Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Transfekowany Alu RNA pierwotny nabłonek barwnikowy siatkówki myszy: patologicznie istotny model in vitro dla zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

558 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

17 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy pełny proces ustanawiania istotnego dla patologii modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (RPE) przy użyciu transfekcji Alu RNA.

Streszczenie

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), szczególnie AMD bez wysięku, wymaga modeli eksperymentalnych, które lepiej odwzorowują ludzką patologię. Obecne modele in vivo są nadal wymagające pod względem technicznym i czasochłonne, podczas gdy konwencjonalne systemy in vitro nie są w stanie odtworzyć patologicznych wyzwalaczy specyficznych dla choroby. W tym miejscu przedstawiamy metodę ustalenia modelu zwyrodnienia nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu pierwotnych mysich komórek RPE transfekowanych Alu RNA, retrotranspozonem bezpośrednio zaangażowanym w patologię atrofii geograficznej.

Protokół ten szczegółowo opisuje enzymatyczną izolację pierwotnych mysich komórek RPE, a następnie transfekcję Alu RNA w celu wywołania zwyrodnienia RPE. Walidacja obejmuje analizę morfologiczną (architektura heksagonalna), funkcjonalną (utrata polarności i zakłócenie białka mysiego ZO-1) oraz molekularną (ilościowa PCR). W rezultacie zaobserwowaliśmy wieloczynnikowe zmiany wywołane transfekcją Alu RNA: zapalne wydzielanie cytokin (mysie geny Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) i starzenie się komórek (regulacja w górę genów myszy p21 i p53 ; p < 0,05). W porównaniu z tradycyjnymi modelami ostrego stresu, system ten rekapituluje przewlekłe kaskady zapalno-zwyrodnieniowe AMD za pomocą standardowych technik, zapewniając odtwarzalność. Łącząc aspekty uproszczonych testów in vitro i złożonych modeli in vivo , podejście to może posłużyć jako wstępna platforma do badania mechanizmów napędzanych przez retrotranspozon i badań przesiewowych potencjalnych kandydatów terapeutycznych.

Wprowadzenie

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest główną przyczyną globalnego upośledzenia wzroku. Jednak skuteczne metody leczenia AMD bez wysięku pozostają ograniczone. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania powtarzalnych i wydajnych modeli badawczych w celu odkrycia mechanizmów chorobowych i zidentyfikowania celów terapeutycznych 1,2. Centralnym elementem tych wysiłków jest nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE), monowarstwa znajdująca się między błoną Brucha (naczyniówką) a fotoreceptorami (siatkówką), która odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy siatkówki poprzez wspieranie funkcji fotoreceptorów, regulację bariery krew-siatkówka i ułatwianie usuwania odpadów 3,4.

Dysfunkcja lub utrata komórek RPE jest istotną cechą wielu chorób zwyrodnieniowych siatkówki, zwłaszcza w AMD, gdzie dysfunkcja RPE stanowi wczesny i krytyczny etap jej postępu 2,4,5. Warto zauważyć, że u pacjentów z atrofią geograficzną (GA), zaawansowaną fazą AMD, obniżony poziom enzymu przetwarzającego mikroRNA Dicer 1 rybonukleazy III (DICER1) powoduje toksyczną akumulację Alu RNA, transkryptu retrotranspozonu bezpośrednio związanego ze zwyrodnieniem RPE i związanego z patologią człowieka6.

