ekspozycji dla każdego widma Ramana równy 1,5 s.
      UWAGA: Regularnie wykonuj kalibrację liczby falowej przy użyciu próbek acetamidofenolu w celu opisania znanych pików Ramana. Skalibruj oś przesunięcia Ramana za pomocą interpolacji kwadratowej.
      UWAGA: Z laserami należy obchodzić się ostrożnie. Zawsze używaj odpowiednich okularów ochronnych dostosowanych do długości fali lasera podczas konfiguracji i pracy.

3. Analiza danych RS

  1. Hiperspektralne mapy ramanowskie po przetworzeniu za pomocą narzędzia internetowego RamApp (https://ramapp.io/):
    1. Zaloguj się do narzędzia internetowego.
    2. Zaimportuj dane hiperspektralne. Na karcie Moje analizy kliknij Nowy i prześlij plik .mat, zawierający zmienną danych przestrzennych i spektralnych oraz zmienną osi x (tj. wartości przesunięcia Ramana).
    3. Aby obciąć widmo do określonych obszarów w przesunięciu Ramana, w menu rozwijanym Kadrowanie i obracanie kliknij opcję Kadrowanie widmowe i zdefiniuj dolną granicę i górną granicę obszaru przesunięcia Ramana równą odpowiednio 600 cm-1 i 1800 cm-1.
      UWAGA: Wykonując to obcięcie widma, szeroki pik o wysokiej amplitudzie związany z materiałem kwarcowym szalki Petriego jest wyłączony z analizy.
    4. Aby skorygować widma Ramana dla promieni kosmicznych, w opcjach odszumiania kliknij Despike, wybierz Z-score jako metodę i ustaw próg równy 8.
      UWAGA: Funkcja wstępnego przetwarzania Despike pomaga rozwiązać problem pikseli zawierających skoki sygnału, które wynikają z promieniowania kosmicznego.
    5. Zaznacz opcję Użyj pierwszej różnicy , aby znaleźć wartości odstające przy użyciu pierwszej dyskretnej różnicy intensywności wzdłuż spektrum, a następnie zaznacz opcję Korekcja skoków. Widmo każdego uszkodzonego piksela zostanie zastąpione medianą widma sąsiednich pikseli.
    6. Kliknij Uruchom , aby skorygować kolce.
    7. Aby usunąć szum z map odpowiadających każdej liczbie falowej, w opcjach Odszumianie kliknij Wygładź mapę, wybierz Filtr mediany i ustaw rozmiar boku kwadratu, który jest brany pod uwagę podczas stosowania filtra na każdym pikselu mapy, równy 3 pikselom. Następnie kliknij przycisk Uruchom.
    8. Aby zastosować filtr w celu wygładzenia widma każdego piksela, kliknij Wygładź widmo w zaznaczeniach Odszumianie . Wybierz filtr Savitzky'ego-Golaya jako Metodę i ustaw długość okna filtru równą 7, a kolejność wielomianów filtru równą 2. Następnie kliknij przycisk Uruchom.
      UWAGA: Filtr Savitzky'ego-Golaya wymaga określenia długości okna filtru (dodatnia nieparzysta liczba całkowita) i kolejności wielomianu.
    9. Aby usunąć średni sygnał tła z pierwszego planu, otwórz panel Usuwanie podłoża optycznego i kliknij opcję Identyfikuj podłoże. Ustaw k-średnie jako metodę , a liczbę klastrów równą 2.
      UWAGA: Ta funkcja segmentuje komórki ("pierwszy plan") i ich podłoże przy użyciu podejścia grupowego. Będziesz wtedy mógł usunąć średni sygnał tła z pierwszego planu lub ograniczyć niektóre kroki, aby działały tylko na pikselach pierwszego planu. Liczba klastrów do wybrania może się różnić w zależności od konkretnego okazu.
    10. W opcjach zaawansowanych zaznacz opcję Czyszczenie morfologiczne , aby usunąć niektóre małe plamy z pierwszego planu (np. fałszywe części komórek itp.). Następnie kliknij przycisk Uruchom.
    11. Aby odjąć średni sygnał tła w panelu Usuwanie podłoża optycznego , kliknij opcję Usuń podłoże, a następnie wybierz opcję Średnia globalna (średnia z 95% środkowych wartości) i kliknij przycisk Uruchom.
