Generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół umożliwiający sekwencjonowanie całego genomu bakteryjnych infekcji przenoszonych drogą płciową z próbek klinicznych przy użyciu wzbogacania docelowego. Ta nowatorska, panelowa metoda syndromiczna pozwala przezwyciężyć wyzwania związane z obfitością ludzkiego DNA i niskim obciążeniem bakteryjnym, ułatwiając nadzór genomiczny nad Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma genitalium.

Streszczenie

Uzyskanie kompletnych genomów bakteryjnych zakażeń przenoszonych drogą płciową (STI) bezpośrednio z próbek klinicznych jest trudne ze względu na obecność ludzkiego DNA, mikrobioty i bardzo niskie obciążenie patogenami bakteryjnymi. Hodowla często nie wchodzi w grę, ponieważ gatunki te są wybredne, a większość próbek jest pobierana w pożywkach transportowych, które lizują mikroorganizmy, czyniąc je niezdolnymi do hodowli. Aby rozwiązać te problemy, użyliśmy panelu sond zaprojektowanego dla czterech gatunków w celu wygenerowania sekwencji całego genomu bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową i przeprowadziliśmy wzbogacanie celu, dwu- lub trzydniową procedurę hybrydyzacji przed sekwencjonowaniem genomu. Nasze wstępne wyniki dostarczyły doskonałych danych genomowych przy użyciu próbek, dla których bezpośrednie sekwencjonowanie nie powiodło się. Wzbogacanie celów okazało się bardzo skuteczne w sekwencjonowaniu genomów chorób przenoszonych drogą płciową bakterii, szczególnie gdy obciążenie patogenami było wysokie (Ct < 30). Badane próbki zawierające Mycoplasma genitalium często miały wartości Ct powyżej 30, co prowadziło do niższych wskaźników powodzenia odzyskiwania genomu; poprawę zaobserwowano po optymalizacji temperatury hybrydyzacji z 65 °C do 62,5 °C. Dostępność kompletnych genomów może nie tylko umożliwić nadzór genomowy, ale także dostarczyć cennych informacji na temat oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, takich jak identyfikacja determinantów nabytej oporności związanych z Neisseria gonorrhoeae. Metoda ta doprowadziła już do zidentyfikowania nowej linii Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum w Buenos Aires, ompA-genotyp L4, podkreślając potencjał tego podejścia w odkrywaniu nowej różnorodności genomowej i poprawie nadzoru nad chorobami przenoszonymi drogą płciową.

Wprowadzenie

Pojawienie się technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) ułatwiło sekwencjonowanie całego genomu bakterii (WGS), umożliwiając sekwencjonowanie izolatów klinicznych w wielu gatunkach ludzkich patogenów bakteryjnych. Technologia ta umożliwiła przeprowadzenie licznych badań porównawczych poprzez wygenerowanie kompletnych genomów na niespotykaną dotąd skalę. Miało to duży wpływ na mikrobiologię kliniczną i mikrobiologię zdrowia publicznego, ponieważ dostęp do danych genomowych z próbek klinicznych za pośrednictwem WGS umożliwia typowanie i wykrywanie genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Ponadto podejścia metagenomiczne umożliwiają bezpośrednie wykrywanie patogenów związanych z chorobą w próbkach klinicznych. Takie informacje stwarzają nowe możliwości w zakresie spersonalizowanych strategii leczenia pacjentów. Ponadto WGS jest potężnym narzędziem, które zapewnia wgląd w ewolucję krążących szczepów określonego patogenu, a także wzorce ich przenoszenia, umożliwiając organom ds. zdrowia publicznego lepsze zrozumienie i reagowanie na ogniska patogenów ^1,2,3.

Aby osiągnąć wystarczającą jakość sekwencjonowania dla WGS, zwykle konieczna jest izolacja bakterii poprzez hodowlę w celu uzyskania wymaganych ilości DNA drobnoustrojów ^4,5,6. Stanowi to czynnik ograniczający dla organizmów, które są trudne do hodowli, tych, które nie mogą być hodowane ze względu na niezdolne do życia przetwarzanie próbek diagnostycznych lub tych, które są narażone na działanie antybiotyków podczas leczenia pacjenta. Przykładami takich trudnych do hodowli mikroorganizmów są patogeny bakteryjne przenoszone drogą płciową, takie jak Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Gatunki te są trudne do hodowli ze względu na kilka czynników, w tym ich wewnątrzkomórkowy charakter, kruchość, wybredne wymagania dotyczące wzrostu i powolne tempo replikacji. Z tych powodów opracowanie i wdrożenie technik, które umożliwiają WGS pomimo niskiej zawartości DNA – jak to często ma miejsce w próbkach pobranych od pacjentów – ma kluczowe znaczenie dla przeprowadzania analiz genomowych w warunkach klinicznych.

Wzbogacanie docelowe jest najbardziej obiecującą metodą sekwencjonowania genomu, gdy DNA drobnoustrojów jest rzadkie¹⁰. Na przykład w kontekście patogenów powodujących infekcje przenoszone drogą płciową (STI) tylko niewielka część DNA obecnego w próbce pacjenta pochodzi od patogenu. W przypadku zakażeń C. trachomatis stwierdzono, że DNA patogenu stanowi maksymalnie 0,6% całkowitego DNA, ale wartości są zwykle znacznie niższe¹¹. Docelowa metoda wzbogacania polega na selektywnym wychwytywaniu interesującego nas DNA drobnoustrojów przed NGS. Osiąga się to za pomocą specjalnie zaprojektowanych sond RNA znakowanych biotyną, które są komplementarne do docelowego DNA drobnoustrojów. Ligacja adaptera jest wykonywana w celu wygenerowania biblioteki genomowej przed hybrydyzacją, podczas której sondy te wiążą się z komplementarnym DNA drobnoustrojów. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do wychwytywania kompleksów kwasów nukleinowych znakowanych biotyną, wykorzystując silne oddziaływanie biotyny-streptawidyny. Na koniec reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) amplifikuje wybrane fragmenty DNA. Te kluczowe kroki koncepcyjne są niezbędne do zrozumienia docelowej strategii wzbogacania. Jednak dodatkowe kroki proceduralne, takie jak mycie i kontrola jakości, są również zaangażowane w pełny protokół^10,12.

Przed zainicjowaniem protokołu sekwencjonowania ważne jest, aby ocenić ilość wejściowego DNA i upewnić się, że warunki w całym przepływie pracy zachowują jego integralność. Zgodnie z zaleceniami producenta, standardowy protokół wymaga 10-200 ng DNA w objętości 7 μL, co odpowiada zakresowi stężeń od około 1,4 do 28,6 ng/μL. Gdy stężenie DNA jest niższe, zaleca się zmodyfikowaną wersję protokołu z użyciem 17 μl, pozwalającą na stężenia od 0,6 do 11,8 ng/μl przy zachowaniu wymaganej ilości wejściowej¹². Biorąc pod uwagę niskie stężenia często uzyskiwane z próbek klinicznych, rutynowo wdrożyliśmy wariant protokołu 17 μl. Wydajność hybrydyzacji i sekwencjonowania jest związana z jakością DNA, co podkreśla znaczenie odpowiednich warunków przechowywania i transportu próbki w celu zachowania integralności kwasów nukleinowych. Dlatego właściwe praktyki obchodzenia się z pożywkami, takie jak stabilizacja pożywek zbiorczych, szybkie przetwarzanie, utrzymywanie warunków łańcucha chłodniczego i minimalizowanie cykli zamrażania i rozmrażania, są ważnymi środkami optymalizacji jakości DNA. Oprócz wymaganych stężeń DNA, wskaźnikiem integralności jest długość fragmentu DNA. Zalecamy zminimalizowanie degradacji DNA podczas obsługi i przechowywania próbki w celu uzyskania dłuższych fragmentów i optymalizacji wyników sekwencjonowania. Jest to szczególnie istotne w warunkach klinicznych, gdzie powszechna jest zmienność metod pobierania, podłoża i obchodzenia się z nimi. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do DNA wyekstrahowanego zarówno z pożywki 2-SP, jak i pożywki transportowej NAAT, ze średnią długością fragmentów do 1 kb, jak opisano w reprezentatywnych wynikach. Wreszcie, udane sekwencjonowanie zdefiniowano jako osiągnięcie ponad 95% pokrycia genomu przy średniej głębokości odczytu przekraczającej 10 x¹⁰.

