Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68577

⸱

29 sierpnia 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

W tym artykule

Podsumowanie

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Streszczenie

Escherichia coli jest szeroko stosowana jako system ekspresji do produkcji rekombinowanych białek. Jednak niektóre typy rekombinowanych białek, takie jak nukleazy, mogą być trudne do nadmiernej rekombinacji w E. coli ze względu na ich aktywność enzymatyczną na komórkowym DNA lub RNA. Takie toksyczne efekty mogą prowadzić do powolnego wzrostu i słabej wydajności białka. Jednym z takich przykładów jest endorybonukleaza Nsp15 z koronawirusów: plony gamma-koronawirusa Nsp15 typu dzikiego (WT) są znacznie niższe niż katalitycznie nieaktywnego Nsp15. Aby rozwiązać ten problem, zastosowaliśmy komórki C41(DE3) i kultury starterowe pojedynczej kolonii tego samego dnia, aby pomóc zmniejszyć toksyczność. Rekombinowany Nsp15 zawierający N-końcowy znacznik 6xHhis poddano nadekspresji i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie kobaltu, a następnie chromatografii wykluczania wielkości (SEC). Uzyskana wydajność oczyszczonego białka jest wystarczająca do testów biochemicznych i badań strukturalnych mikroskopii krioelektronowej. Podejście to okazało się skuteczne w łagodzeniu skutków toksycznych i osiąganiu zadowalającej wydajności białka do dalszej analizy badawczej.

Wprowadzenie

Escherichia coli (E. coli) to bakteria szeroko stosowana do produkcji białek rekombinowanych. Liczne zmutowane szczepy, w tym BL21(DE3) i jego pochodne, zostały opracowane do ekspresji docelowych białek1. Proces ten jest zwykle napędzany przez kodowaną polimerazę RNA T7 bakteriofaga i indukowany izopropylo-ß-D1-tiopalaktopyranozydem (IPTG), analogiem laktozy, który aktywuje operon lac poprzez uwolnienie represora lak 1,2,3. Ponieważ nie ulega hydrolizie, następuje ciągła ekspresja mRNA i wyższa produkcja białka3.

Podczas gdy ten typ systemu jest wygodny i spójny dla wielu białek, niektóre typy rekombinowanych białek wywołują toksyczność u E. coli, prowadząc do słabej wydajności białka. Toksyczność wynikająca z obecności rekombinowanego białka negatywnie wpływającego na bakterie może być spowodowana nieszczelnym odciąganiem pokarmu przed indukcją lub stresem dla bakterii po indukcji 3,4. Rezultatem jest zmniejszenie tempa wzrostu i żywotności bakterii5. Tłumienie nieszczelnej ekspresji może odgrywać ważną rolę w skutecznej ekspresji toksycznych białek. Szczepy ekspresyjne E. coli z plazmidami pLysS (tj. BL21(DE3)pLysS, C41(DE3)pLysS itp.) hamują nieszczelną ekspresję poprzez ekspresję lizozymu T7, który hamuje polimerazę T7 przed indukcją 6,7. Inne szczepy, takie jak szczepy C41(DE3) i C43(DE3), zawierają mutacje, które zmniejszają aktywność polimerazy T7 poprzez zmniejszenie jej poziomu mRNA i usuwają proteazy lon i ompT 1,4,8,9,10. Tłumienie nieszczelnej ekspresji lub zmniejszanie tempa produkcji rekombinowanych białek (poprzez regulację polimerazy T7 lub obniżenie temperatury) pomaga zwiększyć wydajność toksycznych białek 1,9.

