Artykuł metodologiczny

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

DOI:

10.3791/68568

⸱

6 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia elektronowa (EM), a zwłaszcza techniki trójwymiarowe (3D) EM, stały się uznanymi metodami w wirusologii strukturalnej. Badania zmian ultrastruktury komórkowej wywołanych przez wirusa, takich jak fabryki replikacji indukowane wirusem Zika (ZIKV) czy organelle replikacyjne koronawirusa, wymagają obrazowania 3D. Tomografia transmisyjna mikroskopii elektronowej (TEM) jest szeroko stosowaną metodą, mimo ograniczenia do próbek o grubości do 200 nm. Skupiona mikroskopia elektronowa (SEM) z wiązką jonów (SEM) może uzyskać dane 3D o większych objętościach z izotropową, choć zazwyczaj o niższej rozdzielczości. Do obrazowania większych objętości stosuje się alternatywne techniki, takie jak blokowa mikroskopia elektronowa skanująca twarz (BF-SEM), tomografia matrycowa SEM czy obrazowanie TEM przekrojów szeregowych. Jednak w porównaniu z wcześniej wymienionymi technikami, te techniki odbywają się znacznie niższą rozdzielczością wzdłuż osi Z próbki. Techniką dostarczającą informacje 3D o próbkach o grubości do 1 μm z izotropową rozdzielczością kilku nanometrów jest tomografia skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (STEM).

Przedstawiamy tutaj protokół przygotowania próbek wirusologicznych mrożonych pod wysokim ciśnieniem, zamienionych przez zamrożenie i żywicę oraz ich analizę za pomocą tomografii STEM. Protokół ten korzysta z zalet obrazowania w temperaturze pokojowej, jednocześnie zachowując ultrastrukturę biologiczną w stanie bliskim naturalnym. Przedstawiamy dwa reprezentatywne przykłady pytań, na które można odpowiedzieć za pomocą tomografii STEM. Najpierw stosujemy protokół do badania morfogenezy wirionów wirusa wirusa szparkowego (VSV). Tomogramy STEM dostarczają informacji o rekombinowanym pączkowaniu VSV, które w innym przypadku nie byłyby dostępne za pomocą obrazowania 2D. Po drugie, pokazujemy korelacyjne mikroskopię światła i elektronów (CLEM) za pomocą obrazowania rezonansowego transferu energii Foerster (FRET) oraz tomografii STEM (FRET-3D-CLEM) nanofibril peptydowych EF-C. Ta niedawno opublikowana kombinacja dostarcza nowych informacji na temat przyjmowania i demontażu nanofibryli peptydowych wzmacniających infekcje, szczególnie korzystając z dużej objętości dostępnej dzięki tomografii STEM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-introduction-1
Rysunek 1: Porównanie różnych technik mikroskopii 3D, biorąc pod uwagę rozdzielczość, instrumentację, czas akwizycji i wysiłek. Maksymalna dopuszczalna objętość techniki mieści się między technicznie wymagającą tomografią krio-TEM oferującą rozdzielczość molekularną, a mikroskopią świetlną, gdzie rozdzielczość jest ograniczona przez granicę dyfrakcyjną światła. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; STEM = skanujący TEM; SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa; FIB = skupiona wiązka jonów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Struktury i systemy związane z wirusami obejmują skalę od reżimu subangstromowego (np. małe cząsteczki do wirusoterapii, izolowane białka wirusowe) do kilku metrów (np. całe zainfekowane organizmy). Cząstki wirusa mają zakres od 20 do 1000 nm i są badane głównie w kontekście biologicznym, takim jak komórki gospodarza i linie komórkowe producentów wirusów, które mieszczą się w zakresie μm. Wizualizacja konkretnych struktur związanych z wirusami zależy więc od wyboru techniki, która zapewnia wystarczające pole widzenia i odpowiednią rozdzielczość. Badanie komórek i fragmentów tkanek zakażonych wirusem opiera się na technikach mikroskopii (Rysunek 1). Podczas gdy obrazy przeglądowe komórek i tkanek można uzyskać za pomocą klasycznej mikroskopii świetlnej, struktury wewnątrzkomórkowe zaangażowane w replikację wirusów są często badane za pomocą mikroskopii elektronowej (EM). Chociaż obecnie EM jest głównie wykorzystywany w podstawowych badaniach wirusologicznych, jest również wykorzystywany w diagnostyce 1,2 i znalazł swoje miejsce w zastosowaniach biofarmaceutycznych3.

Często podejścia 2D EM, takie jak klasyczna transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), nie są w stanie wystarczająco odpowiedzieć na dane pytanie biologiczne. W wirusologii jest to szczególnie widoczne przy badaniu interakcji wirus-gospodarz-komórka, takich jak przyczepianie i wejście wirionu, tworzenie fabryk wirusów czy morfogeneza wirionów 4,5,6,7,8,9. Dlatego tomografia elektromagnetyczna jest wykorzystywana do analizy ultrastruktury 3D próbek biologicznych. W zasadzie istnieją dwa sposoby pozyskania tomogramu określonej próbki: 1) stopniowe obrazowanie wycinków szeregowych, które później są łączone w stos obrazów 3D, lub 2) pozyskiwanie projekcji z różnych kątów widzenia próbki, a następnie obliczeniowa rekonstrukcja informacji do wirtualnego stosu obrazów.

Techniki pierwszego typu obejmują obrazowanie przekrojów szeregowych za pomocą TEM lub SEM (tomografia matrycowa SEM), SEM z blokami szeregowymi oraz tomografię wiązki jonów skupionych (FIB)-SEM. Obrazowanie SEM i TEM przekrojów szeregowych nie ma rozdzielczości w z, która jest ograniczona grubością przekroju, ale zapewnia szerokie pole widzenia i opiera się na sprzęcie dostępnym w większości laboratoriów EM4. Tomografia FIB-SEM może zapewnić rozdzielczość izotropową, ale koszty urządzeń i utrzymania mogą być wyzwaniem, a obrazowanie całych komórek w rozdzielczości izotropowej jest czasochłonne 9,10.

Drugi typ tomografii opiera się wyłącznie na przepuszczaniu wiązki elektronów przez próbkę. Można to zrobić za pomocą dwóch różnych metod obrazowania: TEM lub skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). Chociaż tomografia TEM jest bardziej powszechna i łatwiejsza do wdrożenia, grubość przekroju jest ograniczona do ~200 nm. Dlatego struktury większe niż grubość przekroju, takie jak mitochondria, pęcherzyki czy wiriony, nie mogą być obrazowane w jednym tomogramie. Tomografia STEM umożliwia obrazowanie próbek o grubości do 1 μm 11,12. Jednak wymaga to STEM o wysokim napięciu przyspieszającym (≥200 kV) oraz konfiguracji obsługującej wysokie kąty nachylenia oraz niewielki półzbieżny kąt13. Chociaż obrazowanie STEM jest powszechną techniką w nauce o materiałach, pozostaje rzadką techniką w laboratoriach biologii EM.

