Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68504

⸱

12 września 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

W tym artykule

Podsumowanie

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

Streszczenie

Pantofelek jest głównym organizmem modelowym do badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w programowane rearanżacje genomu i eliminację transpozonów podczas rozmnażania mejotycznego. Wiele szczegółów tego procesu pozostaje zagadkowych ze względu na złożoność zaangażowanej maszynerii molekularnej i przejściowych interakcji białko-białko. W tym miejscu przedstawiamy metodę czasowo-rozdzielczego znakowania białek biotyną znajdujących się w pobliżu białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania. Metodę tę można łatwo dostosować do różnych celów, ponieważ biotynylację uzyskuje się poprzez wstrzyknięcie DNA kodującego białko docelowe połączone z zmodyfikowaną ligazą biotyny. Konstrukt fuzyjny ulega ekspresji z promotora genu endogennego, co umożliwia specyficzny dla etapu profil ekspresji podobny do profilu białka natywnego. Warto zauważyć, że kowalencyjnie przyłączona grupa biotyny pozwala na selektywne wzbogacanie znakowanych białek za pomocą kulek pokrytych streptawidyną. Ponadto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego wykazaliśmy, że skuteczne znakowanie wymaga uzupełnienia kultury biotyną. Zmodyfikowany wektor ekspresji typu plug-and-play, w połączeniu z zademonstrowaną tutaj wydajną procedurą wstrzykiwania, pozwala na szybkie generowanie linii pantofelka wykazujących ekspresję zmodyfikowanego białka. Zademonstrowana tutaj procedura biotynylacji może być kontynuowana za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji wzbogaconych białek, które zawierają oddziałujących partnerów białka docelowego. Biotynylacja zbliżeniowa może uprościć i przyspieszyć odkrywanie interakcji białko-białko w pantofelku oraz zintensyfikować wysiłki na rzecz zrozumienia jego maszynerii edycji genomu.

Wprowadzenie

Jednokomórkowy organizm rzęskowy Paramecium tetraurelia zawiera dwa różne typy jąder: jądro linii zarodkowej do długotrwałego przechowywania informacji genetycznej i jądro somatyczne do fizjologicznych funkcji komórki1. Rozmnażanie płciowe w tym organizmie wymaga powstania nowego genomu somatycznego. Proces ten obejmuje nieodwracalne wycięcie ponad 45 000 fragmentów DNA z genomu somatycznego2, które zawierają elementy transpozycyjne3 i inne powtórzenia. Szczególnie uderzające jest to, że zdarzenia wycinania są wykonywane z dokładnością do pojedynczej pary zasad1. Ta dokładność jest biologicznie konieczna, ponieważ wycięte fragmenty DNA zakłócają regiony kodujące białka4, a każde wadliwe wycięcie może wywołać mutacje z przesunięciem ramki odczytu, przedwczesne kodony stop lub zmienić sekwencję kodującą białko. Skomplikowany mechanizm porównywania RNA pozwala komórce różnicować sekwencje, które są potrzebne w nowym genomie somatycznym. Rozpoczyna się od transkrypcji całego genomu linii zarodkowej5, po której następuje przycinanie do rozmiaru 25 pz6, transport do starego genomu somatycznego7, gdzie wszystkie komplementarne RNA są odrzucane8. Pozostałe sRNA, które nie mają komplementarnych sekwencji w starym genomie somatyki, są dalej transportowane do nowego rozwijającego się genomu somatycznego, gdzie dopasowują się do wszelkich sekwencji ograniczonych przez linię zarodkową i kierują ich wycięciem9. Ten złożony, wieloetapowy proces wymaga precyzyjnego i terminowego współdziałania wielu składników komórkowych, a zwłaszcza przejściowych słabych oddziaływań, gdy małe RNA przechodzą między różnymi jądrami10,11. Wcześniej próby zrozumienia mechaniki molekularnej procesu podejmowano przy użyciu eksperymentów knockdown, aby określić, czy domniemane składniki są niezbędne dla procesu, a następnie podejścia immunoprecypitacyjne w celu odkrycia interakcji niezbędnych białek 12,13,14. Chociaż ta metoda jest przydatna do wykrywania silnego i ciągłego wiązania, które wytrzymuje również warunki niefizjologiczne podczas ściągania, wykrywanie słabych i przejściowych interakcji może wymagać żmudnej optymalizacji. Ze względu na potencjalnie przejściowy charakter wielu interakcji biorących udział w procesie edycji genomu, metody in vivo mogą poprawić wykrywanie takich interakcji. Ponadto niektóre białka nie mogą być efektywnie rozpuszczalne w warunkach zewnątrzkomórkowych15, co stanowi problem, który można rozwiązać poprzez modyfikacje białek oparte na interakcjach in vivo, takie jak znakowanie zbliżeniowe biotyną.