      UWAGA: K-średnie są zazwyczaj szybsze, choć niedeterministyczne (jednakże, ponieważ losowe ziarno jest stałe, ten sam wynik zostanie uzyskany w każdym przebiegu, a wszystkie inne są równe). Liczba klastrów może zostać zwiększona powyżej 2, jeśli niektóre części pierwszego planu są nadal rozpoznawane jako tło. Klaster o najniższym średnim sygnale jest definiowany jako tło.
    12. Aby skorygować fluorescencję linii bazowej, otwórz panel Linia bazowa i kliknij opcję Popraw linię bazową. Wybierz asPLS (Adaptive Smoothness PLS) i ustaw λ równą 5000000. Następnie kliknij przycisk Uruchom.
      UWAGA: Dostępnych jest 7 metod, z których 5 jest opartych na karanych najmniejszych kwadratach (PLS). W tych metodach PLS konieczny jest parametr wygładzania (λ). Wyższa wartość λ spowoduje gładsze linie bazowe.
    13. Aby znormalizować każdą mapę hiperspektralną Ramana, dzieląc ją przez normę Frobeniusa, kliknij przycisk Różne i wybierz opcję Normalizuj . Następnie wybierz Frobenius jako metodę i kliknij przycisk Uruchom.
      UWAGA: Norma Frobeniusa jest wykorzystywana do normalizacji całej macierzy danych.
    14. Aby uzyskać obraz w sztucznych kolorach ilustrujący rozkład przestrzenny składnika subkomórkowego, w panelu Obrazy po prawej stronie, na obrazie intensywności kliknij symbol menu Otwórz . Następnie kliknij opcję Edytuj obraz , aby otworzyć panel edycji.
    15. Na panelu edycji wybierz Pojedyncze pasmo, a następnie zdefiniuj zakres spektralny (np. 715−725 cm-1 dla cytoplazmy). Wybierz opcję Podwójny kolor na mapie kolorów, zdefiniuj kolor, próg intensywności i krycie, a następnie kliknij przycisk Potwierdź.
    16. Aby pobrać widmo jednopunktowe, kliknij interesujący Cię piksel na obrazie, aby go wybrać. Następnie w panelu Legenda widma , w sekcji Kursor kliknij przycisk Pobierz widmo. Powtórz tę samą procedurę dla różnych składników subkomórkowych.
    17. Aby wyeksportować widma ramanowskie pierwszego planu i podłoża, w panelu Legenda widma w sekcji Identyfikacja podłoża kliknij przycisk Pobierz widmo zarówno dla sekcji Pierwszy plan , jak i Podłoże .
      UWAGA: W wcześniej opisanym protokole analizy danych RS opisano etapy przetwarzania wstępnego i analizę jednowymiarową w celu wygenerowania obrazów w sztucznych kolorach ilustrujących rozkład przestrzenny kluczowych składników subkomórkowych, widma intensywności Ramana zarówno z pierwszego planu, jak i podłoża oraz jednopunktowe widma struktur subkomórkowych. Podczas gdy dalsza analiza jest często dostosowana do konkretnego pytania biologicznego, w niniejszym badaniu zwrócono uwagę na reprezentatywne metody wielowymiarowe i klasyfikacyjne dostępne za pośrednictwem sekcji Analiza mapy zastosowanego narzędzia internetowego. Należą do nich analiza skupień, analiza głównych składowych (PCA), rozdzielczość krzywej wielowymiarowej (MCR), N-FINDR i dopasowanie spektralne. Dopasowanie spektralne umożliwia kwantyfikację i porównanie cech spektralnych przy użyciu podejść opartych na odległości, takich jak współczynnik korelacji Pearsona lub mapowanie kąta spektralnego. Analizę skupień można przeprowadzić przy użyciu algorytmów takich jak k-średnie, k-średnie Mini-batch lub hierarchiczne grupowanie aglomeracyjne, ułatwiające segmentację danych hiperspektralnych na podstawie podobieństwa spektralnego. PCA może być stosowany w celu zmniejszenia wymiarowości danych i podkreślenia wzorców wariancji, podczas gdy MCR umożliwia dekompozycję sygnałów mieszanych na czyste widma składowych. Algorytm N-FINDR pomaga w wyodrębnianiu widm elementów końcowych poprzez zastosowanie najpierw PCA w celu zmniejszenia wymiarowości, dzięki czemu jest szczególnie przydatny w przypadku zestawów danych hiperspektralnych. Narzędzia te zapewniają solidne ramy do dalszej eksploracji wzorców biologicznych zakodowanych w danych spektralnych Ramana.

