Osłabienie feroptozy neuronalnej przez hamowanie RKIP po spontanicznym krwotoku śródmózgowym poprzez aktywację szlaku NRF2/HO-1

Samoistny krwotok śródmózgowy (ICH) to schorzenie mózgowe charakteryzujące się krwawieniem spowodowanym uszkodzeniem naczyń wewnątrzczaszkowych, martwicą i pęknięciem naczyń, często dotykającym jądrów podstawy i stanowiącym główny podtyp udaru krwotocznego¹. Wskaźnik śmiertelności wśród pacjentów z diagnozą ICH wynosi około 50%, a znacząca część osób, które przeżyły, doświadczają poważnej utraty samodzielności². Obecne opcje leczenia spontanicznej ICH są ograniczone, a żadne terapie nie wykazały istotnego zmniejszenia śmiertelności ani znaczącej poprawy wyników neurologicznych po ICH.

Ferroptoza, zależna od żelaza forma zaprogramowanej śmierci komórkowej, definiowana jest przez peroksydację lipidów, gromadzenie jonów żelaznych oraz wyczerpanie glutationu, co odróżnia ją od innych form zaprogramowanej śmierci komórkowej w kategoriach genetycznych, morfologicznych i biologicznych³. Coraz więcej dowodów podkreśla rolę ferroptozy neuronalnej w patologii ICH. Białko inhibitora kinazy raf (RKIP), znane również jako białko wiążące fosfatydylololaminę 1 (PEBP1), uczestniczy w rozwoju nerwowym i tworzy kompleks 15LOX/PEBP1 poprzez wiązanie z 15-lipoksynazą (15LOX), kluczowym regulatorem ferroptozy⁴. Jednak konkretna rola i mechanizmy RKIP w ferroptozie związane z postępem spontanicznej ICH pozostają niezbadane.

Badanie to analizowało działanie antyferroptozy wynikające z hamowania RKIP na neurony, wykazując, że hamowanie ekspresji RKIP może hamować ferroptozę neuronalną po ICH, potencjalnie poprzez aktywację szlaku czynnika E2 powiązanego z czynnikiem jądrowym czynnika E2/hemooxygenazy-1 (NRF2/HO-1). Te odkrycia są istotne dla rozwoju nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na patogenezę ICH.

Hodowla komórek PC12
Linia komórkowa PC12 została rozmnażona w podłożu roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) zawierającym 10% surowicy płodowej bydła (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny, z rutynową konserwacją w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5%_CO2 w atmosferze nawilżonej). W procedurach eksperymentalnych komórki przylegające były nakładane na naczynia hodowlane i pozwalano im rozmnażać się aż do osiągnięcia niemal zbiegających się monowarstw (około 90% powierzchni). Dysocjacja komórkowa została przeprowadzona poprzez leczenie enzymatyczne z użyciem roztworu 0,25% trypsyny-EDTA, po którym następowały trzy kolejne cykle subkultury, aby zapewnić stabilność populacji. Przetworzone komórki zostały następnie przydzielone do dalszych zastosowań eksperymentalnych i ocen analitycznych.

