Wykrywanie kwasu nukleinowego Mycoplasma pneumoniae i genu oporności na leki

Podsumowanie

Protokół ten zapewnia szybki i niezawodny sposób wykrywania zakażeń Mycoplasma pneumoniae i identyfikacji oporności na antybiotyki. Pomaga lekarzom w szybszym doborze odpowiednich metod leczenia, poprawiając opiekę nad pacjentami z zapaleniem płuc i wspierając lepsze stosowanie antybiotyków

Streszczenie

Mycoplasma pneumoniae (Mp) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych patogenów odpowiedzialnych za pozaszpitalne zapalenie płuc (CAP) w populacjach pediatrycznych. Wykrycie genów oporności na Mycoplasma pneumoniae zapewnia solidne wsparcie techniczne i teoretyczne podstawy do precyzyjnej diagnozy klinicznej i leczenia zakażeń MP. Dokładna diagnoza i ocena lekooporności w zakażeniu Mp są niezbędne w leczeniu klinicznym. Typowe metody wykrywania Mycoplasma pneumoniae obejmują hodowlę, wykrywanie przeciwciał i testy oparte na biologii molekularnej. Posiew Mp jest złotym standardem w diagnostyce, ale wymaga specjalnego podłoża, jest czasochłonny i ma niską czułość. Wykrywanie Mp na podstawie przeciwciał jest szeroko stosowane; Jednak wyniki fałszywie ujemne mogą wystąpić we wczesnym stadium zakażenia. Wykrywanie oparte na biologii molekularnej zapewnia szybki zwrot, niskie ryzyko zanieczyszczenia, wysoką czułość, wysoką swoistość i nie jest ograniczone czasem pobrania próbki ani statusem immunologicznym. Dlatego został uznany za nowy złoty standard w diagnozowaniu zakażenia Mycoplasma pneumoniae . Leki makrolidowe są leczeniem pierwszego wyboru w przypadku zakażenia Mp u dzieci. Jednak wraz z szerokim stosowaniem makrolidów w zakażeniach dróg oddechowych u dzieci, częstość występowania lekoopornego zakażenia Mycoplasma pneumoniae wzrasta. Pacjenci zakażeni szczepami opornymi doświadczają znacznie dłuższego czasu trwania gorączki, przedłużonej hospitalizacji i przedłużonej gorączki po podaniu w porównaniu z osobami zakażonymi szczepami wrażliwymi. Zidentyfikowane do tej pory miejsca mutacji to 2063, 2064, 2067 i 2617. W Chinach mutacje punktowe zostały udokumentowane tylko na pozycjach 2063 i 2064, przy czym najczęstsza jest substytucja A-to-G na pozycji 2063. W tych miejscach zastosowano reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w połączeniu z technologią sondy fluorescencyjnej do wykrywania kwasów nukleinowych i mutacji oporności na leki Mycoplasma pneumoniae w próbkach ludzkiej plwociny. Wykrywanie genów oporności na Mycoplasma pneumoniae zapewnia kluczowe wsparcie techniczne i teoretyczną podstawę do dokładnej diagnozy i skutecznego leczenia zakażenia MP.

Wprowadzenie

Mycoplasma pneumoniae (Mp) jest najmniejszym mikroorganizmem chorobotwórczym zdolnym do samodzielnego przetrwania, znajdującym się na pozycji pośredniej między bakteriami a wirusami. Jest on przenoszony głównie drogą kropelkową lub aerozolami z dróg oddechowych i stanowi drugi najczęstszy patogen związany z pozaszpitalnym zapaleniem płuc (CAP) u dzieci¹, odpowiedzialny za 20% do 40% przypadków CAP². Mp wykazuje wrodzoną oporność na antybiotyki β-laktamowe, takie jak penicylina i cefalosporyny, ze względu na brak ściany komórkowej, na którą antybiotyki te są ukierunkowane, utrudniając syntezę ściany komórkowej. Główne metody terapeutyczne zakażeń Mp obejmują czynniki hamujące syntezę białek, w tym makrolidy i tetracykliny, a także farmaceutyki utrudniające replikację DNA, takie jak tetracykliny i fluorochinolony ^3,4,5. W związku z tym szybka identyfikacja laboratoryjna Mp ma zasadnicze znaczenie dla informowania o rozsądnym stosowaniu antybiotyków. Współczesne laboratoryjne metody wykrywania Mp obejmują izolację i hodowlę, wykrywanie antygenów, wykrywanie przeciwciał i genetyczne techniki diagnostyczne.