Tradycyjne modele in vivo, takie jak model jodanu sodu (NaIO3) i model β amyloidu (Aβ), zachowują złożoność choroby ogólnoustrojowej, ale napotykają krytyczne ograniczenia. Model NaIO3 szybko indukuje stres oksydacyjny siatkówki i uszkodzenie RPE, jednak jego ostra toksyczność zaburza zarówno RPE, jak i fotoreceptory, nie naśladując przewlekłej progresji AMD związanej z patologią i zaciemniając ocenę terapeutyczną subtelnej dysfunkcji RPE7. Podobnie, model Aβ wprowadza stresory specyficzne dla choroby, ale wymaga rozległej wiedzy technicznej i wydłużonych ram czasowych w porównaniu z podejściami in vitro 8,9. Z drugiej strony konwencjonalne modele RPE in vitro, takie jakH2O2i modele ekspozycji na hydrochinon, nie mają znaczenia patologicznego, ponieważ nie są w stanie podsumować stresorów specyficznych dla choroby, takich jak toksyczne agregaty białkowe lub czynniki wywołujące stan zapalny1.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ustalania modelu degeneracji RPE w pierwotnych komórkach RPE myszy przy użyciu Alu RNA, niekodującego RNA pochodzącego z retrotranspozonu, bezpośrednio zaangażowanego w patogenezę GA6. Alu RNA aktywuje szlaki zapalne i narusza integralność bariery RPE10,11, naśladując w ten sposób patologiczne cechy związane z niewysiękowym AMD. Metoda ta wykorzystuje enzymatyczną izolację i hodowlę komórek RPE, a następnie indukcję degeneracji RPE za pomocą Alu RNA. Dodatkowo zapewniamy kompleksowy system walidacji, łączący odczyty morfologiczne (architektura sześciokątna), funkcjonalne (integralność bariery i utrata polarności) oraz molekularne (markery stanu zapalnego i starzenia) w celu oceny tego modelu zwyrodnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Szpitala Ogólnego w Szanghaju przy Szkole Medycznej Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju. Protokół ten jest ściśle zgodny z Regulaminem Zarządzania Sprawami Zwierząt Doświadczalnych (wydanym przez Państwową Komisję Nauki i Technologii) oraz wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych ustanowionymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO). Zapoznaj się z Tabelą Materiałów , aby uzyskać więcej informacji na temat materiałów użytych w tym protokole.