W tym miejscu opisujemy nową metodę, która pozwala na specyficzną biotynylację in vivo białek, które są zlokalizowane blisko pożądanego białka docelowego. Kowalencyjna modyfikacja biotyny może być wykorzystana do efektywnego wzbogacania przy użyciu metod pulldown opartych na streptawidynie. Opracowanie tej metody osiągnięto dzięki zastosowaniu ligazy biotyny TurboID16 do wykonywania badań interakcji białkowych w Pantofelii czterobureliowej. Nasze podejście można łatwo zastosować do dowolnego białka docelowego, postępując zgodnie z krokami opisanymi w protokole. Dlatego w tym artykule przedstawiono wydajną i skalowalną strategię biotynylacji zbliżeniowej, która może być wykorzystana do wysokoprzepustowych badań proteomicznych w wybitnym organizmie modelowym pierwotniaka.

Protokół

1. Metody ogólne

  1. Zaopatrzyć się w, odczynniki i inne materiały wymienione w Tabeli 1.
  2. Hoduj monoklonalne linie pantofelków , jak opisano wcześniej17. Krótko mówiąc, przenieś jedną komórkę do nowej studzienki depresyjnej, która zawiera bakteriizowane lekkie podłoże (0,8 μg / ml β-sitosterolu), tak aby gęstość komórek pozostała niższa niż 500 komórek / ml, aby zapobiec przedwczesnemu zainicjowaniu cyklu mejotycznego. Po 50 podziałach komórkowych przenieś komórki do bogatej w bakterie pożywki (z 0,8 μg/ml β-sitosterolu) i pozostaw do momentu, aż wszystkie bakterie zostaną zużyte, indukując w ten sposób rozmnażanie płciowe (autogamię)18.
    UWAGA: Po zakończeniu cyklu rozmnażania płciowego komórki pozostaną w niedzielącym się stanie postautogamicznym, dopóki nie zostanie dostarczone nowe źródło składników odżywczych.
  3. Konstruowanie białek fuzyjnych docelowych genów za pomocą wektora zawierającego zoptymalizowaną pod kątem kodonów sekwencję 3x HA turboID z miejscami cięcia enzymu restrykcyjnego w górę.
    1. Przeprowadzić amplifikację PCR docelowego genu i jego regionu promotorowego z genomowego DNA, używając starterów zaprojektowanych z nawisami, które kodują odpowiednie miejsca restrykcyjne.
    2. Wprowadzić produkt za pomocą standardowego trawienia restrykcyjnego do kompatybilnych miejsc cięcia w ramie19 przed regionami kodowania turboID.
  4. Sekwencjonuj, weryfikuj i amplifikuj skonstruowane plazmidowe DNA w E. coli DH5α. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu i zlinearyzuj 100 μg plazmidowego DNA przez trawienie restrykcyjne.
  5. Oczyść za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, a następnie przefiltruj przez filtr odśrodkowy12. Przeprowadzić wytrącanie etanolu i rozpuścić osad DNA w wodzie, aby uzyskać stężenie 5 mg/ml.
    UWAGA: DNA można wprowadzić do jąder somatycznych komórek pantofelka za pomocą następującej procedury mikroiniekcji.