Testy żywotności komórek
Żywotność komórek oceniano w celu oceny cytotoksyczności hemin i lokostatyny na komórkach PC12, zgodnie z instrukcjami producenta zestawu testowego. Komórki PC12 były równomiernie zasiewane w płytkach z 96 dołkami i hodowane z heminą lub lokostatiną przez 24 godziny. Po płukaniu solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) komórki inkubowano w medium RPMI-1640 zawierającym 10% roztwór soli tetrazolu przez 90 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zmierzono wartości gęstości optycznej (OD) przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Ilościowa reakcja łańcuchowa transkrypcja odwrotna z polimerazą (RT-qPCR)
Całkowite RNA zostało wyekstrahowane z komórek PC12 za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA. Najpierw próbka została ujednolicona w odczynniku ekstrakcyjnym, co zapewniło dokładną lizę. Do mieszaniny dodawano chloroform, energicznie wstrząśnięto i wirowano, aby oddzielić fazy (12 000 × g, 15 min, 4 °C). Pobrano fazę wodną zawierającą RNA, a RNA wytrącono przez dodanie izopropanolu (faza wodna: iPrOH = 1:1) i inkubację w temperaturze pokojowej. Przeprowadzono wirowanie, aby rozpylić RNA (12 000 × g, 10 minut, 4 °C), dodano 1 mL 70% etanolu w celu usunięcia zanieczyszczeń, a na końcu granulek RNA rozpuszczono w wodzie wolnej od RNazy do przechowywania w temperaturze -80 °C. Szablony komplementarnego DNA (cDNA) zostały wygenerowane przez transkrypcję odwrotną z RT Master Mix. Powstałe szablony były następnie rozcieńczane w stosunku 1:5 i poddawane ilościowemu PCR w czasie rzeczywistym na przyrządzie PCR czasu rzeczywistego. Każda próbka była potrójnie amplifikowana, a względna ilość produktu PCR była uśredniana. Używane startery wymieniono w Tabeli 1, gdzie β-aktyna służy jako gen do prowadzenia domu. Względne stężenie mRNA określono według wzoru E = 2^−ΔΔCt, a dla każdej reakcji zarejestrowano wartość cyklu krytycznego progu (CT).

Wewnątrzkomórkowe badania na podstawie reaktywnych form tlenu (ROS) oraz lipidowego hydronadtlenku (LPO)
Poziomy ROS i LPO mierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki PC12 były traktowane heminą (80 μM), lokostatyną (5 μM) i ML385 (5 μM) przez 24 godziny i myte 3 razy PBS w naczyniach. Komórki były następnie inkubowane w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 40 minut w obecności diacetatu diacetatu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA), sondy ROS, oraz sondy BODIPY 581/591 C11, LPO. Po płukaniu PBS w celu usunięcia nadmiaru sond, intensywność fluorescencji zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Stosowano spójną strategię bramkowania we wszystkich próbkach: najpierw komórki były ograniczone na FSC-A vs. SSC-A, aby wykluczyć zanieczyszczenia, następnie pojedyncze komórki zostały wybrane przez FSC-A vs. FSC-H. Komórki niebarwione oraz komórki traktowane wyłącznie heminą były stosowane jako kontrolę negatywną i dodatnią do ustalenia kompensacji fluorescencji i bramek. Dane były analizowane za pomocą powiązanego oprogramowania.

Ekstrakcja białek i western blot
Całkowita ekstrakcja białka
Supernatant z poddanych komórkom PC12 został odrzucony, a następnie wykonano trzy płukania lodowatym PBS. Komórki pobierano trypsyną i wirowano w dawce 200 × g przez 5 minut. Po usunięciu supernatantu osad komórkowy został ujednolicony w zimnym buforze lizy Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) zawierającym 10% inhibitora proteazy i 10% inhibitora fosfatazy. Po 30-minutowej inkubacji na lodzie, lizat był wirowany w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przezroczysty supernatant był mieszany z buforem obciążeniowym (4:1) i podgrzewany w 95 °C przez 5 minut, aby denaturować białka. Próbki białka przechowywano w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.