Przedstawiamy tutaj podejście oparte na zastosowaniu, polegające na wykorzystaniu tomografii STEM dla okazów wirusologicznych. Ze względu na wysoką złożoność i pracochłonność tomografii EM, wysokiej jakości przygotowanie próbki jest kluczowe. Chociaż kriogeniczna TEM (tomografia) jest bez wątpienia złotym standardem badań na poziomie molekularnym, obrazowanie w temperaturze pokojowej komórek zamrożonych i zamrożeniowych zapewnia solidne zachowanie i przejrzystość ultrastruktury komórkowej 7,14. Krótko mówiąc, komórki przyczepne hodowane są na dysku szafirowym i infekowane lub leczone według uznania. Ogniwa są następnie unieruchamiane przez zamrożenie pod wysokim ciśnieniem przy bardzo wysokim tempie chłodzenia, co skutkuje zwitrzaniem wody wewnątrz. Następnie woda jest zastępowana rozpuszczalnikiem, podczas gdy próbki są kontrastowane i stopniowo przywracane do temperatury pokojowej. Próbki są następnie stopniowo osadzane w żywicy.

Istnieje wiele protokołów dotyczących zamrożenia pod wysokim ciśnieniem i podstawienia metodą zamrożenia, które różnią się maszynerią, systemem nośnikowym i składem próbki. Opublikowano szczegółowe protokoły zamrażania pod wysokim ciśnieniem, w tym jeden autorstwa Walthera i in.15 oraz protokół wideo Steyera i in.16, który koncentruje się na przygotowaniu tkanek do FIB-SEM z wykorzystaniem mikrofalowego wzmacniania kontrastu. Dla badań wirusologicznych Read i in.17 oraz Romero-Brey18 opublikowali szczegółowe protokoły przygotowania komórek zakażonych wirusem poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem za pomocą dysków szafirowych oraz późniejszą analizę za pomocą tomografii elektronowej. Ultracienkie przekrojowanie było również wcześniej opisane15,17. Więcej szczegółów na temat tych podejść można znaleźć w cytowanej literaturze.

Tutaj przedstawiamy workflow, który jest dostosowaną i zaktualizowaną wersją wcześniej opublikowanych protokołów15,17, po raz pierwszy połączoną z szczegółowym przewodnikiem wideo. Protokół zapewnia sposób przygotowania próbek z wykorzystaniem zamrożenia pod wysokim ciśnieniem, podstawienia zamrożenia oraz osadzania w żywicy epoksydowej. Przekroje o grubości 800 nm do 1000 nm są cięte ultramikrotomem. Seria tilt jest pozyskiwana za pomocą 200 kV STEM, korzystając z narzędzi programowych EM. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem komórek przylegających i zapewnia kompleksowy przepływ pracy, jednocześnie umożliwiając modyfikacje dla innych typów próbek, takich jak komórki tkankowe lub zawiesiny. W przypadku tomografii STEM w warunkach kriogenicznych odwołuj się do pracy grupy19,20 Michaela Elbauma.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Przygotowanie dysków szafirowych
    1. Czyść dyski szafirowe, myjąc 3 razy w 100% etanolu przez 20 minut. Usuń pozostałe etanol, przeciągając tarcze na suchy papier filtracyjny. Zostaw dyski w komorze suszącej o temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut lub aż całkowicie wyschną.
      UWAGA: W tym protokole stosuje się dyski szafirowe o średnicy 3 mm i grubości 0,16 mm. W przypadku innych systemów, workflow zoptymalizowany pod kątem komórek tkankowych lub zawiesin, odwołuj się do Walthera i in.15. Kilka "wskazówek i trików" dotyczących hodowanych komórek i innych systemów podano przez McDonalda i in.21.
    2. Pokryj szafirowe dyski warstwą węglową, umieszczając około 50 szafirowych dysków płasko na czystym szkle zegarka i pokrywając je warstwą węgla o grubości 10-15 nm za pomocą urządzenia do powłoki węglowej. Piecz dyski przez noc w temperaturze 120 °C, aby ustabilizować warstwę węgla.
      UWAGA: Dla podejść EM korelacyjnych wprowadź układ współrzędnych: umieść siatkę poszukiwawczą na wierzchu szafirowych dysków przed powlekaniem węglowym, tak aby siatka była widoczna jako ujemna na dysku21.
    3. Aby później zidentyfikować stronę szafirowego dysku pokrytą węglem, użyj ostrego narzędzia (np. końcówki pęsety), aby zadrapać ślad na węglu, który można poprawnie odczytać tylko z jednej strony.
      UWAGA: Zalecamy liczbę "2" lub podobną (rysunek 2A,B). Pomiń ten krok dla dysków szafirowych z powłokowym układem współrzędnych.
    4. Przechowuj szafirowe dyski w komorze suszącej o temperaturze 37 °C do dalszego użycia.
      UWAGA: Nie zaleca się ponownego używania dysków szafirowych, ponieważ zwiększa to prawdopodobieństwo ich uszkodzenia podczas zamarzania pod wysokim ciśnieniem.
  2. Hodowla komórkowa
    1. Krótko przed umieszczeniem w hodowli komórek, rozładowuj rozładowanie powłoknięte węglem po stronie dysków za pomocą urządzenia wyładowującego żar, aby uczynić je hydrofilowymi (np. 0,26 mbar przy prądzie 20 mA przez 40 s). Następnie sterylizuj dyski, wystawiając je na światło UV przez 15 minut.
      UWAGA: Ekspozycja na światło UV dłużej niż 30 minut może uszkodzić powłokę węglową.
    2. Użyj sterylnej pęsety, aby umieścić dyski na dnie naczynia z podłożem kulturowym, aby upewnić się, że dyski nie unoszą się na powierzchni. Ostrożnie zasiewaj komórki na wierzchu. Jeśli dyski szafirowe unoszą się w podłożu hodowlanym komórki, podczas powtarzania eksperymentu wyładowania świecącego i świecącego przez dłuższy czas.
      UWAGA: Kluczowe jest, aby "2" była prawidłowo ustawiona, co oznacza, że bok pokryty węglem skierowany jest do góry. Pożądana jest monowarstwa komórkowa na dyskach o końcowej konfluencji ~80%. Wzrost komórek na dyskach szafirowych może różnić się od wzrostu w otaczającej powicie hodowlanym. Sprawdź rozmieszczenie i jakość komórek na dyskach mikroskopem odwróconym przed kontynuacją protokołu. Rozmieszczenie komórek można poprawić, delikatnie kołysząc płytę podczas zasiewania komórek.
      W przypadku komórek zawiesinowych pokryj dyski szafirowe pokryte węglem poli-L-lizyną lub użyj kapilar, jak opisano w15. Nie narażaj dysków pokrytych poli-L-lizyną na światło UV, ponieważ może to uszkodzić powłokę poli-L-lizyny.
    3. Wykonaj dowolne zabiegi dotyczące komórek (np. infekcję, leczenie farmakologicznym), zachowując dyski szafirowe na miejscu. Obchodź się z dyskami ostrożnie, aby uniknąć odłączania się komórek lub porysowania warstwy węglowej. Inkubuj komórki odpowiednio. Przeprowadz chemiczną prefiksację z użyciem np. 2,5% glutaraldehydu, 1% sacharozy w buforze fosforanowej 0,1 M (pH 7,3) lub 4% paraformaldehydu, zgodnie z lokalnymi przepisami, przed transportem próbek do zamrażarki wysokociśnieniowej 1,7,22.
      UWAGA: Zanim zainfekowane próbki opuszczą laboratoria na poziomie bezpieczeństwa biologicznego, należy przestrzegać wszystkich lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w systemie modelowym.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Zamrożenie pod wysokim ciśnieniem. (A) Dyski szafirowe pokazujące powłokę węglową z "2" (po lewej) lub układ współrzędnych do mikroskopii świetlnej i elektronowej (po prawej). (B) Schematyczny opis kanapki SD-gold spacer-SD przygotowanej do zamarzania pod wysokim ciśnieniem. Komórki wyhodowane na dyskach są naprzeciwko siebie i są chronione w ciasnej jamie. (C) Uchwyt do zamrożenia pod wysokim ciśnieniem, zawierający kanapkę SD. (D) Materiały i urządzenia do ładowania uchwytu HPF: (1) Płyta grzewcza, (2) Mikroskop stereo, (3) Papier filtracyjny, (4) Rurka reakcyjna zawierająca 1-heksadeken, (5) Pęseta, (6) Niepowlekane SD, (7) Szalka Petriego ze złotymi odstępkami, (8) Uchwyt HPF. (E) Konfiguracja systemu HPF: (1) LN-box do przenoszenia mrożonych próbek (patrz także F), (2) suszarka do włosów przyspieszająca nagrzewanie uchwytu HPF po zamrożeniu, (3) Azot dewar do uzupełnienia pojemnika LN. (F) Pudełko LN do przechowywania zamrożonych próbek po zamarzaniu pod wysokim ciśnieniem z centralnym korytem (przerywanym obrysem), w którym można otworzyć uchwyt HPF i bezpiecznie obsługiwać SD. Materiały potrzebne bezpośrednio po zamrożeniu pod wysokim ciśnieniem: (1) Uchwyt na maksymalnie sześć pojemników na próbki, (2) Izolowane pęsety, (3) Pojemniki na próbki z pokrywką. Pojemniki zawierają małe otwory i małe ciężarki (np. śrubę), dzięki czemu zanurzają się w ciekłym azocie. Skróty: SD = szafirowa płyta; HPF = zamrażarka wysokociśnieniowa; LN = ciekły azot. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

