Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) to bakteria szeroko stosowana do produkcji białek rekombinowanych. Liczne zmutowane szczepy, w tym BL21(DE3) i jego pochodne, zostały opracowane do ekspresji docelowych białek¹. Proces ten jest zwykle napędzany przez kodowaną polimerazę RNA T7 bakteriofaga i indukowany izopropylo-ß-D1-tiopalaktopyranozydem (IPTG), analogiem laktozy, który aktywuje operon lac poprzez uwolnienie represora lak ^1,2,3. Ponieważ nie ulega hydrolizie, następuje ciągła ekspresja mRNA i wyższa produkcja białka³.

Podczas gdy ten typ systemu jest wygodny i spójny dla wielu białek, niektóre typy rekombinowanych białek wywołują toksyczność u E. coli, prowadząc do słabej wydajności białka. Toksyczność wynikająca z obecności rekombinowanego białka negatywnie wpływającego na bakterie może być spowodowana nieszczelnym odciąganiem pokarmu przed indukcją lub stresem dla bakterii po indukcji ^3,4. Rezultatem jest zmniejszenie tempa wzrostu i żywotności bakterii⁵. Tłumienie nieszczelnej ekspresji może odgrywać ważną rolę w skutecznej ekspresji toksycznych białek. Szczepy ekspresyjne E. coli z plazmidami pLysS (tj. BL21(DE3)pLysS, C41(DE3)pLysS itp.) hamują nieszczelną ekspresję poprzez ekspresję lizozymu T7, który hamuje polimerazę T7 przed indukcją ^6,7. Inne szczepy, takie jak szczepy C41(DE3) i C43(DE3), zawierają mutacje, które zmniejszają aktywność polimerazy T7 poprzez zmniejszenie jej poziomu mRNA i usuwają proteazy lon i ompT 1,4,8,9,10. Tłumienie nieszczelnej ekspresji lub zmniejszanie tempa produkcji rekombinowanych białek (poprzez regulację polimerazy T7 lub obniżenie temperatury) pomaga zwiększyć wydajność toksycznych białek ^1,9.

Nukleazy są często toksycznymi i trudnymi do ekspresji białkami przy użyciu systemu ekspresji E. coli ze względu na ich aktywność enzymatyczną w stosunku do komórkowego DNA lub RNA¹. Na przykład endorybonukleaza Nsp15 znajdująca się w koronawirusach i innych nidowirusach jest toksyczna dla bakterii, co skutkuje wolniejszym tempem wzrostu i niskimi plonami 11,12,13,14,15,16,17. Ze względu na swoją rolę katalityczną, rozszczepianie 3' urydyn w wirusowym RNA, uważa się, że Nsp15 działa zarówno na własne, jak i komórkowe mRNA podczas rekombinacji, co powoduje rozregulowanie metabolizmu i ekspresję rekombinowanego białka ^11,14. W przypadku Nsp15 oligomeryzacja jest niezbędna do aktywności enzymatycznej. Wcześniejsze badania beta-koronawirusa (takiego jak SARS i SARS-CoV-2) Nsp15 wykazały, że enzym przede wszystkim oligomeryzuje się do homoheksameru w roztworze, przy czym forma monomeryczna jest nieaktywna 16,18,19,20. Po zmutowaniu do tworzenia tylko monomerów zaobserwowano znaczny wzrost wydajności¹⁴. Dodatkowo, podczas mutacji jednej z reszt katalitycznych w triadzie katalitycznej do alaniny, zaobserwowano lepszą ekspresję w tych samych warunkach co WT, co dodatkowo potwierdza, że toksyczność Nsp15 dla E. coli jest napędzana przez aktywność nukleazy 13,16,17. W tym protokole pokazujemy różnicę w wydajności między WT gamma-koronawirusem (wirusem zakaźnego zapalenia oskrzeli) Nsp15 a wersją martwą katalitycznie uzyskaną przez mutację jednej z reszt katalitycznej histydyny (H223A).

Tutaj opisujemy krok po kroku metodologię nadekspresji rekombinowanego Nsp15 w systemie ekspresji C41 (DE3), a następnie oczyszczanie białek za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości. Do wyizolowania białka stosuje się N-końcowy 6-krotny znacznik Hisa z chromatografią powinowactwa do immobilizowanych metali na bazie kobaltu (IMAC). Dalsze oczyszczanie odbywa się za pośrednictwem SEC w celu oddzielenia Nsp15 według stanu oligomerycznego i wyizolowania aktywnych gatunków heksameerycznych. Podejście to oferuje metodę nadekspresji i oczyszczania toksycznych nukleaz do badań biochemicznych i strukturalnych.