Analiza zachodniej plamy
Białka były rozdzielane za pomocą SDS-PAGE za pomocą żelu układającego i żelu rozdzielającego, a próbki ładowano do dołków. Elektroforezę wykonano przy napięciu 80 V dla żelu układającego i 120 V dla żelu rozdzielczego. Białka były przenoszone na membranę z poliwinylydenu (PVDF) (wstępnie aktywowaną w metanolu przez 1 minutę) za pomocą systemu transferowego przy stałym prądzie 300 mA przez 1-2 godziny. Błona została zablokowana 5% mlekiem odtłuszczonym w TBST przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Po trzech myciach TBST (każde po 10 minut) błona była inkubowana przez noc w temperaturze 4 °C z następującymi przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w TBST: Króliczy anty-ACSL4 (1:1 000), Króliczy anty-GPX4 (1:1 000), Króliczy anty-HO-1 (1:2 000), Króliczy anty-NRF2 (1:1 000), Króliczy anty-RKIP (1:1 500) oraz myszy anty-β-aktyna (1:5 000). Błona była myta przez 3 x 10 minut metodą TBST i inkubowana z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 2 godziny w temperaturze pokojowej: IgG dla koz znakowanych przez HRP (1:1 000), IgG dla Kóz znakowanych HRP (1:1 000). Po kolejnych płukaniach TBST trwających 3 x 5 minut, sygnały białkowe zostały zwizualizowane za pomocą zestawu ECL Western Blot i zmierzone za pomocą oprogramowania ImageJ.

Barwienie immunofluorescencyjne
Komórki były zasiewane na pokrywkach wstępnie umieszczonych w płytkach hodowlanych i pozostawiane do przylegania. Po eksperymentalnym leczeniu supernatant został odrzucony, a komórki przemyto 3 razy PBS. Komórki były fiksowane 4% paraformaldehydem (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym następowały trzy płukania PBS. Następnie komórki były przepuszczane 0,1% Triton X-100 na 10 minut w temperaturze pokojowej i myte 3 razy PBS. Niespecyficzne wiązanie zostało zablokowane przez inkubację z 3% surowiczą albuminą bydła (BSA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciała pierwotne zastosowano przez noc w temperaturze 4 °C: anty-HO-1 dla królików (1:500), anty-NRF2 dla królików (1:500). Po trzech płukaniach PBS następnego dnia komórki były inkubowane fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej: Alexa Fluor 488-znakowany Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Po końcowych płukaniach próbki zostały zamontowane w medium montażowym zawierającym 4',6-diamidino-2'-fenylindol (DAPI) do neutralizacji jądrowej. Obrazy zostały wykonane za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego skaningowego.

Analiza statystyczna
Dane pomiarowe wyrażano jako średnią ± odchylenie standardowe (S.D.). Dane ilościowe reprezentujące wyniki trzech niezależnych testów replikacyjnych zostały wykorzystane do analizy. Do porównań między dwiema grupami zastosowano test t, następnie jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) do porównań między wieloma grupami, a następnie test post hoc Tukeya dla wielu porównań. Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Hemin może powodować uszkodzenia błony plazmatycznej, dlatego jest często wykorzystywany do budowy modeli komórek in vitro ICH. Badanie to badało wpływ leczenia hemin w różnych stężeniach i czasach trwania na żywotność komórek PC12, jednocześnie analizując dynamikę ekspresji białek RKIP w odpowiednich warunkach eksperymentalnych za pomocą analizy western blot (Rysunek 1A). Żywotność komórek była istotnie obniżona przy stężeniach hemin 60 μM lub wyższych (Rysunek 1B), a spadek ten zachodził w zależności od dawki wraz ze wzrostem stężeń. Ponadto cytotoksyczność heminów była zależna od czasu, osiągając szczyt w ciągu pierwszych 24 godzin ekspozycji, a następnie stopniowo zacząła się zmniejszać (Rysunek 1C). Analiza Western blot wykazała, że ekspresja białek RKIP była istotnie podwyższona przy 80 μM hemin (rysunek 1D,E) i osiągnęła szczyt 24 godziny po stymulacji (rysunek 1F,G). Na podstawie tych wyników wybraliśmy 80 μM hemow oraz 24-godzinny okres leczenia do kolejnych eksperymentów, aby wyjaśnić mechanizmy i szlaki sygnalizacyjne.

