Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

Summary

Opisujemy protokół wysokoprzepustowej metody klonowania, klonowania wahadłowego opartego na CRISPR (klonowanie wahadłowe CRISPR), który umożliwia transfer interesujących fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR.

Abstract

Opracowanie bibliotek plazmidowych całego genomu przy użyciu istniejących repozytoriów genomowych stanowi kluczowy warunek wstępny dla systematycznej charakterystyki funkcjonalnej genów w różnych procesach biologicznych. Obecne wysokoprzepustowe metodologie transferu fragmentów DNA między wektorami wymagają jednak amplifikacji sekwencji docelowych metodą PCR przed klonowaniem, co sprawia, że generowanie kolekcji plazmidów w skali genomu jest technicznie trudne i czasochłonne. Wykorzystując kasetę CRISPRshuttle, opracowaliśmy nową, wysokoprzepustową metodę klonowania, klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR (klonowanie wahadłowców CRISPR), które ułatwia transfer wielu fragmentów DNA z plazmidów dawcy o identycznych sekwencjach szkieletowych do wektora kompatybilnego z CRISPRshuttle bez amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR. W tym miejscu przedstawiamy protokół dla CRISPRshuttle. Protokół ten obejmuje dwie sekwencyjne reakcje w probówkach przed transformacją bakteryjną. Po pierwsze, docelowe fragmenty DNA są wycinane z plazmidów dawcy przez rozszczepienie za pośrednictwem Cas9 ich wspólnej sekwencji szkieletu wektora. Po drugie, wycięte fragmenty DNA są wprowadzane do linearyzowanych wektorów kompatybilnych z CRISPRshuttle poprzez montaż Gibsona. Nasze wyniki pokazują, że wydajność wahadłowca CRISPRshuttle przekracza 94% i że dwóch badaczy może wygenerować około 300 plazmidów w ciągu 7 dni za pomocą CRISPRshuttle. CRISPRshuttle ułatwia wydajny, elastyczny i opłacalny transfer fragmentów DNA między wektorami, znacznie usprawniając generowanie biblioteki plazmidów w całym genomie.

Introduction

Konstruowanie bibliotek plazmidowych całego genomu na podstawie dostępnych zasobów jest podstawą i warunkiem wstępnym zastosowania genomiki funkcjonalnej do analizy procesów biologicznych. Obecne metody klonowania o wysokiej przepustowości, w tym systemy klonowania Gateway, In-Fusion, Creator i Univector, wymagają amplifikacji PCR docelowych fragmentów DNA 1,2,3,4,5. Ten warunek wstępny pociąga za sobą specyficzne dla fragmentów przepływy pracy obejmujące wiele standardowych operacji, w tym między innymi projektowanie starterów oligonukleotydowych, oczyszczanie żelu i walidację sekwencji poprzez sekwencjonowanie. W rezultacie, konstruowanie bibliotek plazmidowych obejmujących cały genom (np. bibliotek nadekspresji cDNA/ORF) stało się pracochłonne i czasochłonne, co utrudnia postęp genomiki funkcjonalnej.

Wcześniej opracowaliśmy CRISPRmass, wysokoprzepustową metodę klonowania zaprojektowaną w celu integracji określonych fragmentów DNA (np. modułu UAS) z wieloma plazmidami o identycznych szkieletach wektorów⁶. Korzystając z CRISPRmass, skonstruowaliśmy ponad 5500 plazmidów UAS-cDNA/ORF opartych na GAL4/UAS z biblioteki Drosophila cDNA/ORF, Drosophila Genomics Resource center (DGRC) Gold Collection⁶. Jednak CRISPRmass nie ma możliwości przenoszenia fragmentów DNA między wektorami, co ogranicza jego zastosowanie w klonowaniu o wysokiej przepustowości.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy klonowanie wahadłowców oparte na CRISPR (CRISPRshuttle), nowatorską metodę o wysokiej przepustowości, która ułatwia transfer wielu docelowych fragmentów DNA do docelowych wektorów z plazmidów dawcy⁷. Proces ten wymaga tylko dwóch sekwencyjnych reakcji w probówce, co pozwala obejść wymóg specyficznego dla fragmentów postępowania z dyskretnymi celami DNA⁷.

