Method Article

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładne, bezznacznikowe obrazowanie organoidów jelitowych ma kluczowe znaczenie dla badania ich morfologii, dynamiki wzrostu i reakcji na bodźce środowiskowe. Holotomografia (HT) zapewnia trójwymiarową (3D) wizualizację żywych organoidów w wysokiej rozdzielczości bez konieczności stosowania markerów fluorescencyjnych, minimalizując w ten sposób fototoksyczność i zachowując integralność próbki. Obrazowanie fazowe w czasie rzeczywistym umożliwia ciągłe, bezznacznikowe śledzenie zmian strukturalnych i funkcjonalnych. Wykorzystując współczynnik załamania światła jako wewnętrzny kontrast obrazowania, metoda ta umożliwia ilościowe określenie właściwości biofizycznych, takich jak objętość, gęstość białka i zawartość białka. Dane obrazowania są dalej przetwarzane za pomocą segmentacji opartej na uczeniu maszynowym i ekstrakcji cech w celu wsparcia spójnej analizy o wysokiej przepustowości. Protokół ten szczegółowo opisuje kompletny eksperymentalny przepływ pracy w celu wykorzystania HT o niskiej koherentności w badaniach organoidów, obejmujący przygotowanie organoidów, akwizycję obrazowania i analizę danych opartą na uczeniu maszynowym. Integrując segmentację obliczeniową i oceny ilościowe, podejście to umożliwia bezstronną ocenę kluczowych właściwości organoidów, w tym żywotności, organizacji strukturalnej i odpowiedzi na lek. Możliwość uchwycenia zmian morfologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej sprawia, że protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniach opartych na organoidach w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i farmaceutycznych badaniach przesiewowych. Przedstawiona tutaj metodologia krok po kroku ułatwia odtwarzalność i szeroką adaptację w różnych systemach organoidowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy to trójwymiarowe (3D) zminiaturyzowane wersje narządów wyhodowanych z komórek macierzystych, zdolne do rekapitulacji kluczowych cech strukturalnych i funkcjonalnych prawdziwych narządów in vitro1. Naukowcy opracowali systemy organoidowe dla szerokiej gamy tkanek - w tym jelita, mózgu, płuc, wątroby i nerek - z których każdy wykazuje samoorganizującą się architekturę i różnorodność typów komórek, przypominając swoje odpowiedniki in vivo . Odzwierciedlając natywną architekturę narządów i złożoność wielokomórkową, organoidy służą jako potężne systemy modelowe do badania rozwoju człowieka, regeneracji tkanek i mechanizmów chorobowych1. Stały się one kluczowymi narzędziami do modelowania chorób i odkrywania leków, umożliwiając naukowcom badanie ścieżek chorobowych i testowanie nowych terapii na specyficznych dla pacjenta tkankach 3D w laboratorium2. Warto zauważyć, że organoidy są również obiecujące w medycynie regeneracyjnej3: tkanki pochodzące z organoidów mogą być wszczepiane in vivo w celu naprawy uszkodzeń, jak wykazano w przypadku organoidów jelitowych i wątrobowych, co podkreśla ich potencjał w przywracaniu funkcji narządów4. Ta wszechstronność sprawia, że organoidy są niezbędne we współczesnych badaniach biomedycznych i medycynie spersonalizowanej.

Biorąc pod uwagę ich wielokomórkowy skład i złożoność strukturalną 3D, uchwycenie i analiza dynamiki organoidów ma kluczowe znaczenie. Jednak konwencjonalne techniki obrazowania napotykają znaczne ograniczenia w rozwiązywaniu struktur i dynamiki organoidów, często tworząc migawki 2D, które nie reprezentują ich pełnego stanu fizjologicznego5.