2. Mikroiniekcja do jądra somatycznego (MAC)

  1. Przenieść komórkę z hodowli postautogamicznej uzyskanej w kroku 1.2 na świeże szkiełko depresyjne z bakteriizowaną pożywką świetlną o stężeniu 0,8 μg/ml β-sitosterolu. Inkubować w temperaturze 27 °C przez dwa dni przed wstrzyknięciem w celu odzyskania komórek.
  2. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego przenieś komórki z odzyskanej kultury na świeżo przygotowany szkiełko depresyjne wypełnione pożywką myjącą.
  3. Gdy komórki znajdują się w podłożu myjącym, dodać 20 μl ddH2O na szkiełko podstawowe i nałożyć je szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Dodaj 200 μl oleju mineralnego na wierzch szkła nakrywkowego.
  5. Następnie przenieś poszczególne umyte komórki w postaci kropelek pod olej mineralny, używając jak najmniejszej objętości płynu. Umieść do 20 pęcherzyków zawierających pojedynczą komórkę na szkiełku, a następnie umieść przygotowane szkiełko na cokole mikroskopu iniekcyjnego.
  6. Zamocuj igłę aspiracyjną i przesuń ją na miejsce, a następnie uruchom ramię robota i maszynę do wstrzykiwania.
  7. Za pomocą końcówki do pipet z mikroładowarką dodać 2-3 μl roztworu DNA przygotowanego w kroku 1.5 do igły iniekcyjnej. Przymocuj igłę do ramienia robota i przesuń ją na miejsce, a następnie podłącz ją do zaworu ciśnieniowego wtryskarki.
  8. Za pomocą ramienia robota umieść igłę iniekcyjną w pustej kropli wody na szkiełku. Następnie naciśnij przycisk Wyczyść , aby usunąć pozostałe powietrze z igły do wstrzykiwań, aż do momentu zaobserwowania przepływu DNA.
  9. Przejdź do kropli zawierającej komórkę, a następnie opuść igłę do aspiracji. Delikatnie usuń płyn (wodę) z tej kropli, aż komórka zostanie unieruchomiona.
  10. Podnieść igłę do aspiracji i opuścić igłę do wstrzykiwań, a następnie przełączyć na większe powiększenie.
  11. Upewnij się, że jądro somatyczne (MAC) jest teraz widoczne jako ciemniejszy obszar pozbawiony wakuoli pokarmowych (patrz ryc. 1c), w który należy wprowadzić igłę do wstrzykiwań.
  12. Dążyć do całkowitego wniknięcia w MAC za pomocą igły do wstrzykiwań i powoli cofać igłę przez kilka sekund.
    UWAGA: Gdy igła znajduje się wewnątrz MAC, DNA będzie przepływać w MAC ze względu na stałe ciśnienie powietrza stosowane przez maszynę do wstrzykiwania. Rozlana wakuola składająca się z wstrzykniętego DNA może stać się widoczna w granicach MAC.
    UWAGA: Możliwe jest wielokrotne wstrzykiwanie tej samej komórki, aby zapewnić udane wstrzyknięcie.
  13. Po zakończeniu wstrzykiwania komórek należy opuścić igłę do aspiracji zawierającą wodę odessaną w kroku 2.9. Odwróć przepływ, aby zwrócić wystarczającą ilość wody do kropli, aż komórka zacznie się ponownie poruszać.
  14. Kontynuuj, aż wszystkie kropelki zawierające komórkę zostaną przetworzone.
  15. Odzyskaj każdą wstrzykniętą komórkę, zbierając kropelki ze szkiełka i przenosząc każdą z nich do oddzielnej studzienki wypełnionej bakterizowanym lekkim podłożem o stężeniu 0,8 μg/ml β-sitosterolu.
  16. Inkubować w temperaturze 27 °C przez noc, przenieść pojedynczą komórkę z każdej studzienki do nowej studzienki i utrzymywać pierwotną studzienkę w temperaturze 18 °C jako zapasową.
  17. Hodować przeniesione komórki przez noc w temperaturze 27 °C przez 1 dzień, a następnie przenieść 5 komórek z każdej studzienki monoklonalnej do probówki PCR. Użyj starterów specyficznych dla konstruktu do amplifikacji, aby zweryfikować obecność wstrzykniętego DNA w komórkach.