Nukleazy są często toksycznymi i trudnymi do ekspresji białkami przy użyciu systemu ekspresji E. coli ze względu na ich aktywność enzymatyczną w stosunku do komórkowego DNA lub RNA1. Na przykład endorybonukleaza Nsp15 znajdująca się w koronawirusach i innych nidowirusach jest toksyczna dla bakterii, co skutkuje wolniejszym tempem wzrostu i niskimi plonami 11,12,13,14,15,16,17. Ze względu na swoją rolę katalityczną, rozszczepianie 3' urydyn w wirusowym RNA, uważa się, że Nsp15 działa zarówno na własne, jak i komórkowe mRNA podczas rekombinacji, co powoduje rozregulowanie metabolizmu i ekspresję rekombinowanego białka 11,14. W przypadku Nsp15 oligomeryzacja jest niezbędna do aktywności enzymatycznej. Wcześniejsze badania beta-koronawirusa (takiego jak SARS i SARS-CoV-2) Nsp15 wykazały, że enzym przede wszystkim oligomeryzuje się do homoheksameru w roztworze, przy czym forma monomeryczna jest nieaktywna 16,18,19,20. Po zmutowaniu do tworzenia tylko monomerów zaobserwowano znaczny wzrost wydajności14. Dodatkowo, podczas mutacji jednej z reszt katalitycznych w triadzie katalitycznej do alaniny, zaobserwowano lepszą ekspresję w tych samych warunkach co WT, co dodatkowo potwierdza, że toksyczność Nsp15 dla E. coli jest napędzana przez aktywność nukleazy 13,16,17. W tym protokole pokazujemy różnicę w wydajności między WT gamma-koronawirusem (wirusem zakaźnego zapalenia oskrzeli) Nsp15 a wersją martwą katalitycznie uzyskaną przez mutację jednej z reszt katalitycznej histydyny (H223A).

Tutaj opisujemy krok po kroku metodologię nadekspresji rekombinowanego Nsp15 w systemie ekspresji C41 (DE3), a następnie oczyszczanie białek za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości. Do wyizolowania białka stosuje się N-końcowy 6-krotny znacznik Hisa z chromatografią powinowactwa do immobilizowanych metali na bazie kobaltu (IMAC). Dalsze oczyszczanie odbywa się za pośrednictwem SEC w celu oddzielenia Nsp15 według stanu oligomerycznego i wyizolowania aktywnych gatunków heksameerycznych. Podejście to oferuje metodę nadekspresji i oczyszczania toksycznych nukleaz do badań biochemicznych i strukturalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie buforu i odczynników

  1. Odczynniki do nadekspresji
    1. Przygotować 1 l pożywki 2xTY, łącząc 16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego, 5 g chlorku sodu (NaCl) i 900 ml wody dejonizowanej w kolbie o pojemności 2 l. Kolbę należy sterylizować w autoklawie przez co najmniej 30 minut w cyklu cieczowym.
      UWAGA: Na jedno oczyszczenie potrzebne są co najmniej 2 litry pożywki 2xTY.
    2. Przygotować odpowiedni zapas antybiotyków dla plazmidu. W przypadku Nsp15-pET-14b należy przygotować 15 ml ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml, rozpuszczając 1,5 g ampicyliny w wodzie dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Zapasy antybiotyków należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
    3. Przygotuj 250 ml pożywki agarowej Lysogeny Bulth (LB), łącząc 2,5 g tryptonu, 1,25 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NaCl, 3,75 g agarozy i 250 ml wody dejonizowanej w szklanej butelce o pojemności 500 ml. Wysterylizuj roztwór w autoklawie przez co najmniej 30 minut w cyklu płynnym i ostudzić, aż będzie ciepły w dotyku.
    4. Przygotować płytki agarowe LB uzupełnione ampicyliną, przenosząc 25 ml ciepłego podłoża agarowego LB do wysterylizowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml (25 ml na płytkę, która ma być wykonana). Dodać 25 μl ampicyliny 100 mg/ml na każde 25 ml pożywki i mieszać, aby połączyć zawartość. Za pomocą pipety serologicznej dodać 25 ml mieszaniny pożywek do sterylnej plastikowej szalki Petriego; Unikaj wprowadzania jakichkolwiek bąbelków.
      1. Zapobiegaj zanieczyszczeniu, przecierając stół laboratoryjny 20% etanolem i zapalając palnik Bunsena, aby zachować sterylność podczas nalewania płytek.
      2. Pozostawić płytki do ostygnięcia przed przechowywaniem ich w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
    5. Przygotować 15 ml 1 M IPTG, rozpuszczając 3,574 g IPTG w wodzie dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania, dzieląc je na trzy podwielokrotności po 5 ml.
  2. Odczynniki oczyszczające
    UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być przygotowane co najmniej jeden dzień przed oczyszczaniem
    1. Przygotować 250 ml buforu do lizy (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 5 mM imidazolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować 15 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 250 mM imidazolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
    3. Przygotować 250 ml buforu do rozszczepiania (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
    4. Przygotować 1 l buforu SEC (20 mM HEPES pH7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl 2) i przefiltrować przez filtr PES 0,22 μm za pomocą filtracji próżniowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C z FPLC.
    5. Przygotować 15 ml 1 M chlorowodorku fluorku 4-(2-aminoetylo)benzenesulfonylu (AEBSF), rozpuszczając 3,595 g AEBSF w wodzie dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przygotować 1 ml porcji w 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
    6. Opcjonalnie: Przygotować główną mieszankę buforową z dodecylosiarczanem sodu (SDS) w żelu, rozcieńczając 200 μl roztworu podstawowego (250 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego, 40% glicerolu, 100 mM DTT) w 400 μl wody dejonizowanej.
    7. Przygotuj probówki z próbkami żelu, aby śledzić oczyszczanie. Przenieś 30 μl 1x buforu ładującego do każdej probówki.
    8. Przygotuj 1 l 10x buforu do biegania Tris-Glycine, rozpuszczając 30 g zasady Tris, 144 g glicyny i 20 g SDS w 1000 ml wody dejonizowanej. Aby uzyskać 1x roztwór, rozcieńczyć 100 ml 10x roztworu w 900 ml dejonizowanej wody w butelce o pojemności 1 l. Oba odczynniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia.