1. Izolacja pierwotnych mysich komórek RPE

  1. Przygotowanie płyt powlekanych
    1. Rozcieńczyć Matrigel w stosunku 150 μL Matrigel do 13 ml DMEM/F12 (stężenie końcowe około 1,14%).
    2. Równomiernie pokryć spód płytki rozcieńczonym Matrigelem (około 150 μl dla płytki 48-dołkowej). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C do uzyskania żelu.
  2. Przygotowanie roztworu
    1. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną RPE, używając zmodyfikowanej mieszanki pożywki Eagle / składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
    2. Przygotuj mieszankę papainy, dodając 4,5 ml zbilansowanego roztworu soli Earle's (EBSS) do fiolki z papainą (100 jednostek/fiolkę).
    3. Przygotuj mieszankę DNazy I, dodając 500 μl EBSS do fiolki DNazy I (1,000 jednostek/fiolkę).
    4. Przygotuj roztwór do wytrawiania papainy, dodając 250 μl mieszanki DNase I do 4,5 ml mieszanki papainy (dostosować protokół dostarczony przez dostawcę, aby osiągnąć końcowe stężenie papainy 22 j.m./ml), co daje końcową objętość 4,75 ml.
  3. Eutanazja i pobieranie tkanek
    1. Eutanazja myszy w wieku 2-3 tygodni poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5% pentobarbitalu sodu w stężeniu 150-200 mg/kg masy ciała. Potwierdź głębokie znieczulenie i śmierć, sprawdzając ustanie bicia serca i oddychania.
    2. Dokładnie spryskaj okolicę oka 70% etanolem przed enukleacją, aby wyeliminować zanieczyszczenia powierzchniowe 12,13,14. Delikatnie naciśnij krawędź okołooczodołową, aby wystawała kula ziemska. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć gałkę oczną, zachowując nerw wzrokowy w celu łatwiejszego wypreparowania.
      UWAGA: Wszystkie narzędzia (np. kleszcze, nożyczki) są sterylizowane w autoklawie, a zabiegi wykonywane są pod kapturem z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność.
    3. Natychmiast zanurzyć gałki oczne w sterylnym, kompletnym pożywce do hodowli RPE podgrzanym do temperatury 37 °C.
  4. Trawienie enzymatyczne
    UWAGA: Wszystkie etapy, w tym trawienie enzymatyczne i późniejsze procedury, muszą być wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność.
    1. Przenieś gałkę oczną do naczynia i użyj kleszczy, aby wyeliminować przylegającą tkankę łączną i resztki mięśni zewnątrzgałkowych pod mikroskopem stereoskopowym.
    2. Delikatnie przepłukać oczy 2x wstępnie schłodzoną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco (D-PBS; bez Ca2+/Mg2+; w temperaturze 4 °C).
      UWAGA: Pozostałość kompletnej pożywki hodowlanej RPE może upośledzać aktywność enzymatyczną papainy.
    3. Całkowicie zanurzyć oczy w 1 ml roztworu do wytrawiania papainy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
  5. Separacja komórek RPE
    1. Po strawieniu zneutralizować aktywność enzymatyczną za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej RPE.
    2. Przenieś gałkę oczną do naczynia i pod mikroskopem stereoskopowym wytnij rogówkę, tęczówkę i soczewkę oraz zachowaj tylną muszlę oczną.
      UWAGA: Komórki RPE zostały wyizolowane i utrzymane jako nienaruszone arkusze (zamiast dysocjować na pojedyncze komórki) podczas całego procesu.
    3. Oddziel kompleks siatkówka-RPE od naczyniówki, a następnie oderwij warstwę RPE od siatkówki w postaci ciągłych arkuszy w kompletnej pożywce hodowlanej RPE. Oderwane warstwy RPE należy zebrać równomiernie do świeżej, kompletnej pożywki do hodowli RPE jako mieszaniny, a następnie wyhodować je na powierzchniach pokrytych Matrigelem.
  6. Hodowla komórkowa
    1. Wysiewaj mieszaninę na 24-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem (8-10 gałek ocznych na basenie na szkiełku nakrywkowym, w celu barwienia immunologicznego), na 48-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem (6-8 gałek ocznych na basenie, w przypadku qPCR) lub na 96-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem (5-6 gałek ocznych na dołek).
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Pierwszą zmianę pożywki należy przeprowadzić po 48 godzinach, używając kompletnej pożywki do hodowli RPE. Zmieniaj podłoże co 48 godzin po pierwszej zmianie.
      UWAGA: Aby w jak największym stopniu utrzymać polaryzację komórek RPE, unikaj ich pasowania, gdy tylko jest to możliwe, ponieważ powtarzające się subkulturowanie może prowadzić do utraty różnicowania i integralności funkcjonalnej.
  7. Monitorowanie morfologii komórek
    1. Pozwól komórkom utworzyć monowarstwę o charakterystycznej sześciokątnej morfologii. Monitorować morfologię pod mikroskopem hodowli komórek odwróconych.