3. Barwienie immunofluorescencyjne w celu weryfikacji prawidłowej lokalizacji białka i funkcji ligazy biotyny

  1. Hoduj wybrane klony PCR-dodatnie w 20 ml bakteriizowanej pożywki z 0,8 μg/ml β-sitosterolu.
  2. Gdy podłoże stanie się mniej mętne, należy pobrać próbkę o objętości 50 μl z kultury. Dodać 1 μl roztworu DAPI (0,1 mg/ml) i 1 μl EDTA (0,5 mM) do barwienia DNA w celu sprawdzenia inicjacji autogamii.
    UWAGA: Autogamia zwykle zaczyna się od gęstości komórek 2,000 komórek/ml.
  3. Jeżeli pożądana jest biotynylacja, należy uzupełnić pożywkę hodowlaną biotyną do końcowego stężenia 500 μM przez co najmniej 1 godzinę przed pobraniem komórek.
  4. Zebrać komórki w odpowiednim stadium rozwojowym za pomocą wirówki do pomiaru oleju wyposażonej w probówki w kształcie gruszki o sile 280 x g przez 2 minuty. Odrzucić pożywkę hodowlaną i dodać PBS do probówek, następnie ponownie odwirować i usunąć PBS.
  5. Zawiesić osad komórkowy w PBS i przenieść do przezroczystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  6. Przygotować 3,7% rozcieńczenie PFA w PBS z 37% roztworu podstawowego.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml 3,7% PFA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze probówkowym.
  8. Wirować przy 600 x g przez 1 minutę, aż utworzy się widoczny osad. Wyrzuć roztwór PFA do wyznaczonego specjalnego pojemnika na odpady.
  9. Zawiesić osad w 1 ml 50 mM glicyny w PBS. Inkubować przez 5-10 minut na rotatorze rurowym.
  10. Wirować przy 600 x g przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 0,8 ml 1x PBS. Opcjonalnie umyj jeszcze raz za pomocą PBS.
    UWAGA: W tym momencie ogniwa można przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  11. Wirować przy 600 x g przez 1 minutę, usunąć PBS i dodać 500 μl 0,5 % Triton X-100 do PBS. Inkubować przez 20 minut na rotatorze probówkowym.
  12. Wirować do momentu, aż osad stanie się widoczny (1 000 x g przez 2 minuty), usunąć roztwór Triton X-100 i ponownie zawiesić komórki w PBS.
  13. Przygotować 5% roztwór BSA w PBS zgodnie z wymaganą objętością przeciwciała.
  14. Usunąć płuczkę PBS z komórek i dodać do komórek 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w 5% BSA w PBS. Dostosuj czas inkubacji do zastosowanego przeciwciała.
    UWAGA: Inkubacja przez 2 godziny w temperaturze pokojowej jest wystarczająca dla większości przeciwciał.
  15. Odwirować przy 600 x g, usunąć rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych i przemyć komórki 500 μl PBS.
  16. Dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 5% BSA w PBS. Dostosuj czas inkubacji; Generalnie wystarczy 1 godzina w temperaturze pokojowej. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby chronić fluorofor przed światłem.
  17. Dodać 1 μl roztworu DAPI (0,1 mg/ml) podczas ostatnich 10 minut inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym.
  18. Wirować przy 600 x g przez 1 minutę, usunąć roztwór barwiący i przemyć dwukrotnie PBS. Pozostaw 20 μl drugiego płukania w probówce i ponownie zawieś komórki.
  19. Zamontować 10 μl na szkiełku w celu kontroli pod mikroskopem.

4. Selektywne wzbogacanie białek biotynylowanych

  1. Zebrać 1 x 106 komórek we właściwym stadium rozwoju, jak opisano w ppkt 3.4.
  2. Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy.
  3. Przenieś do homogenizatora odbijającego i zmilizuj komórki za pomocą 100 pociągnięć tłuczkiem.
  4. Przenieść lizat do dwóch probówek do mikrowirówek i odwirować przy 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zrównoważyć kulki magnetyczne pokryte streptawidyną, mieszając 20 μl (na próbkę) zawiesiny perełkowej z wirem pulsacyjnym z 1 ml buforu do lizy w probówce do mikrowirówki i inkubując przez 2 minuty.
  6. Usuń bufor do lizy z kulek za pomocą stojaka magnetycznego i ponownie zawieś w buforze do lizy.
  7. Powtórz krok 4.6.
  8. Usunąć bufor do lizy i wymieszać zrównoważone kulki z supernatantem (oczyszczonym lizatem) z kroku 4.4.
    UWAGA: Optymalne stężenia soli i procentowa zawartość detergentów do wiązania z kulkami mogą się różnić i muszą zostać zweryfikowane eksperymentalnie. Dodatkowo możliwa jest inkubacja osadu z 4,4 w 50 μl 2% SDS przez 10 minut w temperaturze 60 °C w celu ekstrakcji białek z frakcji nierozpuszczalnej, a następnie odwirowanie w temperaturze 21 000 x g przez 10 min. Dodaj ten ekstrakt do oczyszczonego lizatu i kulek.
  9. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze rurowym.
  10. Krótko odwirować (<1s) probówkę, aby odzyskać całą ciecz na dno probówki, zebrać kulki na stojaku magnetycznym, a następnie zastąpić supernatant (przepływowy) buforem płuczącym 1.
  11. Inkubować przez 5 minut na rotatorze probówkowym, a następnie powtórzyć czynności jak w kroku 4.10 dla drugiego przemycia.
  12. Wymień bufor myjący 1 na bufor płuczący 2 na dwa dodatkowe mycia (mycie 3 i 4).
  13. Wymień bufor myjący 2 na bufor płuczący 3 na dwa mycia końcowe (mycie 5 i 6).
  14. Po usunięciu końcowego prania należy przechowywać kulki w temperaturze -20 °C przed dalszą obróbką.
    UWAGA: Kulki można eluować buforem Laemmli do analizy western blot i przesłać do usług spektrometrii mas w celu przygotowania peptydu na kulkach do identyfikacji białka.