4. Protokół pomiaru TPM

  1. Przygotuj konfigurację mikroskopu.
    1. Umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu. Umieść próbkę na stoliku translacyjnym mikroskopu. Dostosuj położenie próbki, aby wyrównać ją z soczewką obiektywu.
  2. Wyrównaj soczewki obiektywu i kondensatora.
    1. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do obrazowania TomoStudio. Kliknij ikonę mikroskopu na pasku narzędzi. Po zainicjowaniu kliknij przycisk Konfiguracja. Wybierz LiveCell w panelu Job ( Zadanie ) i PBS (PBS ) jako Medium (Nośnik).
      UWAGA: Wartość RI w panelu Medium ( Średnie ) jest automatycznie ustawiana na 1,337, gdy PBS jest wybrany jako średni.
    2. Uzyskaj dostęp do karty Kalibracja w panelu sterowania oprogramowania do obrazowania. Ustaw pozycje osiowe soczewek obiektywu i soczewki kondensora, wybierając odpowiednio Ostrość i Powierzchnia.
    3. Kliknij opcję Tryb skanowania , aby ręcznie wyregulować soczewki, upewniając się, że wzory oświetlenia są skoncentrowane w środku pola widzenia i wydają się prawie nieruchome.
  3. Zlokalizuj próbkę.
    1. Kliknij opcję Tryb normalny i dostosuj etap translacji, aby umieścić komórkę w polu widzenia. Skoncentruj się na próbce, dostosowując położenie osiowe soczewki obiektywu, aż granica próbki stanie się prawie niewidoczna na ekranie.
    2. Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować region bez komórek, zapewniając niezakłócony widok.
  4. Skalibruj system.
    1. Wybierz opcję Kalibruj w oprogramowaniu do obrazowania, aby przechwycić wiele hologramów 2D pod różnymi kątami oświetlenia.
  5. Uzyskaj tomogram 3D RI.
    1. Dostosuj etap tłumaczenia, aby wyśrodkować komórkę w polu widzenia. Przejdź do zakładki Akwizycja i wybierz Migawka 3D , aby uchwycić tomogram komórki.
      UWAGA: Czas akwizycji tomogramu 3D RI pojedynczego ogniwa jest znacznie krótszy (w ciągu kilku sekund) w porównaniu z czasem akwizycji wymaganym przez dane RS; w związku z tym zazwyczaj nie jest wymagane zastosowanie inkubatora na etapie dla TPM. Jeśli jednak mają być wykonane pomiary na dużej liczbie komórek lub w określonych warunkach, dostępne są dedykowane komercyjne komory inkubacyjne zapewniające warunki fizjologiczne, które można zintegrować z systemem TPM.

5. Analiza danych TPM

  1. Przetwarzanie map TPM po użyciu oprogramowania TomoStudio.
    1. Aby zwizualizować tomogramy holograficzne, zaznacz dane w panelu Nawigacja po danych , kliknij je prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij polecenie Otwórz. Zakładka Badania otworzy się automatycznie do dalszej analizy. W panelu Data Manager (Menedżer danych ) kliknij RI Tomogram (RI Tomogram).
    2. W panelu Wizualizacja woluminu wybierz opcję RI i narysuj cztery prostokątne kolorowe pola na płótnie RI.
      UWAGA: Każde pole koloru umożliwia skojarzenie, na tomogramie pokazanym w panelu Wyświetlacz , określonego koloru ze składnikami komórek charakteryzującymi się zakresem RI identyfikowanym przez ramkę na płótnie RI. Po narysowaniu każdego pola koloru powiązane informacje automatycznie pojawiają się w tabeli poniżej płótna RI.
    3. W panelu poniżej obszaru roboczego wystąpień zarezerwowanych ustaw minimalne i maksymalne wartości zakresu wystąpień zarezerwowanych dla każdego pola koloru (tj. pierwsze pole koloru: MinRI = 1,3450 i MaxRI = 1,3499, drugie pole koloru: MinRI = 1,3506 i MaxRI = 1,3571, trzecie pole koloru: MinRI = 1,3586 i MaxRI = 1,3650, czwarte pole koloru: MinRI = 1,3688 i MaxRI = 1,3866). Skojarz wartość krycia i kolor (klikając dwukrotnie każde pole i wybierając kolor) z każdym polem. Pozwala to na wizualizację tomogramów zgodnie z rozkładami 3D RI.
    4. Kliknij przycisk Zapisz , aby zapisać zdefiniowane zakresy wystąpień zarezerwowanych i pola kolorów.
      UWAGA: Zakresy RI należy dostosować w zależności od konkretnych próbek.