Mikroskopia jasnego pola jest szeroko stosowaną, nieinwazyjną metodą wychwytywania organoidów. Wygodnie monitoruje wzrost i morfologię, ale zapewnia ograniczony kontrast w niebarwionych próbkach 3D. Dodatkowo brakuje w nim przekroju optycznego, co skutkuje słabą rozdzielczością struktur wewnętrznych. Organoidy wydają się w dużej mierze przezroczyste, co utrudnia wykrycie drobnych cech pod powierzchnią6. Kontrast fazowy poprawia widoczność, przekształcając przesunięcia fazowe na różnice intensywności, odsłaniając ogólną architekturę (np. centralne światło) bez barwienia. Pomimo swojej użyteczności do obserwacji w czasie rzeczywistym, kontrast fazowy cierpi z powodu artefaktów halo, niskiej rozdzielczości i ograniczonej głębokości penetracji, co czyni go mniej skutecznym w przypadku grubszych organoidów7.

Szeregowe cięcie, a następnie barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz barwienie immunologiczne oparte na przeciwciałach jest szeroko stosowane do analizy mikrostruktury organoidów i składu komórkowego8. Ulepszone techniki przetwarzania tkanek, takie jak zatapianie parafiny utrwalonej w formalinie (FFPE) i kriosekcja, poprawiają zachowanie morfologii, a FFPE zapewnia doskonałe wyniki9. Osadzanie organoidów w hydrożelach, takich jak agaroza, i wirowanie wyrównują wiele próbek w jednej sekcji, poprawiając wydajność analizy. Wybarwione H&E skrawki organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta odzwierciedlają oryginalną histologię guza, podczas gdy barwienie immunofluorescencyjne podkreśla markery, takie jak CK8, do identyfikacji komórek10. Jednak techniki te nie mogą monitorować żywych organoidów i mogą wprowadzać artefakty, takie jak marszczenie się tkanek lub deformacja podczas sekcji.

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do obrazowania organoidów, dając przekroje optyczne o wysokiej rozdzielczości (submikrometrowe), które umożliwiają szczegółową wizualizację architektury organoidów i składu komórkowego11,12. Jednak obrazowanie konfokalne organoidów 3D jest zwykle ograniczone do warstw powierzchniowych (do głębokości 100 μm) i może być czasochłonne i fototoksyczne ze względu na punktowe oświetlenie laserowe13. Mikroskopia fluorescencyjna z użyciem arkuszy świetlnych (LSFM) pokonuje niektóre z tych ograniczeń, oświetlając tylko płaszczyznę obrazowania, uzyskując szybkie obrazowanie wolumetryczne całych organoidów przy minimalnym fotowybielaniu i fototoksyczności14,15; Jednak technika ta często wymaga oczyszczania tkanek w celu optymalnego obrazowania grubych próbek. Ponadto głębokość obrazowania LSFM jest ograniczona przez niedopasowania rozpraszania światła i współczynnika załamania światła (RI), które można złagodzić za pomocą optyki adaptatywnej, obrazowania wielowidokowego i zoptymalizowanych długości fal wzbudzenia16. Montaż próbek wprowadza również deformacje strukturalne, podczas gdy duże zestawy danych 3D stanowią wyzwanie obliczeniowe w zakresie przechowywania i analizy. Ostatnie osiągnięcia, w tym ulepszone techniki znakowania genetycznego, nowatorskie odczynniki czyszczące, optyka adaptatywna i analiza obrazu oparta na sztucznej inteligencji, rozwiązują te ograniczenia, sprawiając, że LSFM staje się coraz bardziej wykonalny w badaniach nad organoidami7.

Pomimo tych postępów, techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D stwarzają kilka wyzwań dla długoterminowego monitorowania żywych organoidów. Po pierwsze, stosowanie znakowania fluorescencyjnego wprowadza efekty fototoksyczne i zaburza procesy biologiczne, co stanowi wyzwanie dla długotrwałych badań obrazowychna żywo 17. Po drugie, znakowanie oparte na przeciwciałach cierpi z powodu ograniczonej penetracji ze względu na bariery dyfuzyjne w gęstych strukturach organoidowych, co wymaga zaawansowanych metod przenikania i oczyszczania tkanek, które wymagają więcej niż 10 dni inkubacji w przypadku użycia przeciwciał pierwszego i drugorzędowego18. Po trzecie, transfekcja i stabilna ekspresja białek fluorescencyjnych w organoidach pozostają nieefektywne, ponieważ konwencjonalne podejścia do dostarczania genów mają problemy ze środowiskami 3D19. Po czwarte, techniki oczyszczania optycznego, niezbędne do głębokiego obrazowania, często prowadzą do utraty sygnału fluorescencji i zniekształcenia tkanek, co wymaga zoptymalizowanych protokołów oczyszczania, które równoważą przezroczystość i zachowanie fluorescencji20.