2. Indukcja modelu zwyrodnienia RPE

  1. Synteza i weryfikacja Alu RNA
    1. Syntetyzuj Alu RNA za pomocą systemu transkrypcji in vitro .
      UWAGA: Synteza Alu RNA wykorzystana w naszym badaniu została oparta na protokole opisanym przez Ambati Lab6.
    2. Oczyść RNA i potwierdź jego jakość za pomocą mikrospektrofotometru.
  2. Transfekcja Alu RNA
    UWAGA: Wyznaczyliśmy dzień pierwotnego wysiewu komórek RPE jako dzień 0. W dniu 5 przylegające pierwotne komórki RPE wykazywały jednolitą morfologię i osiągnęły ponad 50% konfluencji komórkowej, w którym to momencie transfekcję Alu RNA przeprowadzono przy użyciu kationowego odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, zgodnie z wytycznymi producenta.
    W celu walidacji wyników włączono dwie grupy kontrolne: i) kontrolę ujemną (NC), w której nie dodano ani Alu RNA, ani odczynnika do transfekcji, a jako substytut zastosowano pożywkę o niskiej surowicy; ii) kontrola liposomów (LC), w której pominięto Alu RNA, ale tę samą ilość odczynnika do transfekcji zmieszano z pożywką o niskiej surowicy i nałożono na komórki, w celu kontroli efektów związanych z lipofekcją. Poniższe kroki opisują procedurę transfekcji Alu RNA.
    1. Zastąp istniejącą pożywkę 300 μl kompletnej pożywki do hodowli RPE na basenik (płytka 48-dołkowa) przed procedurami transfekcji.
    2. Przygotować kompleksy transfekcyjne z Alu RNA i odczynnikiem na bazie kationowych lipidów w pożywce o niskiej surowicy.
      1. Przygotować Mieszaninę 1 z 1,2 μl odczynnika na bazie lipidów kationowych i 18,8 μl pożywki o niskiej surowicy. Delikatnie wymieszaj (nie wiruj) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. Przygotuj Mieszankę 2 z 6 μl Alu RNA (100 μg/ml) i 14 μl pożywki o niskiej surowicy.
      3. Przygotować kompleksy transfekcyjne, dodając kroplami 20 μl Mix 2 do 20 μl Mix 1.
        UWAGA: Alu RNA transfekowano w końcowym stężeniu 0,6 μg na studzienkę przy użyciu 1,2 μl odczynnika na bazie lipidów kationowych na studzienkę (1,2 μl odczynnika: stosunek 0,6 μg RNA).
      4. Delikatnie przesuń, aby wymieszać. Następnie pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut.
    3. Dodać 40 μl/basenik kompleksów transfekcyjnych do każdego dołka na płytce 24-dołkowej. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na 48 godzin.
    4. Wykonaj qPCR, barwienie immunologiczne i inne procedury eksperymentalne 48 godzin po transfekcji.

3. Walidacja modelu zwyrodnienia

UWAGA: Kompleksowe eksperymenty walidacji modelu przeprowadzono w dniu 7.