    5. Aby uzyskać ilościowe deskryptory morfologii komórki (tj. objętość [V], pole powierzchni [S], obszar rzutowany [A], średnie RI, gęstość [D], sucha masa [DM] i sferyczność [Φ]), należy skorzystać z interfejsu Analiza .
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat teoretycznych obliczeń parametrów ilościowych można znaleźć tutaj 2,23.
      1. Na pasku narzędzi kliknij przycisk Analiza. W panelu Analysis (Analiza ) po prawej stronie wybierz opcję Manual (Ręcznie ) w panelu Segmentation (Segmentacja ) i ustaw wartość 1,3450 (RI) jako RI Threshold (Próg wystąpień zarezerwowanych). Następnie kliknij przycisk Zastosuj.
        UWAGA: Upewnij się, że wartości RII (fl/pg) i wyjściowego RI wynoszą odpowiednio 0,19 (przyrost refrakcji, który jest szeroko ustalony przez poprzednie badania24) i 1,3370 (RI PBS zastosowany do RI kalibracji tła PBS). Oprogramowanie do obrazowania przeprowadza segmentację wolumetryczną komórki docelowej zgodnie z ustawionym progiem RI i oblicza indeksy morfologiczne (V, S, A, średnia RI, D, DM i Φ) i zgłasza je w tabeli wyjściowej w panelu Pomiar .
      2. Kliknij przycisk Zapisz , aby zapisać obliczone indeksy morfologiczne.
        UWAGA: Oprócz zastosowanego oprogramowania, do ilościowego określania cech morfologicznych na podstawie danych TPM można użyć kilku narzędzi typu open source. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) zapewnia narzędzia do analizy obrazu, w tym segmentacji i wyodrębniania cech, które są kompatybilne z obrazami z kontrastem fazowym. Fidżi (https://fiji.sc/) to oprogramowanie typu open source z wtyczkami do segmentacji i obliczania parametrów morfologicznych25. Napari (https://napari.org/) to wielowymiarowa przeglądarka obrazów z obsługą integracji modeli uczenia maszynowego w celu segmentacji i analizy. Ilastik (https://www.ilastik.org/) oferuje narzędzia segmentacji oparte na uczeniu maszynowym, a DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) integruje modele głębokiego uczenia z ImageJ/Fiji w celu zaawansowanej analizy. Poza tym MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) dostarcza narzędzia do operacji morfologicznych 2D i 3D na Fidżi. Cellpose326 to kolejne narzędzie do segmentacji komórek oparte na głębokim uczeniu, które można zastosować do obrazowania z kontrastem fazowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy przebieg pracy dla bezznacznikowej charakterystyki morfochemicznej żywych komórek w oparciu o konfokalne RS i TPM. Przetestowaliśmy zdolność proponowanego przepływu pracy do uzyskania składu molekularnego i parametrów morfologicznych linii komórkowej ludzkiego raka piersi MDA-MB-231 (ryc. 1).

Komórki MDA-MB-231 wysiewano na kwarcowych płytkach Petriego ze szkłem Petriego. Specjalnie skonstruowany konfokalny mikroskop Ramana (ryc. 1A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprezentowaliśmy podejście multimodalne i prosty proces analizy, integrujący dwie zaawansowane, bezznacznikowe techniki obrazowania: RS i TPM. Opisany przebieg pracy umożliwił szybkie, nieinwazyjne fenotypowanie morfochemiczne żywych pojedynczych komórek ludzkiego raka piersi (MDA-MB-231) bez konieczności zewnętrznego znakowania.

RS jest techniką nieniszczącą, która pozwala na scharakteryzowanie składu biochemicznego próbek biologicznych poprzez detekcję modów wibracyjnych cząsteczek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały sfinansowane przez Progetto Rocca z fundacji MIT-Italy, granty NIH (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Seul, Korea Południowa) i National Cancer Center, Korea (NCC-24H1170). Leonardo Bianchi dziękuje za przyznanie stypendium podoktorskiego Progetto Rocca na prowadzenie wspólnych badań w Massachusetts Institute of Technology i Politecnico di Milano.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera CCDInstrumenty PrincetonPIXIS 100BR eXcelonDetektor sygnału rozpraszania Ramana.
Oprogramowanie do sterowania kamerą CCDInstrumenty PrincetonPole świetlne
Laser Ti-Sapphire o fali ciągłej (długość fali: 785 nm)Fizyka widm3900 SSłuży do wzbudzania mikroskopią ramanowską.