2. Nadekspresja Nsp15

UWAGA: Wszystkie odczynniki i materiały powinny być utrzymywane w jak największej sterylności, aby zapobiec ryzyku zanieczyszczenia.

  1. Przekształcenie
    1. Usunąć komórki E. coli C41(DE3) z temperatury -80 °C do rozmrożenia przez 10 minut na lodzie. Pobrać pipetą 1 μl plazmidowego DNA do probówki zawierającej komórki C41. Pozwól mu inkubować, siedząc na lodzie przez 30 minut.
      UWAGA: Chociaż stężenia plazmidów mogą się różnić, dla danych opisanych tutaj dodano 10-20 ng DNA na transformację. Protokół handlowy dla komórek C41(DE3) zaleca 10-50 ng DNA na transformację. Protokół ten ma zastosowanie do każdego plazmidu wykorzystującego układ promotora T7; jednak w tym przypadku wcześniej opublikowany Nsp15 kodujący plazmid pET14b zoptymalizowany pod kątem kodonu, z miejscem TEV po N-końcowym znaczniku 6xHhis i miejscu rozszczepienia trombiny, został zmodyfikowany przez zastąpienie SARS-CoV-2 Nsp15 sekwencją IBV Nsp15 (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. Umieścić probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 42 °C na 45 s, aby wstrząsnąć cieplnie komórki w celu wychwycenia plazmidów. Inkubować probówkę na lodzie przez 2 minuty.
    3. Odpipetować 200 μl pożywki regeneracyjnej (SOC lub innej pożywki bogatej) do probówki zawierającej komórki C41(DE3) i plazmidy. Wytrząsać przy 210 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Wyjąć płytki agarowe LB z dodatkiem ampicyliny z 4 °C i umieścić w niewstrząsającym inkubatorze ustawionym na 37 °C.
    5. Odpipetuj bakterie na płytce agarowej. Za pomocą sterylnego rozsiewacza rozprowadź komórki na płytce agarowej. Umieść płytkę w niewstrząsającym inkubatorze ustawionym na 37 °C, aby rosła przez 14-16 godzin.