Wyniki

Nasz protokół opisuje uproszczoną metodę wprowadzania kowalencyjnej modyfikacji biotyny do białek w pobliżu białka docelowego w Pantofelku (ryc. 1A). Te biotynylowane białka mogą być następnie dalej wzbogacane za pomocą ściągania streptawidyny i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas20. Aby zademonstrować praktyczny przypadek użycia metody, zastosowaliśmy protokół do białka Nowa1. Białko to jest niezbędne w procesie rearanżacji genomu i ma dynamiczne zmiany w swojej lokalizacji12. We wczesnych stadiach pozostaje w starym jądrze somatycznym i fragmentach, ale później znajduje się w nowym rozwijającym się jądrze. Warto zauważyć, że nasze poprzednie próby wzbogacenia białek oddziałujących z Nowa1 za pośrednictwem znaczników zakończyły się niepowodzeniem (niepublikowane wyniki). Było to prawdopodobnie spowodowane złożonymi powtórzeniami podobnymi do białka prionowego PrP27, które mogły powodować samoagregację w nieoptymalnych warunkach podczas procedury pulldown21. Przeprowadziliśmy PCR amplifikację regionu kodującego Nowa1 wraz z jego nadrzędnym regionem niekodującym zawierającym promotor. Produkt został następnie umieszczony w ramce ze zoptymalizowaną pod kątem kodonów sekwencją kodowania turboID (rysunek 1B). Aby uniknąć wyciszenia wywołanego transgenem spowodowanego wstrzyknięciem kolistego DNA do pantofelka, wektor został zlinearyzowany przed wstrzyknięciem. Zlinearyzowane i oczyszczone DNA zostało następnie mikrowstrzyknięte do jądra somatycznego (MAC), jak opisano w tym protokole. Rozproszona kropla zamknięta w ciemniejszym obszarze jądra somatycznego stała się widoczna w niektórych udanych iniekcjach (ryc. 1C). Udane wstrzyknięcie i amplifikacja DNA przez komórki podczas podziału komórki zostały następnie zweryfikowane za pomocą PCR. Zgodnie z oczekiwaniami, 40-50% komórek było dodatnich dla wstrzykniętego DNA konstruktu Nowa1 (oczekiwana wielkość produktu 685 pz) (Figura 2). Kolejnym krokiem było zweryfikowanie obecności białka kodowanego przez wstrzyknięte DNA. Ponieważ wektor biorcy zawiera sekwencję turboID otoczoną potrójnym znacznikiem HA, użyliśmy barwienia immunofluorescencyjnego do wykrycia znacznika. Pozwoliło nam to zweryfikować, czy w wstrzykiwanych komórkach występuje ekspresja białka fuzyjnego i czy jest ono prawidłowo zlokalizowane. Użyliśmy komórek w późnym stadium, które wykazały lokalizację białka fuzyjnego w dwóch nowo rozwijających się jądrach, jak wcześniej zaobserwowano dla białka Nowa1 typu dzikiego12. Poszczególne wstrzyknięte linie komórkowe wykazywały różne poziomy białka fuzyjnego (ryc. 3). Niższy poziom ekspresji może być korzystny dla zastosowań, w których pożądane jest zmniejszone tło, ale w tym przypadku zdecydowaliśmy się na maksymalny sygnał i przeszliśmy do klonu 2, który wykazał najwyższą ekspresję. Następnie pobraliśmy próbki na różnych etapach rozwoju, aby śledzić lokalizację białka fuzyjnego. Białko było początkowo zlokalizowane w motkach powstałych ze starego jądra somatycznego oraz w oddzielonych fragmentach jądrowych we wczesnych stadiach autogamii. Po pojawieniu się anlagenu jądrowego, białko fuzyjne przeszło w kierunku tych nowo rozwijających się jąder (ryc. 4). Aby wspomóc biotynylację proteomu proksymalnego na różnych etapach, uzupełniliśmy hodowlę biotyną o wielkości 500 μM przez 2 godziny przed pobraniem komórek do IF. Zobrazowaliśmy białka znakowane biotyną za pomocą barwienia IF przy użyciu fluorescencyjnie znakowanej streptawidyny. Obserwowany sygnał odpowiadał lokalizacji białka fuzyjnego znakowanego HA. Co ważne, udało się uzyskać lokalizację biotynylacji, która jest specyficzna dla różnych etapów rozwoju jądrowego, ponieważ nawet krótka inkubacja z biotyną jest wystarczająca do osiągnięcia znaczącej biotynylacji (ryc. 4). Dodatkowo, bez dodatku uzupełniającej biotyny, w wstrzykniętych komórkach wykryto tylko znikomą biotynylację. W komórkach typu dzikiego dodanie dodatkowej biotyny nie spowodowało wykrywalnej biotynylacji (ryc. 5A). Warto zauważyć, że biotyna nie tylko gromadziła się w rozwijającym się jądrze, ponieważ nawet w warunkach denaturacji pozostaje przyczepiona do białek. (Rysunek 5B). Za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną możliwe było selektywne wzbogacenie biotynylowanych białek (ryc. 6). Wzbogacone białka można zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas. W tych kolejnych eksperymentach z identyfikacją białek, niesuplementowane kultury, jak również komórki wyrażające nieskondensowane białko turboID, mogą być wykorzystane jako tła grupy kontrolne.