Lustro dichroiczneThorLabs powiedział:DMSP750BLustro dichroiczne 749 nm, odchyla wzbudzenie Ramana 785 nm do próbki, odfiltrowuje sygnały fluorescencji i jasnego pola.
Surowica bydlęca płoduThermo Fisher NaukowyA5256701
Korpus mikroskopu fluorescencyjnegoOlympusZobacz materiał IX83
Laser (długość fali: 532 nm)Fizyka widmTysiąclecia eVLaser pompujący do systemu laserowego Ti-Sapphire 785 nm.
Oprogramowanie MATLABMathWorks (Prace matematyczne)2023a
Linia komórkowa MDA-MB-231Kontroler ATCC (Kontroler TZobacz materiał HTB-26
Spektrograf NIRAndror powiedział:Holospecyfikacja HS-HSG-785-LFSłuży do analizy spektralnej światła wstecznie rozproszonego.
Soczewka obiektywu (60 razy; zanurzenie w wodzie 1,2 NA)OlympusUPLSAPO60 razy;
Komora inkubacyjna na scenieHit TokajuSTXG-welsx-zestaw
Oprogramowanie do sterowania mikroskopem typu open source&mikro; MenedżerMikro-Menedżer-2.0
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Naukowy15140122
Bez fenolu DMEM/F-12Thermo Fisher Naukowy21041025
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco (firma Gibco)10-010-023
Płytki Petriego ze szkłem kwarcowymObudź się B TechZobacz materiał SF-S-D12
Oprogramowanie do analizy danych RamanaRamApp (Kanał RamAppInternetowe narzędzie do przetwarzania danych hiperspektralnych Ramana.
Kamera sCMOSFotonika HamamatsuOrca Flash 4.0 v2
Pompa strzykawkowaChemyx (Chemyks)Fuzja 720
Tomograficzny mikroskop fazowyTomocube, Inc.HT-2HKomercyjny system do uzyskiwania ilościowych obrazów fazowych.
Oprogramowanie do analizy danych TPMTomocube, Inc.TomoStudio (Pracownia Górnicza)Oprogramowanie służące do analizy danych z tomograficznej mikroskopii fazowej (TPM).

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).
  2. Bresci, A., et al. Label-free morpho-molecular phenotyping of living cancer cells by combined Raman spectroscopy and phase tomography. Commun Biol. 7 (1), 1-13 (2024).
  3. Rocha, R. A., Fox, J. M., Genever, P. G., Hancock, Y. Biomolecular phenotyping and heterogeneity assessment of mesenchymal stromal cells using label-free Raman spectroscopy. Sci Rep. 11 (1), 4385(2021).
  4. Vicar, T., et al. Cell segmentation methods for label-free contrast microscopy: review and comprehensive comparison. BMC Bioinform. 20 (1), 360(2019).
  5. Kang, J. W., et al. Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis. Biomed Opt Express. 2 (9), 2484-2492 (2011).
  6. Pandey, R., et al. Integration of diffraction phase microscopy and Raman imaging for label-free morpho-molecular assessment of live cells. J Biophotonics. 12 (4), e201800291(2019).
  7. Zhao, W., Sun, D., Yue, S. Label-free multimodal non-linear optical imaging of three-dimensional cell cultures. Front Phys. 10, 1100090(2023).
  8. Hanna, K., et al. Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects. Br J Cancer. 126 (8), 1125-1139 (2022).
  9. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  10. Puppels, G. J., et al. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature. 347 (6290), 301-303 (1990).
  11. Elumalai, S., Managó, S., De Luca, A. C. Raman microscopy: progress in research on cancer cell sensing. Sensors (Basel). 20 (19), 5525(2020).
  12. Chandra, A., et al. Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research. ACS Omega. 9 (51), 50049-50063 (2024).
  13. Cacace, T., Bianco, V., Ferraro, P. Quantitative phase imaging trends in biomedical applications. Opt Laser Eng. 135, 106188(2020).
  14. Nguyen, T. L., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine. ACS Nano. 16 (8), 11516-11544 (2022).
  15. Kuś, A., et al. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. J Biomed Opt. 19 (4), 046009(2014).
  16. Memmolo, P., et al. Loss minimized data reduction in single-cell tomographic phase microscopy using 3D Zernike descriptors. Intell Comput. 2, 0010(2023).