1. Przygotowanie buforu i odczynników

1. Odczynniki do nadekspresji
   1. Przygotować 1 l pożywki 2xTY, łącząc 16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego, 5 g chlorku sodu (NaCl) i 900 ml wody dejonizowanej w kolbie o pojemności 2 l. Kolbę należy sterylizować w autoklawie przez co najmniej 30 minut w cyklu cieczowym.
      UWAGA: Na jedno oczyszczenie potrzebne są co najmniej 2 litry pożywki 2xTY.
   2. Przygotować odpowiedni zapas antybiotyków dla plazmidu. W przypadku Nsp15-pET-14b należy przygotować 15 ml ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml, rozpuszczając 1,5 g ampicyliny w wodzie dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Zapasy antybiotyków należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
   3. Przygotuj 250 ml pożywki agarowej Lysogeny Bulth (LB), łącząc 2,5 g tryptonu, 1,25 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NaCl, 3,75 g agarozy i 250 ml wody dejonizowanej w szklanej butelce o pojemności 500 ml. Wysterylizuj roztwór w autoklawie przez co najmniej 30 minut w cyklu płynnym i ostudzić, aż będzie ciepły w dotyku.
   4. Przygotować płytki agarowe LB uzupełnione ampicyliną, przenosząc 25 ml ciepłego podłoża agarowego LB do wysterylizowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml (25 ml na płytkę, która ma być wykonana). Dodać 25 μl ampicyliny 100 mg/ml na każde 25 ml pożywki i mieszać, aby połączyć zawartość. Za pomocą pipety serologicznej dodać 25 ml mieszaniny pożywek do sterylnej plastikowej szalki Petriego; Unikaj wprowadzania jakichkolwiek bąbelków.
      1. Zapobiegaj zanieczyszczeniu, przecierając stół laboratoryjny 20% etanolem i zapalając palnik Bunsena, aby zachować sterylność podczas nalewania płytek.
      2. Pozostawić płytki do ostygnięcia przed przechowywaniem ich w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
   5. Przygotować 15 ml 1 M IPTG, rozpuszczając 3,574 g IPTG w wodzie dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania, dzieląc je na trzy podwielokrotności po 5 ml.
2. Odczynniki oczyszczające
   UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być przygotowane co najmniej jeden dzień przed oczyszczaniem
   1. Przygotować 250 ml buforu do lizy (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 5 mM imidazolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotować 15 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 250 mM imidazolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
   3. Przygotować 250 ml buforu do rozszczepiania (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
   4. Przygotować 1 l buforu SEC (20 mM HEPES pH_7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl 2) i przefiltrować przez filtr PES 0,22 μm za pomocą filtracji próżniowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C z FPLC.
   5. Przygotować 15 ml 1 M chlorowodorku fluorku 4-(2-aminoetylo)benzenesulfonylu (AEBSF), rozpuszczając 3,595 g AEBSF w wodzie dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przygotować 1 ml porcji w 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
   6. Opcjonalnie: Przygotować główną mieszankę buforową z dodecylosiarczanem sodu (SDS) w żelu, rozcieńczając 200 μl roztworu podstawowego (250 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego, 40% glicerolu, 100 mM DTT) w 400 μl wody dejonizowanej.
   7. Przygotuj probówki z próbkami żelu, aby śledzić oczyszczanie. Przenieś 30 μl 1x buforu ładującego do każdej probówki.
   8. Przygotuj 1 l 10x buforu do biegania Tris-Glycine, rozpuszczając 30 g zasady Tris, 144 g glicyny i 20 g SDS w 1000 ml wody dejonizowanej. Aby uzyskać 1x roztwór, rozcieńczyć 100 ml 10x roztworu w 900 ml dejonizowanej wody w butelce o pojemności 1 l. Oba odczynniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia.

2. Nadekspresja Nsp15

UWAGA: Wszystkie odczynniki i materiały powinny być utrzymywane w jak największej sterylności, aby zapobiec ryzyku zanieczyszczenia.