Do tej pory wzbogacanie tarczy było z powodzeniem stosowane przez różne grupy badawcze do szerokiej gamy mikroorganizmów i wirusów, w tym patogenów wywołujących choroby przenoszone drogą płciową, norowirusów, wirusów zwierząt gospodarskich i patogenów roślin 10,13,14,15,16. Jednak do tej pory konstrukcja sondy była na ogół ograniczona do pojedynczych patogenów, a nie do panelu ukierunkowanego na kompletne genomy wielu syndromicznie powiązanych patogenów. Idealnymi celami są organizmy z małymi, konserwatywnymi genomami, do których rzeczywiście należą C. trachomatis, T. pallidum i M. genitalium. Podczas gdy N. gonorrhoeae ma bardziej zróżnicowany genom i większy pan-genom, sondy pokrywające go nadal mogą być zracjonalizowane w projekcie z pozostałymi trzema bakteriami. Istnieje pewna rozbieżność w %G+C między tymi bakteriami i inne, które mogą być połączone syndromicznie, co oznacza, że warunki mogą wymagać optymalizacji.

Celem tego protokołu jest uzyskanie kompletnych genomów bezpośrednio z próbek klinicznych, aby umożliwić analizy filogenetyczne i epidemiologiczne. Demonstrujemy nowatorską i skuteczną strategię przy użyciu panelu sond dostosowanego do C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum i M. genitalium w celu odzyskania kompletnych genomów przy użyciu wyekstrahowanego DNA z próbek klinicznych, takich jak wymazy z układu moczowo-płciowego i odbytu. Podejście to okazało się skuteczne i zostało zastosowane w charakterystyce wybuchu epidemii ziarniniaka wenereum (LGV) w Buenos Aires, umożliwiając opisanie nowej linii C. trachomatis LGV^10,13.

Opisana zostanie procedura wzbogacania celu, w tym zastosowanie dostępnej na rynku metody wychwytywania DNA z łączeniem po wychwytywaniu dla sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stosowanej do uzyskania pełnych genomów bezpośrednio z próbek klinicznych od pacjentów, u których zdiagnozowano C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. palidum i/lub M. genitalium Zakażeń. Aby uzyskać optymalny sukces, zaleca się wybieranie próbek o wartości Ct poniżej 30, ponieważ wyższe wartości Ct odzwierciedlają niższe obciążenia patogenami i mają mniejsze szanse na uzyskanie kompletnych genomów. Ekstrakt DNA do tej metody można uzyskać z próbek klinicznych różnych typów próbek i pożywek do pobierania. Procedury ekstrakcji DNA mogą być wykonywane ręcznie lub za pomocą zautomatyzowanych systemów, przy użyciu zestawów przeznaczonych do izolacji DNA patogenu lub wirusa z próbek wymazów pobranych od ludzi (patrz tabela materiałów).

Zestaw sond wykorzystany w procedurze wzbogacania celu (patrz tabela materiałów) został specjalnie zaprojektowany w celu uchwycenia różnorodności genomowej C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. palidum i M. genitalium. Wygenerowano niestandardowe sondy przy użyciu wielu kompletnych genomów dla każdego gatunku, optymalizując pokrycie ich znanych pangenomów¹⁰. Kryteria projektowe obejmowały minimalną homologię sekwencji wynoszącą 90% w stosunku do sekwencji odniesienia oraz częstotliwość kafelkowania 1x-2x w celu zwiększenia skuteczności przechwytywania celów. Aby zoptymalizować opłacalność, algorytm zastosowany w konstrukcji sondy zminimalizował liczbę sond przy jednoczesnym zachowaniu kompleksowej reprezentacji genomowej. Ostateczny zestaw sond składał się z 242 000 sond dla projektów multipleksów ukierunkowanych na C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium i T. pallidum. Cały protokół wzbogacania celu można wykonać w ciągu 2 lub 3 dni. Zarówno w przypadku dwudniowego, jak i trzydniowego przepływu pracy dostępne są wyraźne wskazania punktów zatrzymania.

OŚWIADCZENIE ETYCZNE
W niniejszym opracowaniu zaproponowano ulepszenia metodologiczne w oparciu o wcześniej opublikowane protokoły^10,13. Opisane procedury obejmują wyłącznie próbki pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i nie obejmują danych pacjenta; W związku z tym nie było wymagane szczególne zatwierdzenie etyczne w odniesieniu do aspektów metodologicznych. Reprezentatywne wyniki uzyskano z dwóch zestawów wcześniej badanych próbek: próbek argentyńskich pobranych zgodnie z zatwierdzonym protokołem Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, nr zatwierdzenia 201723), za pisemną świadomą zgodą uzyskaną od wszystkich uczestników; oraz zanonimizowane próbki fińskie, w przypadku których nie była wymagana żadna konkretna zgoda etyczna. Przed przesłaniem do bazy danych jakichkolwiek wynikowych danych sekwencjonowania należy usunąć odczyty odczytane przez człowieka.

Protokół

UWAGA: Przestrzeń robocza powinna być podzielona na strefę pre-PCR (przestrzeń robocza wolna od amplikonu) i strefę po PCR (przestrzeń robocza do obsługi amplikonu), aby zapobiec zanieczyszczeniu. O ile wyraźnie nie zaznaczono inaczej, wszystkie kroki muszą być wykonywane w jednym z dwóch kontrolowanych obszarów roboczych. Wszystkie mieszaniny wzorcowe i mieszaniny reakcyjne PCR powinny być przygotowywane w przestrzeni roboczej wolnej od amplikonów, natomiast wszystkie kolejne etapy obejmujące amplifikowane DNA powinny być przeprowadzane w przestrzeni roboczej do pracy z amplikonami. Wszystkie ilości w tym protokole są obliczane w celu przetworzenia ośmiu próbek.

1. Fragmentacja DNA

1. Zmierzyć stężenie DNA w ekstraktach DNA z próbek klinicznych zawierających DNA docelowego patogenu (DNA) przy użyciu czułej, dokładnej metody opartej na fluorescencji (test dwuniciowego DNA [dsDNA], przy użyciu 1 μl próbki, z zakresem wykrywania do 120 ng/μl; patrz tabela materiałów). Ta metoda kwantyfikacji jest stosowana konsekwentnie w całym protokole za każdym razem, gdy mierzone jest stężenie DNA.
2. Rozcieńczyć każdą próbkę DNA do stężenia 10 - 200 ng przy użyciu wody wolnej od nukleaz, zapewniając końcową objętość 17 μl w każdym pasku probówki PCR. Aby osiągnąć optymalne wyniki sekwencjonowania, należy użyć jak największej ilości wejściowego DNA w zalecanym zakresie.
   UWAGA: W przypadkach, gdy całkowite stężenie DNA jest poniżej zalecanego minimum wynoszącego 10 ng w 17 μl, można zastosować suplementację tłem DNA (np. ludzkim genomowym DNA) w celu spełnienia wymagań dotyczących wsadu, zgodnie z sugestią producenta. Może to pomóc ustabilizować reakcję przygotowania biblioteki i poprawić wydajność sekwencjonowania w próbkach klinicznych o niskim nakładzie wejściowym.
3. Rozmrozić bufor do rozdrobnienia (5x), odwirować i umieścić na lodzie.
4. Zaprogramować termocykler zgodnie z tabelą 1. Uruchom program i natychmiast wstrzymaj pracę.
   UWAGA: Czas trwania etapu inkubacji w temperaturze 37 °C może się różnić w zależności od początkowej wielkości fragmentu DNA i pożądanej długości odczytu NGS. W przypadku próbek DNA wysokiej jakości zaleca się czas inkubacji wynoszący 15 minut w celu uzyskania fragmentów o długości od 150 do 200 pz odpowiednich do 2 100-krotnych odczytów i 10-minutowy w celu uzyskania fragmentów o długości od 180 do 250 pz w przypadku 2 150-krotnych odczytów.
5. Pobrać wymagane fiolki do głównej mieszanki rozdrobnienia z miejsca przechowywania w temperaturze -20°C. Przygotować mieszankę wzorcową w oparciu o tabelę 2. Uszczelnij rurkę i wiruj z dużą prędkością przez 5-10 s. Krótko zakręć, aby usunąć bąbelki i trzymaj mieszankę główną na lodzie.
6. Dodać 3 μl głównej mieszanki rozdrobnienia do każdej studzienki zawierającej 17 μl wejściowego DNA. Wymieszać pipetując w górę i w dół 20x, uszczelnić pasek probówki do PCR, wirować z dużą prędkością przez 5-10 s i krótko odwirować.
7. Umieść pasek probówki PCR w termocyklerze (patrz Tabela materiałów) i wznów program zilustrowany w Tabeli 1 na początku kroku 1.
8. Po osiągnięciu stopnia zatrzymania 4 °C wyjmij pasek probówki PCR z termocyklera i dodaj 30 μl wody wolnej od nukleaz. Umieść pasek probówki do PCR na lodzie.