2. Przygotowanie próbki do mikroskopii elektronowej

  1. Zamarzanie pod wysokim ciśnieniem
    UWAGA: Protokół ten opisuje zamrożenie pod wysokim ciśnieniem przy użyciu wspomnianej zamrażarki wysokociśnieniowej (HPF, Tabela Materiałów). Opisane kroki nie powinny się zbytnio różnić w przypadku innych maszyn, ponieważ pełnią tę samą funkcję.
    1. Stosuj się do instrukcji producenta, aby ustawić zamrażarkę wysokociśnieniową. Upewnij się, że jest odpowiednie dopływ ciekłego azotu (rysunek 2E), włącz maszynę i wykonaj test testowy.
    2. Ustaw przestrzeń roboczą do ładowania dysków do uchwytu HPF (Rysunek 2D). Przygotuj następujące elementy: płytę grzewczą (1), stereomikroskop (2), kawałki papieru filtracyjnego (3), rurkę reakcyjną z heksadenem jako wypełniaczem (4), pęsetę (5), puste/niepowlekane dyski szafirowe do zamrażania nieparzystej liczby SDs z ogniwami (6), złote dystansy (7) oraz uchwyt HPF (8, szczegół na rysunku 2C).
    3. Przygotuj przestrzeń roboczą do obsługi zamrożonych próbek (rysunek 2E,F). Przed rozpoczęciem zamarzania pod wysokim ciśnieniem przygotuj następujące wyposażenie:
      1. Przygotuj pudełko LN-box i napełnij go ciekłym azotem (rysunek 2E,F) w celu przygotowania do obsługi i przeniesienia zamrożonych dysków szafirowych z uchwytu HPF do kapsuł magazynowych.
      2. Przygotuj mały dewar (3 na rysunku 2E) i napełnij go ciekłym azotem: przygotuj się na wielokrotne uzupełnianie LN-boxa ciekłym azotem podczas procesu zamrażania.
      3. Miej pod ręką izolowaną pęsetę (2 na rysunku 2F).
      4. Przygotuj pojemniki na próbki, które pomieścią dyski szafirowe po zamrożeniu pod wysokim ciśnieniem (kapsuły magazynowe, 3 na Rysunku 2F). Upewnij się, że mają pokrywę i kilka otworów na wlewanie ciekłego azotu oraz małe obciążniki (np. małe śruby lub podobne), aby nie unosiły się na powierzchni. Oznacz pojemniki przed użyciem i wstępnie schłodzić je w pudełku LN.
        UWAGA: Używamy kapsuł BEEM jako kapsuł magazynowych.
    4. Trzymaj próbki w inkubatorze blisko zamrażarki wysokociśnieniowej, jeśli komórki nie zostały wcześniej zafiksowane lub jeśli to niemożliwe, na podgrzewanej płycie (1 na Rysunku 2D), aby utrzymać warunki fizjologiczne (37°C, 5%CO2) tak długo, jak to możliwe.
    5. Upewnij się, że na dyskach szafirowych jest wystarczająco dużo komórek i ich jakość przed rozpoczęciem zamrażania pod wysokim ciśnieniem. Aby to zrobić, należy obejrzeć dyski za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.
    6. Wykonaj zamrażanie pod wysokim ciśnieniem.
      1. Weź jeden szafirowy dysk z naczynia hodowlanego pęsetą i umieść go w uchwytie HPF (rysunek 2C) z bokiem pokrytym węglem skierowanym do góry ("2" jest czytelne). Przed tym usuń nadmiar medium, szybko zanurzając dysk na papierze filtracyjnym, ale uważaj, by komórki nie wyschły.
      2. Zanurz złotą podkładkę w heksadecenie i ostrożnie połóż ją na szafirowym dysku. Weź drugi dysk szafirowy i umieść go na złotym dystansie z bokiem pokrytym węglem skierowanym w dół, tworząc kanapkę z dysku szafirowego – złoty dystans – szafirowy – z komórkami skierowanymi ku sobie. Upewnij się, że w kanapce nie ma żadnego powietrza.
      3. Zamknij uchwyt HPF. Wykonaj ten krok ostrożnie, ale szybko, aby zminimalizować obciążenie próbki, szczególnie dla żywych komórek bez prefiksacji.
        UWAGA: W przypadku próbek zawierających substancje nowotworowe, mutagenne lub reprotoksyczne (CMR), takie jak chemiczne utrwalacze chemiczne, załaduj uchwyt HPF pod osłoną oparową, aby zminimalizować narażenie.
      4. Rozpocznij proces zamrażania. Szybko włóż uchwyt HPF do zamrażarki wysokociśnieniowej, zablokuj go zgodnie z instrukcjami producenta i rozpocznij proces zamrażania.
    7. Usuń próbki zwinięte z uchwytu HPF. Szybko przenieś końcówkę uchwytu HPF, który przenosi teraz zamarznięte szafirowe dyski, do schłodzonej skrzynki LN. Ostrożnie wyjmij dyski z uchwytu HPF do centralnej rowiny w pudełku LN-box (przerywana linia na Rysunku 2F). Następnie podgrzej uchwyt HPF i usuń resztki etanolu lub heksadecenu, zanim zaczniesz składać kolejną kanapkę.
      UWAGA: Od teraz upewnij się, że wszystko, co styka się z dyskami, jest wstępnie schładzone ciekłym azotem. Przeprowadz szybkie przelewy w atmosferze azotowej i przechowuj dyski w ciekłym azocie, aby uniknąć rozmrażenia próbki. Ćwicz wcześniej przeniesienie uchwytu z HPF do pudełka LN, aby zapewnić płynne i szybkie przejście. Proces nagrzewania uchwytu można przyspieszyć po zamrożeniu, używając suszarki do włosów (2 na rysunku 2E).
    8. Po wyjęciu dysków szafirowych z uchwytu umieść je w oznaczonych pojemnikach, aby przenieść je do urządzenia zastępującego zamrażanie lub do przechowywania ciekłego azotu do dalszego przetwarzania. Jeśli dyski szafirowe są ściśle ze sobą po HPF, użyj skalpela, aby je oddzielić przed zamianowaniem zamrożenia.
      UWAGA: Uważaj, aby nie złamać dysków i unikać sił ścinania. Zaplanuj wystarczająco dużo czasu na ten krok.
  2. Zamrożenie i podstawienie
    1. Ustaw urządzenie zastępujące zamrażanie zgodnie z instrukcjami producenta. Napełnij dewar ciekłym azotem i rozpocznij program wstępnego schładzania komory próbki do -90 °C. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo ciekłego azotu na cały proces podstawiania.
      UWAGA: Zaangażowane chemikalia są niebezpieczne. Wszystkie kroki wykonuj pod okapem spalinowym i przestrzegaj lokalnych wytycznych dotyczących środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa (EHS).
    2. Przygotuj roztwór zastępujący zamrożenie zawierający 0,1% (w/v) octanu uranilu, 0,2% (w/v) czterotlenku osmu (OsO4) oraz 5% (v/v) wody w acetonie. Aby przygotować objętość 6 mL (wystarczającą do wypełnienia 24 kriovialów, co odpowiada maksymalnej pojemności używanego tutaj urządzenia substytucyjnego), należy wykonać następujące kroki:
      1. Odważ 6 mg octana uranilu do szklanego naczynia z szczelną pokrywką.
      2. Dodaj 300 μL 4% (w/v) czterotlenku osmu do wody.
      3. Zamknij naczynie i smagnuj przez 5 minut, aby rozpuścić octan uranylu.
      4. Dodaj 5,7 mL acetonu, wymieszaj i równomiernie podziel roztwór w kriovialach zgodnych z urządzeniem zamrażającym i podstawiającym.
    3. Umieść zamknięte krioviale zawierające roztwór podstawienia zamrażania w urządzeniu do wstępnie schładzonego urządzenia do zamrożenia w temperaturze -90 °C i czekaj, aż roztwór również ostygnie do -90 °C (przez około 20 minut).