1. Przekształcenie
   1. Usunąć komórki E. coli C41(DE3) z temperatury -80 °C do rozmrożenia przez 10 minut na lodzie. Pobrać pipetą 1 μl plazmidowego DNA do probówki zawierającej komórki C41. Pozwól mu inkubować, siedząc na lodzie przez 30 minut.
      UWAGA: Chociaż stężenia plazmidów mogą się różnić, dla danych opisanych tutaj dodano 10-20 ng DNA na transformację. Protokół handlowy dla komórek C41(DE3) zaleca 10-50 ng DNA na transformację. Protokół ten ma zastosowanie do każdego plazmidu wykorzystującego układ promotora T7; jednak w tym przypadku wcześniej opublikowany Nsp15 kodujący plazmid pET14b zoptymalizowany pod kątem kodonu, z miejscem TEV po N-końcowym znaczniku 6xHhis i miejscu rozszczepienia trombiny, został zmodyfikowany przez zastąpienie SARS-CoV-2 Nsp15 sekwencją IBV Nsp15 (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)¹⁹.
   2. Umieścić probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 42 °C na 45 s, aby wstrząsnąć cieplnie komórki w celu wychwycenia plazmidów. Inkubować probówkę na lodzie przez 2 minuty.
   3. Odpipetować 200 μl pożywki regeneracyjnej (SOC lub innej pożywki bogatej) do probówki zawierającej komórki C41(DE3) i plazmidy. Wytrząsać przy 210 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   4. Wyjąć płytki agarowe LB z dodatkiem ampicyliny z 4 °C i umieścić w niewstrząsającym inkubatorze ustawionym na 37 °C.
   5. Odpipetuj bakterie na płytce agarowej. Za pomocą sterylnego rozsiewacza rozprowadź komórki na płytce agarowej. Umieść płytkę w niewstrząsającym inkubatorze ustawionym na 37 °C, aby rosła przez 14-16 godzin.

3. Wzrost

1. Zbieranie pojedynczych kolonii
   UWAGA: Użyto starterów pojedynczej kolonii tego samego dnia zamiast nocnej kultury starterowej w celu zaszczepienia komórek w logarytmicznej fazie wzrostu. W przypadku hodowli nocnych komórki są zazwyczaj w fazie stacjonarnej lub śmierci, zwłaszcza w przypadku toksycznych białek. Dodatkowo, biorąc pod uwagę dłuższy czas hodowli, zanieczyszczenia lub mutanty mogą konkurować z toksyczną nukleazą.
   1. Użyć jednej wysterylizowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 50 ml na każdy litr kultury oraz 2-3 dodatkowe startery. Oznaczyć jedną z kolb gwiazdką do kontroli gęstości optycznej (OD). OD pobrany z tej kolby będzie reprezentował cały wzrost, chyba że istnieje wizualna różnica między kolbami.
      UWAGA: Stwierdzono, że kolby Erlenmeyera zapewniają lepsze napowietrzenie niż probówki startowe o pojemności 15 ml.
   2. Stworzyć główną mieszankę 2xTY plus odpowiednie antybiotyki, używając objętości 10 ml x N liczby starterów. Aby uzyskać wzrost o pojemności 4 litrów, przygotuj 6 kultur starterowych. Mieszanka wzorcowa składałaby się z 60 μl ampicyliny (rozmrożonej w temperaturze -20 °C) i 60 ml 2xTY (rozcieńczenie 1:1000). Mieszać do wymieszania i podaszkować 10 ml do każdego Erlenmeyera.
   3. Wyjąć przekształconą płytkę z inkubatora. Zerwij pojedynczą, izolowaną kolonię z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety. Przenieś wykałaczkę z kolonią do kolby z podłożem. Powtarzaj, aż każda kolba będzie zawierała wykałaczkę.
   4. Umieścić zaszczepione kolby startowe w inkubatorze do wytrząsania z prędkością 210 obr./min, 37 °C. Pozostawić kolby startowe do wzrostu przez ~5-7 godzin.
2. Inokulacja kultur
   1. Po 5 godzinach sprawdzić średnicę zewnętrzną przy 600 nm (OD₆₀₀) kolby oznaczonej gwiazdą za pomocą mikrokuwety i spektrometru. Wyjąć i przenieść 1 ml kultury z kolby do mikrokuwety. Powtarzaj pomiary okresowo, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,8-1,0.
   2. 30 min do 1 h przed inokulacją (gdy OD₆₀₀ osiąga 0,4), ogrzać 2 L kolby 2xTY w temperaturze 37 °C. Ciepłe podłoże skraca czas opóźnienia po inokulacji kulturą starterową.
   3. Rozmrozić zapas ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml w temperaturze od -20 °C. Po osiągnięciu docelowego OD₆₀₀ przygotować cztery 2-litrowe kolby z 1 litrem pożywki 2xTY, dodając 1 ml ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml (rozcieńczenie 1:1000).
   4. W celu zaszczepienia należy wlać zawartość jednej kolby startowej do jednej kolby o pojemności 2 l. Powtarzać tę czynność, aż każda kolba o pojemności 2 litrów zostanie zaszczepiona. Unikaj wlewania wykałaczki do kolby, aby ułatwić zbieranie komórek.
   5. Umieścić zaszczepione kolby o pojemności 2 l w inkubatorze z wytrząsaniem przy 210 obr./min, 37 °C na 3 godziny przed sprawdzeniem pierwszego OD₆₀₀.
3. Indukcja za pomocą IPTG
   1. Sprawdzić średnicę zewnętrzną₆₀₀ , usuwając 1 ml pożywki z kolby za pomocą pipety serologicznej. Powtarzaj, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,8-1,0.
   2. Po osiągnięciu docelowego OD₆₀₀ dodać 1 ml 1 M IPTG dla końcowego stężenia 1 mM (rozmrożonego od -20 °C) w celu wywołania nadekspresji.
   3. Przenieść kolby o pojemności 2 l do inkubatora z wytrząsaniem przy 210 obr./min, 16 °C w celu indukcji przez noc (14-16 godzin).
      UWAGA: Niższa temperatura spowolni wzrost komórek E. coli , zmniejszając toksyczność poprzez spowolnienie produkcji białek i aktywności nukleazy.
4. Żniwa
   1. Wyjąć indukowane kolby z inkubatora do wytrząsania i wlać zawartość do oddzielnych butelek wirówkowych o pojemności 1 l. Zrównoważ butelki za pomocą wody dejonizowanej. Wirować komórki w temperaturze 4500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Usunąć sklarowany osad i przenieść osad do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą szpatułki. Połącz granulki w jedną stożkową rurkę. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