figure-results-1
Rycina 1: Przegląd procedury biotynylacji zbliżeniowej u P. tetraurelia.(A) Uogólniony zarys protokołu. (B) Zasada klonowania dla wektora biorcy turboID typu plug-and-play i wynikowy konstrukt dla białka fuzyjnego Nowa1. Region 3'UTR używany w tym plazmidzie pochodzi z CenH3a. (C) Widoczna rozproszona kropla zawarta w ciemniejszym obszarze odpowiadającym jądru somatycznemu (MAC) po udanym wstrzyknięciu DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Test PCR pod kątem udanego wstrzyknięcia. Analiza reakcji PCR w żelu agarozowym dla produktu ze starterem do przodu specyficznym dla regionu poprzedzającego kodującym oporność na ampicylinę (amp start) i odwrotnym starterem komplementarnym do Nowa1. Grot strzałki pokazuje oczekiwany rozmiar produktu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Barwienie immunofluorescencyjne w celu walidacji prawidłowej lokalizacji białka fuzyjnego turboID. Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała króliczego anty-HA (1:100) i sprzężonego z koziego przeciwciała anty-królika Alexa Fluor 568 (1:1000) monoklonalnych linii Pantofelka z dodatnim sygnałem PCR dla DNA kodującego białko fuzyjne Nowa1-HA-turboID. Skala 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Biotynylacja specyficzna dla Nowa1 na różnych etapach rozwoju. Barwienie immunofluorescencyjne linii monoklonalnej 2 na postępujących etapach podczas tworzenia nowego jądra somatycznego. Pożywkę hodowlaną uzupełniono biotyną o wielkości 500 μM w celu uzyskania optymalnej aktywności turboID. Znacznik HA wykryto jak na rysunku 3, a biotynę wykryto za pomocą Streptavidin-FITC (1:200). Skala 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Skuteczne znakowanie zbliżeniowe za pomocą turboID wymaga dodatkowej biotyny w hodowli. (A) Barwienie immunofluorescencyjne komórek wt i wstrzykniętych komórek w późnym stadium rozwoju, wykazujące ekspresję Nowa1-HA-turboID i obserwowaną biotynylację 500 μM uzupełniającej biotyny. Znacznik HA i biotynę wykryto jak na rysunku 4. Skala 20 μm. (B) Analiza Western blot dla biotyny przy użyciu HRP-streptawidyny komórek wt hodowanych z biotyną 500 μM i komórek wstrzykniętych turboID z biotyną i bez biotyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Wzbogacanie biotynylowanych białek za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny. Analiza Western blot dla biotyny w próbkach z eksperymentu pulldown przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Próbki to: lizat komórkowy Nowa1-HA-turboID (wejście), frakcja niezwiązana (przepływ), etapy płukania (płukanie 1-6) oraz białka związane z kulkami (wyjście). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje technikę przyłączania ugrupowania biotyny do białek znajdujących się w pobliżu białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ze względu na silne powinowactwo streptawidyny do biotyny, pozwala to na szybkie i skuteczne wzbogacenie zmodyfikowanych białek. W połączeniu z szybką zdolnością adaptacji do różnych białek będących przedmiotem zainteresowania, przedstawiona metoda może ułatwić badania interakcji wielobiałkowych w pantofelku. Ten organizm modelowy jest dobrze przygotowany do badań nad interakcjami transpozon-gospodarz podczas rozmnażania mejotycznego3. Ponadto może zaoferować nowatorskie narzędzia molekularne do precyzyjnej edycji genomu, ponieważ wycina ponad 45 000 sekwencji podczas zaprogramowanych rearanżacji genomu. Proces ten jest koordynowany przez złożoną, wieloskładnikową maszynerię, która pozwala na precyzyjne wycinanie tych fragmentów DNA z odtwarzalnym miejscem cięcia przez każde pokolenie, kierowane przez RNA. Przedstawiona tutaj metoda oferuje dwie główne korzyści dla badania tego procesu. Upraszcza to odkrywanie przejściowych interakcji białko-białko. Dodatkowo, wektor biorczy plug-and-play pozwala na szybkie tworzenie wielu funkcjonalnych białek fuzyjnych. Ponieważ na różnych etapach procesu prawdopodobnie zaangażowanych jest wiele czynników, zdolność adaptacji pozwala na odkrycie interakcji wielu białek, które mogą być częścią maszynerii wycinającej. Co ważne, konstrukty fuzyjne są wyrażane przez promotor genu endogennego, a zatem ściśle odpowiadają natywnemu przebiegowi czasowemu ekspresji. Co więcej, zademonstrowane zastosowanie mikroiniekcji do dostarczania egzogennego materiału genetycznego do tego organizmu modelowego pozwala na generowanie jednorodnych populacji monoklonalnych. Takie populacje umożliwiają bardziej synchroniczne zainicjowanie procesu autogamii, podczas którego następuje rozwój nowego jądra somatycznego.