    4. Napełnij pudełko LN-boxem ciekłym azotem. Do przenoszenia dysków szafirowych do urządzenia zastępującego zamrożenie, pęsety wstępnego schładzania, skalpela oraz szczypiec (lub dużych pęset) w ciekłym azocie.
    5. Użyj schłodzonych, dużych pęset, aby przenieść kapsuły magazynowe z wysokociśnieniowymi mrożonymi próbkami ze zbiornika do pudełka LN.
      UWAGA: Pracuj szybko, aby zapobiec rozmrażaniu próbek. Podczas przetwarzania próbek bezpośrednio po zamrożeniu pod wysokim ciśnieniem można pominąć ten etap.
    6. Przenieś próbki zamrożone pod wysokim ciśnieniem do urządzenia do zastępowania zamrożenia. Oddzielaj szafirowe dyski pojedynczo, trzymając je w ciekłym azocie. Szybko przenieś każdy dysk osobno do kriovialu z roztworem zamrożenia i podstawienia, zapewniając pełne zanurzenie. Zamknij kriovial i natychmiast umieść go z powrotem w urządzeniu do zastępowania zamrożenia.
      UWAGA: Podczas transferu trzymaj kriovial w atmosferze ciekłego azotu, aby zapobiec nagrzewaniu się roztworu podstawienia, ale nie w ciekłym arze, aby zapobiec zamarzaniu. Trzymaj fiolkę palcami blisko pokrywki, aby zapobiec ogrzaniu roztworu zastępczego. Ostrożnie obchodz się z roztworem substytucyjnym, ponieważ zawiera on toksyczne substancje.
    7. Gdy wszystkie dyski zostaną przeniesione do urządzenia substytucyjnego, rozpocznij proces zamrożenia podstawienia. Ustaw urządzenie tak, aby stopniowo podnosiło temperaturę przez 16 godzin od -90 °C do 0 °C, z krokiem inkubacji trwającym 1 godzinę w 0 °C, a następnie stopniowym zwiększaniem do 20 °C w ciągu 1 godziny.
    8. Gdy próbki osiągną 20 °C, kontynuuj bezpośrednio płukanie próbek przez 3 x 30 minut w 100% acetonie.
      UWAGA: Nie pozwól, by komórki na dyskach wyschły. Wszystkie kolejne kroki wykonuj pod osłoną oparową. Wszystkie odpady należy zebrać do odpowiednich pojemników i utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami EHS.
  3. Osadzanie
    1. Świeżo przygotuj żywicę epoksydową zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj z żywicą epoksydową pod okapem spalającym (fume). Zalecamy przygotowanie świeżej żywicy do każdego procesu osadzania ze względu na niższą lepkość, a tym samym lepszą infiltrację próbek.
    2. Aby osadzić próbki wstępnie, inkubuj je w roztworze zawierającym 1/3 żywicy epoksydowej i 2/3 acetonu przez 1 godzinę. Zamień roztwór na 2/3 żywicy epoksydowej i 1/3 acetonu i inkubuj przez 3 godziny. Wymień roztwór z żywicą epoksydową 100% i pozwól mu inkubować przez noc z otwartą pokrywką fiolki, aby pozostała aceton mógł odparować.
    3. Następnego dnia przełóż dyski szafirowe do nowych, oznakowanych probówek reakcyjnych wypełnionych świeżo przygotowaną żywicą epoksydową. Ustaw dyski poziomo, podparte ścianą rurki reakcyjnej, i upewnij się, że strona z komórkami jest skierowana ku górze w rurce reakcyjnej (""2" jest czytelne pod mikroskopem stereoskopowym). Umieść probówki reakcyjne z otwartą pokrywką w piecu w temperaturze 60 °C i pozwól żywicy epoksydowej polimeryzować się przez co najmniej 48 godzin.
      UWAGA: Jeśli fragment dysku szafirowego wymaga osadzenia, umieść go za pomocą polimeryzowanego końcówki bloku żywicy z poprzedniego eksperymentu: umieść końcówkę w probówce reakcyjnej, napełnij ją świeżą żywicą i połóż uszkodzony dysk na zpolimeryzowanym końcówce.
      Wszelkie jednorazowe materiały spalające skażone żywicą epoksydową należy umieścić w piecu w temperaturze 60 °C, aby żywica mogła całkowicie zpolimeryzować przed utylizacją. Pęsety i inne przedmioty można wcześniej wytrzeć etanolem.
    4. Zanurz końcówkę zamkniętej rurki reakcyjnej w ciekłym azocie na około 10 sekund. Następnie usuń blok żywicy z probówki reakcyjnej, uderzając w rurkę reakcyjną na stole. Dysk szafirowy łatwo oddziela się od warstwy węglowej, która pozostaje na osadzonych komórkach.
      UWAGA: Upewnij się, że Twoje medium osadzające toleruje zmiany temperatury wywołane przez zabieg ciekłym azotem.
  4. Przygotowanie sekcji tomografii STEM
    1. Przygotuj przekroje znacznie grubsze niż ultracienkie do obrazowania TEM, zwykle od 800 nm do 1 μm.
      UWAGA: Przygotowanie sekcji do tomografii STEM różni się nieco od konwencjonalnej ultramikrotomii. Szczegółowy protokół opisujący przygotowanie sekcji tomografii STEM można znaleźć w Walther i in.15 oraz Villinger i in.10.
      Przed kontynuacją przygotowania sekcji tomografii STEM upewnij się, że jakość komórek jest dobra. W tym celu wykonaj ultracienkie przekroje (~70 nm) oraz analizę TEM (rysunek 3D,E).
    2. Zbieraj przekroje na równoległych prętach miedzianych, tak aby żadne pręty siatki nie blokowały wiązki elektronów podczas przechylania próbki pod wysokimi kątami. Dla lepszego przylegania sekcji należy poddać siatki 0,01% poli-L-lizyny: przygotować niewielką ilość aliquotu 0,01% poli-L-lizyny z roztworu 0,1% materiałowego, zanurzyć siatki w aliquotie, ostrożnie je wysuszyć, przeciągając krawędź siatki po papierze filtracyjnym. Rozładowuj siatki i użyj ich do zbierania sekcji.
    3. Traktuj przekroje z kolorydalnym złotem jako wskaźniki fiducial dla wyrównania serii nachyleń (patrz sekcja 3).
    4. Nałóż warstwę węglową na przekroje, aby je ustabilizować i uczynić bardziej przewodzącymi.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Kontrola jakości poprzez TEM – różne wyglądy komórek po osadzeniu, przycinaniu i ultracienkim przecinaniu. (A) Komórki osadzone w żywicy epoksydowej po usunięciu SD. Warstwa węgla z zarysowaną literą '2' pozostaje na komórkach osadzonych w żywicy i jest wyraźnie widoczna. Prawie przezroczyste komórki są równomiernie rozłożone na powierzchni bloku. (B) Przycięta powierzchnia blokowa przed mikrotomią. Część porysowanej dwójki jest nadal widoczna na powierzchni bloku żywicy. (C) przekroje o cienkości 70 nm zamontowane na siatce TEM. (D) Przegląd TEM jednego całego ultracienkiego przekroju. Zwróć uwagę na dziury w przekroju (białe groty strzał), które powstają w wyniku niepełnego przeniknięcia żywicy i są powszechnym artefaktem. (E) Powiększony widok wybranej komórki oznaczonej białym prostokątem w (D). Podobnie jak (D), niepełne osadzenie widoczne jest w błonie plazmatycznej (białe groty strzałek); jednak reszta komórki wykazuje dobrą konserwację i osadzenie. Pręty skalowe = 100 μm (D), 10 μm (E). Skróty: SD = szafirowa płyta; TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Obrazowanie