Protokół CRISPRshuttle obejmuje dwie sekwencyjne reakcje w probówkach (ryc. 1). Po pierwsze, wspólne sekwencje szkieletu wektorowego plazmidów dawcy są rozszczepiane przez Cas9 / sgRNA w celu uwolnienia docelowych fragmentów DNA. Fragmenty te są następnie przenoszone do kasety CRISPRshuttle wektora kompatybilnego z CRISPRshuttle za pomocą zespołu Gibsona w celu wygenerowania końcowych plazmidów. Kaseta CRISPRshuttle składa się z sekwencji szkieletowej wektora o długości ~20-40 pz, która flankuje końce 5' i 3' fragmentów DNA pochodzących z plazmidów dawcy oraz jedno lub dwa unikalne miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych znajdujące się między tymi sekwencjami flankującymi. Wektor kompatybilny z CRISPRshuttle jest konstruowany przez włożenie kasety CRISPRshuttle do wektora docelowego, który jest następnie linearyzowany przez trawienie miejsc restrykcyjnych w kasecie. Wektor docelowy musi być nosicielem genu oporności na antybiotyki innego niż w plazmidach dawcy; Jeśli gen oporności jest identyczny, przed użyciem musi zostać zastąpiony innym genem.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystujący CRISPRshuttle do budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF. Proces ten polega na przeniesieniu ludzkich ORF z biblioteki CCSB-Broad Lentiviral Expression Library do wektora transgenezy Drosophila pBID-UASC ^8,9. CRISPRshuttle usprawnia budowę bibliotek plazmidów obejmujących cały genom, ułatwiając w ten sposób badania genomiki funkcjonalnej.

Protocol

1. Określenie optymalnych miejsc rozszczepienia Cas9/sgRNA flankujących cDNA/ORF

1. Przygotowanie plazmidów cDNA/ORF
   1. Pozyskaj klony cDNA/ORF z repozytoriów publicznych.
      UWAGA: Ten protokół wykorzystuje klony ORF oparte na wektorach pLX304 z ludzkiej biblioteki ekspresji lentiwirusowej⁸ o szerokości CCSB.
   2. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do minipreparacji plazmidu i zmierz jego stężenie za pomocą spektrofotometru.
2. Projektowanie sgRNA
   1. Wejdź na stronę internetową CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Wklej obszar 20-100 pz szkieletu wektorowego pLX304 flankujący koniec ORF 3' w polu docelowym.
   2. Wybierz Drosophila melanogaster jako gatunek i kliknij Znajdź miejsca docelowe. Wybierz kandydatów sgRNA, którzy według prognoz będą mieli wydajność ponad 80%.
3. Preparat sgRNA
   1. Zsyntetyzuj starter do przodu (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′), gdzie (N)₂₀ reprezentuje sekwencję docelową sgRNA, a starter odwrotny sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGTGCCACTT-3′).
      UWAGA: Zalecane są podkłady oczyszczone przez PAGE.
   2. Wygeneruj matrycę DNA do transkrypcji sgRNA in vitro (IVT) za pomocą PCR. Przygotować 100 μl reakcji zawierającej po 5 μl matrycy pX330 (plazmid Addgene 42230; 0,1 ng/μL), starter do przodu (10 μM) i starter sgRNA-REV (10 μM); 50 μl 2x wysokiej jakości mieszanki wzorcowej PCR; i 35 μl ultraczystej wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC).
   3. Amplifikuj w termocyklerze PCR za pomocą następującego programu: 98 °C przez 30 s; 5 cykli w temperaturze 98°C przez 8 s, 52 °C przez 15 s, 72 °C przez 5 s; 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 8 s, 72 °C przez 20 s; 72 °C przez 2 min.
   4. Rozwiąż produkty PCR na 0,8% żelu agarozowym. Wytnij pasmo ~120 pz i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
   5. Przygotować 10 μl reakcji IVT zawierającej 300 ng oczyszczonego fragmentu DNA, 3,33 μl mieszaniny buforowej NTP, 0,67 μl mieszaniny polimerazy T7 RNA i ultraczystą wodę uzdatnioną DEPC. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
   6. Określić ilościowo nieoczyszczone sgRNA za pomocą spektrofotometrii, rozcieńczyć do 20 ng/μl ultraczystą wodą poddaną działaniu DEPC i zamrozić w temperaturze -80 °C w małych podwielokrotnościach.
      UWAGA: Leczenie DNazą nie jest konieczne, ponieważ resztkowe DNA nie zakłóca dalszych reakcji.
4. Ocena sgRNA
   1. Trawić plazmid cDNA/ORF zawierający szkielet wektora pLX304 za pomocą enzymu restrykcyjnego. Rozpuść powstałe fragmenty DNA za pomocą 0,8% żelu agarozowego. Oczyść substrat DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
   2. Przygotuj 5 μl mieszaniny reakcyjnej rozszczepienia Cas9 zawierającej 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng/μL sgRNA, 0,015 pmol substratu DNA, 0,5 μl 10x buforu Cas9 i ultraczystą wodę poddaną działaniu DEPC. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   3. Rozwiąż produkty łupliwości za pomocą 0,8% żelu agarozowego. Uwzględnij nierozszczepiony substrat DNA jako kontrolę negatywną.
   4. Wizualizuj wzorce cięcia za pomocą cyfrowego systemu obrazowania i wybierz sgRNA z minimalną resztkową nieszczelną substratem do kolejnych eksperymentów (ryc. 2).

