Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wielopoziomowa mikrodysekcja i profilowanie funkcjonalno-strukturalne gałęzi tętniczych ludzkiego nerki

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68579

⸱

5 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

W tym artykule

Podsumowanie

W artykule przedstawiono krok po kroku protokół izolacji i oceny funkcjonalnej ludzkich gałęzi tętnic nerkowych, ułatwiający badania przedkliniczne w celu opracowania farmaceutycznego.

Streszczenie

Dysfunkcja naczyń nerkowych odgrywa kluczową rolę w patogenezie wielu stanów klinicznych, w tym ostrego uszkodzenia nerek, niedokrwienia nerek i nadciśnienia, stanowiąc poważne wyzwania w postępowaniu klinicznym i niekorzystnie wpływając na wyniki pacjentów. Izolacja i charakterystyka funkcjonalna tętnic wewnątrznerkowych mają kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji naczyń nerkowych, szczególnie związanych z uszkodzeniem nerek, oraz ukierunkowania ukierunkowanego rozwoju terapeutycznego. Pomimo znaczenia klinicznego, ustandaryzowane podejścia do izolacji i funkcjonalnej oceny ludzkich tętnic wewnątrznerkowych na różnych poziomach rozgałęzień pozostają słabo rozwinięte. Protokół ten zapewnia kompleksowe ramy dla systematycznej izolacji i multimodalnej oceny wewnątrznerkowych odgałęzień tętniczych, obejmujących oceny funkcjonalne i strukturalne zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Metodologia obejmuje trzy kluczowe elementy: (1) precyzyjną anatomiczną identyfikację i mikrodysekcję tętnic wewnątrznerkowych z nerek dawcy, której towarzyszy barwienie hematoksyliną-eozyną (H&E) w celu potwierdzenia strukturalnego; (2) rygorystyczne procedury normalizacji w miografii drutowej w celu zwiększenia odtwarzalności i wiarygodności pomiarów; oraz (3) analiza ilościowa odpowiedzi naczynioruchowych przy użyciu precyzyjnych technik miografii drucianej. Normalizacja opiera się na zależności długości mięśnia od napięcia, w której przyrostowe rozciąganie odcinków tętnic ustanawia optymalne napięcie spoczynkowe, aby zmaksymalizować nakładanie się aktyny i miozyny, wywołując w ten sposób szczytowe reakcje skurczowe. W miografii drutowej izolowane segmenty naczyń są zawieszone między dwoma równoległymi drutami, co umożliwia precyzyjny pomiar napięcia naczyniowego. Dzięki zastosowaniu rygorystycznych protokołów normalizacji technika ta umożliwia powtarzalną i wiarygodną ocenę ilościową reaktywności naczyń krwionośnych w różnych stanach patofizjologicznych i interwencjach farmakologicznych.

Wprowadzenie

Nerka jest ważnym narządem odpowiedzialnym za utrzymanie homeostazy człowieka poprzez usuwanie produktów przemiany materii, równowagę elektrolitową i regulację płynów - funkcje, które wymagają wyjątkowo wysokiego przepływu krwi. W warunkach fizjologicznych nerki otrzymują około 25% całkowitej objętości krwi pompowanej przez serce co minutę (pojemność minutowa serca), co podkreśla ich istotną rolę w ogólnoustrojowym przepływie krwi i krytyczne znaczenie perfuzji nerkowej w utrzymaniu ogólnej równowagi fizjologicznej1. Układ tętniczy nerkowy precyzyjnie reguluje ten masywny dopływ krwi w celu utrzymania GFR, jednocześnie dostosowując się do ogólnoustrojowych zmian hemodynamicznych. W związku z tym upośledzenie perfuzji nerek stanowi krytyczny mechanizm patologiczny, który przyczynia się do zmniejszenia współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) w stanach takich jak ostre uszkodzenie nerek i niedokrwienie nerek. Ponadto często występuje wtórnie do zaburzeń ogólnoustrojowych, które upośledzają przepływ krwi przez nerki, w tym wstrząsu, dysfunkcji serca i sepsy 2,3,4,5. Tętnica nerkowa ulega sekwencyjnemu rozgałęzianiu w nerce, najpierw dzieląc się na tętnice międzypłatowe, które przebiegają przez kolumny nerkowe między piramidami rdzeniowymi. Po dotarciu do połączenia korowo-rdzeniowego naczynia te powodują powstanie łukowatych tętnic, które wyginają się w łuk wzdłuż granicy między korą a rdzeniem. Z tych krzywoliniowych naczyń wyłaniają się tętnice międzyzrazikowe, które wnikają promieniście w miąższ korowy, ostatecznie dostarczając krew do naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych przez tętniczki doprowadzające w celu perfuzji poszczególnych nefronów 1,6,7. Tętnice międzypłatowe, łukowate i międzyzrazikowe stanowią kluczowe unaczynienie oporowe w nerkach, służąc jako podstawowe regulatory hemodynamiki wewnątrznerkowej i kontroli ciśnienia 1,8. Precyzyjna izolacja i charakterystyka tych naczyń mają kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia podstawowych mechanizmów rządzących homeostazą perfuzji nerkowej9. Co więcej, ich niejednorodna reaktywność naczyniowa w różnych stanach patofizjologicznych stanowi strategiczne ramy dla opracowania nowych środków rozszerzających naczynia krwionośne o potencjale ochronnym dla nerek10,11.