  1. Pozyskiwanie serii STEM tilt
    1. Ustaw mikroskop zgodnie z wytycznymi producenta. Upewnij się, że belka jest prawidłowo ustawiona.
    2. Ostrożnie napełnij dewar ciekłym azotem pod mikroskopem.
    3. Wybierz odpowiedni uchwyt tomografii w oprogramowaniu do obsługi mikroskopu.
    4. Włóż kratkę do uchwytu. Zwróć uwagę, aby pręty siatki były ustawione prostopadle do osi nachylenia, aby zapobiec blokowaniu wiązki elektronów przy dużych kątach nachylenia.
    5. Włóż uchwyt do mikroskopu.
    6. Wyrównaj belkę, wykonując następujące kroki:
      1. Załaduj plik wyrównania dostarczony przez producenta. Otwórz zawór wiązki i na razie pracuj w trybie TEM . Ustaw powiększenie na około 20 000x i ustaw standardową ostrość, naciskając STD Focus.
      2. Szukaj dziury w próbce. Jest to łatwiejsze w trybie niskiego powiększenia (naciśnij LowMag).
      3. Upewnij się, że nie ma żadnej przysłony. Ustaw rozmiar punktu na 1 , a alfa na 3. Minimalizuj wiązkę na ekranie widoku, obracając przycisk jasności przeciwnie do ruchu wskazówek zegara i wycentruj ją przyciskami przesuwania wiązki.
      4. Poprawne ustawienie działka: W panelu wyrównania oprogramowania do obsługi mikroskopu wybierz Działo i chwiejkę anody. Dostosuj symetrię wiązki przyciskami DEF/STIG . Potwierdź, że ruch wiązki na ekranie jarzeniowym jest jednorodny. Przesuń najjaśniejszy punkt na środek ekranu za pomocą przycisków SHIFT ; Odznacz wszystkie po skończeniu.
      5. Poprawne stygmatory kondensatora: W tym samym panelu wyrównania wybierz CLA i drgający HT. Dostosuj za pomocą przycisków DEF/STIG , aby uzyskać jednolity ruch.
      6. Ustaw przysłonę obiektywu kondensatora: Maksymalizuj wiązkę na ekranie fluorescencyjnym, przekręcając przycisk jasności zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Włóż najmniejszą aperturę soczewki kondensatora i upewnij się, że jest prawidłowo wyrównana w wiązce, zmieniając jasność. Jeśli wiązka porusza się asymetrycznie na ekranie widokowym, ręcznie reguluj przysłonę za pomocą ręcznych napędów przysłony. Jeśli przysłona na ekranie fluorescencyjnym wydaje się zniekształcona, ponownie skoryguj stygmator kondensatora CLA za pomocą DEF/STIG (poprzedni krok 3.1.6.5).
      7. Przełącz się na tryb STEM (wybierz ASID).
        UWAGA: Możesz przerwać dialog relaksacji obiektywu po 5-10 sekundach.
      8. Przenieś stopień do cienkiego, kontrastowego obszaru próbki. Naciśnij STD Focus i usuń wszystkie przysłony. Zmień powiększenie na 25 000 z rozmiarem plamki 1,5 nm, ustaw długość aparatu na 80 do 120 cm i wybierz tryb punktowy.
      9. Zmień wartość z goniometru, aż ronchigram będzie widoczny na ekranie widoku. Zmień długość aparatu, jeśli ronchigram jest słaby. Jeśli nie jest okrągły, użyj przycisku COND Stig , aby go wyregulować.
      10. Wstaw najmniejszą aperturę obiektywu skraplaczającego. Użyj ręcznych napędów przysłony, aby wycentrować przysłonę wokół ronchigramu.
    7. Włóż odpowiedni detektor. Na podstawie pytania badawczego użyj detektora jasnego pola i/lub detektora ciemnego pola. Aktywuj tryb skanowania i wykonaj pierwszy obraz testowy próbki.
    8. Wybierz powiększenie większe niż to, które jest pożądane dla tomogramu (większe niż 800 000x). Poprawna ostrość i astygmatyzm: rób to w okolicy, ale nie bezpośrednio w obszarze zainteresowania (ROI), aby zapobiec uszkodzeniom wiązki w krytycznych obszarach próbek.
      UWAGA: Złote markery powiernicze mogą ułatwić ten krok.
    9. Ustaw wysokość eucentryczną , aby ROI pozostał wyśrodkowany w całym zakresie nachylenia (czyli od -72 ° do 72 °). Wybierz element blisko ROI, przysuń go do środka, wyostrz, skoryguj astygmatyzm i pochyl stopień stopniowo do - 72°. Reguluj pozycję z uchwytu, aby utrzymać funkcję wyśrodkowaną, a w razie potrzeby dostosuj kontrast i jasność. W razie potrzeby powtórz to, przechylając krok po kroku do +72°.
    10. Wybierz pole widzenia, wracając do zwrotu z inwestycji (ROI), ostrość i uzyskaj obraz przeglądowy (Rysunek 4). Ustaw pożądane powiększenie do rejestrowania serii tilt.
    11. Ustaw automatyczne przechwytywanie zdjęć z serii tilt od -72° do +72° i obraz co 1,5°.
    12. Aby przeciwdziałać efektom mechanicznym występującym przy zmianie kierunku nachylenia sceny, rozpocznij serię pochylenia z większym kątem niż ten, od którego zaczynasz obrazowanie. Jeśli obrazujesz od -72° do 72°, zacznij od przechylenia etapu od 0° do -74°, a następnie rozpocznij akwizję obrazu do +72°, uzyskując pierwsze zdjęcie pod kątem -72°.
    13. Rozpocznij automatyczne przechwytywanie serii tilt. Upewnij się, że w oprogramowaniu do pozyskiwania aktywności jest aktywne skupienie .
      UWAGA: Jeśli akwizycja serii przechylenia zostanie zakończona przedwcześnie, skoryguj wysokość eucentryczną. Zwłaszcza przy większym powiększeniu może to powodować problemy z automatycznym przechwytywaniem serii nachyleń z powodu migracji zwrotu z inwestycji poza pole widzenia.
      Powszechnie używanym oprogramowaniem do tomografii STEM i TEM jest SerialEM. Kirchweger i in.20 opublikowali protokół wideo do tomografii krio-STEM z wykorzystaniem SerialEM, który można łatwo dostosować do tomografii STEM w temperaturze pokojowej.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Pozyskiwanie serii tilt. (A) 200 kV STEM. (B) Przegląd STEM ogniwa wysokociśnieniowego zamrożonego, zamrożeniowego podstawionego, osadzonego w żywicy epoksydowej. Seria przechylenia pokazana w (C-E) została uzyskana na pozycji oznaczonej białym prostokątem. (C-E) Wybrane zdjęcia serii nachyleń wykonanych od -72° do +72°. Złote fiduciale po obu stronach sekcji są używane do obliczeniowej rekonstrukcji tomogramów. Skupiskowe fiduciale, takie jak te oznaczone białymi elipsami, nie mogą być użyte do rekonstrukcji tomogramu, ale są dobrze rozpoznawalne przy dużych kątach nachylenia. Te lub podobne struktury spoza interesującego obszaru są przydatne do określania wysokości eucentrycznej. Pasek skali = 1 μm (B). Skrót: STEM = skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Rekonstrukcja i segmentacja tomogramu