Tabela 1: Program termocyklera do fragmentacji enzymatycznej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przygotowanie mieszanki głównej rozdrobnienia Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Przygotowanie biblioteki

1. Przygotowanie mieszanki głównej do podwiązywania
   UWAGA: W tym momencie należy przygotować mieszankę wzorcową do podwiązywania, ponieważ potrzebuje ona 30-45 minut, aby zrównoważyć się do temperatury pokojowej.
   1. Pobrać bufor ligacyjny z magazynu w temperaturze -20°C i rozmrozić na lodzie. Pobrać ligazę DNA T4 z magazynu w temperaturze -20°C, wymieszać, odwracając fiolkę i trzymać na lodzie.
   2. Przygotować główną mieszankę do podwiązywania zgodnie z tabelą 3. Zamknij rurkę i wiruj z dużą prędkością przez 10-20 s, krótko wiruj i trzymaj w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut przed użyciem.
2. Naprawa końcowa i fragmenty dA-tail
   1. Zaprogramować termocykler zgodnie z tabelą 4.
   2. Odzyskać końcowy bufor naprawczy z magazynu w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie. Po rozmrożeniu wiruj z dużą prędkością, krótko wiruj. Odzyskać mieszankę enzymów ogonowych do naprawy końca-A, wymieszać, odwracając fiolkę i trzymać na lodzie.
   3. Przygotować końcową mieszankę główną do naprawy/dA-tailing zgodnie z tabelą 5 (patrz tabela materiałów). Wymieszaj, szczelnie zamykając rurkę i wiruj z dużą prędkością przez 10-20 s, krótko wiruj i trzymaj na lodzie.
   4. Odpipetować 20 μl głównej mieszanki do naprawy końcówek/dA-tailing do każdej studzienki zawierającej 50 μl fragmentów DNA (z etapów 1.1-1.8). Uszczelnij pasek probówki do PCR, dokładnie wymieszaj, wirując z dużą prędkością przez 5-10 sekund. Krótko obróć pasek probówki do PCR i umieść go w termocyklerze. Wznów program z Tabeli 4.
3. Podwiązanie adapterów z oznaczeniem MBC
   1. Gdy program w Tabeli 4 zakończy swój ostatni krok, umieść pasek probówki PCR na lodzie. Ustaw termocykler zgodnie z parametrami w tabeli 6. Uruchom program i natychmiast go wstrzymaj.
   2. Dodać 25 μl głównej mieszanki ligacji w temperaturze pokojowej do każdej próbki przygotowanej w kroku 2.1. Uszczelnij pasek probówki do PCR, wiruj przez 5-10 s i krótko wiruj.
   3. Pobrać mieszankę oligo adaptera dla bibliotek oznaczonych MBC (patrz tabela materiałów) z magazynu w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie. Po rozmrożeniu wiruj z dużą prędkością przez 5-10 s. Krótko zakręć i trzymaj na lodzie.
   4. Do każdej próbki dodać 5 μl mieszanki oligonugolaktycznej adaptera dla bibliotek oznaczonych MBC. Uszczelnij pasek probówki do PCR i wiruj z dużą prędkością przez 5-10 s, krótko wiruj. Natychmiast umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i kontynuuj uruchamianie programu zgodnie z tabelą 6.
4. Oczyszczanie podwiązania
   1. Wykonaj oczyszczanie DNA za pomocą kulek magnetycznych. Wyjmij kulki z magazynu w temperaturze 4 °C i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przed użyciem.
   2. Przygotuj 4 ml 70% etanolu, używając wody bez nukleazy. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się świeże przygotowanie 70% roztworu etanolu do użycia na etapach czyszczenia, aby zapewnić optymalną wydajność. W przypadku przygotowania 70% etanolu należy użyć wody wolnej od nukleaz bezpośrednio przed użyciem.
   3. Dokładnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych, aż mieszanina będzie jednolita, a kolor będzie spójny.
   4. Gdy program w Tabeli 6 osiągnie stopień wstrzymania 4 °C, przenieś pasek probówki PCR z termocyklera do temperatury pokojowej. Do każdej studzienki dodać 80 μl zawiesiny kulek. Uszczelnij pasek probówki PCR i wiruj przez 5-10 s, krótko zakręć.
   5. Inkubować zawiesiny kulek przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś pasek probówki do PCR na stojak magnetyczny (patrz Tabela materiałów) i odczekaj 5-10 minut, aż roztwór stanie się klarowny.
   6. Trzymając pasek probówki do PCR w stojaku magnetycznym, ostrożnie wyjmij i wyrzuć oczyszczony roztwór z każdej studzienki, unikając kontaktu z kulkami.
   7. Z paskiem probówki do PCR w stojaku magnetycznym wykonaj dwa płukania 70% etanolem w następujący sposób: dodaj 200 μl 70% etanolu do każdej próbki. Odczekaj 1 minutę i usuń 70% etanolu. Unikaj dotykania koralików podczas wyjmowania roztworu.
   8. Po drugim umyciu uszczelnij pasek probówki do PCR i krótko odkręć próbki, aby zebrać resztki etanolu. Umieść pasek probówki PCR w stojaku magnetycznym na 30 sekund.
   9. Usuń zebrany etanol, unikając dotykania koralików. Aby usunąć resztki etanolu, wyjmij pasek probówki PCR ze stojaka magnetycznego i trzymaj ją rozpieczętowaną (najlepiej w kapturze) przez maksymalnie 5 minut. Upewnij się, że koraliki są całkowicie wysuszone, ale nie wyglądają na popękane; Zmniejszyłoby to skuteczność procesu elucji.
   10. Eluuj DNA, dodając 35 μl wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki próbki. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół 10x-15x, uszczelnij probówki i wiruj przez 5-10 s. Potwierdź brak widocznych grudek. W przypadku, gdy takowe są, wiruj aż do rozpuszczenia.
   11. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść pasek probówki do PCR w podstawce magnetycznej i odczekaj około 5 minut, aż roztwór się przejrzy.
   12. Ostrożnie usunąć oczyszczony supernatant (~34 μl) z każdej studzienki i przenieść do odpowiedniego dołka w świeżym pasku probówki do PCR. Próbki należy przechowywać na lodzie i wyrzucić kulki.
       UWAGA: W przypadku protokołu 3-dniowego oznacza to koniec Dnia 1. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Wzmocnienie i podwójny indeks
   UWAGA: Wybierz odpowiednią parę starterów indeksowych dla każdej próbki, aby zapewnić prawidłową identyfikację podczas sekwencjonowania. Każda sekwencja indeksu składa się ze znacznika 8 pz wbudowanego w startery używane do wzmacniania bibliotek przed przechwytywaniem.
   1. Odzyskaj bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności z dNTP (5x) z przechowywania w temperaturze -20 °C i rozmroź na lodzie. Pobrać wybrane indeksowane startery sekwencjonowania z magazynu w temperaturze -20 °C i przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Upewnij się, że zapisałeś określony kod kreskowy przypisany do każdej próbki w celu dokładnej identyfikacji i identyfikowalności w całym procesie sekwencjonowania.
   2. Zaprogramować termocykler zgodnie z tabelą 7. Uruchom program i natychmiast wstrzymaj pracę.
      UWAGA: Producent zaleca wykonanie od 8 do 14 cykli PCR przed wychwytywaniem w zależności od jakości i ilości pobranego DNA. W tym protokole zrealizowano 11 cykli zgodnie z zaleceniami producenta, co zaowocowało wysokiej jakości danymi sekwencjonowania^10,12.
   3. Pobrać enzym fuzyjny o wysokiej wierności do amplifikacji PCR z magazynu w temperaturze -20 °C. Pipetuj enzym w górę iw dół, aby wymieszać, unikając nadmiernego mieszania, i wiruj bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zapewnić jednorodność. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR do wstępnego wychwytywania (zgodnie z opisem w Tabeli 8). Zmieszaj ostateczną mieszankę i krótko odwiruj, trzymaj na lodzie.
   4. Dozować 11 μl mieszaniny reakcyjnej PCR do wstępnego wychwytywania (przygotowanej zgodnie z opisem w tabeli 8) do każdej studzienki zawierającej oczyszczoną bibliotekę DNA. Do każdej reakcji dodać 5 μl wybranej pary starterów indeksowych. Uszczelnij pasek probówki PCR i wiruj przez 5 sekund, a następnie szybko odwiruj.
   5. Wznów program termocyklera zgodnie z tabelą 7. Gdy temperatura osiągnie 98 °C, umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i dokładnie zamknij pokrywę.
6. Sprzątanie biblioteki
   1. Przed użyciem pozwól, aby kulki magnetyczne zrównoważyły się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut. Przygotuj 4 ml 70% etanolu, używając wody bez nukleazy. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   2. Dokładnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych, aż mieszanina będzie jednolita, a kolor będzie spójny.
   3. Gdy program w Tabeli 7 osiągnie krok wstrzymania 4 °C, przenieś pasek probówki PCR z termocyklera do temperatury pokojowej. Do każdej próbki dodać 50 μl zawiesiny kulek. Uszczelnij pasek probówki PCR i wiruj przez 5-10 s, krótko wiruj (bez granulowania kulek magnetycznych).
   4. Inkubować zawiesiny kulek przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś pasek probówki do PCR na stojak magnetyczny i odczekaj 5-10 minut, aż roztwór stanie się klarowny.
   5. Trzymając pasek probówki do PCR w stojaku magnetycznym, ostrożnie wyjmij i wyrzuć przezroczysty roztwór z każdej studzienki. Unikaj dotykania koralików podczas wyjmowania roztworu.
   6. Z paskiem probówki do PCR w stojaku magnetycznym wykonaj dwa prania z 70% etanolem w następujący sposób. Do każdej próbki dodać 200 μl 70% etanolu. Odczekaj 1 minutę i usuń 70% etanolu. Unikaj dotykania koralików podczas wyjmowania roztworu.
   7. Po drugim praniu uszczelnij pasek probówki do PCR i krótko ją odwiruj, aby zebrać resztki etanolu. Umieść pasek probówki PCR w stojaku magnetycznym na 30 sekund. Usuń resztki etanolu, unikając dotykania kulek.
   8. Aby usunąć resztki etanolu, wyjmij pasek probówki PCR ze stojaka magnetycznego i trzymaj ją rozpieczętowaną (najlepiej w kapturze) przez maksymalnie 5 minut. Upewnij się, że kulki są całkowicie wysuszone, ale nie mają popękanego wyglądu, ponieważ zmniejszyłoby to wydajność procesu elucji.
   9. Eluuj DNA biblioteki, dodając 15 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki z próbką. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół 10x-15x, uszczelnij pasek probówki PCR i wiruj przez 5-10 sekund. Potwierdź brak widocznych grudek. W przypadku, gdy takowe są, wiruj aż do rozpuszczenia.
   10. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść pasek probówki do PCR w podstawce magnetycznej i odczekaj około 5 minut, aż roztwór się przejrzy.
   11. Ostrożnie usunąć oczyszczony supernatant (~15 μl) z każdej studzienki i przenieść do odpowiedniego dołka w świeżym pasku probówki do PCR. Próbki należy przechowywać na lodzie i wyrzucić kulki.
7. Kontrola jakości
   1. Zmierz stężenie DNA w oczyszczonym DNA z biblioteki. Ze względu na wyższą czułość należy użyć metody opartej na fluorescencji, aby określić ilościowo DNA w 1 μl.