Obecnie techniki obrazowania klinicznego (np. ultradźwięki) są rutynowo stosowane do monitorowania zmian przepływu krwi w nerkach; Jednak metodologie eksperymentalne w badaniach podstawowych do bezpośredniej oceny napięcia naczyniowego nerek, kluczowego czynnika determinującego perfuzję nerek, pozostają ograniczone 12,13,14,15. System miografii drucianej jest ugruntowaną platformą eksperymentalną, która mierzy zmiany napięcia w małych tkankach biologicznych in vitro, w tym w naczyniach krwionośnych, tchawicy 16,17,18, o średnicach od 50 μm do 10 mm 16,19,20 . Chociaż miografia drutowa jest szeroko stosowana w badaniach na zwierzętach, międzygatunkowe różnice w strukturze i funkcji naczyń krwionośnych ograniczają zakres, w jakim naczynia krwionośne gryzoni mogą reprezentować fizjologię naczyń krwionośnych człowieka21. W związku z tym precyzyjna identyfikacja i izolacja ludzkich tętnic wewnątrznerkowych na różnych poziomach anatomicznych (międzypłatowych, łukowatych i międzyzrazikowych) ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia kompleksowych badań in vitro nad ich właściwościami fizjologicznymi, a także związanymi z chorobą zmianami funkcjonalnymi i patologicznymi mechanizmami uszkodzeń. W połączeniu z interwencjami farmakologicznymi z wykorzystaniem różnych związków wazoaktywnych, system ten pozwala na dynamiczną ocenę i ilościowe rejestrowanie odpowiedzi na zwężenie/rozszerzenie naczyń krwionośnych w izolowanych pierścieniach tętniczych, zapewniając potężne narzędzie do badania reaktywności naczyń w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych 19,22,23.

Protokół ten szczegółowo opisuje kompleksową metodologię precyzyjnej lokalizacji anatomicznej i mikrodysekcji ludzkich gałęzi tętnic wewnątrznerkowych (tętnic międzypłatowych, łukowatych i międzyzrazikowych), a następnie charakterystykę funkcjonalną przy użyciu systemu monitorowania napięcia naczyniowego in vitro w celu oceny ich zróżnicowanej reaktywności na leki wazoaktywne, ustanawiając w ten sposób zarówno strukturalne, jak i funkcjonalne różnice między tymi segmentami naczyń krwionośnych. Łącząc lokalizację anatomiczną z profilowaniem reaktywności farmakologicznej i analizą histopatologiczną, tworzymy platformę ex vivo , która umożliwia kompleksową ocenę specyficznych dla regionu odpowiedzi naczyniowych na czynniki wazoaktywne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisany tutaj protokół i przykłady zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Oddział Urologii Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego (nr zatwierdzenia 2023yan500-002) i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed uczestnictwem.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować roztwór Krebsa-Ringera (Krebs) zawierający 119,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2, 25,0 mM NaHCO3, 1,2 mM KH2PO4 i 11,0 mM D-glukozy o pH 7,4.
  2. Przygotować roztwór soli o wysokiej zawartości potasu (60K+) zawierający 64,0 mM NaCl, 60 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2, 25,0 mM NaHCO3, 1,2 mM KH2PO4 i 11,0 mM D-glukozy o pH 7,4.

2. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Leki należy przechowywać zgodnie z danymi podanymi w Karcie Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS) natychmiast po ich otrzymaniu.

  1. Przygotować fenylefrynę (Phe, 10-1 M w magazynie) rozpuszczając 167,21 mg fenylefryny w 10 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -80 °C, rozcieńczyć do 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M jako stężenie robocze w dniu użycia.
  2. Przygotować acetylocholinę (ACh, 10-2 M w magazynie), rozpuszczając 18,166 mg acetylocholiny w 10 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -80 °C, rozcieńczyć do 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M jako stężenie robocze w dniu użycia.