3. Wzrost

  1. Zbieranie pojedynczych kolonii
    UWAGA: Użyto starterów pojedynczej kolonii tego samego dnia zamiast nocnej kultury starterowej w celu zaszczepienia komórek w logarytmicznej fazie wzrostu. W przypadku hodowli nocnych komórki są zazwyczaj w fazie stacjonarnej lub śmierci, zwłaszcza w przypadku toksycznych białek. Dodatkowo, biorąc pod uwagę dłuższy czas hodowli, zanieczyszczenia lub mutanty mogą konkurować z toksyczną nukleazą.
    1. Użyć jednej wysterylizowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 50 ml na każdy litr kultury oraz 2-3 dodatkowe startery. Oznaczyć jedną z kolb gwiazdką do kontroli gęstości optycznej (OD). OD pobrany z tej kolby będzie reprezentował cały wzrost, chyba że istnieje wizualna różnica między kolbami.
      UWAGA: Stwierdzono, że kolby Erlenmeyera zapewniają lepsze napowietrzenie niż probówki startowe o pojemności 15 ml.
    2. Stworzyć główną mieszankę 2xTY plus odpowiednie antybiotyki, używając objętości 10 ml x N liczby starterów. Aby uzyskać wzrost o pojemności 4 litrów, przygotuj 6 kultur starterowych. Mieszanka wzorcowa składałaby się z 60 μl ampicyliny (rozmrożonej w temperaturze -20 °C) i 60 ml 2xTY (rozcieńczenie 1:1000). Mieszać do wymieszania i podaszkować 10 ml do każdego Erlenmeyera.
    3. Wyjąć przekształconą płytkę z inkubatora. Zerwij pojedynczą, izolowaną kolonię z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety. Przenieś wykałaczkę z kolonią do kolby z podłożem. Powtarzaj, aż każda kolba będzie zawierała wykałaczkę.
    4. Umieścić zaszczepione kolby startowe w inkubatorze do wytrząsania z prędkością 210 obr./min, 37 °C. Pozostawić kolby startowe do wzrostu przez ~5-7 godzin.
  2. Inokulacja kultur
    1. Po 5 godzinach sprawdzić średnicę zewnętrzną przy 600 nm (OD600) kolby oznaczonej gwiazdą za pomocą mikrokuwety i spektrometru. Wyjąć i przenieść 1 ml kultury z kolby do mikrokuwety. Powtarzaj pomiary okresowo, aż OD600 osiągnie 0,8-1,0.
    2. 30 min do 1 h przed inokulacją (gdy OD600 osiąga 0,4), ogrzać 2 L kolby 2xTY w temperaturze 37 °C. Ciepłe podłoże skraca czas opóźnienia po inokulacji kulturą starterową.
    3. Rozmrozić zapas ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml w temperaturze od -20 °C. Po osiągnięciu docelowego OD600 przygotować cztery 2-litrowe kolby z 1 litrem pożywki 2xTY, dodając 1 ml ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml (rozcieńczenie 1:1000).
    4. W celu zaszczepienia należy wlać zawartość jednej kolby startowej do jednej kolby o pojemności 2 l. Powtarzać tę czynność, aż każda kolba o pojemności 2 litrów zostanie zaszczepiona. Unikaj wlewania wykałaczki do kolby, aby ułatwić zbieranie komórek.
    5. Umieścić zaszczepione kolby o pojemności 2 l w inkubatorze z wytrząsaniem przy 210 obr./min, 37 °C na 3 godziny przed sprawdzeniem pierwszego OD600.
  3. Indukcja za pomocą IPTG
    1. Sprawdzić średnicę zewnętrzną600 , usuwając 1 ml pożywki z kolby za pomocą pipety serologicznej. Powtarzaj, aż OD600 osiągnie 0,8-1,0.
    2. Po osiągnięciu docelowego OD600 dodać 1 ml 1 M IPTG dla końcowego stężenia 1 mM (rozmrożonego od -20 °C) w celu wywołania nadekspresji.
    3. Przenieść kolby o pojemności 2 l do inkubatora z wytrząsaniem przy 210 obr./min, 16 °C w celu indukcji przez noc (14-16 godzin).
      UWAGA: Niższa temperatura spowolni wzrost komórek E. coli , zmniejszając toksyczność poprzez spowolnienie produkcji białek i aktywności nukleazy.
  4. Żniwa
    1. Wyjąć indukowane kolby z inkubatora do wytrząsania i wlać zawartość do oddzielnych butelek wirówkowych o pojemności 1 l. Zrównoważ butelki za pomocą wody dejonizowanej. Wirować komórki w temperaturze 4500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć sklarowany osad i przenieść osad do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą szpatułki. Połącz granulki w jedną stożkową rurkę. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

4. Oczyszczanie Nsp15

UWAGA: Wszystkie i probówki powinny być trzymane na lodzie. Wszystkie etapy wirowania powinny być przeprowadzane w temperaturze 4 °C. Poniższy protokół zakłada białko znakowane przez Hisa.

OPCJONALNIE: Po każdym etapie można pobrać próbki żelu, aby śledzić postęp oczyszczania.