2. Zamiana genu oporności na antybiotyki wektora docelowego

UWAGA: W tym protokole używamy przykładu zamiany genu oporności na ampicylinę wektora docelowego pBID-UASC z genem oporności na chloramfenikol, generując w ten sposób wektor docelowy zawierający chloramfenikol pBIDC-UASC.

1. Usuń gen oporności na ampicylinę z pBID-UASC.
   UWAGA: Gen oporności na ampicylinę pBID-UASC został usunięty przez trawienie Cas9 w połączeniu z dwoma sgRNA, f1Ori5-G4 (sekwencja docelowa: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') i Amp3-G2 (sekwencja docelowa: 5'-GGAACGAAAAACTCACGTTAA-3'), w wyniku czego powstał liniowy szkielet wektorowy pBID-UASC o długości 7,687 pz. Te dwa sgRNA celują odpowiednio w 5' w górę i 3' w dół genu oporności na ampicylinę.
   1. Przygotować 10 μl reakcji rozszczepienia zawierającej 0,03 pmol pBID-UASC, 0,25 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 20 ng f1Ori5-G4, 20 ng Amp3-G2, 1 μL 10x Cas9 Buffer i ultraczystą wodę uzdatnioną DEPC. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      UWAGA: Plazmid rozszczepiony przez Cas9, bez oczyszczania, jest bezpośrednio poddawany montażowi Gibsona.
2. PCR-amplifikacja genu oporności na chloramfenikol.
   UWAGA: Gen oporności na chloramfenikol o sile 840 pz amplifikowano z plazmidu pMartini-Cam⁶ metodą PCR przy użyciu f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
   GTCGCGTATGTATGATAGGTT-3') i Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
   GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') podkłady.
   1. Przygotuj gen oporności na chloramfenikol metodą PCR, wzmacniając gen oporności na chloramfenikol o wartości 840 pz. Przygotuj 20 μl reakcji PCR zawierającej 2 μL pMartini-Cam (0,1 ng/μL), 1 μL f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL buforu 5x, 0,4 μL dNTPs (10 mM), 0,4 μL polimerazy DNA o wysokiej wierności (2,5 jednostki/μL), 11,2 μL wody ultraczystej.
   2. Przeprowadzić PCR w następujących warunkach termocyklingu: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 1 minutę; 5 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 46 °C przez 15 s, 72 °C przez 20 s; 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 20 s; 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 2 min. Przeprowadź reakcję w termocyklerze.
   3. Rozpuścić produkty rozszczepienia za pomocą 0,8% żelu agarozowego i oczyść fragment DNA o objętości 840 pz za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
3. Wstaw gen oporności na chloramfenikol do zlinearyzowanego szkieletu wektora pBID-UASC, w wyniku czego powstanie pBIDC-UASC.
   1. Przeprowadzić reakcję montażu Gibsona 2 μL: 0,008 pmol genu oporności na chloramfenikol 840 pz, 0,002 pmol zlinearyzowanego pBID-UASC (krok 2.1.1), 1,0 μl 2x mieszanki głównej zespołu Gibsona. Przeprowadzać reakcję w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
   2. Przekształć 10 μl kompetentnych komórek E. coli w 1 μl produktu reakcji ligacji. Wybrać transformanty na płytce LB uzupełnionej 15 μg/ml chloramfenikolu.
   3. Wybierz pojedynczą kolonię i poddaj ją późniejszej hodowli bakteryjnej i minipreparacji plazmidu. Zweryfikować wektor docelowy zawierający chloramfenikol pBIDC-UASC za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania DNA.

3. Budowa wektora docelowego kompatybilnego z CRISPRshuttle

UWAGA: Kaseta CRISPRshuttle składa się z około 20-40 sekwencji szkieletowych wektorów pz, które otaczają zarówno końce 5', jak i 3' docelowych fragmentów DNA, z jednym lub dwoma unikalnymi miejscami restrykcyjnymi znajdującymi się między nimi.