Chociaż zademonstrowana procedura wprowadzania konstruktów fuzyjnych turboID jest solidna, może być konieczna specyficzna optymalizacja w dalszych protokołach wzbogacania białek ze względu na mechanizm biotynylacji. Ponieważ skondensowany enzym turboID generuje reaktywne ugrupowania biotyny-AMP, które dyfundują z dala od enzymu, mogą one potencjalnie reagować z dowolną grupą nukleofilową w pobliżu. W związku z tym istotnym krokiem w tej metodologii jest identyfikacja prawdziwych partnerów interakcji na podstawie trafień tła oraz białek zlokalizowanych w ogólnym sąsiedztwie białka fuzyjnego turboID, które nie są rzeczywistymi partnerami interakcji. Aby to osiągnąć, można dostosować różne parametry, takie jak czas inkubacji z biotyną16. Co więcej, konfiguracja eksperymentalna, która obejmuje grupę kontrolną bez dodatkowej biotyny w pożywce, może wskazywać na wiązanie tła. Jak wykazano, taka grupa kontrolna będzie genetycznie identyczna z rzeczywistym eksperymentem, ale biotynylacja przez turboID jest znacznie zmniejszona ze względu na niską obfitość biotyny. Dodatkowe ważne grupy kontrolne mogą obejmować nieskondensowane białko turboID, a także grupę typu dzikiego, obie hodowane w pożywce uzupełnionej biotyną. Ponadto, mimo że silne powinowactwo streptawidyny do biotyny stanowi istotną przewagę nad ekstraktorami opartymi na przeciwciałach, różne stężenia soli i detergentów mogą mieć wpływ na czystość i skuteczność wzbogacania.

