Method Article

Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół wysokoprzepustowej metody klonowania, klonowania wahadłowego opartego na CRISPR (klonowanie wahadłowe CRISPR), który umożliwia transfer interesujących fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie bibliotek plazmidowych całego genomu przy użyciu istniejących repozytoriów genomowych stanowi kluczowy warunek wstępny dla systematycznej charakterystyki funkcjonalnej genów w różnych procesach biologicznych. Obecne wysokoprzepustowe metodologie transferu fragmentów DNA między wektorami wymagają jednak amplifikacji sekwencji docelowych metodą PCR przed klonowaniem, co sprawia, że generowanie kolekcji plazmidów w skali genomu jest technicznie trudne i czasochłonne. Wykorzystując kasetę CRISPRshuttle, opracowaliśmy nową, wysokoprzepustową metodę klonowania, klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR (klonowanie wahadłowców CRISPR), które ułatwia transfer wielu fragmentów DNA z plazmidów dawcy o identycznych sekwencjach szkieletowych do wektora kompatybilnego z CRISPRshuttle bez amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR. W tym miejscu przedstawiamy protokół dla CRISPRshuttle. Protokół ten obejmuje dwie sekwencyjne reakcje w probówkach przed transformacją bakteryjną. Po pierwsze, docelowe fragmenty DNA są wycinane z plazmidów dawcy przez rozszczepienie za pośrednictwem Cas9 ich wspólnej sekwencji szkieletu wektora. Po drugie, wycięte fragmenty DNA są wprowadzane do linearyzowanych wektorów kompatybilnych z CRISPRshuttle poprzez montaż Gibsona. Nasze wyniki pokazują, że wydajność wahadłowca CRISPRshuttle przekracza 94% i że dwóch badaczy może wygenerować około 300 plazmidów w ciągu 7 dni za pomocą CRISPRshuttle. CRISPRshuttle ułatwia wydajny, elastyczny i opłacalny transfer fragmentów DNA między wektorami, znacznie usprawniając generowanie biblioteki plazmidów w całym genomie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstruowanie bibliotek plazmidowych całego genomu na podstawie dostępnych zasobów jest podstawą i warunkiem wstępnym zastosowania genomiki funkcjonalnej do analizy procesów biologicznych. Obecne metody klonowania o wysokiej przepustowości, w tym systemy klonowania Gateway, In-Fusion, Creator i Univector, wymagają amplifikacji PCR docelowych fragmentów DNA 1,2,3,4,5. Ten warunek wstępny pociąga za sobą specyficzne dla fragmentów przepływy pracy obejmujące wiele standardowych operacji, w tym między innymi pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Określenie optymalnych miejsc rozszczepienia Cas9/sgRNA flankujących cDNA/ORF

  1. Przygotowanie plazmidów cDNA/ORF
    1. Pozyskaj klony cDNA/ORF z repozytoriów publicznych.
      UWAGA: Ten protokół wykorzystuje klony ORF oparte na wektorach pLX304 z ludzkiej biblioteki ekspresji lentiwirusowej8 o szerokości CCSB.
    2. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do minipreparacji plazmidu i zmierz jego stężenie za pomocą spektrofotometru.
  2. Projektowanie sgRNA
    1. Wejdź na stronę internetową CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Wklej obszar 20-100 pz szkieletu wektorowego pLX304 flanku....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystaliśmy wahadłowiec CRISPRshuttle do skonstruowania kolekcji plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmującej 1397 ludzkich genów, które są konserwatywne w Drosophila7. Analiza ograniczeń wykazała, że CRISPRshuttle osiąga wydajność 94,5% w przypadku korzystania z wektorów docelowych kompatybilnych z CRISPRshuttle zawierających dwie powtarzające się sekwencje i 96,1% w przypadku korzystania z wektorów docelowych bez powtarzających się sekwencji7. Nasze dane wykazały, że o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym krokiem w protokole CRISPRshuttle jest przygotowanie linearyzowanych wektorów docelowych kompatybilnych z CRISPRshuttle. Aby zapewnić całkowite trawienie, należy użyć nadmiaru enzymów restrykcyjnych do trawienia wektorów, a zdecydowanie zaleca się oczyszczanie trawionych wektorów w żelu. Kolejnym kluczowym krokiem jest trawienie plazmidów cDNA/ORF za pomocą Cas9. Jeśli budowa plazmidu nie powiedzie się, użyj elektroforezy w żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy przynajmniej częściowe cDNA/ORF zostały uwolnione z .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to było wspierane przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32071135) oraz fundusz startowy z Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China. Jesteśmy wdzięczni prof. Feng Zhangowi za uprzejme dostarczenie plazmidu pX330 oraz dr Xiaohui Cai za pomoc techniczną.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar w proszkuBaza chemicznaKBS-001H
AgarozySangon powiedział:A600014-0100
Zautomatyzowany cyfrowy system analizy obrazu żeluTanonTanon-2500B
ChloramfenikolSangon powiedział:A100230-0010
Zestaw do ekstrakcji żelu E.Z.N.A.OmegaZobacz materiał D2500-02
E.Z.N.A. Plazmidowe DNA Mini Kit IOmegaZobacz materiał D6942-02
EcoRI-HFNEBCzynnik chłodniczy R3101S
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
HiScribe T7 Szybki zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajnościNEBE2050 powiedział:
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621X
Termocykler PCRLongGene (Długi Gen)Zobacz materiał T20
Polimeraza DNA Platinum SuperFi IIThermo Scientific12361010
PvuII-HFNEBCzynnik chłodniczy R3151L
Q5 Gorący start High-Fidelity 2x Master MixNEBZobacz materiał M0494 TGL
S. pyogenes Cas9Język GenScriptZ03386 powiedział:
Inkubator z wytrząsaniemZhichu powiedział:ZQLY-180V
SpektrofotometrShimadzu powiedział:Specyfikacja BioSpec-nano
Ligaza DNA T4Preparat PromegaZobacz materiał M1801
Trans 10 Kompetentna chemicznie komórkaTransGen (Pokolenie Transpłciowe)CD101-02
TryptonOxoid (Oxoid)Zobacz materiał LP0042
XbaI powiedział:NEBCzynnik R0145S
Ekstrakt drożdżowyOxoid (Oxoid)Zobacz materiał LP0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from th....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

Related Articles