  1. Wykonaj rekonstrukcję tomogramów (np. za pomocą oprogramowania Etomo z pakietu IMOD23).
    1. Wykonaj pierwsze wyrównanie serii przechyleń i zrekonstruuj tomogram za pomocą projekcji obciążonej do tyłu.
      UWAGA: Szczegółowy protokół można znaleźć na stronie IMOD: IMOD Tomography Guide (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). W przypadku przetwarzania obrazów uzyskanych detektorem ciemnego pola, należy odnieść się do wcześniej opublikowanych prac11,13.
  2. Segmentuj struktury komórkowe (np. za pomocą oprogramowania takiego jak 3DMOD z pakietu IMOD lub rozwiązań opartych na AI).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia STEM umożliwia obrazowanie grubszych przekrojów niż tomografia TEM z izotropową rozdzielczością w zakresie nanometrów i – w porównaniu do tomografii FIB-SEM – zapewnia stosunkowo efektywny w czasie proces obrazowania. W wirusologii jest to szczególnie przydatne, ponieważ pozwala na obrazowanie dużej liczby cech ultrastrukturalnych do analizy statystycznej w 3D lub podczas poszukiwania rzadkich zdarzeń. Tutaj przedstawiamy dwa reprezentatywne wyniki, które pokazują, jak tomografia STEM może być wykorzystywana w odniesieniu do tych dwóch aspektów.

Wizualizacja pączkujących rekombinowanych wirionów VSV

Istnieje wiele wirusów, które tworzą cząstki o różnych kształtach i rozmiarach. Aby przeanalizować kształt wirionów w zawiesinie wirusowej, często wystarczy prosta metoda, taka jak TEM z negatywnym barwieniem. Scharakteryzowanie morfologii wirionów w kontekście komórkowym jest trudniejsze. Dotyczy to szczególnie wirusów tworzących cząstki o morfologii anizotropowej, takich jak rhabdoviridae. VSV to rabdowirus, który tworzy wiriony w kształcie pocisków o długości ~180 nm. W komórkach zawiesinowych wiriony są losowo ułożone, co utrudnia zawsze rozpoznanie kształtu pocisku na obrazach 2D (rysunek 5A-C). Aby prawidłowo zdefiniować kształt pocisku wszystkich rekombinowanych wirionów VSV w próbce, potrzebna jest metoda 3D o rozdzielczości izotropowej – taka, która może również dostarczyć informacji wolumetrycznych na wystarczająco dużym obszarze próbki. Tomogram STEM może zawierać wiele kompletnych wirionów w jednym zbiorze danych (rysunek 5D,E). Dzięki temu możliwe jest obrazowanie dużej liczby wirionów do analizy statystycznej, nawet jeśli uzyskano tylko jeden tomogram na komórkę. Dla porównania, tomogram TEM przekroju o grubości 200 nm uchwyciłby tylko kilka pełnych rekombinowanych wirionów VSV (jak zaznaczono na Rysunku 5E).