Aby zaradzić tym ograniczeniom, wprowadzono holotomografię (HT) jako technikę obrazowania nieznakowanych żywych organoidów z wysoką rozdzielczością w czasie. HT, znana również jako ilościowe obrazowanie fazowe 3D, HT jest bezznacznikową modalnością o wysokiej rozdzielczości, która umożliwia ilościową wizualizację organoidów w czasie rzeczywistym przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnego stanu fizjologicznego. Zasada działania HT jest analogiczna do rentgenowskiej tomografii komputerowej; przechwytując wiele obrazów pola optycznego 2D w różnych warunkach oświetleniowych, rozkład 3D RI nieznakowanej próbki jest rekonstruowany za pomocą równania fali odwrotnej rozwiązującegorównanie 21,22,23. HT jest szeroko stosowany w różnych dziedzinach biologii, w tym w hematologii24,25, kondensacji fazowej w biologii komórki26, mikrobiologii27 i histopatologii28. Ostatnio jego zdolność do obrazowania 3D w wysokiej rozdzielczości bez znaczników jest coraz częściej wykorzystywana do badań nad organoidami 21,22,23,29, oferując nieinwazyjne podejście do badania ich dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej.

W tym badaniu przedstawiono szczegółowy protokół stosowania HT o niskiej koherencji w długoterminowym, bezznacznikowym monitorowaniu organoidów jelita cienkiego myszy (sIO). Metoda ta umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wzrostu organoidów i reakcji na leki w ciągu 24 godzin, zapewniając jednocześnie ilościowe pomiary objętości organoidów, gęstości i zawartości białka, ułatwiając rygorystyczną, opartą na danych analizę zachowania organoidów. Aby zbadać zmiany morfologiczne w organoidach, potraktowaliśmy próbki cisplatyną, chemioterapeutykiem na bazie platyny, o którym wiadomo, że indukuje apoptozę poprzez tworzenie wiązań krzyżowych DNA i hamowanie replikacji komórkowej30. Podczas gdy obrazowanie 3D RI rejestruje szczegóły strukturalne, systematyczna analiza jest niezbędna do ilościowego określenia dynamiki organoidów. Aby to osiągnąć, integrujemy ilastik, zestaw narzędzi do segmentacji oparty na uczeniu maszynowym31 w celu odróżnienia regionów organoidów od tła. Protokół ten przedstawia pełny przepływ pracy, w tym przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję HT 3D, segmentację opartą na uczeniu maszynowym i analizę ilościową na podstawie tomogramów RI. Oferując skalowalne, powtarzalne i nieinwazyjne ramy obrazowania, podejście to ustanawia nowy standard badań organoidowych o szerokim zastosowaniu w modelowaniu chorób, medycynie regeneracyjnej i badaniach przesiewowych leków.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, przyrządów i oprogramowania użytego w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Jako alternatywę można stosować równoważne produkty różnych producentów. Schematyczny proces całego protokołu przedstawiono na rysunku 1.