4. Oczyszczanie Nsp15

UWAGA: Wszystkie i probówki powinny być trzymane na lodzie. Wszystkie etapy wirowania powinny być przeprowadzane w temperaturze 4 °C. Poniższy protokół zakłada białko znakowane przez Hisa.

OPCJONALNIE: Po każdym etapie można pobrać próbki żelu, aby śledzić postęp oczyszczania.

1. Liza komórek i klarowanie lizatu
   1. Zawiesić osad bakteryjny, dodając 2 ml buforu do lizy na każde 1,2 g osadu. Dodać 100 μl 1 M AEBSF na każde 10 ml buforu do lizy jako inhibitora proteazy. W przypadku stosowania kombinowanego osadu o pojemności 4 litrów, dodać 100 μl DNazy I, aby uzyskać końcowe stężenie 200 U.
      UWAGA: Jedna tabletka koktajlowa inhibitora proteazy wolna od EDTA na litr może być zastąpiona jako inhibitor proteazy.
   2. Krótko wirować zawartość probówki przez 30 s, aby umożliwić wymieszanie się osadu i buforu. Przenieś wirowany granulat do młynka do tkanek Dounce. Za pomocą luźnego tłuczka homogenizuj zawartość (~10 uderzeń).
   3. Przenieść homogenizowaną próbkę do metalowej zlewki w celu sonikacji.
      1. Aby upewnić się, że uzyskano maksymalną próbkę, przepłucz probówkę zawierającą oryginalny osad 5 ml buforu do lizy i krótko przekręć probówkę. Wlej zawartość do homogenizatora Dounce, zastosuj ~5 pociągnięć, a następnie przenieś do zlewki sonikacyjnej.
   4. Do metalowej zlewki dodać 75 μl Triton X-100, aby wspomóc lizę błony i solubilizację. Umieść metalową zlewkę w łaźni lodowej, aby upewnić się, że próbka pozostaje zimna podczas sonikacji.
   5. Umieścić sondę soniczną w metalowej zlewce i sonikować próbkę przez 6 minut i 30 s z impulsami co 2 s i amplifikacją na poziomie 70%.
      UWAGA: Używaj ochronników słuchu, jeśli sonda sonikatora nie jest dołączona.
   6. Za pomocą pipety serologicznej przenieść lizat do probówki wirówkowej. Do tej samej probówki dodać 1 M AEBSF w rozcieńczeniu 1:100 jako świeży inhibitor proteazy. Klarować lizat przez odwirowanie w stężeniu 26,915 x g przez 50 min.
2. Chromatografia powinowactwa metodą filtracji grawitacyjnej
   UWAGA: Żywica kobaltowa znacznie zmniejsza ilość niespecyficznych spoiw metalowych w porównaniu z żywicą niklową²¹.
   1. Podczas sonikacji uzyskać 2 ml zawiesiny żywicy kobaltowej i ponownie zawiesić z 25 ml buforu do lizy w nowej stożkowej probówce. Odwirować zawieszoną żywicę przez 5 minut przy 500 x g. Po odwirowaniu odleć supernatant, uważając, aby nie stracić żywicy.
   2. Powtórzyć z dwoma oddzielnymi płuczkami buforu do lizy o pojemności 25 ml, a następnie odwirować. Nie wylewać supernatantu z ostatniego prania, dopóki nie będzie gotowy do wiązania partiami. Gdy będzie gotowy, wylej bufor do lizy z ostatniego płukania żywicą i ponownie zawieś żywicę z 10 ml świeżego buforu do lizy (10 ml buforu na 1 ml żywicy).
   3. Dodaj rozpuszczalną frakcję do probówki i pozwól, aby 6 razy oznaczone białkiem Hisa związało się z żywicą na wahaczu przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli objętość wiązania wsadowego przekracza 50 ml, wykonaj ten krok w zlewce o pojemności 250 ml z mieszadłem z bardzo małą prędkością w temperaturze 4 °C. Przenieś całą żywicę do zlewki podczas wykonywania tego etapu za pomocą buforu do lizy.
   4. Po związaniu partii wlać zawartość do grawitacyjnej kolumny filtracyjnej i zebrać przepływ w kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Zawartość kolby powinna być białkiem, które nie wiąże się z żywicą; Oznaczony przez niego Nsp15 zostanie związany z żywicą. Używając oddzielnej kolby do zbierania, przemyć żywicę buforem o pojemności 8 x 25 ml w sumie co najmniej 200 ml (~5x pierwotna objętość) za pomocą pipety serologicznej.
      UWAGA: Powoli dodawaj bufor po boku kolumny, a nie bezpośrednio po środku, aby zapobiec naruszeniu złoża żywicy, co może prowadzić do nieefektywnego lub nierównomiernego mycia.
3. Elucja białek
   1. Eluować znakowany przez Hisa Nsp15 w trzech elucjach z buforem elucyjnym. Elutiony 1 i 2 to 2 ml elucji, a elucja 3 to 1 ml elucji.