Tabela 3: Przygotowanie głównej mieszanki do podwiązywania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Program termocyklera do naprawy końcowej/dA-tailingu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Przygotowanie do naprawy końcówki/mieszanki głównej dA. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6 Program termocyklera do podwiązania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Program termocyklera PCR przed wychwytywaniem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 8: Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR przed wychwytywaniem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Hybrydyzacja/wychwytywanie próbki

1. Biblioteki hybrydyzacji do sondowania
   1. Zaprogramować termocykler zgodnie z tabelą 9. Uruchom program i natychmiast wstrzymaj pracę.
      UWAGA: Producent zaleca temperaturę hybrydyzacji 65°C. Temperatura ta została obniżona do 62,5 °C, co spowodowało poprawę wyników.
   2. Pobrać bufor hybrydyzacyjny z magazynu w temperaturze -20 °C, rozmrozić na lodzie i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Pobrać mieszaninę blokera RNazy i blokera oligonukleotydów z magazynu w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie. Przechowywać te fiolki na lodzie do czasu użycia.
   3. Obliczyć objętość wymaganą, aby każda próbka zawierała 500–1000 ng biblioteki DNA, w oparciu o stężenie DNA zmierzone w kroku 2.7. Przenieś obliczoną objętość do nowego paska probówki do PCR i dostosuj całkowitą objętość do 12 μl wodą bez nukleaz.
   4. Wiruj i szybko odwiruj mieszankę blokerów oligonukleotydów. Dodać 5 μl do każdej probówki z próbką. Uszczelnij pasek probówki do PCR i przenieś do termocyklera. Wznowić program cykli termicznych opisany w Tabeli 9 i uruchomić do Kroku 3, w którym należy dodać dodatkowe odczynniki bezpośrednio do dołków na próbki w termocyklerze.
   5. Przygotować 25% roztwór blokowy RNazy zgodnie z tabelą 10. Zamknij rurkę i wiruj z dużą prędkością przez 10-20 s, krótko wiruj i trzymaj na lodzie do użycia.
      UWAGA: Unikaj długotrwałego wystawiania roztworów zawierających sondę na działanie temperatury pokojowej. Przechowywać w temperaturze pokojowej tylko podczas etapów przygotowania.
   6. Wyjąć fiolkę z sondą z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C i przechowywać ją w stojaku chłodzącym, gdy nie jest używana. Przełóż do lodu w celu rozmrożenia. Zaleca się stosowanie sond zgodnie z przepisami, ale można je rozcieńczyć, jeśli zostanie przetestowane^10,13.
   7. Gdy wszystkie odczynniki wymienione w Tabeli 11 osiągną temperaturę pokojową, połącz w celu przygotowania mieszanki hybrydyzacyjnej sondy. Wymieszaj roztwór, wirując z dużą prędkością przez 5 sekund, krótko odwiruj i natychmiast przejdź do następnego kroku.
   8. Gdy termocykler osiągnie krok 3 programu opisanego w tabeli 9, dodaj 13 μl mieszanki hybrydyzacyjnej sondy temperatury pokojowej do każdej studzienki próbki, utrzymując probówki w termocyklerze przez cały proces. Dokładnie wymieszaj, pipetując powoli w górę i w dół 8x-10x.
   9. Bezpiecznie zamknij pasek probówki do PCR, krótko zawiruj i odwiruj probówki. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie natychmiast włóż rurki paskowe do termocyklera. Dokładnie sprawdź, czy rurki są odpowiednio uszczelnione.
   10. Wznów program cykli termicznych w celu przeprowadzenia hybrydyzacji przygotowanych próbek DNA z biblioteki z sondami. Hybrydyzacja postępuje z dnia na dzień
       UWAGA: W przypadku protokołu 2-dniowego oznacza to koniec Dnia 1. W przypadku 3-dniowego protokołu oznacza to koniec Dnia 2.
2. Przygotowanie kulek streptawidyny
   1. Kulki magnetyczne pokryte streptawidyną (kulki streptawidyny) należy pobrać z magazynu w temperaturze 4 °C. Dokładnie przemieszać fiolkę, aby upewnić się, że kulki są całkowicie zawieszone. Zawiesina musi być jednorodna.
   2. Dla każdej próbki hybrydyzacji przenieś 50 μl całkowicie zawieszonych kulek do pojedynczych probówek nowego paska probówki do PCR.
   3. Przemyć kulki streptawidyny w następujący sposób: dodać 200 μl buforu wiążącego do każdej probówki, mieszać pipetując w górę i w dół. Uszczelnij rurki, wiruj z dużą prędkością przez 5-10 s i krótko odwiruj. Umieść pasek probówki PCR w stojaku magnetycznym. Pozostawić roztwór do klarowizacji na 5 minut, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz kroki 2x, wykonując w sumie trzy prania.
   4. Zawiesić kulki w 200 μl buforu wiążącego.
3. Przechwytywanie bibliotek hybrydowych
   1. Gdy program cykli termicznych hybrydyzacji wskazany w Tabeli 9 zakończy swój ostatni etap, przenieś pasek probówki PCR do temperatury pokojowej.
   2. Przenieść całą objętość (~30 μl) z każdej probówki do odpowiednich probówek zawierających 200 μl wstępnie umytych kulek streptawidyny. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 5x-8x, a następnie dokładnie zamknij probówkę z paskiem.
   3. Umieść probówkę paskową na 96-dołkowym mikserze płytkowym i energicznie mieszaj z prędkością 1800 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że ciecz jest prawidłowo wymieszana w studzienkach.
      UWAGA: Jeśli 96-dołkowy mieszalnik płytkowy jest niedostępny lub próbki nie mieszają się skutecznie, należy rozważyć alternatywne metody, takie jak poziome zabezpieczenie probówek paskowych na górnej powierzchni mieszalnika lub użycie wytrząsarki o kontrolowanej temperaturze (z wyłączoną opcją podgrzewania) w celu zapewnienia dokładnego mieszania próbki.
   4. Podczas tego czasu inkubacji należy przygotować sześć podwielokrotności po 200 μl wysokotemperaturowego buforu do przemywania dla każdej próbki (tj. w tym przypadku 6 x 8 probówek paskowych każda o zawartości 200 μl). Uszczelnić probówki i inkubować w termocyklerze utrzymywanym w temperaturze 70 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
   5. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji wychwytywania należy krótko obrócić pasek probówki do PCR, aby zebrać płyn. Umieść pasek probówki PCR w stojaku magnetycznym, aby zebrać koraliki. Poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny (około 2 minut), a następnie ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant, unikając dotykania kulek.
   6. Po wyjęciu paska probówki PCR ze stojaka magnetycznego dodać 200 μl buforu do przemywania w temperaturze pokojowej. Pipetować w górę i w dół, aż kulki streptawidyny zostaną całkowicie ponownie zawieszone (15x-20x).
   7. Umieść pasek probówki do PCR w podstawce magnetycznej i poczekaj, aż zawiesina zniknie (około 1 minuta). Następnie usunąć i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Aby zapewnić specyficzność wychwytywania, ważne jest, aby utrzymać zawiesinę ściegu w temperaturze 70 °C przez cały czas trwania procedury mycia opisanej poniżej. Dlatego przed użyciem należy sprawdzić, czy bufor do mycia w wysokiej temperaturze jest wstępnie podgrzany do temperatury 70 °C.