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie pożywki hodowlanej sIO
    1. Przygotuj dostępną w handlu pożywkę hodowlaną zgodnie z instrukcjami producenta. Wysterylizuj pożywkę hodowlaną, filtrując ją przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.
      UWAGA: Jeśli pożywka jest przygotowywana całkowicie w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli komórkowych, a wszystkie składniki są wstępnie sterylizowane (np. dostarczane w sterylnych butelkach i fiolkach), wówczas filtracja przez filtr 0,22 μm może nie być absolutnie konieczna.
    2. Podaniec 15 ml przygotowanej pożywki do sterylnych probówek do przechowywania. Podgrzej podaną pożywkę do temperatury pokojowej (15 - 25 °C) przed użyciem w hodowli organoidów.
  2. Rozmrażanie zapasów sIO
    1. Zamrożony materiał organoidowy należy szybko rozmrozić w ciągu 2 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść rozmrożoną zawiesinę organoidów do probówki do mikrowirówki i wirować przy 150 x g przez 3 minuty w celu osadzenia organoidów.
    2. Ostrożnie usunąć supernatant, aby wypłukać DMSO, minimalizując potencjalne efekty cytotoksyczne.
    3. Dodać pożywkę i świeżą macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w stosunku 1:4 i delikatnie odpipetować, aby zapewnić równomierne ponowne zawieszenie osadu. Dozować 15 μl na kopułę do każdego dołka 48-dołkowej płytki. Utrzymuj ECM na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
    4. Umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację ECM. Po polimeryzacji ostrożnie dodaj 200 μl świeżej pożywki do każdej studzienki.
      UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z różnymi komercyjnymi naczyniami do obrazowania i płytkami studzienkowymi. Dostosuj głośność nośnika w zależności od typu studzienki, aby upewnić się, że kopuła ECM jest całkowicie zanurzona.
  3. Przekazywanie sIO
    UWAGA: Organoidy mają tendencję do przylegania do końcówek pipet. Aby zminimalizować przywieranie, należy wstępnie zwilżyć końcówki pipet pożywką.
    1. Odessać zużyte podłoże. Dodać 200 μl roztworu do odzyskiwania komórek do każdego dołka i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby ułatwić degradację ECM i pobieranie organoidów.
    2. Zebrać zawiesinę organoidu przez delikatne pipetowanie i przenieść ją do probówki do mikrowirówki. Wirować przy 150 x g przez 3 minuty, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.
    3. (Opcjonalnie) Aby przejść jako pojedyncze komórki, wykonaj jedną z następujących metod dysocjacji:
      1. Metoda enzymatyczna: Dodać 100 μl roztworu do dysocjacji pojedynczych komórek do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% inkubatorze CO2 przez 1-2 min. Dodaj 150 μl pożywki do zneutralizowania. Wykonaj pipetowanie lub delikatne stukanie. Wirować przy 150 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant, pozostawiając tylko osad.
        UWAGA: Unikaj nadmiernej inkubacji, ponieważ długotrwała ekspozycja może być bardzo szkodliwa dla komórek.
      2. Dysocjacja mechaniczna: Zawiesić osad w 200 μl pożywki hodowlanej. Używając pipety P200, pipetuj w górę i w dół 20x-30x, aby mechanicznie zdysocjować organoidy na mniejsze fragmenty lub pojedyncze komórki. Wirować przy 150 x g przez 3 minuty, następnie odessać supernatant i zachować osad.
    4. Dodaj pożywkę i świeży ECM w stosunku 1:4 i delikatnie odpipetować, aby zapewnić równomierne ponowne zawieszenie osadu. Dozować 15 μl na kopułę do każdego dołka 48-dołkowej płytki.
    5. Umieścić płytkę do góry dnem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację ECM.
    6. Po polimeryzacji dodaj 200 μl świeżej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i wypełnij puste studzienki zewnętrzne PBS, aby zapobiec parowaniu. Pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 2-3 dni i co tydzień przepuszczać organoidy. Dostosuj interwał pasażu zgodnie z żądanym rozmiarem organoidu.
  4. Leczenie farmakologiczne
    1. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy cisplatyny, rozpuszczając 3,00 mg cisplatyny w proszku (MW ≈ 300,05 g/mol) w 1 ml DMSO. Krótko odwiruj i chroń roztwór przed światłem za pomocą bursztynowych probówek lub owijając je folią aluminiową.
    2. Aby przygotować pożywkę zabiegową, należy rozcieńczyć 10 mM cisplatyny w stosunku 1:1 000 w kompletnej pożywce hodowlanej sIO, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM cisplatyny i 0,1% DMSO.
    3. Do kontroli nośnika należy przygotować 0,1% DMSO w pożywce hodowlanej, aby dopasować końcowe stężenie DMSO bez cisplatyny.
    4. Usunąć zużytą pożywkę z kultur sIO i delikatnie zastąpić ją pożywką zawierającą 10 μM cisplatynę lub pożywką kontrolną tylko DMSO.
    5. Po poddaniu działaniu substancji należy przenieść próbki do inkubatora systemu obrazowania.