   2. Wykonaj "szybki i brudny" test Bradforda, rozcieńczając odczynnik Bradforda w wodzie w stosunku 1:1. Przenieść 10 μl każdej elucji do probówek i odwrócić w celu wymieszania. Roztwór powinien zmienić kolor na niebieski w obecności białka. Oceń zmianę koloru, aby określić, jak łączyć elucje.
      UWAGA: Jeśli elucja 1 i 2 jest silna, a elucja 3 jest słaba, połącz elucjacje 1 i 2 i kontynuuj. Jeśli wszystkie są słabe, połącz wszystkie trzy rurki.
4. Koncentracja białka i rozszczepienie znacznika
   1. Przenieść połączoną próbkę elucji do koncentratora MWCO o mocy 30 kD (lub o odpowiedniej wielkości dla białka będącego przedmiotem zainteresowania). Skoncentrować białko do ≤2 ml przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 minut. Przenieść zagęszczoną próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. W razie potrzeby zwiększyć końcową objętość próbki do 2 ml za pomocą buforu rozszczepiającego.
   2. Przygotuj jednorazową kolumnę odsalającą (np. kolumnę PD-10) zgodnie ze wskazówkami producenta. Dodaj próbkę o objętości 2 ml do kolumny. Umieścić kolumnę w czystej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i eluować przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty.
      UWAGA: Ten krok szybko usuwa imidazol, który zakłóca rozszczepianie trombiny, unikając agregacji wywołanej stężeniem podczas stosowania koncentratorów MWCO do buforowania wymiany.
   3. Do eluatu dodać β-Me i CaCl₂ do końcowego stężenia 2 mM każdy. Dodać 50 μl wywaru trombinowego o stężeniu 1 μl. Po dodaniu wszystkich składników umieścić probówkę na wytrząsarce w pozycji pionowej i pozostawić reakcję do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając.
      UWAGA: Nocne rozszczepienie w temperaturze 4 °C może działać w przypadku niektórych białek; poprawę wydajności Nsp15 zaobserwowano przy 4-godzinnym rozszczepieniu w temperaturze pokojowej w porównaniu z rozszczepieniem w temperaturze 4 °C przez noc.
   4. Ponownie wyrównać kolumnę filtracji grawitacyjnej w buforze rozszczepiającym (przemyć 3x 25 ml buforem rozszczepiającym). Upewnij się, że kurek odcinający jest zamknięty i dodaj 5 ml buforu do rozszczepienia, aby zapobiec wysychaniu żywicy. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C w okresie łupania.
5. Oddzielanie rozszczepionego białka od rozszczepionego His-tag i nierozszczepionego białka
   1. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie odpipetować reakcję rozszczepienia bezpośrednio na żywicę i zebrać eluat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   2. Przemyj żywicę 2 ml buforu do rozszczepienia i zbierz w tej samej probówce o pojemności 15 ml. Powtórz w sumie dwa prania. Po zakończeniu dodać AEBSF do probówki, aby ugasić trombinę w celu uzyskania końcowego stężenia 10 mM.
   3. Przenieść próbkę ponownego przejścia do nowego koncentratora MWCO o mocy 30 kD. Zagęścić białko do ≤500 μl przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 min. Przenieść zagęszczoną próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
6. Chromatografia wykluczania wielkości
   1. Uruchomić kolumnę analityczną S200 zwiększającą (lub inną kolumnę o odpowiednim rozmiarze dla białka będącego przedmiotem zainteresowania) zgodnie ze specyfikacjami producenta. Zrównoważyć w buforze SEC i ustawić wielkość frakcji FPLC na 500 μL.
   2. Przenieś wybrane probówki frakcji z pików do nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dodaj 2,5 μl 1 M DTT (stężenie końcowe 5 mM) do każdej frakcji, aby utrzymać oczyszczony Nsp15 na niskim poziomie.
   3. Zmierzyć wartości A₂₈₀ każdej frakcji za pomocą nanospektrofotometru. Opróżnij przyrząd buforem SEC przed pobraniem pomiarów. Oczyszczone próbki Nsp15 należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
7. Opcjonalnie: Kontrola oczyszczania
   1. Podgrzewać probówki z próbkami żelu na bloku grzewczym o temperaturze 95 °C przez 10 minut. Po podgrzaniu krótko odwirować probówki, aby odwirować kondensację. Załaduj próbki do 4-20% bezplamistego żelu Mini-Protean TGX i pracuj pod napięciem 300 V przez 17 minut. Zobrazuj żel/żele, aby sprawdzić czystość.