   8. Przemyć kulki streptawidyny 6x podzielonym i wstępnie podgrzanym do temperatury 70 °C buforem do płukania, jak opisano poniżej.
      1. Wyjmij probówkę z paskiem PCR zawierającą koraliki ze stojaka magnetycznego. Dodać 200 μl wstępnie podgrzanego wysokotemperaturowego buforu do płukania o temperaturze 70 °C do każdej probówki zawierającej kulki. Pipetuj w górę i w dół, aż kulki zostaną całkowicie ponownie zawieszone (15x-20x). Ostrożnie uszczelnij pasek probówki do PCR, wiruj z dużą prędkością przez 8 s i szybko wiruj bez granulowania kulek.
      2. Umieścić probówkę z paskiem do pobierania próbek zawierającą zawieszone kulki w bloku termocyklera w temperaturze 70 °C na 5 minut. Przenieś rurkę paskową z termocyklera na stojak magnetyczny w temperaturze pokojowej.
      3. Odczekaj 1 minutę, aż roztwór się usunie. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz 5 razy, co daje w sumie sześć prań.
   9. Upewnij się, że cały bufor do płukania został całkowicie usunięty, a następnie dodaj 25 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki z próbką. Powoli ponownie zawiesić kulki, pipetując 8 razy w górę i w dół, starając się uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
   10. Pasek PCR zawierający próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, gdy będą one gotowe do użycia w reakcjach PCR opisanych poniżej.
4. Biblioteki wzbogacone o wzmocnienie
   1. Zaprogramować termocykler zgodnie z tabelą 12. Uruchom program i natychmiast wstrzymaj pracę.
      UWAGA: Producent zaleca wykonanie od 10 do 16 cykli PCR po wychwyceniu w zależności od wielkości konstrukcji sondy. W tym protokole zaimplementowano 22 cykle, co zaowocowało pomyślnym odzyskaniem genomu patogenu^10,12.
   2. Pobrać zarówno bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności z dNTP (5x), jak i mieszankę starterów po wychwyceniu (patrz tabela materiałów) z przechowywania w temperaturze -20 °C, rozmrażać i przechowywać na lodzie. Wiruj z dużą prędkością i szybko odkręć przed użyciem.
   3. Enzym fuzyjny o wysokiej wierności do amplifikacji PCR (patrz tabela materiałów) należy pobrać z pamięci przechowywanej w temperaturze -20 °C. Aby prawidłowo wymieszać roztwór enzymu, należy pipetować płyn w górę i w dół, aby uniknąć nadmiernego mieszania. Następnie należy przygotować mieszaninę reakcyjną PCR po wychwyceniu, łącząc wszystkie odczynniki zgodnie z tabelą 13. Zmieszaj ostateczną mieszankę i krótko odwiruj, trzymaj na lodzie.
   4. Dodać 25 μl mieszaniny reakcyjnej PCR po wychwyceniu do każdej probówki z próbką (każda zawierająca 25 μl DNA wzbogaconego w kulki docelowe). Pipetować w górę i w dół, aby mieszać reakcje, aż zawiesina kulek będzie jednolita. Bezpiecznie uszczelnij pasek probówki do PCR. Na tym etapie nie należy odkręcać paska probówki do PCR.
   5. Umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i wznów program termocyklera, jak określono w tabeli 12. Gdy program dojdzie do ostatniego kroku, krótko obróć pasek probówki do PCR. Umieść pasek probówki do PCR w stojaku magnetycznym, odczekaj około 2 minut, aż roztwór się klaruje.
   6. Przenieść około 50 μl supernatantu z każdego paska probówki do PCR do odpowiedniego dołka nowego paska probówki do PCR. Tubkę z paskiem zawierającą kulki streptawidyny można wyrzucić.
5. Czyszczenie bibliotek końcowych
   1. Przed użyciem pozwól, aby kulki magnetyczne zrównoważyły się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut. Przygotuj 4 ml 70% etanolu, używając wody bez nukleazy. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   2. Dokładnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych, aż mieszanina będzie jednolita, a kolor będzie spójny.
   3. Dodać 50 μl zawiesiny kulek do każdej probówki z próbką. Uszczelnij rurki i wiruj przez 5-10 s, krótko wiruj (bez granulowania kulek magnetycznych).
   4. Inkubować zawiesiny kulek przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś pasek probówki do PCR na stojak magnetyczny i odczekaj 5-10 minut, aż roztwór stanie się klarowny.
   5. Trzymając pasek probówki do PCR w stojaku magnetycznym, ostrożnie wyjmij i wyrzuć przezroczysty roztwór z każdej studzienki. Unikaj dotykania koralików podczas wyjmowania roztworu.
      1. Z paskiem probówki do PCR w stojaku magnetycznym wykonaj dwa płukania 70% etanolem w następujący sposób: dodaj 200 μl 70% etanolu do każdej próbki. Odczekaj 1 minutę, aby zaburzone kulki opadły i usuń 70% etanolu. Unikaj dotykania koralików podczas wyjmowania roztworu.
   6. Po drugim umyciu uszczelnij probówki i krótko odkręć pasek probówki do PCR, aby zebrać resztki etanolu. Umieść pasek probówki PCR na stojaku magnetycznym na 30 sekund.
   7. Aby usunąć resztki etanolu, wyjmij pasek probówki do PCR ze stojaka magnetycznego i trzymaj go rozpieczętowany (najlepiej w kapturze) przez maksymalnie 5 minut. Upewnij się, że kulki są całkowicie wysuszone, ale nie mają popękanego wyglądu, co zmniejszyłoby wydajność procesu elucji.
   8. Eluuj DNA biblioteki, dodając 25 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki z próbką. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół 10x-15x, uszczelnij pasek probówki PCR i wiruj przez 5-10 sekund. Potwierdź brak widocznych grudek.
   9. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść pasek probówki do PCR w podstawce magnetycznej i odczekaj około 5 minut, aż roztwór się przejrzy.
   10. Ostrożnie usunąć oczyszczony supernatant (około 25 μl) z każdej studzienki i przenieść do odpowiedniego dołka w świeżym pasku probówki do PCR. Próbki należy przechowywać na lodzie i wyrzucić kulki.
6. Kontrola jakości
   1. Zmierz stężenie DNA w oczyszczonym DNA z biblioteki. Aby uzyskać lepszą czułość, należy użyć metody opartej na fluorescencji do ilościowego określenia DNA w 1 μl.
7. Sekwencjonowanie nowej generacji
   UWAGA: W zależności od pojemności używanej platformy i ilości danych sekwencjonowania wymaganych na próbkę, indeksowane biblioteki z kilku partii mogą być multipleksowane w jednym przebiegu sekwencjonowania.
   1. Przed zebraniem próbek należy dostosować stężenie DNA w każdej próbce do 5 ng/μl. Połączyć biblioteki w ilościach równomolowych, aby zachować zrównoważoną reprezentację.
   2. Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek przy użyciu wysokoprzepustowego systemu sekwencjonowania krótkiego odczytu z, na przykład, konfiguracją odczytu sparowanego końca 150 bp (patrz tabela materiałów).