2. Obrazowanie holotomograficzne o niskiej koherentności za pomocą oprogramowania operacyjnego

  1. Przygotowanie próbki do obrazowania
    1. Dozować 15 μl kopuły organoid-ECM na naczynie obrazowania #1.5 z dnem szkiełka nakrywkowego, postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach 1.3.1-1.3.4. Umieść każdą kopułę w naczyniu jak najbliżej środka, aby uzyskać optymalne obrazowanie.
    2. Przed polimeryzacją inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby organoidy mogły osiąść na dnie.
    3. Umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę w celu polimeryzacji ECM. Następnie delikatnie dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby całkowicie zanurzyć organoidy.
      UWAGA: Dostosuj objętość podłoża, aby upewnić się, że organoidy są całkowicie zanurzone zgodnie z rozmiarem naczynia do obrazowania z dnem nakrywkowym.
    4. Po 5 dniach od przejścia należy przemyć próbkę 2x-3x PBS bezpośrednio przed obrazowaniem, aby usunąć zanieczyszczenia i zredukować artefakty optyczne.
  2. Konfiguracja obrazowania
    1. Włącz kontroler środowiskowy, aby utrzymać żywotność próbki. Sterownik komory automatycznie dostosowuje temperaturę do 37 °C, a stężenie CO2 do 5%.
    2. Naciśnij przycisk drzwi z przodu instrumentu, aby otworzyć drzwi. Dodaj wodę, aby dobrze utworzyć cienką warstwę wewnątrz komory, aby zapobiec wysychaniu pożywki hodowlanej.
    3. Umieść naczynie obrazowania w odpowiednim uchwycie naczynia, włóż je do komory obrazowania i zabezpiecz za pomocą kołka, aby zapobiec przemieszczaniu się. Upewnij się, że naczynie jest mocno przymocowane do uchwytu naczynia bez przechylania.
    4. Zamknij drzwiczki instrumentu za pomocą przycisku drzwi , aby zablokować zakłócenia światła zewnętrznego.
    5. Uruchom oprogramowanie TomoStudio X i zaloguj się. Kliknij przycisk Start , aby otworzyć okno główne.
    6. Kliknij Dodaj projekt w lewym górnym rogu i przypisz parametry eksperymentalne (np. nazwę projektu, typ medium, typ próbki itp.). Panel próbki zostanie utworzony automatycznie. Upewnij się, że przypisano odpowiedni typ podłoża do użycia odpowiedniego RI w eksperymencie.
    7. Kliknij na Żądane studzienki w panelu i kliknij Utwórz u góry, aby zarejestrować studzienki jako próbki.
    8. Kliknij Ustawienia ROI w prawym górnym rogu, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI) w daniu. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk Uruchom eksperyment w prawym dolnym rogu, aby otworzyć okno pobierania obrazu.
    9. Kliknij przycisk Załaduj statek w prawym górnym rogu. Pojawi się obraz w jasnym polu. Dostosuj pozycję Z za pomocą przycisków +Z i -Z , aby ustawić ostrość.
    10. Na karcie Single imaging (Pojedyncze obrazowanie) dostosuj rozmiar ROI. Uchwyć organoidy w polu widzenia 160 μm x 160 μm i uzyskaj osiowe stosy o głębokości do 140 μm. W przypadku większych organoidów uzyskaj wiele tomogramów RI i zszyj obrazy, zaznaczając pole wyboru Obrazowanie kafelkowe na dole.
    11. Przejdź do zakładki Obrazowanie poklatkowe, aby skonfigurować obrazowanie długoterminowe. Ustaw czas trwania i czas interwału zgodnie z potrzebami. W tym eksperymencie obrazowanie poklatkowe wykonywano w odstępach 10-minutowych przez okres 24 godzin, a analizę prowadzono w odstępach 2-godzinnych przez ten sam czas.
    12. Kliknij ikonę Skanuj , aby przechwycić bieżącą lokalizację zwrotu z inwestycji. Ręcznie wyśrodkuj kopułkę ECM za pomocą obrazowania w jasnym polu. Kliknij przycisk BF , aby dostosować intensywność i wartości ekspozycji dla obrazowania w jasnym polu.
    13. Wybierz ROI , przesuwając pole ROI, które pojawi się w panelu Podgląd. Po znalezieniu żądanego zwrotu z inwestycji kliknij przycisk Dodaj punkt na dole. Pojawi się lista punktów obrazowania.
    14. Kliknij przycisk Pobierz , aby rozpocząć obrazowanie. Zostaną pozyskane surowe dane obrazu.
  3. Akwizycja obrazu
    UWAGA: Ten proces generuje wspólny plik Tomocube (TCF) z surowych danych obrazu. Surowe dane obrazu muszą zostać przetworzone na plik TCF, który zawiera wiele typów obrazów, takich jak tomogram RI i projekcja maksymalnej intensywności. Tomogram RI reprezentuje rozkład RI 3D próbki, a projekcja maksymalnej intensywności pokazuje najwyższą wartość RI dla każdej pozycji bocznej w płaszczyźnie XY.
    1. Przeciągnij i upuść surowe pliki obrazów na serwer przetwarzania HTX. Kliknij przycisk Przetwarzaj , aby wygenerować plik TCF z pliku obrazu RAW.
    2. Aby wyświetlić tomogramy RI wygenerowane w pliku TCF, użyj programu TomoAnalysis Viewer, MATLAB lub Python. Aby wyświetlić plik TCF w programie MATLAB, użyj funkcji takich jak h5info i h5read. Podobnie w języku Python użyj pakietu h5py do odczytywania plików H5.