Lepsze podejścia proteomiczne mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat unikalnej maszynerii molekularnej pantofelka i potencjalnie innych orzęsków. Składniki molekularne o nowych funkcjach mogą zostać ponownie wykorzystane jako narzędzia w biologii syntetycznej, a tym samym mogą sprzyjać rozwojowi biotechnologicznemu22,23. Zmodyfikowane białka syntetyczne często składają się z kombinacji domen funkcjonalnych o nowatorskich właściwościach, które umożliwiają wcześniej niewykonalne zastosowania terapeutyczne. Modyfikowane białka mogą również znaleźć zastosowanie w procesach produkcji farmaceutycznej24. Kierowany przez RNA system wycinania genomu z pantofelka jest szczególnie interesujący dla takich odkryć. System ten osiąga zależne od RNA wycinanie tysięcy fragmentów DNA, z precyzją do pojedynczego nukleotydu25. Takie parametry sprawiają, że interesujące jest zwiększenie dokładności edycji genomu w komórkach ludzkich. Przedstawiona metoda biotynylacji zbliżeniowej może zostać wykorzystana do przyspieszenia i wspierania odkrywania nowych składników białkowych i ich interakcji w wielobiałkowych maszynach molekularnych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana z grantu DigiK Uniwersytetu w Bernie i grantu Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki, 229074 przyznany licencjatowi licencjackiemu. oraz grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki 214853 przyznany M.N.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop Axiovert 40 CFL (soczewki 10x, 40x)Zeissnie
B-sitosterolSigma Aldrich567152
albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA9647 (wersja angielska)
Olej CellTramEpendorf powiedział:nie
zoptymalizowana sekwencja DNA 3xHA-turboIDTwist biologianieGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATGATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATGGGGTGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCCTCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAAATCAATATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTCTCCTTTT GGTAGAAAATGGTTCTCCTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTT�
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTCAT
TGGTATTGTTTGTCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA< br/> TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT

TCAAACACTTTAGCTGCTCTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCTCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPI (interfejs DAPI)Sigma AldrichZobacz materiał D9542
EDTAFischer NaukowyAAA151610B
Końcówki do mikroładowarek epT.I.P.S.Ependorf powiedział:5242956003
EtanolGrogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorf powiedział:nie
Femtotip IIKaliber: Naukowy5242957000
Roztwór formaldehyduSigma AldrichF8775 powiedział:
GlicynaZastosowanie10021259
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fischer NaukowyA-11011
HA-tag (C29F4) mAB królikasystemy komórkowe3724
Wtryskiwacz NI 2Ependorf powiedział:nie
Lekki średninienie0,2x roztwór sproszkowanej trawy pszenicznej w 2,5 mM Na2HPO4
Olej mineralnySigma AldrichZobacz materiał M8691
Na2HPO4 powiedział:Sigma Aldrich71643
Alkohol fenolowo-chloroformowy-izoamylowySigma Aldrich77617
sól fizjologiczna buforowana fosforem Fischer Naukowy10722497
Plazmid plus zestaw midiprepQiagene powiedział:12945
Bogate podłożenienie1x roztwór trawy pszenicznej w proszku w 2,5 mM Na2HPO4
Streptawidyna-FITCThermo Fisher Naukowy11-4317-87
Filtr odśrodkowy Ultrafree-MC GV EMD MiliporeUFC30GV00
Roztwór do mycianienie0,1% BSA w wodzie Volvic 
Roztwór trawy pszenicznej w proszkuSosny międzynarodoweniePrzygotuj jako 20x bulion z proszku, jak opisano wcześniej (0,5 g/10 ml)
Streptawidyna-HRPBiblioteka ABCAMab7403 powiedział:
Koraliki magnatyczne pokryte streptawidynąSigma AldrichLSKMAGT02
Bufor do lizy do ściąganianienie50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Deoksycholan sodu; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x inhibitor proteazy cOmplete (Roche);  
Bufor myjący 1 do ściąganianienie50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Deoksycholan sodu; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2;
Bufor myjący 2 do ściąganianienie10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM MgCl2
Bufor myjący 3 do ściąganianienie10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl;

Bibliografia

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

nacznianie biotynligaza TurboIDmikrowstrzykiwanie DNAbarwienie immunofluorescencyjnekulki streptawidynoweWestern blotwzbogacanie bia ek
In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.