  1. Barwienie immunofluorescencyjne w celu oceny polarności i integralności bariery
    1. Utrwal hodowane komórki RPE za pomocą 4% formaldehydu wolnego od metanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Mycie 3 x 10 min z 1x PBS.
    2. Zablokuj niespecyficzne wiązanie z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 1 godzinę.
    3. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-ZO1 (rozcieńczenie 1:1,000 w 3% BSA) i falloidyną 488 (rozcieńczenie 1:1,000 w 3% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C, unikając światła.
    4. Delikatnie umyj komórki 3 x 10 min PBS.
    5. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (rozcieńczenie 1:1 000 w 3% BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć próbki 3 x 10 min 1x PBS.
    7. Barwienie przeciwstawne za pomocą DAPI (rozcieńczenie 1:1 000 w PBS) przez 10 min.
    8. Myć próbki przez 3 x 10 minut za pomocą 1x PBS.
    9. Ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej i umieść je na szkiełku podstawowym z kroplą podłoża mocującego. Rejestruj obrazy konfokalne za pomocą obiektywu 40x/0,95.
  2. Ilościowy PCR (qPCR) dla markerów starzenia i stanu zapalnego
    UWAGA: Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (mysi gen Gapdh) została zastosowana jako wewnętrzny gen odniesienia do normalizacji wartości cyklu progowego (Ct). Wszystkie ilościowe reakcje PCR (qPCR) obejmowały trzy kontrpróby biologiczne na grupę eksperymentalną. Sekwencje starterów znajdują się w tabeli uzupełniającej S1.
    1. Ekstrakcja RNA
      1. Dodać bufor do lizy (zestaw całkowitego RNA) do płytki hodowlanej (1 ml na 10 cm² powierzchni) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. Wirować w temperaturze 13 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki wolnej od RNaz.
        UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli próbki są wolne od zanieczyszczeń (np. lizat z przezroczystych komórek).
      3. Dodać 200 μl chloroformu do supernatantu, wirować przez 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
      4. Wirować przy 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść górną fazę wodną (~500 μl) do nowej probówki.
      5. Dodać 0,5 objętości etanolu do fazy wodnej. Delikatnie wymieszać, pipetując.
      6. Załaduj mieszaninę na kolumnę z membraną krzemionkową (dołączoną do zestawu Total RNA). Wirować przy 13 400 × g przez 30 s. Odrzuć przepływ.
      7. Dodać 500 μl buforu do usuwania białek (zestaw Total RNA) do kolumny. Wirować przy 13 400 × g przez 30 s. Odrzuć przepływ.
      8. Dodać 500 μl buforu do przemywania (zestaw całkowitego RNA) do kolumny. Wirować przy 13 400 × g przez 30 s. Odrzuć przepływ.
      9. Powtórz poprzedni krok 3.2.
      10. Odwirować pustą kolumnę o stężeniu 13 400 × g przez 2 minuty w celu wysuszenia membrany.
      11. Eluować RNA, dodając do membrany 30-100 μl wody wolnej od RNaz. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wirować przy 13 400 × g przez 2 min.
    2. Komplementarna synteza DNA (cDNA)
      1. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru przy 260 nm i 280 nm.
        UWAGA: Uważa się, że stosunek A260/A 280 między 1,8 a 2,0 jest związany z akceptowalną czystością RNA.
      2. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wolnej od RNaz: matryca RNA (500-1 000 ng): X μL (w zależności od jego stężenia), 5x bufor do odwrotnej transkrypcji: 4 μL, woda wolna od RNaz: do 20 μL.
      3. Inkubować mieszaninę reakcyjną w termocyklerze, stosując następujący program: 37 °C przez 15 minut, 85 °C przez 5 s i bezterminowe przetrzymywanie w temperaturze 4 °C.
    3. qPCR (badanie qPCR)
      1. Przygotuj główną mieszankę qPCR dla każdej reakcji (łącznie 10 μL): TB Green (zawarty w Premix Taq): 5 μL, Barwnik ROX (zawarty w Premix Taq): 0,2 μL, Starter do przodu (1 μM): 0,2 μL, Starter odwrotny (1 μM): 0,2 μL, Woda wolna od RNaz: 3,4 μL, Matryca cDNA: 1 μL.
      2. Dodać 10 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
      3. Uszczelnij płytkę samoprzylepną osłoną optyczną. Wirować przy 300 × g przez 1 min.
      4. Uruchom następujący program w systemie PCR w czasie rzeczywistym: Etap 1: 95 °C przez 30 s; Etap 2: 40 cykli: 95 °C przez 5 s, 60 °C przez 30 s; Etap 3: Analiza krzywej topnienia.
      5. Obliczyć względne poziomy ekspresji docelowych mRNA za pomocą metody 2−ΔΔCt 15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne mysie komórki RPE przed transfekcją Alu RNA