Ze względu na toksyczność Nsp15 jako nukleazy, zwykle potrzeba łącznie ~7 godzin, aby kultury starterowe osiągnęły OD600 0,8-1,0. Po zaszczepieniu, w sumie ~3-5 godzin było zwykle wymagane dla tego samego optymalnego OD600 0,8-1,0 do indukcji. W tym przypadku czas podwojenia wynosił ~1 h. Kiedy katalitycznie martwy mutant Nsp15 uległ ekspresji, podwojenie komórek E. coli wydawało się normalne (~ 20 min), co jest kolejnym dowodem na to, że aktywność nukleazy jest odpowiedzialna za toksyczność (Figura 1A).

Po indukcji przez noc zwykle zbierano 6-9 g mokrego granulatu komórkowego na 2 l wzrostu WT. W wielu różnych naroślach z różnymi mutantami Nsp15 zaobserwowaliśmy, że mniejsze granulki korelują z wyższą aktywnością nukleazy. W przypadku martwego katalitycznego Nsp15 uzyskano znacznie większy granul, ~18-30 g, na 2 litry wzrostu. Razem to dodatkowo potwierdza, że aktywność nukleazy prowadzi do toksyczności podczas ekspresji, chociaż brakuje nam bezpośrednich dowodów w postaci western blot ze względu na ograniczenia zasobów.