  1. Liza komórek i klarowanie lizatu
    1. Zawiesić osad bakteryjny, dodając 2 ml buforu do lizy na każde 1,2 g osadu. Dodać 100 μl 1 M AEBSF na każde 10 ml buforu do lizy jako inhibitora proteazy. W przypadku stosowania kombinowanego osadu o pojemności 4 litrów, dodać 100 μl DNazy I, aby uzyskać końcowe stężenie 200 U.
      UWAGA: Jedna tabletka koktajlowa inhibitora proteazy wolna od EDTA na litr może być zastąpiona jako inhibitor proteazy.
    2. Krótko wirować zawartość probówki przez 30 s, aby umożliwić wymieszanie się osadu i buforu. Przenieś wirowany granulat do młynka do tkanek Dounce. Za pomocą luźnego tłuczka homogenizuj zawartość (~10 uderzeń).
    3. Przenieść homogenizowaną próbkę do metalowej zlewki w celu sonikacji.
      1. Aby upewnić się, że uzyskano maksymalną próbkę, przepłucz probówkę zawierającą oryginalny osad 5 ml buforu do lizy i krótko przekręć probówkę. Wlej zawartość do homogenizatora Dounce, zastosuj ~5 pociągnięć, a następnie przenieś do zlewki sonikacyjnej.
    4. Do metalowej zlewki dodać 75 μl Triton X-100, aby wspomóc lizę błony i solubilizację. Umieść metalową zlewkę w łaźni lodowej, aby upewnić się, że próbka pozostaje zimna podczas sonikacji.
    5. Umieścić sondę soniczną w metalowej zlewce i sonikować próbkę przez 6 minut i 30 s z impulsami co 2 s i amplifikacją na poziomie 70%.
      UWAGA: Używaj ochronników słuchu, jeśli sonda sonikatora nie jest dołączona.
    6. Za pomocą pipety serologicznej przenieść lizat do probówki wirówkowej. Do tej samej probówki dodać 1 M AEBSF w rozcieńczeniu 1:100 jako świeży inhibitor proteazy. Klarować lizat przez odwirowanie w stężeniu 26,915 x g przez 50 min.
  2. Chromatografia powinowactwa metodą filtracji grawitacyjnej
    UWAGA: Żywica kobaltowa znacznie zmniejsza ilość niespecyficznych spoiw metalowych w porównaniu z żywicą niklową21.
    1. Podczas sonikacji uzyskać 2 ml zawiesiny żywicy kobaltowej i ponownie zawiesić z 25 ml buforu do lizy w nowej stożkowej probówce. Odwirować zawieszoną żywicę przez 5 minut przy 500 x g. Po odwirowaniu odleć supernatant, uważając, aby nie stracić żywicy.
    2. Powtórzyć z dwoma oddzielnymi płuczkami buforu do lizy o pojemności 25 ml, a następnie odwirować. Nie wylewać supernatantu z ostatniego prania, dopóki nie będzie gotowy do wiązania partiami. Gdy będzie gotowy, wylej bufor do lizy z ostatniego płukania żywicą i ponownie zawieś żywicę z 10 ml świeżego buforu do lizy (10 ml buforu na 1 ml żywicy).
    3. Dodaj rozpuszczalną frakcję do probówki i pozwól, aby 6 razy oznaczone białkiem Hisa związało się z żywicą na wahaczu przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli objętość wiązania wsadowego przekracza 50 ml, wykonaj ten krok w zlewce o pojemności 250 ml z mieszadłem z bardzo małą prędkością w temperaturze 4 °C. Przenieś całą żywicę do zlewki podczas wykonywania tego etapu za pomocą buforu do lizy.
    4. Po związaniu partii wlać zawartość do grawitacyjnej kolumny filtracyjnej i zebrać przepływ w kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Zawartość kolby powinna być białkiem, które nie wiąże się z żywicą; Oznaczony przez niego Nsp15 zostanie związany z żywicą. Używając oddzielnej kolby do zbierania, przemyć żywicę buforem o pojemności 8 x 25 ml w sumie co najmniej 200 ml (~5x pierwotna objętość) za pomocą pipety serologicznej.
      UWAGA: Powoli dodawaj bufor po boku kolumny, a nie bezpośrednio po środku, aby zapobiec naruszeniu złoża żywicy, co może prowadzić do nieefektywnego lub nierównomiernego mycia.
  3. Elucja białek
    1. Eluować znakowany przez Hisa Nsp15 w trzech elucjach z buforem elucyjnym. Elutiony 1 i 2 to 2 ml elucji, a elucja 3 to 1 ml elucji.
    2. Wykonaj "szybki i brudny" test Bradforda, rozcieńczając odczynnik Bradforda w wodzie w stosunku 1:1. Przenieść 10 μl każdej elucji do probówek i odwrócić w celu wymieszania. Roztwór powinien zmienić kolor na niebieski w obecności białka. Oceń zmianę koloru, aby określić, jak łączyć elucje.
      UWAGA: Jeśli elucja 1 i 2 jest silna, a elucja 3 jest słaba, połącz elucjacje 1 i 2 i kontynuuj. Jeśli wszystkie są słabe, połącz wszystkie trzy rurki.
  4. Koncentracja białka i rozszczepienie znacznika
    1. Przenieść połączoną próbkę elucji do koncentratora MWCO o mocy 30 kD (lub o odpowiedniej wielkości dla białka będącego przedmiotem zainteresowania). Skoncentrować białko do ≤2 ml przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 minut. Przenieść zagęszczoną próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. W razie potrzeby zwiększyć końcową objętość próbki do 2 ml za pomocą buforu rozszczepiającego.