Aby zbadać rolę RKIP w ferroptozie neuronalnej po ICH, użyliśmy lokostatyny do hamowania ekspresji RKIP (Rysunek 2A). Lokostatyna wiąże się z RKIP, zakłóca interakcje między RKIP a kinazą Raf-1 i GRK2, tym samym łagodząc funkcjonalne działanie RKIP w celu osiągnięcia celu hamowania. W tym badaniu zastosowaliśmy lokostatynę jako inhibitor RKIP do badania powiązanych mechanizmów molekularnych 5,6. Cytotoksyczność lokostatyny została po raz pierwszy oceniona w zakresie stężeń 0-40 μM za pomocą testu żywotności. Wyniki nie wykazały istotnej cytotoksyczności przy ≤5 μM, co ustanowiło bezpieczny zakres stężeń dla kolejnych eksperymentów (Rysunek 2B). Potwierdziliśmy dodatkowo hamujący wpływ lokostatyny 5 μM na ekspresję RKIP za pomocą analiz western blotting i RT-qPCR. Western blot wykazał istotny spadek poziomu białka RKIP (rysunek 2C,D), natomiast RT-qPCR wykazał spadek poziomu mRNA RKIP (rysunek 2E). Wyniki te wykazują skuteczność lokostatyny 5 μM w hamowaniu ekspresji RKIP.

W tym badaniu opracowano model komórek PC12 indukowany przez heminowe z krwokiem śródmózgowym (ICH), aby określić funkcję regulacyjną RKIP w ferroptozie. Nasze wyniki wskazały, że stymulacja hemin istotnie zwiększała ekspresję RKIP , jednocześnie obniżając żywotność komórek. Na podstawie istniejących badań spekulowaliśmy, że śmierć komórkowa wywołana przez heminę może być ściśle powiązana z ferroptozą, procesem peroksydacji lipidów katalyzowanym żelazem, charakteryzującym się patologiczną depozycją żelaza w przedziałach komórkowych oraz podwyższonym poziomem reaktywnych form tlenu (ROS).

Aby dalej zbadać związek między RKIP a ferroptozą, lecząc komórki PC12 stymulowane heminowcami lokostatyną. Analiza western blota wykazała, że ekspresja rodziny syntezaty długich łańcuchów acyl-CoA 4 (ACSL4), kluczowego czynnika ferroptozy, była istotnie zwiększona w grupie leczonej heminami (rysunek 3A,B). ACSL4 jest kluczowym genem sprzyjającym śmierci ferroptozie, promującym estryfikację wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), a tym samym zwiększając wrażliwość komórek na ferroptozę. Dodatkowo, ekspresja peroksydazy glutationowej 4 (GPX4), inhibitora ferroptozy, była istotnie obniżona w grupie leczonej heminami (Rysunek 3A,C). GPX4 jest kluczowym regulatorem ferroptozy, który hamuje peroksydację lipidów poprzez usuwanie nadtlenków lipidów, chroniąc tym samym komórki przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Wyniki te wskazują, że stymulacja hemin zwiększa ferroptozę w komórkach PC12. Jednak w porównaniu z grupą heminową, farmakologiczna inhibicja RKIP za pomocą lokostatyny odwróciła te zmiany, wskazując, że zahamowanie ekspresji RKIP hamowało ferroptozę w komórkach PC12. Na poziomie mRNA zaobserwowano również spójne wyniki (Rysunek 3 F,G).