  17. Jin, D., Zhou, R., Yaqoob, Z., So, P. T. C. Tomographic phase microscopy: principles and applications in bioimaging [Invited]. JOSA B. 34 (5), B64-B77 (2017).
  18. Pirone, D., et al. Stain-free identification of cell nuclei using tomographic phase microscopy in flow cytometry. Nat Photonics. 16 (12), 851-857 (2022).
  19. Bresci, A., et al. Non-invasive morpho-molecular imaging reveals early therapy-induced senescence in human cancer cells. Sci Adv. 9 (37), eadg6231(2023).
  20. Ghislanzoni, S., et al. Optical diffraction tomography and Raman confocal microscopy for the investigation of vacuoles associated with cancer senescent engulfing cells. Biosensors. 13 (11), 973(2023).
  21. Bischof, J., et al. Multimodal bioimaging across disciplines and scales: challenges, opportunities and breaking down barriers. npj Imageing. 2 (1), 1-6 (2024).
  22. Kobayashi-Kirschvink, K. J., et al. Prediction of single-cell RNA expression profiles in live cells by Raman microscopy with Raman2RNA. Nat Biotechnol. 42 (11), 1726-1732 (2024).
  23. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  24. Kim, K., Lee, S., Yoon, J., Heo, J., Choi, C., Park, Y. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Sci Rep. 6 (1), 36815(2016).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22 (3), 592-599 (2025).
  27. Talari, A. C. S., Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 50 (1), 46-111 (2015).
  28. Hobro, A. J., et al. Raman and Raman optical activity (ROA) analysis of RNA structural motifs in Domain I of the EMCV IRES. Nucleic Acids Res. 35 (4), 1169-1177 (2007).
  29. Samuel, A. Z., Sugiyama, K., Ando, M., Takeyama, H. Direct imaging of intracellular RNA, DNA, and liquid-liquid phase separated membraneless organelles with Raman microspectroscopy. Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).
  30. Kuhar, N., Sil, S., Umapathy, S. Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 258, 119712(2021).
  31. Park, C., Shin, S., Park, Y. Generalized quantification of three-dimensional resolution in optical diffraction tomography using the projection of maximal spatial bandwidths. JOSA A. 35 (11), 1891-1898 (2018).
  32. Bresci, A., et al. Label-free monitoring of embryonic development in living colonies by combining Raman spectroscopy and tomographic phase microscopy. Multiscale Imaging Spectrosc VI. PC13327, PC1332703(2025).
  33. Baczewska, M., et al. Refractive index changes of cells and cellular compartments upon paraformaldehyde fixation acquired by tomographic phase microscopy. Cytometry A. 99 (4), 388-398 (2021).
  34. Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 42 (5), 493-541 (2007).
  35. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nat Protoc. 11 (4), 664-687 (2016).
  36. Allakhverdiev, E. S., et al. Raman spectroscopy and its modifications applied to biological and medical research. Cells. 11 (3), 386(2022).
  37. Xu, J., et al. Unveiling cancer metabolism through spontaneous and coherent Raman spectroscopy and stable isotope probing. Cancers. 13 (7), 1718(2021).
  38. Swain, R. J., et al. Assessment of cell line models of primary human cells by Raman spectral phenotyping. Biophys J. 98 (8), 1703-1711 (2010).
  39. Smith, R., Wright, K., Ashton, L. Raman spectroscopy: an evolving technique for live cell studies. Analyst. 141 (12), 3590-3600 (2016).
  40. Du, J., et al. Raman-guided subcellular pharmaco-metabolomics for metastatic melanoma cells. Nat Commun. 11 (1), 4830(2020).
  41. Jones, R. R., et al. Raman techniques: fundamentals and frontiers. Nanoscale Res Lett. 14, 231(2019).
  42. Shirokova, O., et al. Possibilities of holotomographic microscopy for studying primary cell cultures of the brain. Proc IEEE CNN. 208 (211), 208-211 (2024).
  43. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  44. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  45. Jung, J., et al. Label-free non-invasive quantitative measurement of lipid contents in individual microalgal cells using refractive index tomography. Sci Rep. 8 (1), 6524(2018).
  46. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Opt Lett. 36 (23), 4677-4679 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrospektroskopia ramanowskatomograficzna mikroskopia fazowaobrazowanie bez znakowaniafenotypowanie morfochemicznehiperspektralne obrazowanie ramanowskietomografia wsp czynnika za amania wiat aanaliza morfologii kom rekmapowanie subkom rkowe

Powiązane artykuły