Reprezentatywne żele próbek pobranych podczas procedury wykazały udaną nadekspresję i oczyszczanie WT Nsp15 i katalitycznego martwego Nsp15 z gamma-koronawirusa, wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (ryc. 1 do ryc. 3). Na rysunku 1B występuje wyraźne nadeksprymowane pasmo postindukcyjne o prawidłowej masie cząsteczkowej dla Nsp15 martwego katalitycznie, ale nie WT Nsp15 (rysunek 1B, pasy 3 i 5). Jednak podczas oczyszczania pasmo WT stało się widoczne podczas chromatografii powinowactwa (ryc. 2, tor 6). Podobny wzorzec zaobserwowano w przypadku koronawirusa indyka Nsp15, gdzie nie było wyraźnego prążka po indukcji, ale po chromatografii powinowactwa22 pojawiło się wyraźne prążko. Wykorzystanie chromatografii powinowactwa i chromatografii wykluczania wielkości pozwoliło na wyizolowanie aktywnego enzymu, najpierw przez 6-krotny znacznik His, a następnie przez stan oligomeryczny. Żywica użyta do izolacji była żywicą IMAC naładowaną kobaltem o wyższej specyficzności dla 6x His-tags niż żywice naładowane niklem. Dowodem na to jest rysunek 1B, pas 5, pojawienie się dominującego pasma na poziomie ~42 kDa (His-Nsp15) i brak wyższych pasm MW (ArnA, powszechne spoiwo z żywicy niklowej, ma MW 75 kDa)23. Pierwszy żel oczyszczający demonstruje elucję His-Nsp15 poprzez pojawienie się pojedynczego izolowanego pasma o tej samej masie cząsteczkowej opisanej wcześniej (Rysunek 2A i Rysunek 3A, linia 7). Większość białka została wymyta przy pierwszym płukaniu imidazolem, z resztkowymi ilościami w drugim i trzecim przemyciu i śladowymi ilościami pozostałymi związanymi z żywicą (Figura 2A i Figura 3A, pasy 7-10).

Rozszczepienie trombinowe znacznika Hisa następuje w RT przez 4 godziny. Udane rozszczepienie zaobserwowano w drugim żelu oczyszczającym, ze spadkiem masy cząsteczkowej o ~ 2 kDa między pasami przed i po rozszczepieniu (Figura 2B i Figura 3B, pasy 2-3). Ponowne przejście reakcji rozszczepienia przez żywicę oczyszcza reakcję, usuwając znacznik His, pozostałości nienaruszonego Nsp15 i niespecyficzne białka wiążące metale, przy czym bardzo mało rozszczepionego Nsp15 pozostaje na samej żywicy (Figura 2B i Figura 3B, pasy 4-5).

Ponieważ oligomeryczny Nsp15 był w stanie aktywnym, SEC został użyty do oddzielenia i zidentyfikowania podstawowych stanów oligomerycznych. Na reprezentatywnym chromatogramie otrzymanym z oczyszczania obserwuje się dwa piki, przy czym pik przy ~11 ml objętości elucji odpowiada aktywnemu heksamerowi, a pik przy ~15 ml odpowiada nieaktywnemu monomerowi (ryc. 4). Frakcje pikowe heksameru i monomeru wykazują czystość >95% według SDS-PAGE (Rysunek 2B i Rysunek 3B, pasy 6-10). Frakcje 1-10 i 14-18 wyświetlane na śladzie nie zostały uwzględnione w SDS-PAGE, ponieważ nie zaobserwowano w nich wykrywalnego białka. Używając podwójnie znakowanego (5'-fluorosceina, 3'-Cy5) 51-merowego RNA, wykazaliśmy, że heksameryczne WT Nsp15 było aktywne, a monomeryczne WT Nsp15 i oba stany katalitycznego martwego Nsp15 były nieaktywne (Figura 5).

Do pomiaru absorbancji frakcji Nsp15 przy 280 nm (A280) użyto nanospektrofotometru. Otrzymane wartości A280 przeliczono na stężenia w jednostkach μM przy użyciu prawa Beera i odpowiedniego współczynnika ekstynkcji (przy użyciu Expasy ProtParam; Tabela 1). Ponownie, porównując WT i katalityczny martwy Nsp15, stwierdzono istotną różnicę w wydajności (Tabela 1). Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda ekspresji i oczyszczania daje wysoce czysty, aktywny Nsp15 w stężeniach wystarczających do badań biochemicznych i strukturalnych krio-EM.