Jako tradycyjna metoda wykrywania, izolacja i hodowla nadal stanowią ostateczny standard diagnozowania zakażenia Mycoplasma pneumoniae . Kashyap i wsp. zaobserwowali, że hodowla Mp z wymazów z gardła lub próbek plwociny jest niezawodną techniką diagnostyczną⁶. Podejście to napotyka na poważne przeszkody, takie jak rygorystyczne wymagania kulturowe Mp, wydłużone okresy posiewu i zazwyczaj niskie wskaźniki dodatnich wykrywalności, które ograniczają jego rutynowe zastosowanie kliniczne. Wykrywanie antygenu Mp zależy od przeciwciał specyficznych dla Mp. Miyashita i in. wykorzystali przeciwciała monoklonalne z różnych szczepów Mp jako środki powlekające w teście ELISA kanapkowym z podwójnym przeciwciałem i ocenili ich skuteczność za pomocą PCR⁷. Wyniki nie wykazały istotnych różnic między tymi dwiema metodologiami. Jednak konieczność stosowania wysoce swoistych przeciwciał monoklonalnych o wysokim mianie ogranicza szerokie zastosowanie tej metody.

Po zakażeniu Mp układ odpornościowy wytwarza swoiste przeciwciała IgM i IgG. Przeciwciała IgM na ogół stają się wykrywalne w ciągu 1 tygodnia po zakażeniu i osiągają szczyt po 3 do 4 tygodniach, co czyni je cennymi wskaźnikami diagnostycznymi dla wczesnej infekcji. Jednak w początkowych stadiach mogą pojawić się wyniki fałszywie ujemne z powodu obniżonego poziomu przeciwciał⁸. I odwrotnie, przeciwciała IgG ujawniają się później i zazwyczaj oznaczają przebytą infekcję ^9,10. Wykrywanie serologiczne Mp dzieli się na nieswoiste i swoiste testy przeciwciał. Chociaż testy na przeciwciała nieswoiste są proste do przeprowadzenia, ich swoistość jest ograniczona, ponieważ infekcje innymi patogenami, w tym riketsjami i adenowirusem, mogą również zwiększać poziom zimnej aglutyniny, co skutkuje fałszywie dodatnimi wynikami. Testy swoistych przeciwciał obejmują test wiązania dopełniacza, test aglutynacji cząstek, test hemaglutynacji pośredniej, test immunofluorescencji pośredniej i test immunoenzymatyczny (ELISA). Test ELISA jest szeroko stosowany w Chinach ze względu na uznaną technologię i dostępność komercyjną, zapewniając wysoką czułość i prostotę obsługi, służąc tym samym jako praktyczna i niezawodna metoda diagnozowania zakażeń Mp w rutynowej praktyce klinicznej¹¹.