    2. Przygotuj jednorazową kolumnę odsalającą (np. kolumnę PD-10) zgodnie ze wskazówkami producenta. Dodaj próbkę o objętości 2 ml do kolumny. Umieścić kolumnę w czystej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i eluować przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty.
      UWAGA: Ten krok szybko usuwa imidazol, który zakłóca rozszczepianie trombiny, unikając agregacji wywołanej stężeniem podczas stosowania koncentratorów MWCO do buforowania wymiany.
    3. Do eluatu dodać β-Me i CaCl2 do końcowego stężenia 2 mM każdy. Dodać 50 μl wywaru trombinowego o stężeniu 1 μl. Po dodaniu wszystkich składników umieścić probówkę na wytrząsarce w pozycji pionowej i pozostawić reakcję do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając.
      UWAGA: Nocne rozszczepienie w temperaturze 4 °C może działać w przypadku niektórych białek; poprawę wydajności Nsp15 zaobserwowano przy 4-godzinnym rozszczepieniu w temperaturze pokojowej w porównaniu z rozszczepieniem w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Ponownie wyrównać kolumnę filtracji grawitacyjnej w buforze rozszczepiającym (przemyć 3x 25 ml buforem rozszczepiającym). Upewnij się, że kurek odcinający jest zamknięty i dodaj 5 ml buforu do rozszczepienia, aby zapobiec wysychaniu żywicy. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C w okresie łupania.
  5. Oddzielanie rozszczepionego białka od rozszczepionego His-tag i nierozszczepionego białka
    1. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie odpipetować reakcję rozszczepienia bezpośrednio na żywicę i zebrać eluat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Przemyj żywicę 2 ml buforu do rozszczepienia i zbierz w tej samej probówce o pojemności 15 ml. Powtórz w sumie dwa prania. Po zakończeniu dodać AEBSF do probówki, aby ugasić trombinę w celu uzyskania końcowego stężenia 10 mM.
    3. Przenieść próbkę ponownego przejścia do nowego koncentratora MWCO o mocy 30 kD. Zagęścić białko do ≤500 μl przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 min. Przenieść zagęszczoną próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
  6. Chromatografia wykluczania wielkości
    1. Uruchomić kolumnę analityczną S200 zwiększającą (lub inną kolumnę o odpowiednim rozmiarze dla białka będącego przedmiotem zainteresowania) zgodnie ze specyfikacjami producenta. Zrównoważyć w buforze SEC i ustawić wielkość frakcji FPLC na 500 μL.
    2. Przenieś wybrane probówki frakcji z pików do nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dodaj 2,5 μl 1 M DTT (stężenie końcowe 5 mM) do każdej frakcji, aby utrzymać oczyszczony Nsp15 na niskim poziomie.
    3. Zmierzyć wartości A280 każdej frakcji za pomocą nanospektrofotometru. Opróżnij przyrząd buforem SEC przed pobraniem pomiarów. Oczyszczone próbki Nsp15 należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  7. Opcjonalnie: Kontrola oczyszczania
    1. Podgrzewać probówki z próbkami żelu na bloku grzewczym o temperaturze 95 °C przez 10 minut. Po podgrzaniu krótko odwirować probówki, aby odwirować kondensację. Załaduj próbki do 4-20% bezplamistego żelu Mini-Protean TGX i pracuj pod napięciem 300 V przez 17 minut. Zobrazuj żel/żele, aby sprawdzić czystość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ze względu na toksyczność Nsp15 jako nukleazy, zwykle potrzeba łącznie ~7 godzin, aby kultury starterowe osiągnęły OD600 0,8-1,0. Po zaszczepieniu, w sumie ~3-5 godzin było zwykle wymagane dla tego samego optymalnego OD600 0,8-1,0 do indukcji. W tym przypadku czas podwojenia wynosił ~1 h. Kiedy katalitycznie martwy mutant Nsp15 uległ ekspresji, podwojenie komórek E. coli wydawało się normalne (~ 20 min), co jest kolejnym dowodem na to, że aktywność nukleazy jest odpowiedzialna za toksycznoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy szczegółowy protokół, który skutkuje udaną nadekspresją toksycznego nukleazy w E. coli i oczyszczeniem za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczenia wielkości. Wdrożenie 10 ml kultur starterowych pojedynczej kolonii tego samego dnia zamiast kultur starterowych przez noc zwiększyło spójność czasu wzrostu i wydajności białka we wszystkich wzrostach. Zdecydowaliśmy się użyć komórek C41 (DE3), które zawierają mutacje zmniejszające aktywność polimerazy T7, aby pomóc w radzeniu sobie z toksycznoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana przez College of Charleston School of Natural and Environmental Sciences w ramach finansowania start-upów, College of Charleston Undergraduate Research and Creative Activities Summer Undergraduate Research with Faculty Grant oraz SC INBRE DRP Sub-Award od P20GM103499.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m PES - Sterylizacja , Niskie wiązanie białek, System filtracyjny, 1 LCorning431098