Badaliśmy także ekspresję cząsteczek szlaków związanych z ferroptozą. Wykazano, że szlak NRF2/HO-1 odgrywa kluczową rolę w ferroptozie. Na tej podstawie wysunęliśmy hipotezę, że hamowanie RKIP może hamować ferroptozę neuronalną poprzez aktywację szlaku NRF2/HO-1. Aby przetestować tę hipotezę, najpierw stymulowaliśmy komórki PC12 heminą i stwierdziliśmy, że ekspresja białka NRF2 była istotnie zwiększona (rysunek 3A,D), wraz ze znaczącym wzrostem produktu końcowego HO-1 (rysunek 3A,E). Wyniki te sugerują, że ferroptoza wywołana przez heminy aktywuje szlak NRF2/HO-1, który działa ochronnie na komórki. Jako główny regulator komórkowych odpowiedzi antyoksydantów, NRF2 zwiększa komórkową pojemność antyoksydacyjną poprzez regulację ekspresji genów docelowych w dalszej fazie, takich jak HO-1, hamując tym samym ferroptozę. Następnie leczenie lokostatyną dodatkowo zwiększyło ekspresję HO-1 i NRF2 w porównaniu z grupą leczoną heminami (Rysunek 3A,D). Obserwowano również spójne wyniki na poziomie mRNA (rysunek 3I,J), co dodatkowo potwierdza, że hamowanie RKIP hamuje ferroptozę w komórkach PC12 stymulowanych heminami poprzez modulację NRF2 i jego cząsteczki HO-1.

Warto zauważyć, że inny inhibitor ferroptozy, łańcuch ciężki ferrytyny 1 (FTH1), wykazał zwiększoną ekspresję po stymulacji hemin, a jej ekspresja była jeszcze bardziej podwyższona po hamowaniu RKIP (Rysunek 3H). FTH1 jest głównym składnikiem ferrytyny, odpowiedzialnym za magazynowanie i utlenianie żelaza. Przekształca jony żelaza w bardziej stabilną formę, redukując stres oksydacyjny wywołany wolnym żelazem. Wzrost stężenia FTH1 podczas stymulacji hemin może stanowić kompensacyjną odpowiedź na przeciążenie żelazem, ponieważ komórki próbują magazynować nadmiar żelaza, aby uniknąć uszkodzeń oksydacyjnych. Dalszy wzrost ekspresji FTH1 po leczeniu lokostatyną sugeruje obniżony poziom wolnego żelaza i zwiększoną zdolność antyoksydacyjną, co potwierdza wniosek, że hamowanie RKIP hamuje ferroptozę wywołaną przez heminę w komórkach PC12.

Poziomy ROS i nadtlenku lipidów (LPO) w komórkach PC12 oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Leczenie Hemin doprowadziło do znacznego wzrostu poziomu ROS i LPO, które zostało odwrócone po podaniu Locostatiny. To odkrycie wskazuje, że hamowanie RKIP może pomóc w hamowaniu ferroptozy w neuronach (Rysunek 4A-D).

Podsumowując, dawka indukowana przez heminę oraz zależne od czasu spadki żywotności komórek PC12, w połączeniu z wyraźnym wzrostem poziomu białka RKIP . Proces ten wiązał się z podwyższonymi poziomami ACSL4 i zahamowaną ekspresją GPX4. Równocześnie zaobserwowano istotne nagromadzenie markerów uszkodzeń oksydacyjnych (ROS i LPO), które pełnią rolę głównych czynników napędzających ferroptozę, pośrednicząc w stresie oksydacyjnym i zaburzeniach błony lipidowej. Ponadto wzrost poziomu białka magazynującego żelazo FTH1 sugerował kompensacyjną odpowiedź komórkową na przeciążenie żelazem. Co istotne, farmakologiczne hamowanie RKIP przez lokostatynę odwróciło te zmiany i zlikwidowało ferroptozę indukowaną przez heminę (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4).

Wyniki testów wskazywały, że hamowanie RKIP skutecznie hamowało ferroptozę neuronalną i regulowało ekspresję NRF2/HO-1 . Biorąc pod uwagę, że szlak NRF2/HO-1 odgrywa kluczową rolę w ferroptozie, postawiono hipotezę, że hamowanie ferroptozy neuronalnej obserwowane przy inhibicji RKIP może być pośredniczone poprzez stymulację tego szlaku. Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadzono kolejne eksperymenty (rysunek 5A).