Fluorescencyjny ilościowy PCR w czasie rzeczywistym wyróżnia się szybkim czasem przetwarzania, podwyższoną swoistością, solidną czułością i brakiem reaktywności krzyżowej. Ta metoda identyfikuje DNA Mp w próbkach plwociny, wymazu z gardła lub płynu z płukania oskrzeli i wymaga 1-100 ng DNA na reakcję. Detekcję przeprowadzono za pomocą przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym. Matryca DNA ulega denaturacji w wyższych temperaturach, a następnie wyżarzaniu starterów i hybrydyzacji sondy fluorescencyjnej. Technologia amplifikacji genów umożliwia replikację fragmentów kwasu nukleinowego w ekstremalnie niskich stężeniach do milionów kopii w krótkim czasie, osiągając czułość wykrywania ≥10 CFU/ml¹². W porównaniu z konwencjonalnym PCR, fluorescencyjny ilościowy PCR w czasie rzeczywistym zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia, umożliwiając jednocześnie wysokowydajną i zautomatyzowaną analizę. W związku z tym stała się ulubioną techniką bezpośredniego wykrywania Mp w praktyce klinicznej¹³. Ze względu na zwiększoną czułość konieczne są rygorystyczne środki, aby zapobiec zanieczyszczeniu, które może skutkować fałszywie dodatnimi lub fałszywie ujemnymi wynikami.

W leczeniu klinicznym makrolidy stanowią główną interwencję terapeutyczną w zapaleniu płuc wywołanym przez Mycoplasma pneumoniae (MPP). Nadmierne stosowanie i niewłaściwe stosowanie antybiotyków wywarło presję selekcyjną, prowadząc do pojawienia się Mp opornych na makrolidy. Ta odporność jest znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do powstawania ogniotrwałego MPP. Oporność na makrolidy w Mycoplasma pneumoniae jest znacznie wyższa w Azji Wschodniej, szczególnie w Chinach i Japonii, podczas gdy Europa i Stany Zjednoczone wykazują stosunkowo niższe wskaźniki oporności. Pacjenci pediatryczni na ogół wykazują podwyższone wskaźniki oporności w porównaniu z dorosłymi, co wymaga wzmożonej kontroli¹⁴. Od 2000 r. częstość występowania zakażeń Mycoplasma pneumoniae (MRMPI) znacznie wzrosła w skali globalnej, zwłaszcza w Azji Wschodniej. W Chinach szczepy MRMPI stanowią od 69% do 95% przypadków¹⁵, znacząco przyczyniając się do ciężkiej choroby, niepowodzenia leczenia, powikłań i długoterminowych następstw. Badania wskazują, że mutacje w genie 23S rRNA hamują wiązanie makrolidów z miejscami docelowymi, co w konsekwencji zmniejsza skuteczność leku. Loci częstych mutacji obejmują pozycje 2063, 2064, 2067 i 2617. W Chinach mutacje zostały zidentyfikowane wyłącznie na pozycjach 2063 i 2064^16,17. Badanie z 2016 r. wykazało, że wskaźniki oporności na makrolidy w Pekinie, Harbinie, Szanghaju i Sinciangu wahały się od 66,7% do 86,7%, podczas gdy w Nankinie wskaźnik ten był niższy i wynosił 20%¹⁸. Szczepy oporne na makrolidy pojawiły się w różnych regionach, a wskaźniki oporności odnotowano w następujący sposób: 8,3%-9,8% we Francji, 3,0%-3,6% w Niemczech, 8,2% w Stanach Zjednoczonych, 0,9%-2,9% w Danii, 12,1% w Kanadzie, 20% we Włoszech, 22% w Izraelu, 8% w Hiszpanii i 9,3% w Wielkiej Brytanii 19,20,21,22,23,24,25,26^{, Lokal mieszkalny 27}. Tendencja ta podkreśla ogólnoświatowe rozprzestrzenianie się oporności na makrolidy. W 2008 roku Hindley i wsp. opisali 46 przypadków opornego na makrolidy Mycoplasma pneumoniae, z czego 40 przypadków wykazało mutację A2063G, jeden przypadek przedstawił mutację A2063C, a pięć przypadków wykazało mutację A2064G²⁸. Porównywalne mutacje oporności zostały zidentyfikowane w Japonii i Stanach Zjednoczonych, przy czym pierwotne mutacje występują w pozycjach 2063 i 2064²⁹. Badania sugerują związek między miejscami mutacji a fenotypami oporności na leki: mutacja A2063G nadaje oporność na 14-członowe makrolidy (ML), mutacja A2064G nadaje oporność zarówno na 14-, jak i 16-członową ML, C2617G nadaje oporność na 14- i 15-członową ML, a mutacja A2067G nadaje oporność na 16-członową ML³⁰. Monitorowanie oporności na Mp ma kluczowe znaczenie dla wczesnej identyfikacji zakażeń lekoopornych i informowania o klinicznych wyborach terapeutycznych. Badania wykazały, że badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe in vitro może prognozować skuteczność kliniczną leku³¹. W 2011 r. American Clinical and Laboratory Standards Institute ogłosił wytyczne zalecające metodę mikrorozcieńczenia w celu ustalenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) w celu oceny oporności na makrolidy³². Jednak określenie MIC może zająć kilka tygodni, co ogranicza jego przydatność kliniczną w kierowaniu antybiotykoterapią w czasie rzeczywistym.