W dniu 0 (ryc. 1) wyizolowano pierwotne mysie komórki RPE, które wykazywały charakterystyczną sześciokątną morfologię, która jest typowa dla zdrowych komórek RPE. Komórki te utrzymywały dobrze zorganizowaną monowarstwę. Komórki hodowano, aby umożliwić wstępną organizację strukturalną i tworzenie ścisłych połączeń, o czym świadczy sześciokątny kształt i dobrze zdefiniowane granice. Ta morfologia posłużyła jako punkt odn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naszym celem było stworzenie powtarzalnego i dostępnego modelu urazów RPE, który umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i analizę mechanistyczną przy minimalnych ograniczeniach zasobów. Podejście to zapewniło wyraźną wizualizację zaburzeń strukturalnych wywołanych przez Alu RNA w porównaniu z grupą kontrolną, w tym fragmentacji wierzchołkowego ścisłego połączenia i podstawowej dezorganizacji cytoszkieletu poprzez konfokalne obrazowanie stosu Z (rozmiar kroku 0,5 μm). Niezawodność systemu zapewniają dwa kluczowe ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Prace te były częściowo wspierane przez Plan Działań na rzecz Innowacji Naukowych i Technologicznych Specjalny Projekt Badań nad Innowacjami Medycznymi (23Y11901300), Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (82171076) oraz Komisję Edukacji Miejskiej w Szanghaju (2023ZKZD18). Dziękujemy Panu Profesorowi L.Z. za miły dar w postaci Alu RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Seria 1300 klasa II, szafa bezpieczeństwa biologicznego typu A2Thermo Scientific
37 &stopnie; C/5% CO2 inkubatorThermo Scientific
4% paraformaldehydu (PFA)Serwis bioG1101-500ML
ludzki Alu RNAPodarowany przez L.Z.
Przeciwciało wtórne przeciw królikowi, Alexa Fluor 568 (koza)Invitrogen Thermo ScientificA11011
Stosowana samoprzylepna osłona optyczna MicroAmp firmy BiosystemsThermo Fisher Naukowy
Applied Biosystems MicroAmp Optyczne 96-dołkowe płytki reakcyjneThermo Fisher Naukowy
System PCR w czasie rzeczywistym firmy Applied Biosystems ViiA 7Thermo Fisher NaukowySystem PCR w czasie rzeczywistym do ilościowej analizy ekspresji genów
Albumina surowicy bydlęcej (BSA, frakcja V)Beyotine (Beyotine)Zobacz materiał ST023-50g
Mikroskop odwróconych hodowli komórkowych Carl Zeiss PrimovertZeissDo monitorowania morfologii komórek
Wirówka 5424 REppendorf powiedział:
ChloroformSigmaSeparacja faz w ekstrakcji RNA.
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (LSM900 + Cell discover 7)ZeissObrazowanie markerów immunofluorescencyjnych (np. ZO-1 i F-aktyny).
Płytka dołkowa Costar 24/48/96Corning
szkiełko nakrywkoweThermo Fisher NaukowyStosowany na płytce 24-dołkowej do obrazowania immunofluorescencyjnego.
DAPI (interfejs DAPI)Thermo62248
Cyfrowa sucha kąpielMulab powiedział:
DMEM/F12Certyfikat GibcoPożywki do hodowli komórek RPE 
Buforowany fosforanem Dulbecco (D-PBS)Udostępnij biografięZobacz materiał SB-CR017
Earle'a s Zrównoważony roztwór soli (EBSS)Certyfikat GibcoZbilansowany roztwór soli stosowany do rozcieńczania papainy i DNazy I podczas izolacji RPE.
Etanol (absolutny)SigmaWytrącanie RNA i mycie kolumn.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaDo kompletnych pożywek do hodowli komórkowych RPE
KleszczeDo preparacji
Lipofectamine 3000 (kationowy odczynnik do transfekcji na bazie lipidów)Rybak termicznyL300015Aby transfekować Alu RNA do komórek RPE
MatrigelCorning356234Matryca (rozcieńczenie 1,14%) do powlekania płyt w celu wspomagania adhezji i polaryzacji RPE.
Formaldehyd bez metanoluThermo ScientificAlternatywny utrwalacz (4%) do zachowania epitopów w immunofluorescencji
MikropipetaEppendorf powiedział:
Spektrofotometr Nanodrop 2000Thermo ScientificMierzy stężenie i czystość RNA
Nikon ECLIPSE Ti-S fluorescencyjny mikroskop odwróconyNikonObrazowanie fluorescencyjne barwionych próbek
Mikroskop stereoskopowy Olympus SZX16OlympusDo preparacji gałek ocznych myszy i izolacji RPE
Opti-MEMCertyfikat GibcoPożywka o niskiej surowicy do przygotowania kompleksu transfekcji
System dysocjacji papainyWorthingtonLK003150Do działania enzymu
Penicylina-Streptomycyna Certyfikat GibcoDo kompletnych pożywek do hodowli komórkowych RPE
Sól sodowa pentobarbitaluSigmaCzynnik eutanazji
Falloidyna 488 Księga Abcam176753Do oceny polaryzacji
Zestaw odczynników PrimeScript RTTakaraZobacz materiał RR037AZestaw do odwrotnej transkrypcji do syntezy cDNA (przygotowanie matrycy qPCR)
Zestaw RNAsimple Total RNATIANGENZobacz materiał DP419Do ekstrakcji RNA
TB Zielony  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)TakaraPrzekaźnik RR420ADo qPCR
Przeciwciało poliklonalne królika ZO-1Technologia białkowa21773Do oceny morfologicznej