1. Wyżarzanie oligonukleotydów za pomocą termocyklera z następującym programem: 94 °C przez 2 min; 70 cykli po 52 s w temperaturze (95-N) °C, gdzie N oznacza numer cyklu.
   UWAGA: Wyżarzona kaseta wahadłowa CRISPR zawiera 5'-wysięgi uzupełniające EcoRI i XbaI.
2. Zaktualizuj wyżarzoną kasetę CRISPRshuttle do trawionego przez EcoRI/XbaI WEKTORA DOCELOWEGO PBIDC-UASC, aby wygenerować wektor docelowy zgodny z CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect.
   UWAGA: Ta ligacja eliminuje oryginalne miejsca EcoRI i XbaI w wielu miejscach klonowania, co sprawia, że miejsca EcoRI i XhoI w środku kasety CRISPRshuttle są unikalne w końcowym wektorze. Unikalne miejsca ograniczeń w kasecie CRISPRshuttle umożliwiają linearyzację wektora docelowego kompatybilnego z CRISPRshuttle.
   1. Przygotować 5 μl reakcji ligacji zawierającej 14 ng 8,451 bp pBIDC-UASC trawionego przez EcoRI/XbaI, 0,02 pmol wyżarzonej kasety CRISPRshuttle, 0,5 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 0,3 μl ligazy DNA T4. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C.
   2. Przekształć 10 μl komórek kompetentnych E. coli w 1 μl produktu reakcji ligacji. Wybrać transformanty na płytce LB uzupełnionej 15 μg/ml chloramfenikolu i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   3. Wybierz pojedynczą kolonię i poddaj ją późniejszej hodowli bakteryjnej i minipreparacji plazmidu. Zweryfikuj wektor docelowy zgodny z CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect poprzez analizę restrykcji i sekwencjonowanie DNA.

4. Generowanie plazmidów UAS-cDNA/ORF za pomocą CRISPRshuttle

UWAGA: Protokół CRISPRshuttle polega na tym, że dwuetapowe reakcje w probówkach są przeprowadzane równolegle przed transformacją bakteryjną (ryc. 1).

1. Reakcja w probówce, krok 1
   1. Wyciąć ORF z plazmidów pLX304-ORF poprzez rozszczepienie szkieletu wektora za pomocą Cas9 w połączeniu z dwoma sgRNA, pLX304-CMV-G1⁶ (sekwencja docelowa: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', zlokalizowana w szkielecie wektora pLX304 flankującym koniec ORF 5') i pLX304-3'-G1 (sekwencja docelowa: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', zlokalizowana w szkielecie wektora pLX304 flankującym koniec ORF 3').
      1. Przygotować mieszankę wzorcową dla danej liczby (N) reakcji trawienia w następujący sposób: (N+1) x 0,4 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 μL 80 ng/μL pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 μL 80 ng/μL pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 μL 10x Cas9 Buffer, i (N+1) x 1,45 μl ultraczystej wody uzdatnionej DEPC.
      2. Dokładnie wymieszaj i odwiruj mieszankę główną. Podwielokrotność 3,75 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,75 μl plazmidu 0,03 μM pLX304-ORF do każdej probówki. Dokładnie wymieszać i inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
         UWAGA: Rozcieńczyć każdy plazmid pLX304-ORF do stężenia 0,03 μM ultraczystą wodą uzdatnioną DEPC. Jeśli stężenie jest mniejsze niż 0,03 μM, dodaj plazmidowe DNA bezpośrednio do reakcji. Plazmidy rozszczepione Cas9 nie muszą być oczyszczane po reakcjach rozszczepienia i mogą być bezpośrednio użyte do późniejszego montażu Gibsona.
2. Reakcja w probówce, krok 2
   1. Włóż wycięte ORF do wektora docelowego zgodnego z CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect za pomocą zespołu Gibsona, w wyniku czego utworzą się plazmidy UAS-cDNA/ORF.
      1. Digest pBIDC-UASC-pLXvect z EcoRI i XbaI. Oddzielić zlinearyzowany pBIDC-UASC-pLXvect za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyścić za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
      2. Przygotuj mieszankę wzorcową dla danej liczby (N) reakcji montażu Gibsona w następujący sposób: (N+1) x 0,14 μL 3,36 μM zlinearyzowanego pBIDC-UASC-pLXvect i (N+1) x 1,8 μL mieszanki głównej zespołu Gibsona.
      3. Dokładnie wymieszaj i odwiruj mieszankę główną. Podwielokrotność 1,94 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Do każdej probówki dodać 1,66 μl plazmidu z rozszczepionym Cas9. Dokładnie wymieszać i inkubować reakcje w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
         UWAGA: Mieszankę wzorcową i probówki należy przechowywać w lodzie przed inkubacją w temperaturze 50 °C.
3. Przekształć E. coli za pomocą produktów montażowych Gibson.
   UWAGA: Produkty montażu Gibsona nie wymagają oczyszczania przed transformacją E. coli .
   1. Rozmrozić kompetentne komórki bakteryjne na lodzie. Porcję 10 μl komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Zalecane są kompetentne komórki bakteryjne o wydajności przemiany co najmniej 1 × 10⁸ jtk/μg DNA pUC19.
   2. Delikatnie wymieszaj 10 μl kompetentnych ogniw z 1 μl produktów montażowych Gibsona. Ułóż na lodzie na 30 min.
   3. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 1 minutę, a następnie schładzanie na lodzie przez 2 minuty.
   4. Dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki SOC (37 °C) do każdej probówki. Wytrząsać z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   5. Umieścić komórki na płytkach LB zawierających 15 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Przeprowadzenie tych procedur na dużą skalę zajmuje zazwyczaj kilka godzin. O ile nie zaznaczono inaczej, zarówno odczynniki, jak i zestawy reakcyjne należy przechowywać na lodzie.
4. Weryfikacja plazmidów UAS-cDNA/ORF.
   1. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 4,5 ml pożywki LB za pomocą 15 μg/ml chloramfenikolu. Wstrząsać z prędkością 250 obr./min przez noc w temperaturze 37 °C.
   2. Wyizoluj DNA plazmidu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu.
   3. Przygotuj 20 μl reakcji trawienia restrykcyjnego dla każdego plazmidu zawierającego 300-500 ng plazmidowego DNA, 0,3 μl PvuII, 2 μl 10x buforu i ultraczystą wodę. Przeprowadzać reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   4. Rozdziel fragmenty DNA za pomocą 0,8% żelu agarozowego. Obraz w świetle UV (rysunek 3).