Sekwencjonowanie Sangera jest bezpośrednią techniką identyfikacji mutacji w genie 23S rRNA Mp. Metoda ta wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie nukleotydy i analizę elektroforetyczną w celu ustalenia sekwencji DNA, ułatwiając identyfikację zmienności genetycznej Mpix. Sekwencjonowanie Sangera, choć zdolne do jednoczesnej identyfikacji wielu mutacji i ilościowego określania proporcji szczepów opornych i podatnych, jest pracochłonne i czasochłonne, co ogranicza jego użyteczność kliniczną^33,34. Natomiast pirosekwencjonowanie zapewnia dokładniejszą ocenę zmian sekwencji DNA poprzez identyfikację uwalniania pirofosforanu podczas inkorporacji nukleotydów. Metoda ta może identyfikować szczepy MRMPI i określać ilościowo proporcje szczepów opornych i podatnych w próbkach klinicznych z większą dokładnością niż sekwencjonowanie Sangera. Ponadto pirosekwencjonowanie umożliwia długotrwałe monitorowanie poszczególnych pacjentów, co pozwala na ocenę w czasie rzeczywistym rozwijającej się oporności i informowanie o modyfikacjach leczenia³³. Jednak jego zastosowanie kliniczne jest ograniczone koniecznością specjalistycznej aparatury, biegłego personelu i wydłużonego czasu przetwarzania.

Na podstawie analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) genu P1, Mp dzieli się na dwa typy: typ I (dalej podzielony na pięć podtypów: 1a-1e) i typ II (dalej podzielony na trzy podtypy: 2a-2c). Ten test może wykryć 8 podtypów genów Mycoplasma pneumoniae³⁵. Metoda ta ułatwia jakościową identyfikację mutacji Mycoplasma pneumoniae i mutacji oporności na makrolidy (miejsca mutacji 23S rRNA 2063 (A:G) i 2064 (A:G)) w próbkach plwociny pediatrycznej, zapewniając szybki i prosty dodatkowy instrument diagnostyczny dla zakażeń Mycoplasma i nadzoru nad opornością na antybiotyki.

Protokół

Wszystkie protokoły badań zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Szpitala Ludowego Heyuan (nr zatwierdzenia. YXYJLL-LW2025001). Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę przed uczestnictwem.

1. Pobieranie próbek

UWAGA: Zachowaj ostrożność w utrzymywaniu techniki aseptyki podczas pobierania próbki.

1. Zbierz próbki plwociny pacjenta lub pacjenta podejrzanego o zakażenie. Próbki należy pobrać w ciągu 3 dni od wystąpienia choroby u pacjenta.
2. Poinstruuj pacjenta, aby przepłukał usta wodą, oddychał głęboko, wstrzymał oddech na 5 s i stopniowo wydychał powietrze.
3. Poproś pacjenta o ponowne głębokie wydech, spróbuj wydalić plwocinę, umieść ją w przeznaczonym do tego plastikowym kubku i zabezpiecz pokrywkę. Plwocina powinna być niezwłocznie dostarczona do laboratorium klinicznego w temperaturze pokojowej (RT). Próbki należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C w lodówce.