figure-results-1
Rysunek 5: Tomografia STEM miejsc pączkowania rekombinowanych VSV. (A-C) Szczegóły z wirtualnego przekroju tomogramu STEM uzyskanego z przekroju o grubości 800 nm pokazują, że kształt pocisku nie zawsze jest widoczny z powodu (A,B) różnych orientacji wirionów. (C) Tylko wiriony ustawione równolegle do płaszczyzny widzenia występują jako dobrze zdefiniowane pociski. (D) Miejsca pączkowania rekombinowanego VSV przypominają duże skupiska wirionów bez preferowanej orientacji. (E) Widok boczny tomogramu pokazuje zdolność do uchwycenia wielu kompletnych rekombinowanych wirionów VSV w jednym przekroju za pomocą tomografii STEM. Wirtualny stos obrazów ma grubość około 600 nm w tej pozycji. Linie przerywane reprezentują przybliżoną grubość przekroju w tomografii TEM (200 nm), gdzie uwzględniałoby tylko kilka kompletnych wirionów w kształcie pocisku. Pasek skali = 500 nm (D). Skróty: STEM = skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa; VSV = wirus zapalenia szparków pęcherzykowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Degradacja nanofibrylów peptydowych EF-C

W kontekście terapii genowej nanofibrile peptydowe wzmacniające transdukcję stały się tematem zainteresowania. W niedawno opublikowanym badaniu24 zastosowano obrazowanie korelacyjne z wykorzystaniem obrazowania Foerster Resonance Energy Transfer (FRET) oraz tomografii STEM (FRET-3D-CLEM) do badania pobierania i rozkładania nanofibril peptydowych EF-C. Wysoka sprawność FRET, odpowiadająca parom FRET blisko siebie, emitują czerwoną fluorescencję odpowiadającą złożonym włókniom. Niska sprawność FRET, odpowiadająca parom FRET oddalonym od siebie, emitują zieloną fluorescencję, reprezentującą rozłożone włókna. Oba sygnały pojawiają się w komórkach podczas przyjmowania i rozkładu nanofibryli peptydowych EF-C. Obszary, gdzie występują wysokie i niskie efektywności FRET, są oznaczone na żółto (Rysunek 6A).

figure-results-2
Rysunek 6: Obrazowanie degradacji nanofibryl peptydów EF-C za pomocą korelacyjnego obrazowania FRET i tomografii STEM (FRET-3D-CLEM). (A) Mikroskopia konfokalna komórki inkubowanej z nanofibrilami EF-C oznaczonymi parą FRET. Sygnały zielone odpowiadają rzekomo rozmontowanym włókniom. Czerwony odpowiada rzekomo nienaruszonym włókniom. Żółty odpowiada obszarom, gdzie wykrywana jest mieszanka sygnału czerwonego i zielonego. Nucleus. (B) Przegląd STEM przekroju o grubości 800 nm z tej samej komórki. (C) Wskazana jest pozycja tomogramu. Obraz jest kompozycją dwóch obrazów uzyskanych na różnych przekrojach, ponieważ komórka była częściowo zablokowana przez siatkę kresków na jednej z sekcji. Jądro jest oznaczone Nu w literach A, B i C. (C) Wirtualny przekrój z tomogramu. Czerwone grotki strzałek oznaczają obszary nakładające się na czerwone sygnały fluorescencji. Tomografia STEM potwierdza obecność nienaruszonych włókien. Zielony grot strzałki wskazuje na obszar z rozłożonymi włóknami. (D) Segmentacja tomogramu. Endocytowany filopodium ściska błonę pęcherzyka (biała strzałka). Duża objętość, którą można zbadać za pomocą tomogramu STEM (tutaj około 7 μm x 7 μm x 550 nm), ułatwia obserwację tak rzadkiego zdarzenia. (E) Wirtualne sekcje 19, 24 i 29 tomogramu. Przy rozmiarze piksela 6,8 nm, sekcje są oddalone od siebie o 27,2 nm. Figura została zaczerpnięta z danych opublikowanych przez Rauch-Wirth i in.24 . Paski skalowe = 5 μm (A), 1 μm (C). Skróty: STEM = skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa; FRET = Transfer energii rezonansu Foerstera. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wizualizacja została przeprowadzona tym podejściem korelacyjnym, aby potwierdzić, że włókna EF-C są przyjmowane przez komórkę i następnie degradowane. Mikroskopia świetlna pozwala nam wybrać komórki do mikroskopii elektronowej, które dostarczają sygnały czerwone i zielone, aby porównać wygląd ultrastrukturalny korelujący z różnymi sygnałami fluorescencji. Tomogramy STEM z tej samej komórki pokazują, że sygnał czerwony może pochodzić albo z włókien, które wciąż znajdują się poza komórką, albo być świeżo zinternalizowany przez makropinocytozę (rysunek 6C). Ponadto CLEM potwierdził, że sygnał zielony rzeczywiście pochodzi z rozłożonych włókien (rysunek 6B,C, który można znaleźć w lizosomach (rysunek 6C, największa pęcherzyk). Dzięki dużej objętości dostępnej za pomocą tomografii STEM oraz wizualizacji 3D struktur, łatwiej jest korelować sygnał z mikroskopii świetlnej z cechami ultrastrukturalnymi i interpretować je. Ponadto można wykryć rzadkie zjawiska, takie jak ściskanie filopodów wewnątrz lizosomu (rysunek 6D, E, biała strzałka), dzięki temu podejściu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia STEM oferuje rozdzielczość porównywalną z tomografią TEM, w połączeniu z możliwością badania objętości o grubości do 1 μm. Dlatego uważamy ją za idealną do obrazowania zmian struktur wewnątrzkomórkowych wywołanych przez wirusa, takich jak remodelowanie błony 4,6,25, pączkowanie wirionów7 czy endocytoza5. W zależności od pytania badawczego, mogą być rozważone inne techniki VolumeEM. Dla techniki zapewniającej większe pole widzenia o porównywalnej rozdzielczości zalecamy tomografię FIB-SEM. Tomografia FIB-SEM będzie wolniejsza niż tomografia STEM przy obrazowaniu porównywalnej objętości o podobnej rozdzielczości, ponieważ czas obrazowania wzrasta wraz ze wzrostem rozdzielczości. Często jest to następnie mierzone przez obrazowanie mniejszych pól widzenia. Ponadto rozdzielczość z 6,8 nm (rysunek 6) byłaby technicznie trudna przy frezowaniu wiązki jonowej. Dlatego FIB-SEM jest optymalny do obrazowania większych struktur, takich jak komórki całe i tkanki 9,10,26,27, choć zwykle o (izotropowych) rozmiarach pikseli rzędu kilkudziesięciu nanometrów. Ponadto tomogramy FIB-SEM nie wykazują efektów "brakującego klina", co jest typowe dla tomogramów rekonstruowanych z serii przechylenia. Ponadto, wraz z rozwojem maszyn plazmowych FIB, obecnie wprowadzane są alternatywy zapewniające szybsze i nadal precyzyjne frezowanie.