Tabela 9: Program termocyklera do hybrydyzacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 10: Przygotowanie roztworu bloku RNazy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 11: Przygotowanie mieszanki hybrydyzacyjnej sondy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 12: Program termocyklera PCR po wychwyceniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 13: Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR po wychwyceniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wyniki

Badanie nad wybuchem epidemii Lv C. trachomatis w Buenos Aires w Argentynie wykazało pewne nowe cechy w próbkach, a mianowicie 10 podstawień nukleotydów w genie ompA w porównaniu z genotypem L1 ompA oraz niezwykłą sekwencję typu 2 17,18,19 (Multi-Locus Sequence Typing) (MLST). Naszym celem było zbadanie genomów z tych próbek klinicznych, umieszczając je w kontekście danych globalnych. Aby to osiągnąć, porównaliśmy wydajność podejścia do wzbogacania docelowego z bezpośrednim sekwencjonowaniem metagenomicznym dla WGS bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową z próbek klinicznych, próbując przezwyciężyć wyzwania związane z niskim obciążeniem bakteryjnym oraz obfitym ludzkim i mikrobiologicznym DNA.

Wykorzystane DNA pochodziło z próbek wymazów z odbytu pobranych w latach 2017-2023 w Buenos Aires w Argentynie, umieszczonych w pożywce 2-SP (pożywka sacharozowo-fosforanowa) uzupełnionej 2% płodową surowicą cielęcą (FCS) i antybiotykami (gentamycyna 25 μg/ml, wankomycyna 0,5 mg/ml i amfoterycyna B 2,5 μg/ml) i przechowywane w temperaturze -80 °C, lub zbiorcze wymazy z cewki moczowej, odbytnicy i gardła pobrane w Szpitalu Uniwersyteckim w Zurychu (USZ) w buforze NAAT (Nucleic Acid Amplification Tests). DNA z próbek z Buenos Aires zostało wyekstrahowane przy użyciu zestawu do ekstrakcji ręcznej na bazie krzemionki, podczas gdy DNA z próbek USZ zostało wyekstrahowane za pomocą zautomatyzowanego systemu opartego na kulkach magnetycznych.

Wszystkie próbki kliniczne uwzględnione w tym badaniu zostały potwierdzone dodatnim wynikiem za pomocą opracowanego przez nas multipleksowego testu PCR w czasie rzeczywistym (patrz tabela materiałów) z wartościami progowymi cyklu qPCR (Ct) w następującym zakresie: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae: 24-31, T. pallidum: 27-36 i M. genitalium: 30-37. Stężenie DNA określono ilościowo za pomocą testu fluorometrycznego o wysokiej czułości przed sekwencjonowaniem w celu scharakteryzowania materiału wejściowego próbek klinicznych (patrz Tabela materiałów).

Aby porównać bezpośrednie sekwencjonowanie metagenomiczne ze wzbogaceniem docelowym, użyliśmy 32 próbek, z których 29 było dodatnich dla C. trachomatis, dziewięć dla N. gonorrhoeae, pięć dla T. pallidum i trzy dla M. genitalium. Bezpośrednie sekwencjonowanie metagenomiczne nie dało żadnych kompletnych genomów, a w rzeczywistości ledwo osiągnęło dane docelowe powyżej wartości wyjściowej obserwowanej w próbkach ujemnych. Wzbogacenie celu za pomocą hybrydyzacji w temperaturze 65 °C dało znacznie lepsze wyniki dla każdego patogenu, a w wielu przypadkach uzyskano udane genomy dzięki tej metodzie (ryc. 1).

Aby ocenić optymalny wybór próbki do wzbogacenia docelowego, oceniliśmy związek między diagnostycznymi wartościami qPCR Ct a skutecznością odzyskiwania genomu, mierzoną procentem odczytów na miejscu (%OTR). Wskaźnik ten odzwierciedla proporcję odczytów sekwencjonowania, które odwzorowują genom organizmu docelowego i jest powszechnie stosowany do oceny wydajności wzbogacania. Stwierdzono istotną korelację między obciążeniem patogenem a sukcesem sekwencjonowania C. trachomatis, z punktem odcięcia Ct dla powodzenia około Ct30. Chociaż dane dotyczące innych docelowych patogenów były ograniczone, zaobserwowano podobny trend, w którym sukces sekwencjonowania genomu wystąpił głównie w próbkach z ładunkiem patogenu poniżej Ct30 (ryc. 2).