2. Przygotowanie odczynników do amplifikacji

1. W obszarze przygotowania odczynników w laboratorium PCR rozmrozić bufor, sondę startera i wodę z zestawu w temperaturze 4 °C po wyjęciu ich z zamrażarki w temperaturze -20 °C. Usunąć enzym, delikatnie wymieszać go przez wstrząsanie, a następnie odwirować przy 1,006 x g przez 10 s.
2. Pobrać sterylną probówkę wirówkową wolną od nukleaz, oznaczyć ją i przygotować system reakcji dla każdej osoby, jak opisano w Tabeli 1. Całkowita liczba reakcji PCR musi być równa sumie próbek, jednej słabej dodatniej kontroli jakości, jednej kontroli jakości produktu W i jednej kontroli ekstrakcji ujemnej.
3. Określ ilość każdego odczynnika, wprowadź go do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości, dokładnie wymieszaj i krótko odwiruj na niskich obrotach. Dozować 20 μl odczynnika do każdej probówki reakcyjnej PCR i przenieść ją do obszaru przetwarzania próbki.

3. Leczenie próbki

1. Potraktuj 1 ml próbek plwociny 2 ml buforu do trawienia plwociny, dokładnie wymieszaj wirowo i inkubuj przez 30 minut, aż do całkowitego upłynnienia.
2. W zależności od ilości próbki dodać kolejno 5 μl wzorca wewnętrznego do 1^{. i 7. kolumny} płytki do ekstrakcji kwasów nukleinowych, a następnie dodać kolejno 200 μl skroplonych próbek, soli fizjologicznej i MM słabej dodatniej kontroli jakości.
3. Pobierz płytkę do ekstrakcji kwasów nukleinowych za pomocą automatycznego przyrządu do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Dodać wyekstrahowane kwasy nukleinowe po przeprowadzeniu dalszych analiz w kolumnach 6 i 12 płytki ekstrakcyjnej.
4. Dodawanie próbki: W obszarze przygotowania próbki w laboratorium PCR dodaj wyekstrahowany kwas nukleinowy do 6^{. i} 12^{. kolumny} płytki ekstrakcyjnej. Następnie przenieś 5,0 μl przygotowanej próbki kwasu nukleinowego do probówki reakcyjnej PCR, która zawiera mieszaninę reakcyjną PCR (w tym próbka, silne i słabe dodatnie kontrole jakości, kontrola jakości W i kontrola ujemna ekstrakcji).
5. Zabezpiecz ciecz z probówki reakcyjnej PCR i natychmiast odwiruj, aby potwierdzić, że ciecz jest prawidłowo uszczelniona i pozbawiona pęcherzyków.

4. Wzmocnienie

1. Włóż probówkę reakcyjną do detektora fluorescencyjnego PCR i skonfiguruj parametry cyklu w następujący sposób w tabeli 2.
2. Pozyskiwanie sygnałów fluorescencyjnych w FAM (mutacja 2063 lub 2064 A:G), VIC (Mycoplasma pneumoniae) i CY5 (wzorzec wewnętrzny), przy zbieraniu danych ustawionych na 64 °C.

5. Analiza danych

UWAGA: W badaniu tym zastosowano ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), z reprezentatywnymi wynikami wskazującymi na mutacje związane z opornością A:G w pozycjach 2063 lub 2064 Mycoplasma pneumoniae. Pacjenci, u których wynik testu jest dodatni, powinni unikać stosowania antybiotyków makrolidowych w leczeniu klinicznym.