Inhibitor proteazy serynowej AEBSFŻyciorys30827-99-7
Agar bakteriologicznyAmresco (angielski)Zobacz materiał J637
Ä System oczyszczania KTA goCytiva (Cytiwa)29383015
Koncentrator Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa MWCOMiliporyUFC903024
Ampicylina sodowaŻyciorysA-301-25
Kolby wstrząsowe z przegrodamiNalgene F0527 powiedział:
Wirówka stołowaEppendorf 5920R
BioPhotometer plusEppendorf powiedział:E-BP6132
Trombina bydlęcaBioPharm91-030
Odczynnik do barwników BradfordProdukty biologiczne BostonProcesor BPA-200
Błękit bromofenolowySigma-Aldrich114931
Chlorek wapniaSigma-AldrichZobacz materiał C4901
Cyfrowa sucha kąpielBio Rad1660562
Rozsiewacze jednorazowe, w kształcie litery LPartnerzy MedSupply62-1014-1
DitiotreitolŻyciorys27565-41-9
DNaza z trzustki bydłaSigma-AldrichZobacz materiał D4527
Młynek do tkanek Douce, 40 mlWheaton357546
Kolumny chromagtografii ekonomicznejBio-Rad737-1532
Mieszalnik nutacyjny Enduro minimixLabnetZobacz materiał S0600 powiedział:
EtanolSigma-Aldrich459844
Wytrząsarka Excella E25R Inc/RefEppendorf powiedział:NB-E25R
FastPette V2LabnetZobacz materiał P2000
Wirnik stałokątowy Fiberlite F10-4x1000 LEXThermo Fisher Naukowy096-041075
Wirnik stałokątowy Fiberlite F21-8x50yThermo Fisher Naukowy096-084275
Żel Doc EZ ImagerBio-Rad1708270
GlicerolSigma-AlrichZobacz materiał G5516
GlicynaBio-Rad161-0718
HEPESYSigma-AldrichH3375 powiedział:
Mieszadło z płytą grzejnąFirma VWR12365-346
Kwas solnyFirma VWRBDH3028
ImidazolŻyciorysI-902-25
Izopropylo-ß-D-tiogalaktiozyd (IPTG)ŻyciorysNumer katalogowy: 12481C25
Kompetentne komórki E. coli Lemo21(DE3)Laboratoria biologiczne w Nowej AngliiZobacz materiał C2528J
Chlorek manganu(II) czterowodnySigma-AldrichZobacz materiał M3634
Probówki do mikrowirówek, 0,5 mlFirma VWR87003-290
Probówki do mikrowirówek, 1,7 mlPartnerzy MedSupply15-1151
Probówki do mikrowirówek, 2 mlAxygen (Axigen)MCT-200-C (Przekaźnik MCT-200-C)
Pionowe ogniwo elektroforetyczne Mini-PROTEAN tetraBio-Rad10025025
Mini-Protean Tris-glicynowe żele, 4-20%Bio-Rad4568094
Mini wirówka MyFugePartnerzy MedSupplyZobacz materiał C1008-B
Butelka wirówkowa Nalgene 1 L o dużej prędkościThermo Fisher Naukowy3141-1006
Probówka wirówkowa z dębu dębowego NalgeneThermo Fisher Naukowy31139-0050
NanofotometrImplen3769
Inkubator niewstrząsającyLabnetI 5110 
Nadekspresja C41(DE3) chemicznie kompetentne komórkiTechnologie biosearch60442-1
Nadekspresja C41(DE3) chemicznie kompetentne komórkiSigma-AldrichCMC0017Przerwać; Alternatywą są komórki Biosearch C41(DE3) lub komórki NEB Lemo21
Szalki PetriegoPartnerzy MedSupply62-1077-3
Plazmidy (szkielet pET-14b)Język GenscriptNa zamówienie
Mikrokuwety plastikoweFisher Naukowy14955127
Zasilacz uniwersalny PowerPacBio-Rad1645070
Precyzyjna igła ślizgowaBectona Dixona305198
Precyzja i niebarwione wzorce białkoweBio-Rad1610363
Podłoże odzyskowe do odciągania pokarmu Sigma-AldrichCMR0001K
Wirnik łyżki wahliwej S-4x1000Eppendorf powiedział:EP-S4X1
Pipeta serologiczna, 10 mlFaclon357551
Pipeta serologiczna, 25 mlFaclon35725
Pipeta serologiczna, 5 mlFaclon35743
Pipeta serologiczna, 50 mlPr1ma powiedział:PR-Sero-50
Chlorek soduSigma-AldrichNumer katalogowy S9888 powiedział:
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich567530
Dysmembrator sonicznyFisher NaukowyZobacz materiał FB505
Wirówka Sorvall Lynx 4000Thermo Fisher Naukowy75006580
Kolumna Spephadex G-25 M PD-10Cytiva (Cytiwa)17085101
ß-MerkaptoetanolMilipory444203
Zlewka Griffin ze stali nierdzewnejWyroby polarne13977-010-EA
Sterylne probówki Falcon, 15 mlSokół352097
Sterylne probówki Falcon, 50 mlSokół352098
Kolumna Superdex 200 10/300 GLCytiva (Cytiwa)28990944
Strzykawki, 1 mlPowietrze-Tite Klasa A1
Strzykawki, 3 mlBectona Dixona309657
Żywica o powinowactwie do metalu TALONTakara635503
WykałaczkiUlica KreatywnościPAC3690-01
Baza TrisŻyciorysT-400-1
Tryton X-100MP Biomedycyna807423
TryptonMiędzynarodowe produkty badawczeZobacz materiał T60065 TGL
Vornado powiedział:Punkt odniesieniaBV101-G
Ekstrakt drożdżowyMiędzynarodowe produkty badawczeRok 20025