3. Analiza obrazu

  1. Segmentacja obrazów oparta na uczeniu maszynowym
    1. Eksportuj plik obrazu TCF do formatu HDF5 (Supplementary Coding File 1), aby upewnić się, że dane są w formacie wielowymiarowym zgodnym z ilastik.
    2. Otwórz ilastik i przejdź do Plik > Nowy projekt. Wybierz opcję Klasyfikacja pikseli w sekcji Przepływy pracy segmentacji. Zapisz plik projektu w wyznaczonym katalogu.
    3. Załaduj plik HDF5, przechodząc do 1. Zakładka Dane wejściowe. Kliknij przycisk Add New File (Dodaj nowy plik), wybierz odpowiedni zestaw danych H5 i upewnij się, że zostały przypisane właściwe kanały obrazów.
    4. Przejdź do punktu 2. Zakładka Wybór funkcji, aby wybrać odpowiednie cechy (Kolor/Intensywność, Krawędź, Tekstura) w celu optymalizacji segmentacji.
      UWAGA: Wybór funkcji może się różnić w zależności od zestawu danych i charakterystyki obrazu. Na potrzeby bieżącej analizy wybrane cechy obejmowały: Kolor/Intensywność (σ = 1,60), Krawędź (σ = 3,50) i Tekstura (σ = 1,60). W zależności od złożoności obrazu może być wymagana optymalizacja oparta na podejściu heurystycznym. Alternatywnie, funkcja Zasugeruj funkcje > Uruchom wybór funkcji w ilastik może być użyta do zidentyfikowania optymalnego zestawu parametrów.
    5. W 3. Zakładka Trening, oznacz regiony organoidowe i nieorganoidalne, stosując pociągnięcia pędzlem o różnych kolorach. Aby zwiększyć wierność segmentacji, ostrożnie opisz regiony wokół granic.
    6. Kliknij opcję Aktualizacja na żywo , aby wyświetlić podgląd wyników segmentacji i w razie potrzeby wprowadzić poprawki.
    7. Przejdź do 4. Eksport prognoz. W polu Wybór źródła wybierz opcję Prosta segmentacja , aby wyeksportować przewidywania oznaczone etykietami. Kliknij przycisk Eksportuj wszystko, upewniając się, że format wyjściowy jest ustawiony na .h5 lub .tiff, w zależności od wymagań dalszej analizy.
  2. Ilościowa analiza cech
    UWAGA: Ten krok protokołu jest wykonywany w programie MATLAB, a każda procedura jest szczegółowo opisana w Dodatkowym pliku kodowania 2.
    1. Łącząc tomogram RI z obrazem maski, utwórz zamaskowany obraz RI, który zawiera tylko region organoidu.
    2. Korzystając z zamaskowanego obrazu RI, oblicz parametry ilościowe, takie jak objętość organoidów, gęstość białka i zawartość białka.
      1. Objętość: Oblicz całkowitą objętość organoidu, mnożąc liczbę pikseli w masce podzielonej na segmenty przez rozdzielczość pikseli dla X, Y i Z. Oblicz liczbę pikseli, zliczając wszystkie wartości wokseli w tablicy masek oznaczonych organoidami, używając wbudowanej funkcji MATLAB Suma.
        UWAGA: Rozdzielczość pikseli jest określana przez system obrazowania i można ją znaleźć w grupie Atrybuty danych > 3D w strukturze HDF5.
      2. Gęstość białka: Oblicz gęstość białka, odejmując wartość średniego RI od średniej organoidu RI i dzieląc ją przez przyrost współczynnika załamania białka.
        1. Średni RI: Przed analizą zmierz RI otaczającego podłoża za pomocą refraktometru.
        2. Średnia wartość RI organoidu: Określ średnią wartość RI organoidu, uśredniając wartości RI wokseli znajdujących się w masce organoidu.
        3. Przyrost indeksu załamania światła białka (α): Użyj wcześniej zgłoszonej stałej empirycznej uzyskanej z badań przyrostu indeksu załamania światła.
      3. Zawartość białka: Obliczyć całkowitą zawartość białka, mnożąc objętość oznaczoną w kroku 3.2.2.1 przez gęstość białka otrzymaną w kroku 3.2.2.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje schematyczny przebieg pracy dla obrazowania 4D i analizy ilościowej sIO. Protokół ten umożliwia ciągłe obrazowanie na żywo i kompleksową ocenę sIO w czteroetapowym procesie: hodowla, obrazowanie 4D, przetwarzanie obrazu i analiza ilościowa (ryc. 1D).