Ten eksperyment z temperaturą hybrydyzacji 65 °C dał wskaźniki powodzenia sekwencjonowania genomu ze wzbogaceniem docelowym o 75%-80% dla C. trachomatis, N. gonorrhoeae i T. pallidum, na podstawie próbek o wartościach Ct poniżej 30. Trzy próbki dodatnie M. genitalium miały wartości Ct 30-37 i osiągnęły niższe pokrycie genomu oraz średnią głębokość odczytu. Aby poprawić te wyniki, eksperymentowaliśmy z obniżeniem temperatury hybrydyzacji, co poprawia hybrydyzację ze względu na niską zawartość %G+C w genomie M. genitalium . Stosując niższe temperatury hybrydyzacji, takie jak obecnie zalecana temperatura 62,5 °C, możemy poprawić odzyskiwanie genomów M. genitalium bez uszczerbku dla odzyskiwania innych genomów (ryc. 3). Wyniki te pokazują, że wzbogacanie docelowe jest skutecznym podejściem do uzyskiwania cennych informacji genomowych z próbek klinicznych i może być dostosowane do szerokiego zakresu genomów, również w ramach projektu panelowego.

Analiza filogenetyczna pomyślnie wzbogaconych genomów C. trachomatis wykazała, że większość próbek z Buenos Aires skupia się w obrębie kladu ompA-genotyp L2b, co sugeruje udaną linię o globalnym obiegu. Analiza ujawniła również obecność nowej, odrębnej linii rodowej w Argentynie, powodującej LGV. Próbki z tego kladu różnią się o około 600 SNP od innych linii LGV, a linia ta jest proponowana jako genotyp L4 ompA (ryc. 4). Szczegółowy opis próbek użytych na rys. 1, rys. 2 i rys. 4 znajduje się w tabeli uzupełniającej 1.

Odkrycia te podkreślają wartość wzbogacania celu w badaniu różnorodności patogenów i wykazują wysoki stopień sukcesu sekwencjonowania genomu na podstawie próbek klinicznych.

Rysunek 1: Wzbogacanie genomów za pomocą wzbogacania docelowego w porównaniu z bezpośrednim sekwencjonowaniem metagenomicznym. Odsetek odczytów po osiągnięciu celu (%OTR), zdefiniowany jako odsetek odczytów sekwencjonowania mapujących genom organizmu docelowego, pokazuje stopień wzbogacenia osiągnięty dzięki wzbogaceniu docelowemu. Linia reprezentuje medianę wszystkich punktów danych, a pole wskazuje 50% przedział międzykwartylowy (IQR). Kolory punktów danych odpowiadają źródłu próbki: bladoniebieski dla Argentyny i czerwony dla Szwajcarii. Sukces sekwencjonowania genomu, zdefiniowany jako pokrycie >95% i średnia głębokość odczytu >10, jest reprezentowany przez duże punkty, podczas gdy niepowodzenie jest wskazywane przez małe punkty. Zwróć uwagę na różne skale na osi y. Skróty: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Liczba ta została zmodyfikowana z¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Korelacja %OTR ze wzbogacenia celu z diagnostycznymi wartościami qPCR Ct. Kolory punktów danych reprezentują źródło próbki: bladoniebieski dla Argentyny i czerwony dla Szwajcarii. Powodzenie sekwencjonowania genomu, zdefiniowane jako pokrycie >95% i średnia głębokość odczytu >10, jest oznaczone dużymi punktami, podczas gdy niepowodzenie jest reprezentowane przez małe punkty. Zwróć uwagę na różne skale na osi y. Skróty: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Liczba ta została zmodyfikowana z¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wpływ temperatury hybrydyzacji na odzyskiwanie kompletnych genomów wszystkich patogenów bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową w dziesięciu próbkach. Ludzkie DNA w zakresie próbek klinicznych zostało wzbogacone znanymi stężeniami docelowego bakteryjnego DNA osobno (pojedyncze), a także razem, aby reprezentować próbkę z wieloma infekcjami (połączone). Przeprowadzono dwa eksperymenty, każdy z pięcioma patogenami/kombinacjami: 0,01% i 0,03%, aby przedstawić przybliżony procent DNA z każdego mikroorganizmu w stosunku do całkowitego DNA w próbce (pozostałe DNA odpowiada ludzkiemu DNA). Regeneracja M. genitalium poprawia się w niższych temperaturach. C. trachomatis (C. trachomatis) DNA zostało wzbogacone w niskim stężeniu; Dalsze eksperymenty pokazują, że temperatury nie wpłynęły na odtworzenie genomów C. trachomatis (dane nie pokazane). Skróty: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: filogeneza skorygowana o rekombinację szczepów LGV z Argentyny. Analiza obejmuje wszystkie dostępne genomy LGV wraz z opublikowanymi danymi. Metadane wyświetlane po prawej stronie filogenezy obejmują zduplikowane próbki pacjentów, bayesowską analizę struktury populacji (BAPS; klaster = klad, z polifiletycznym klastrem BAPS 6 reprezentującym różnorodność genetyczną populacji), metodę sekwencjonowania genomu (dane z tego badania), genotyp ompA , kraj i rok, jak wskazano w kluczu w lewym górnym rogu. Brakujące dane są wyświetlane w kolorze białym. Nazwy genomów z tego badania są wyróżnione kolorem jasnoniebieskim dla Argentyny i ciemnoniebieskim dla Finlandii (nie uzyskano ich przez docelowe wzbogacenie). Kolory te są używane wyłącznie do rozróżnienia genomów wygenerowanych w tym badaniu. Wartości bootstrap z 1000 ultraszybkich bootstrapów są wyświetlane jako wartości procentowe w głównych gałęziach. Liczba ta została zmodyfikowana z¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Opis materiałów, odczynników, przyrządów i sprzętu wykorzystanych w badaniu. Tabela zawiera szczegółowe informacje na temat nazwy handlowej, producenta i numeru katalogowego składników używanych do ekstrakcji DNA, przygotowania biblioteki, wzbogacania celu i sekwencjonowania. Obejmuje również pozycje używane do wewnętrznych testów qPCR i ogólnych procedur biologii molekularnej. Równoważne alternatywy mogą być stosowane w przypadku produktów oznaczonych gwiazdką (*). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Generowanie kompletnych danych dotyczących genomu bakteryjnego z próbek klinicznych jest szczególnie trudne. Jednak dane te są nam potrzebne, aby uzyskać informacje na temat krążących klonów i zbadać profile oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, szczególnie u wybrednych i trudnych do hodowli bakterii. Stosując alternatywne metody, takie jak głębokie sekwencjonowanie lub sekwencjonowanie adaptacyjne z wykorzystaniem technologii Oxford Nanopore, nie można uzyskać wystarczających danych do analizy sekwencji całego genomu. W przypadkach takich jak próbki chorób przenoszonych drogą płciową, wzbogacanie docelowe jest optymalną techniką dostępu do pełnego genomu, a metoda ta może być stosowana w całym panelu bakteryjnych patogenów STI. Chociaż nie jest to tania procedura, wyników, które może zaoferować, nie można uzyskać w żaden inny sposób¹⁰.

Odpowiednie próbki powinny być starannie dobrane, najlepiej tak, aby odpowiadały na istotne i ważne pytania w diagnostyce i badaniach. Pożywka używana do zbierania niekoniecznie odgrywa kluczową rolę, z udanymi sekwencjami uzyskanymi zarówno z pożywki 2-SP, jak i NAAT. Przechowywanie próbek jest ważne w celu utrzymania integralności DNA. Za najważniejszy czynnik uznano obciążenie diagnostyczne, dążące do uzyskania przybliżonych wartości Ct poniżej Ct30. W przypadku próbek o wartościach Ct powyżej 30 powodzenie pełnego sekwencjonowania genomu jest mniej prawdopodobne, ale w niektórych przypadkach częściowe dane mogą dostarczyć istotnych informacji.