Results

Wykorzystaliśmy wahadłowiec CRISPRshuttle do skonstruowania kolekcji plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmującej 1397 ludzkich genów, które są konserwatywne w Drosophila⁷. Analiza ograniczeń wykazała, że CRISPRshuttle osiąga wydajność 94,5% w przypadku korzystania z wektorów docelowych kompatybilnych z CRISPRshuttle zawierających dwie powtarzające się sekwencje i 96,1% w przypadku korzystania z wektorów docelowych bez powtarzających się sekwencji⁷. Nasze dane wykazały, że o...

Discussion

Kluczowym krokiem w protokole CRISPRshuttle jest przygotowanie linearyzowanych wektorów docelowych kompatybilnych z CRISPRshuttle. Aby zapewnić całkowite trawienie, należy użyć nadmiaru enzymów restrykcyjnych do trawienia wektorów, a zdecydowanie zaleca się oczyszczanie trawionych wektorów w żelu. Kolejnym kluczowym krokiem jest trawienie plazmidów cDNA/ORF za pomocą Cas9. Jeśli budowa plazmidu nie powiedzie się, użyj elektroforezy w żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy przynajmniej częściowe cDNA/ORF zostały uwolnione z ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar w proszku	Baza chemiczna	KBS-001H
Agarozy	Sangon powiedział:	A600014-0100
Zautomatyzowany cyfrowy system analizy obrazu żelu	Tanon	Tanon-2500B
Chloramfenikol	Sangon powiedział:	A100230-0010
Zestaw do ekstrakcji żelu E.Z.N.A.	Omega	Zobacz materiał D2500-02
E.Z.N.A. Plazmidowe DNA Mini Kit I	Omega	Zobacz materiał D6942-02
EcoRI-HF	NEB	Czynnik chłodniczy R3101S
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
HiScribe T7 Szybki zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności	NEB	E2050 powiedział:
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621X
Termocykler PCR	LongGene (Długi Gen)	Zobacz materiał T20
Polimeraza DNA Platinum SuperFi II	Thermo Scientific	12361010
PvuII-HF	NEB	Czynnik chłodniczy R3151L
Q5 Gorący start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	Zobacz materiał M0494 TGL
S. pyogenes Cas9	Język GenScript	Z03386 powiedział:
Inkubator z wytrząsaniem	Zhichu powiedział:	ZQLY-180V
Spektrofotometr	Shimadzu powiedział:	Specyfikacja BioSpec-nano
Ligaza DNA T4	Preparat Promega	Zobacz materiał M1801
Trans 10 Kompetentna chemicznie komórka	TransGen (Pokolenie Transpłciowe)	CD101-02
Trypton	Oxoid (Oxoid)	Zobacz materiał LP0042
XbaI powiedział:	NEB	Czynnik R0145S
Ekstrakt drożdżowy	Oxoid (Oxoid)	Zobacz materiał LP0021