Zastosowano ML385, selektywny inhibitor NRF2, a wyniki potwierdziły, że ekspresja NRF2 była skutecznie zmniejszona zarówno przy poziomie białka (Rysunek 5B, C), jak i mRNA (Rysunek 5E). Dodatkowo oceniono ekspresję HO-1, cząsteczki poniżej NRF2. Wyniki wskazywały, że choć początkowo hamowanie RKIP zwiększało ekspresję HO-1, efekt ten został odwrócony po inhibicji NRF2 (rysunek 5B, D, F). Wyniki te sugerują, że hamowanie RKIP może osłabić ferroptozę neuronalną poprzez aktywację szlaku NRF2/HO-1. Barwienie immunofluorescencyjne dodatkowo potwierdziło te ustalenia, ponieważ po hamowaniu RKIP zaobserwowano translokację NRF2 jądrową (rysunek 5G-J).

Następnie dodatkowo oceniliśmy poziomy ROS i LPO w komórkach PC12 za pomocą cytometrii przepływowej. Stwierdziliśmy, że hamowanie NRF2 za pomocą ML385 odwróciło spadek poziomów ROS i LPO wywołany przez lokostatynę. Wyniki te sugerują, że supresja RKIP może hamować ferroptozę neuronalną poprzez aktywację szlaku NRF2/HO-1 (rysunek 6A-D).

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Zbiory danych wygenerowane podczas obecnego badania są zawarte w Pliku Uzupełniającym 1.