Procedura nie jest trywialna, obejmuje wiele etapów, w tym cykle PCR, hybrydyzację i wiele myć perełek. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zwrócić szczególną uwagę na procedurę. Krytyczne etapy protokołu – fragmentacja DNA, hybrydyzacja za pomocą sond wychwytujących i wychwytywanie oparte na kulkach magnetycznych z myciem – wymagają starannego wykonania i właściwego obchodzenia się z nimi. Protokół może być nauczony przez badaczy i techników po kilku próbach. W pierwszych rundach, podczas nauki, 3-dniowy protokół może być zaletą; W przypadku bardziej doświadczonych użytkowników 2-dniowy protokół może przyspieszyć wyniki. Ponieważ odczynniki są drogie, warto przeprowadzić test bez drogich komponentów, na przykład sond. W przypadku alternatywnych zestawów przynęt temperaturę hybrydyzacji można dostosować, co może poprawić czułość lub swoistość wzbogacenia. Jeśli zostanie wygenerowana wystarczająca ilość danych i zaobserwowany zostanie znaczny odsetek duplikatów PCR, można również dostosować liczbę cykli PCR przed wychwytywaniem i po wychwyceniu.

Dane uzyskane z tych eksperymentów można wykorzystać do typowania, z wyodrębnionym MLST i innymi odpowiednimi celami. Można go dalej analizować w kontekście epidemiologicznym, globalnie lub lokalnie, w porównaniu z odpowiednimi genomami w celu uzyskania współczesnych informacji. Rekombinacja i analiza elementów ruchomych w całym genomie również wnioskują o zmianach w czasie i pod presją selekcyjną oraz możliwych koinfekcjach. Dysponując wystarczającą ilością danych i powiązanych metadanych, można dokonać obliczeń czasowych i wywnioskować przodków o określonych cechach i liniach, a także możliwych trasach i mechanizmach transmisji. Wszystkie te postępy w naszej wiedzy na temat ważnej grupy patogenów mogą stanowić podstawę strategii zdrowia publicznego. Nasz protokół i reprezentatywne wyniki wskazują na zastosowanie zestawów sond docelowych z panelem syndromicznym, które są skuteczne w próbkach bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową i mogą być rozszerzone na dodatkowe typy próbek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipeta 8-kanałowa 0,5-10 i mikro; L	Eppendorf powiedział:	3125000010	Badania Eppendorf  plus, 8-kanałowy, 0,5-10 i mikro; L, średnio szary, o zmiennej objętości.
Pipeta 8-kanałowa 10-100 µ L	Eppendorf powiedział:	3125000036	Badania Eppendorf  plus, 8-kanałowe, 10-100 i mikro; L, żółty, zmienna głośność.
Adapter Oligo Mix dla bibliotek oznaczonych MBC	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).
Zautomatyzowany system ekstrakcji kwasów nukleinowych za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA wirusa/patogenu	Qiagen powiedział:	937036 (Zestaw) / 9001297 (Instrument)	Instrument QIAsymphony SP/AS używany z zestawem QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit do automatycznej ekstrakcji DNA.
Bufor powiązań	Technologie Agilent	5190-9687	Część zestawu do wzbogacania celów SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
Zestaw do ekstrakcji DNA i automatyczny instrument	Korporacja Badawcza Zymo	D3024/D3025	Quick-DNA Miniprep Kit służy do całkowitej ekstrakcji DNA z próbek klinicznych. Kompatybilny z ręcznym lub zautomatyzowanym przepływem pracy.
Naprawa końcowa - mieszanka enzymów ogonowych	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).
Koniec bufora ogonowego naprawy	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).
Etanol	VWR Chemicals BDH	20816.298	Etanol absolutny ≥ 99,5% Ph. Eur., USP
Fluorometr z testem dsDNA o wysokiej czułości / metoda oparta na fluorescencji do ilościowego oznaczania DNA	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	Q33238, Q33231	Fluorometr Qubit 4 z zestawem testowym 1X dsDNA o wysokiej czułości (HS).
Bufor fragmentacji	Technologie Agilent	5191-4080	Część zestawu do fragmentacji enzymatycznej SureSelect o nazwie "5X Fragmentation Buffer".
Enzym fragmentacji	Technologie Agilent	5191-4080	Część zestawu do fragmentacji enzymatycznej SureSelect.
Bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR) o nazwie ''Herculase II Buffer''.
Bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności z dNTP (5X)	Technologie Agilent	5190-9687	Część zestawu SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Herculase II Buffer''.
Enzym fuzyjny o wysokiej wierności do amplifikacji PCR	Technologie Agilent	5191-5688	Część zestawu SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Herculase II''.
Wysokotemperaturowy bufor do płukania	Technologie Agilent	5190-9687	Część zestawu SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Wash buffer 2''.
Bufor hybrydyzacyjny	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).
Indeksowane startery sekwencjonowania	Technologie Agilent	5500-0147	Część par starterów indeksowych SureSelect XT HS2 1-96 do ILM (Pre PCR).
Wewnętrzny multipleksowy test PCR w czasie rzeczywistym	Tib Molbiol	N/A	Opracowany i akredytowany test oparty na zestawach Lightmix do wykrywania chorób przenoszonych drogą płciową
Bufor podwiązania	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).
Koraliki magnetyczne do sprzątania	Technologie Agilent	5191-5740	Koraliki SureSelect DNA AMPure XP.
Stojak magnetyczny	Sprzęt laboratoryjny Permagen	MSRLV08	0,2 ml PCR 8-paskowy separator magnetyczny 5 i mikro; L ~ 0,2 ml objętości.
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS): Wysokowydajny system sekwencjonowania z krótkim odczytem	Illumina, Inc.	N/A	Sekwencjonowanie parowanych końców 150 pz (PE150) wykonywane na platformach Illumina NextSeq1000 i MiSeq.
Woda wolna od nukleaz	Koncepcja biologiczna	3-07F04-H	Woda do biologii molekularnej, wolna od DNA / DNAse / RNazy, sterylna, bez inhibitorów PCR.
Mieszanka blokerów oligonukleotydów	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).
Pasek probówki do PCR	avantor, dostarczony przez firmę VWR	732-3608	Paski probówki do PCR z dołączonymi płaskimi nakrętkami.
Mieszanka podkładów po wychwyceniu	Technologie Agilent	5190-9687	Część zestawu do wzbogacania celów SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
Sonda RNA	Technologie Agilent	5191-6916	SureSelect Niestandardowa sonda Tier4 6Mb-11.9Mb, np. Identyfikator projektu S3465164).
Bloker RNaz	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).
Bufor do płukania w temperaturze pokojowej	Technologie Agilent	5190-9687	SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Wash buffer 1''.
Koraliki paciorkowca	Technologie Agilent	5191-5742	JasneWybierz koraliki Streptawidyny.
Ligaza DNA T4	Technologie Agilent	5500-0147	Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR) .
Metoda wzbogacania celu / metoda wychwytywania DNA	Technologie Agilent	G9983-90000	Zestaw SureSelect XT HS2 DNA z przygotowaniem biblioteki, szybkim wzbogacaniem celów i przepływem pracy po schwytaniu. Wersja protokołu F0, maj 2023 r. Dla platformy Illumina NGS
Zestaw sondy wzbogacającej cel dla C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum i M. genitalium	Agilent Technologies / Laboratorium Mikrobiologii Wzbogacającej (IMM, UZH)	Identyfikator wzoru S3465164	Specjalnie zaprojektowany zestaw sond (~242 000 sond) do multipleksowego wychwytywania czterech patogenów STI. Projektowanie w oparciu o wiele genomów referencyjnych.
Termocykler	Termofischer	4375305	96-dołkowy termocykler Veriti.