1. Po reakcji przyrząd autonomicznie analizuje i archiwizuje wyniki. Sprawdzić, czy geny docelowe do kontroli ujemnej wykazują fluorescencję FAM Ct ≥ 35,33 i fluorescencję VIC Ct ≥ 35,01, podczas gdy geny docelowe do kontroli jakości W wykazują fluorescencję FAM Ct ≥ 35,33 i fluorescencję VIC Ct ≥ 35,01. Wartości Ct dla fluorescencji FAM i VIC w produktach słabo dodatniej kontroli jakości wahały się od 29,00 do 34,00.
2. Generalnie wartość Ct wzorca wewnętrznego wynosi ≤ 35,00. Jeśli zaobserwowana jest charakterystyczna krzywa amplifikacji S, ale wzorzec wewnętrzny nie jest amplifikowany z powodu podwyższonego stężenia genu docelowego, należy zgłosić go bezpośrednio jako próbkę dodatnią lub ponownie ocenić próbkę przez 10-krotne rozcieńczenie gradientowe.
3. Sklasyfikować próbkę wykazującą UNDECT lub brak typowej krzywej amplifikacji typu S jako ujemną.
4. Uznaje się, że próbki są ujemne, gdy fluorescencja FAM (mutacja 2063 lub 2064 A:G) Ct ≥ 35,33, fluorescencja VIC (Mycoplasma pneumoniae) Ct ≥ 35,01 lub gdy nie ma typowej krzywej amplifikacji typu S. Uznaje się, że próbki są dodatnie, gdy ich wartość Ct jest zgodna z tabelą 3 i wykazują charakterystyczną krzywą amplifikacji typu S.
   UWAGA: Wyniki wykrywania próbek zależą od jakości pobierania, przetwarzania, transportu i konserwacji próbki; Wszelkie błędy mogą skutkować fałszywie ujemnymi wynikami. Brak kontroli zanieczyszczenia krzyżowego podczas przetwarzania próbki może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami.

Wyniki

Po upłynnieniu, ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji fluorescencyjnej PCR próbek plwociny, wartość początkowa, wartość końcowa i wartość progowa linii podstawowej zostały zmodyfikowane po analizie krzywej amplifikacji. Wartość początkowa wynosiła 3, a wartość końcowa wynosiła 20.

Reprezentatywne wyniki tego eksperymentu były pozytywne dla kwasu nukleinowego M, a mutacja oporności A: G wystąpiła w 2063 lub 2064 miejscach...

Dyskusja

PCR i jego pochodne wykazują wyższą czułość i swoistość w porównaniu z metodami serologicznymi w identyfikacji, typowaniu i wykrywaniu lekooporności w Mycoplasma pneumoniae (MP). Co więcej, techniki oparte na PCR zapewniają łatwość obsługi i mniejsze wydatki, co czyni je realną alternatywą dla rutynowej diagnostyki klinicznej³⁶. Mp jest znaczącym patogenem związanym z CAP i wykazuje znaczne rozpowszechnienie³⁷. Wybór odpowiednich antybiotyków może przyspieszyć powr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zautomatyzowany przyrząd do ekstrakcji kwasów nukleinowych	Kanton da 'an Gene Co., Ltd.	Inteligentny 32
Wskazówki dotyczące filtrów	Coring Life Science Co., Sp. z o.o.	29822001	0-10 i mikro; L
Wskazówki dotyczące filtrów	Coring Life Science Co., Sp. z o.o.	03023001	1-50 i mikro; L
Wskazówki dotyczące filtrów	Coring Life Science Co., Sp. z o.o.	05623001	5-300 i mikro; L
Mikrorurki	Coring Life Science Co., Sp. z o.o.	14124934	1,5 ml
Mycoplasma pneumoniae zestaw do wykrywania miejsc mutacji kwasów nukleinowych i oporności na leki (metoda fluorescencji PCR)	Jiangsu Mole Biotechnology Co., Sp. z o.o.	20241111
Odczynnik do ekstrakcji kwasów jądrowych (metoda kulek magnetycznych)	Shengxiang Biotechnology Co., Sp. z o.o.	G24004 powiedział:
Probówki do PCR	DN Biotech (Hongkong)  Sp. z o.o.	6121003	0,2 ml
Przyrząd do fluorescencyjnego PCR w czasie rzeczywistym	BIO-RAD	Silnik CFX96