Jeśli wysoka rozdzielczość w z nie jest kluczowa, alternatywą może być obrazowanie TEM lub SEM przekrojów seryjnych, umożliwiającą badanie bardzo dużego pola widzenia w krótkim czasie28,29, jednak zazwyczaj z rozdzielczością anizotropową. W tomografii TEM można łączyć różne tomogramy z szeregowych grubych przekrojów30,31. To samo jest możliwe w tomografii STEM; jednak ze względu na grubość przekrojów, które można badać, jest mniejsza potrzeba łączenia wielu tomogramów. W wirusologii tomografia TEM jest często wykorzystywana do charakteryzowania remodelowania błony indukowanego przez wirusa 32,33,34,35. Chociaż sama tomografia TEM dostarcza cennych informacji na temat cyklu replikacji wirusów, większość przypadków skorzystałaby na możliwości tomografii STEM do obrazowania grubszych objętości. Dotyczy to szczególnie wirionów o morfologii anizotropowej, takich jak rhabdoviridae, gdzie tomografia TEM może uchwycić tylko kilka kompletnych wirionów w jednym tomogramie35 lub obrazować kilka wirionów otaczających w przedziale replikacyjnej o rozmiarze kompleksu cytoplazmatycznego wirusa (cVAC) ludzkiego cytomegalowirusa (HCMV)4.

Tomografia STEM w warunkach kriogenicznych oferuje dodatkowe funkcjonalne informacje19 , a dostępny jest protokół wideo20. Nasz protokół różni się procesem przygotowania próbki, który zamiast zachować próbkę w stanie natywnym, zapewnia niemal naturalną ultrastrukturalną ochronę. Chociaż tomografia STEM próbek zamrożonych i zamienionych w wysokociśnieniowym zamrożeniu nie jest w stanie osiągnąć ultrastrukturalnej ochrony i rozdzielczości atomowej jak w kriogenicznym EM, korzysta z zalet prostszego sprzętu, bardziej stabilnych próbek i wyższej przepustowości.

Następujące kroki są kluczowe dla sukcesu metody:

Po pierwsze, jasny cel eksperymentu obrazowania. Ze względu na pracochłonność tej techniki potrzebny jest dobrze zaplanowany eksperyment z jasnym celem obrazowania. Szczegółowa wiedza o systemie modelowym – linii komórkowej i wirusie – powinna być generowana wcześniej, stosując inne metody, które są łatwiejsze do wykonania. Dlatego zachęcamy do optymalizacji wskaźników zakaźności w eksperymentach przedeksperymentalnych opartych na mikroskopii świetlnej oraz dostosowywania warunków eksperymentalnych do systemu biologicznego. Parametry optymalizacyjne obejmują liczbę komórek, wielokrotność infekcji (MOI) oraz punkty czasowe w zależności od wirusa i zdarzenia, które ma być obrazowane. Zapewni to wysoki udział wartościowych komórek w próbce.

Po drugie, wysokiej jakości przygotowanie próbek. Podkreślamy znaczenie wysokiej jakości przygotowania próbek. Obecnie uważamy witryfikację przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem za złoty standard dla grubych próbek, takich jak komórki. Zamrożenie, zanurzanie i późniejsze obrazowanie w temperaturze pokojowej to solidny sposób uzyskiwania wysokiej jakości wyników w połączeniu z tomografią STEM. Dlatego ustanowienie stabilnej rutyny przygotowywania próbek jest kluczowe. W związku z tym chcielibyśmy podkreślić literaturę dotyczącą zamarzania pod wysokim ciśnieniem14,21. Jeśli ma być stosowany mniej toksyczny roztwór zamrożenia i podstawienia, zalecamy stosowanie nadmanganianu potasu jako zamiennika czterotlenku osmu, jak opisują Schauflinger i in.36.

Na koniec, należy ustalić płynny przepływ pracy przy pozyskiwaniu serii pochyleń, w tym dobrze wyrównany mikroskop, zgodnie z instrukcjami użytkownika STEM i będzie się różnił w zależności od mikroskopu. Ustalenie płynnego przepływu zależy również od generatora skanowania oraz oprogramowania do akwizycji obrazów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR oraz MD są pracownikami firmy Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, firmy farmaceutycznej zainteresowanej opracowywaniem i produkcją produktów opartych na wirusach. Nie miało to wpływu na projekt gazety; Dlatego nie zgłaszamy żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta publikacja jest częścią Globalnej Strategii Rozwoju Technologicznego i została wspierana przez Globalne Zarządzanie Technologią w Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. Dziękujemy Renate Kunz i Janie Apolloni za doskonałą pomoc techniczną oraz pomocne dyskusje dotyczące przygotowania próbek. Dziękujemy Reinhardowi Weihowi za doskonałą pomoc w kwestiach technicznych oraz konserwacji urządzeń. Dziękujemy Torstenowi Friedrichowi za pomocną dyskusję i pomoc przy ustawieniu mikroskopu. Prace Clarissy Read, Julii LaRoche i Jana Müncha zostały sfinansowane z grantu Cooperative Research Centre Niemieckiej Fundacji Badawczej (SFB1279).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-HeksadeceneMerck KGaA8220640500
200 miedziana siatka z równoległymi prętamiPlano GmbHG2014C
37 i stopni; Komora susząca CBinder GmbH9010-0323
AcetonVWR international GmbH20066330
DDSANauki o mikroskopii elektronowej13710
Nóż diamentowyDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Nauki o mikroskopii elektronowej13600
Embed-812 ResinNauki o mikroskopii elektronowej14900
Narzędzia EMTVIPS GmbHOprogramowanie TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Etanol 100%Merck KGaA1.00983.2511
Papier filtrującyVWR international GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
FormvarNauki o mikroskopii elektronowej15830-25
Jednostka substytucyjna zamrażania Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nmAURION Immuno Gold Reagenty & Akcesoria425.011
Złoty pinhole i oslash; 2000 i mu; mScience Services GmbHGA2000-AU
Graiticules Buchstaben-Netzchen KupferPlano GmbHNH6C
Płyta grzewczaMEDAX GmbH & Kompania KG12501
System wapowania wysokiego próżniowego BAF 300BAL-TEC AG
Zamrażarka wysokociśnieniowa Wohlwend HPF Compact 01Biuro inżynieryjne M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Zbiornik ciekłego azotuH.Erben GmbH94500
Azot (płyn)VWR international GmbH-
NMANauki o mikroskopii elektronowej19000
Czterotlenek osmuChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Piekarnik 120 stopni i stopni; CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Poly-L-Lizyna 0,1% z aq. RozwiązanieTed Pella, Inc.18026
Safe-Lock Tubes 0,5 mLEppendorf SE0030 121.023
Pojemniki na próbki (kapsuły Beem)Plano GmbHG360-1
Szafirowy dysk o średnicy 3 x 0,16 mmBiuro inżynieryjne M. Wohlwend GmbH500
Ultramikrotom Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
Octan uraniluRiedel de Haë n AG31697
Komora UVDiniesELG100S

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tomografia STEMmro enie pod wysokim ci nieniemsubstytucja mro eniowaobrazowanie 3Dkom rki zainfekowane wirusemzatapianie w ywicywirus zapalenia jam ustnychkorelacyjna mikroskopia wietlna i elektronowamorfogeneza wirion w

Powiązane artykuły