Po 5-dniowym okresie inkubacji dojrzałe sIO przeniesiono do nakrywkowych naczyń obrazowych w celu wizualizacji za pomocą holotomografii o niskiej koherentności (HT) (<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Holotomografia stanowi potężne podejście do bezznacznikowego obrazowania żywych organoidów w wysokiej rozdzielczości, pokonując wiele wyzwań związanych z konwencjonalnymi technikami obrazowania. W tym protokole opisujemy kompleksową metodologię stosowania niskokoherentnego HT do badań sIO, umożliwiając ilościową wizualizację w czasie rzeczywistym morfologii organoidów, dynamiki wzrostu i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne. Integracja segmentacji opartej na uczeniu maszynowym i analizy ilościowej jeszcze bardziej zwię...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L., J.H.L., S.M.L. i Y.K.P. mają udziały finansowe w Tomocube Inc., firmie zajmującej się komercjalizacją holotomografii i ilościowego obrazowania fazowego.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei finansowany przez rząd koreański (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), Koreański Instytut Postępu Technologii (KIAT) w ramach programu International Cooperative R&D (P0028463) oraz grant Koreańskiego Funduszu Medycyny Regeneracyjnej (KFRM) finansowany przez rząd Korei (Ministerstwo Nauki i ICT oraz Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej) (21A0101L1-12). Akwizycja danych została przeprowadzona przez M.J.L. i J.H.L., przy czym J.H.L. był odpowiedzialny za przetwarzanie danych, a J.M.C. za analizę danych. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania manuskryptu. Serdecznie dziękujemy ChulMin Oh i Chungha Lee za cenne rozmowy techniczne i pomoc w przygotowaniu figury.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytka 48-dołkowa Corning3548Danie hodowlane
Rozwiązanie do odzyskiwania komórek Corning354253Degradacja Matrigelu 
Cisplatynasupelco powiedział:PHR1624N/A
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichZobacz materiał D2650Pojazd
Rurka EppendorfaCorningMCT-175-C-SN/A
Serwer przetwarzania HTXTomocube Inc., KoreaN/ASerwer przetwarzania danych
HT-X1 (odbiornik HT-X1)Tomocube Inc., KoreaN/AOprogramowanie operacyjne
IlastikN/AN/AZestaw narzędzi do segmentacji oparty na uczeniu maszynowym
Uchwyt naczynia do obrazowania Tomocube Inc., KoreaN/AUchwyt na czaszę obrazowania
IntestiCult Organoid Growth Medium (mysz)Technologie STEMCELL#06005Dostępna na rynku gotowa pożywka hodowlana 
Matlab (Matlab)MathWorks (Prace matematyczne)Matlab 2024a (wersja matowa)Oprogramowanie do przetwarzania obrazu
MatrigelCorning356231ECM dla organoidów 3D
Milipore  Steritop  Filtr górny do butelki próżniowejMerckS2GPT05RE0,22 &m; M Jednostka filtrująca do sterylizacji pożywki
Organoidy jelitowe myszyTechnologie STEMCELL#70931N/A
RefraktometrATAGO (Agencja ATAGO)Czynnik chłodniczy R-5000Kalkulator indeksu refrakcji
TomoDish powiedział:Tomocube Inc., Korea901002-02#1.5 Naczynie obrazowe z dnem nakrywkowym
TomoStudio XTomocube Inc., KoreaN/AOprogramowanie do obrazowania
TrypLE powiedział:Gibco (firma Gibco)12604Dysocjacja pojedynczych komórek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  3. Arjmand, B., et al. Advancement of organoid technology in regenerative medicine. Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).
  4. Zhang, W., et al. Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states. Biomaterials. 288, 121647(2022).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Park, J., et al. Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences. Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).
  7. Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. Present application and perspectives of organoid imaging technology. Bioengineering. 9 (3), 121(2022).
  8. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).
  9. Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids. Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).
  10. Badder, L. M., et al. 3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors. PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).