Bibliografia

  1. Francis, D. M., Page, R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).
  2. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).
  3. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).
  4. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  5. Kato, Y. Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production. Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).
  6. Dubendorf, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  7. Studier, F. W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).
  8. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  9. Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields. Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).
  10. James, J., et al. Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance. Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).
  11. Shi, Y., et al. A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11. J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).
  12. Nedialkova, D. D., et al. Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease. J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).
  13. Zhao, J., et al. Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation. J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).
  14. Joseph, J. S., et al. Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch. J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).
  15. Xie, Y., et al. Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence. Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).
  16. Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation. J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).
  17. Xu, X., et al. New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15. J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).
  18. Bhardwaj, K., et al. Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15. J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).
  19. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 12 (1), 636(2021).
  20. Kim, Y., et al. Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2. Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).
  21. Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle. Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).
  22. Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease. Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).
  23. Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification. Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).
  24. Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).
  25. Godoy, A. S., et al. Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).
  26. Otter, C. J., et al. SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).
  27. Wang, X., Zhu, B. SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).
  28. Zheng, A., et al. Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer. J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).
  29. Huang, T., et al. Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation. J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).
  30. Zhang, L., et al. Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).
  31. Jernigan, R. J., et al. Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser. Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).
  32. Ricagno, S., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus. Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).
  33. Canal, B., et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease. Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).
  34. Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor. J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).
  35. De Marco, A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Nadprodukcja białkachromatografia powinowactwachromatografia wykluczania cząsteczkowegooczyszczanie białka Nsp15ekspresja białek rekombinowanychkriomikroskopia elektronowatest cięcia RNAusuwanie znacznika His
Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.