Rysunek 1: Reprezentatywne dane typowej śmierci katalitycznej H223A i nadekspresji WT Nsp15 w komórkach C41 (DE3). (A) Krzywa wzrostu martwego katalitycznego H223A (trójkąty) i WT Nsp15 (okręgi) w OD600 w funkcji czasu (h). Pomiary OD600 pobrane z 10 ml kultur starterowych są reprezentowane przez SC. Pomiary OD600 pobrane z 2-litrowych kolb po inokulacji są reprezentowane przez PI. (B) Żel SDS-PAGE (4-20% TGX) próbek przed i po indukcji nadekspresji Nsp15 WT i H223A martwych katalitycznie. Próbki przed indukcją pobrano przed dodaniem 1 M IPTG do kolb. Próbki po indukcji pobrano po nocnej indukcji w temperaturze 16 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne żele SDS-PAGE (4-20% TGX) typowego oczyszczania WT Nsp15, nadeksprymowane w komórkach C41 (DE3). (A) Żel z próbkami pobranymi z lizy komórek do elucji Nsp15 z żywicy kobaltowej. Pasy 6 i 10 reprezentują próbki pobrane bezpośrednio ze złoża żywicy po wypłukaniu żywicy w kroku 4.2.4 i po elucji Nsp15 po etapie 4.3.1. (B) Żel z próbkami pobranymi od etapu wstępnego rozszczepienia przez SEC. Próbki sprzed rozszczepienia pobrano przed dodaniem trombiny, po odsoleniu próbki w kroku 4.4.2. Próbki po rozszczepieniu pobrano po 4-godzinnym okresie rozszczepienia znacznika przed wykonaniem kroku 4.5.1. Próbkę repass pobrano z eluatu pobranego po przejściu próbki rozszczepienia przez żywicę kobaltową w celu wychwycenia rozszczepionego znacznika Hisa i nierozszczepionego białka po kroku 4.5.1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Reprezentatywne żele SDS-PAGE (4-20% TGX) typowego oczyszczania Nsp15 z martwa katalitycznego H223A, z nadekspresją w komórkach C41(DE3). (A) Żel z próbkami pobranymi z lizy komórek do elucji H223A Nsp15 z żywicy kobaltowej. Pasy 6 i 10 reprezentują próbki pobrane bezpośrednio ze złoża żywicy odpowiednio po wypłukaniu żywicy i po elucji H223A Nsp15. (B) Żel z próbkami pobranymi od fazy przed rozszczepieniem do SEC. Próbki pobrane przed rozszczepieniem pobrano przed dodaniem trombiny. Próbki po rozszczepieniu pobrano po 4-godzinnym okresie rozszczepienia. Próbkę repass uzyskano z eluatu pobranego po przejściu próbki rozszczepienia przez żywicę kobaltową w celu wychwycenia rozszczepionego znacznika Hisa i rozszczepionego białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne ślady SEC rekombinowanego Nsp15 nadekspresji w komórkach C41 (DE3). Warianty Nsp15 (A) WT i (B) H223A martwa katalitycznie zostały rozwiązane w żelowej kolumnie filtracyjnej przy użyciu buforu SEC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Żel rozszczepiający testu nukleazy przeprowadzonego z wybranym substratem RNA. Sekwencja jest pokazana pod żelami z etykietami pokolorowanymi tak, aby pasowały do nakładek. IBV Nsp15 (100 nM) inkubowano z 5'-FI-RNA-Cy5-3' (500 nM) przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Określone próbki pobrano w oznaczonym czasie (min) i schłodzono buforem ładującym. Obrazy dla produktów 5'-FI (niebieski) i 3'-Cy5 (czerwony) zostały nałożone na siebie. Fioletowy prążek jest reprezentatywny dla nieszczelnego RNA. Przeprowadzono zasadową hydrolizę substratu RNA w celu wytworzenia drabiny. Zastosowano tylko kontrole RNA po 0 i 60 minutach, aby upewnić się, że nie dochodzi do degradacji substratu w czasie. (A) Heksameryczne WT i H223A katalityczne martwe Nsp15. (B) Monomeryczny WT i przebieg czasowy Nsp15 martwy katalitycznie H223A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Dane z trzech reprezentatywnych oczyszczań Nsp15 WT (4 l) i katalitycznych (2 l). Wydajność obliczono zarówno dla całkowitego (heksamerycznego + monomerycznego), jak i heksamerycznego Nsp15 w mg oczyszczonego Nsp15 na l wzrostu komórek i na g mokrej masy osadu komórkowego. Średnie zostały obliczone dla każdej jednostki miary. W przypadku mniejszej objętości hodowli oczyszcza się znacznie więcej martwego katalitycznie Nsp15, co podkreśla toksyczne skutki aktywności nukleazy Nsp15.

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.