Rysunek 1: Konstrukcja modelu choroby in vitro za pomocą komórek PC12 stymulowanych heminami. (A) Schematyczna ilustracja konstrukcji modelu komórkowego PC12 stymulowanego heminą. (B) Określenie optymalnego stężenia hemin dla ustanowienia modelu in vitro intracerebralnego krwotoku z wykorzystaniem testu żywotności komórek do oceny żywotności komórek. (C) Badanie żywotności komórek z komórkami PC12 traktowanymi hemisyną (80 μM) przez różne punkty czasowe. (D,E) Reprezentatywna analiza western blot oraz ilościowa ocena poziomu ekspresji RKIP w komórkach PC12 leczonych różnymi stężeniami hemin (24 h). (F,G) Reprezentatywna analiza western blot oraz ilościowa ocena poziomu ekspresji RKIP w komórkach PC12 narażonych na hemin (80 μM) przez różny czas trwania. Wszystkie dane są prezentowane jako średnia ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skróty: CCK8 = Zestaw do Liczenia Komórek-8; WB = zachodni blot; RKIP = białko inhibitora kinazy RAF. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Wpływ lokostatiny na ekspresję RKIP w komórkach PC12 stymulowanych heminą. (A) Schematyczna ilustracja eksperymentalnej procedury leczenia lokostatyną w komórkach PC12. (B) Żywotność komórek PC12 leczonych różnymi stężeniami lokostatyny oceniano za pomocą testu żywotności komórek. (C,D) Ekspresja RKIP w komórkach PC12 leczona hemistą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h) była analizowana metodą western blota, z wykazem reprezentatywnych blotek i analizy statystycznej. (E) Ekspresja mRNA RKIP w komórkach PC12 leczona hemistą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h) została zmierzona za pomocą RT-qPCR. Wszystkie dane są przedstawione jako średnia ± SD (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skróty: CCK8 = Zestaw do Liczenia Komórek-8; WB = zachodni blot; RT-qPCR = Ilościowa reakcja łańcuchowa transkrypcja odwrotna z polimerazą; ROS = Reaktywne Składniki tlenu; LPO = peroksydacja lipidów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Wpływ hamowania RKIP na ferroptozę w komórkach PC12 po stymulacji heminą. (A-E) Analiza zmian ekspresji białek w ACSL4, GPX4, NRF2 i HO-1 w komórkach PC12 traktowanych heminą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h). (F-J) Analiza RT-qPCR poziomów ekspresji mRNA ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 i FTH1 w komórkach PC12 leczonych hemistą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h). Wszystkie dane są przedstawione jako średnia ± SD (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skróty: WB = western blot; RT-qPCR = Ilościowa reakcja łańcuchowa transkrypcja odwrotna z polimerazą; RKIP = białko inhibitora kinazy Raf; ACSL4 = rodzina syntezazy długich 4 syntezazy Acyl-CoA; GPX4 = nadoksydaza glutationu 4; NRF2 = czynnik 2 związany z czynnikiem jądrowym E2; HO-1 = Oxygenaza hemu-1; FTH1 = Ciężki łańcuch ferrytynowy 1. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Wpływ hamowania RKIP na stres oksydacyjny w komórkach PC12 po stymulacji hemin. (A,C) Analiza cytometrii przepływowej produkcji reaktywnych form tlenu w komórkach PC12 leczonej heminą (80 μM,24 h) i/lub lokostatiną (5 μM,24 h). (B,D) Analiza cytometrii przepływowej peroksydacji lipidów w komórkach PC12 leczonej hemistą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h). Wszystkie dane są prezentowane jako średnia ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skróty: ROS = Reaktywne Tlenowe Związki; LPO = peroksydacja lipidów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Rola NRF2 w efektach antyferroptotycznych pośredniczonych przez hamowanie RKIP. (A) Schematyczna ilustracja eksperymentalnej procedury leczenia komórek PC12 w różnych warunkach. (B-D) Analiza Western blot zmian ekspresji białek w NRF2 i HO-1 w różnych warunkach leczenia w komórkach PC12 z heminą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatiną (5 μM, 24 h) i/lub ML385 (5 μM, 24 h). (E,F) Analiza RT-qPCR poziomu ekspresji NRF2 i HO-1 w komórkach PC12 leczonych hemisyną (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h) i/lub ML385 (5 μM, 24 h). (G-J) Analiza immunofluorescencji ekspresji NRF2 i HO-1 oraz ilościowa ilościowa średnia intensywność fluorescencji w komórkach PC12 leczonych heminą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h) i/lub ML385 (5 μM, 24 h). Paski skali = 50 μm. Wszystkie dane są prezentowane jako średnia ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skróty: WB = western blot; RT-qPCR = Ilościowa reakcja łańcuchowa transkrypcja odwrotna z polimerazą; Barwienie IF = barwienie immunofluorescencyjne; NRF2 = czynnik 2 związany z czynnikiem jądrowym E2; HO-1 = Heme-oxygenaza-1. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Rola NRF2 w tłumieniu stresu oksydacyjnego pośredniczonego przez hamowanie RKIP.(A,C) Analiza cytometrii przepływowej produkcji reaktywnych form tlenu w komórkach PC12 z użyciem heminy (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyny (5 μM, 24 h) i/lub ML385 (5 μM, 24 h). (B,D) Analiza cytometrii przepływowej peroksydacji lipidów w komórkach PC12 leczonych hemistą (80 μM, 24 h) i/lub lokostatyną (5 μM, 24 h) i/lub ML385 (5 μM, 24 h). Wszystkie dane są prezentowane jako średnia ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skróty: ROS = Reaktywne Tlenowe Związki; LPO = peroksydacja lipidów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7: Schematyczne przedstawienie hamowania hamowania ferroptozy neuronalnej RKIP po spontanicznym ICH poprzez aktywację szlaku NRF2/HO-1.Nasze wyniki pokazują, że hamowanie RKIP skutecznie wspiera translokację jądra NRF2, hamuje nagromadzenie ROS lipidów i w konsekwencji chroni przed ferroptozą wywołaną przez heminy oraz stresem oksydacyjnym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Startery do ilościowej transkrypcji odwrotnej – PCR.

Plik uzupełniający 1: Surowe i przetworzone dane ilościowe wspierające pierwsze sześć cyfr, w tym testy CCK-8, Western blot, RT-qPCR oraz analizy cytometrii przepływowej. Dane są zorganizowane według podpaneli rysunków i obejmują wszystkie wartości replikowane używane w analizach statystycznych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w tym artykule.