  11. Lacin, M. E., Yildirim, M. Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids. Front Neurosci. 18, 1360482(2024).
  12. Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis. Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).
  13. Smits, L. M., Schwamborn, J. C. Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).
  14. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  15. Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).
  16. Masson, A., et al. High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM. Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).
  17. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  18. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. elife. 9, e52904(2020).
  19. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).
  20. Susaki, E., Takasato, M. Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies. Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).
  21. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).
  22. Kim, G., et al. Holotomography. Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).
  23. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).
  24. Kim, H., et al. Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML. Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).
  25. Kim, S. Y., et al. Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography. Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).
  26. Kim, T., et al. RNA-mediated demixing transition of low-density condensates. Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).
  27. Kim, G., et al. Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network. Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).
  28. Hugonnet, H., et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).
  29. Lee, M. J., et al. Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography. Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).
  30. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).
  31. Berg, S., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  32. Sbrana, F., et al. Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy. Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).
  33. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).
  34. Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer. EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).
  35. Hooper, L. V. Epithelial cell contributions to intestinal immunity. Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).
  36. Atanga, R., Singh, V., In, J. G. Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets. Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).
  37. Dicarlo, M., et al. Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice. Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).
  38. Miura, S., Suzuki, A. Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).
  39. Barer, R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells. Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).
  40. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  41. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).
  42. Kim, Y. S., et al. Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology. Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).
  43. Liu, C., et al. Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence. Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).
  44. Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. bioRvix. , (2020).
  45. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).
  46. Jo, Y., et al. Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning. Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).
  47. Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect. Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).
  48. Yasuhiko, O., Takeuchi, K. In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation. Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Holotomography ImagingIntestinal OrganoidsLabel Free Imaging3D Organoid ImagingMachine Learning SegmentationRefractive Index MappingOrganoid MorphologyProtein Density QuantificationDrug Response AnalysisTime Lapse Imaging

Related Articles