Bibliografia

  1. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 13 (4), 359-377 (2018).
  2. Fleckenstein, M., Schmitz-Valckenberg, S., Chakravarthy, U. Age-related macular degeneration. JAMA. 331 (2), 141-157 (2024).
  3. Kaufmann, M., Han, Z. Rpe melanin and its influence on the progression of AMD. Ageing Res Rev. 99, 102358(2024).
  4. Du, J., Zhu, S., Lim, R. R., Chao, J. R. Proline metabolism and transport in retinal health and disease. Amino Acids. 53 (12), 1789-1806 (2021).
  5. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res. 79, 100858(2020).
  6. Kaneko, H., et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature. 471 (7338), 325-330 (2011).
  7. Anderson, B. D., Lee, T. T., Bell, B. A., Wang, T., Dunaief, J. L. Optimizing the sodium iodate model: Effects of dose, gender, and age. Exp Eye Res. 239, 109772(2024).
  8. Qarawani, A., et al. PEDF-derived peptide protects against amyloid-β toxicity in vitro and prevents retinal dysfunction in rats. Exp Eye Res. 242, 109861(2024).
  9. Chen, S. -J., et al. Cytoprotective potential of fucoxanthin in oxidative stress-induced age-related macular degeneration and retinal pigment epithelial cell senescence in vivo and in vitro. Mar Drugs. 19 (2), 114(2021).
  10. Kerur, N., et al. cGAS drives noncanonical-inflammasome activation in age-related macular degeneration. Nat Med. 24 (1), 50-61 (2018).
  11. Kim, Y., et al. Dicer1/ Alu RNA dysmetabolism induces caspase-8-mediated cell death in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (45), 16082-16087 (2014).
  12. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  13. Shang, P., et al. A novel method of mouse rpe explant culture and effective introduction of transgenes using adenoviral transduction for in vitro studies in AMD. Int J Mol Sci. 22 (21), 11979(2021).
  14. Sun, J., et al. ROS production and mitochondrial dysfunction driven by PU.1-regulated NOX4-p22phox activation in aβ-induced retinal pigment epithelial cell injury. Theranostics. 10 (25), 11637-11655 (2020).
  15. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta ct) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  16. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J Vis Exp. (133), e56997(2018).
  17. Datta, S., Cano, M., Ebrahimi, K., Wang, L., Handa, J. T. The impact of oxidative stress and inflammation on RPE degeneration in non-neovascular AMD. Prog Retin Eye Res. 60, 201-218 (2017).
  18. Liu, X., et al. The novel triterpenoid RTA 408 protects human retinal pigment epithelial cells against H2O2-induced cell injury via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. Redox Biol. 8, 98-109 (2016).
  19. Bhattarai, N., et al. Resvega alleviates hydroquinone-induced oxidative stress in ARPE-19 cells. Int J Mol Sci. 21 (6), 2066(2020).
  20. Chen, C., et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid Redox Signal. 20 (14), 2091-2106 (2014).
  21. Lin, C. -H., et al. Low-luminance blue light-enhanced phototoxicity in A2E-laden RPE cell cultures and rats. Int J Mol Sci. 20 (7), 1799(2019).
  22. Lewis Luján, L. M., et al. Nutraceuticals/drugs promoting mitophagy and mitochondrial biogenesis may combat the mitochondrial dysfunction driving progression of dry age-related macular degeneration. Nutrients. 14 (9), 1985(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transfekcja RNA Alupierwotne komórki RPE myszydegeneracja RPEizolacja enzymatycznasekrecja cytokin zapalnychstarzenie komórkoweilościowe PCRprzewlekły stan zapalny

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.