3. Pobranie tkanki nerkowej i izolacja tętnicy śródnerkowej

  1. Rekrutacja dorosłych pacjentów z rozpoznaniem raka nerkowokomórkowego, potwierdzonego histologicznie przez przedoperacyjną biopsję gruboigłową lub śródoperacyjne zamrożone cięcie.
    UWAGA: Pacjenci zaplanowani do radykalnej nefrektomii są specjalnie wybierani, ponieważ ich próbki chirurgiczne zapewniają dostęp do nienaruszonych wewnątrznerkowych odcinków tętnic położonych dystalnie do brzegów guza. Segmenty te można precyzyjnie wypreparować i wyizolować, co pozwala na szczegółowe badanie fizjologii naczyń nerkowych człowieka bez ingerencji ze strony złośliwej tkanki. Potwierdzenie histologiczne zapewnia dokładną identyfikację raka i wyraźne wytyczenie granic guza, ułatwiając wybór normalnych, wolnych od guza odcinków tętnic do badań eksperymentalnych.
    1. Wykluczenie pacjentów ze znacznymi chorobami współistniejącymi (nadciśnienie, cukrzyca lub inne choroby ogólnoustrojowe), aby uniknąć zakłócającego wpływu na czynność naczyń krwionośnych, zwiększając w ten sposób wiarygodność i trafność ocen fizjologicznych.
      UWAGA: Próbki do tego eksperymentu zostały pobrane od pacjentów, u których zaplanowano radykalną nefrektomię w Pierwszym Szpitalu Uniwersytetu Pekińskiego.
  2. Podczas radykalnej nefrektomii należy pobrać świeżo wycięte próbki nerki ludzkiej i natychmiast zanurzyć je w lodowatym roztworze Krebsa, aby zachować żywotność tkanek. Tylko makroskopowo normalnie wyglądające obszary dystalne do brzegów guza są zachowywane do rozwarstwienia tętnicy (ryc. 1A).
    UWAGA: W celu optymalnej izolacji tętnicy wewnątrznerkowej, sąsiednie zdrowe tkanki powinny być pobierane jako klin korowo-rdzeniowy o pełnej grubości podczas radykalnej nefrektomii, zachowując w ten sposób całe drzewo tętnicze od kory do unaczynienia rdzeniowego.
    1. Wyciętą tkankę należy natychmiast przechowywać w 200 ml zimnego roztworu Krebsa. Umieść pojemnik na lodzie i przetransportuj go w izolowanej torbie chłodzącej do laboratorium w ciągu 2 godzin od pobrania. Upewnij się, że tkanka pozostaje całkowicie zanurzona przez cały transport, aby zachować żywotność i integralność strukturalną do późniejszej sekcji i analizy funkcjonalnej.
      UWAGA: Aby utrzymać żywotność tkanek i funkcje fizjologiczne, cały proces izolacji, a następnie przechowywania w roztworze Krebsa w temperaturze 4 °C powinien zostać zakończony w ciągu 6 godzin 24,25,26,27. Roztwór powinien być regularnie wymieniany podczas zabiegów, aby utrzymać natlenienie i żywotność tkanek, jednocześnie ułatwiając usuwanie składników krwi ze światła naczyniowego.
  3. Wizualnie zidentyfikuj płaszczyznę koronalną, lokalizując wnękę nerki i wyrównując cięcie tak, aby przechodziło zarówno przez miedniczkę nerkową, jak i boczną wypukłą granicę. Za pomocą sterylnego skalpela przetnij nerkę wzdłuż płaszczyzny koronalnej, aby uzyskać dwie symetryczne połówki. Takie podejście odsłania architekturę wewnętrzną, w tym piramidy i kolumny nerkowe, ułatwiając dokładną identyfikację, a następnie rozwarstwienie tętnic wewnątrznerkowych (ryc. 1A).
    UWAGA: Aby ułatwić oddzielenie tętnic nerkowych, należy najpierw usunąć część miedniczki nerkowej, piramid nerkowych i tłuszczu na powierzchni przekroju poprzecznego, aby odsłonić więcej naczyń krwionośnych (ryc. 1B). Uważaj, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym skrupulatnie oddziel tętnice międzypłatowe, łukowate i międzyzrazikowe za pomocą nożyczek do mikropreparacji i kleszczyków w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z czarnym dnem (ryc. 1C).
    UWAGA: W ludzkiej nerce tętnica międzyzrazikowa przechodzi przez piramidy nerkowe, z najgrubszą ścianą naczyniową spośród trzech gałęzi tętniczych 1,8, o średniej średnicy około 1-2 mm. W połączeniu korowo-rdzeniowym tętnica międzypłatowa przechodzi w tętnicę łukowatą, tworząc półkolisty łuk wzdłuż granicy korowo-rdzeniowej o średniej średnicy około 500 μm. Naczynia krwionośne dalej rozgałęziają się do kory nerkowej, która jest tętnicą międzyzrazikową, o najcieńszej ścianie naczyniowej i najmniejszej średnicy spośród trzech, około 200 μm (ryc. 1C). Ponadto, przy różnicowaniu trzech gałęzi naczyniowych, lokalizacja anatomiczna dostarcza bardziej krytycznych informacji niż bezwzględne pomiary średnicy naczyń 1,8.
    1. Delikatnie usuń otaczającą tkankę i tłuszcz z tętnic, upewniając się, że dokładnie je oczyściłeś w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z czarnym dnem (ryc. 1B).
  5. Użyj izolowanych tętnic nerkowych (tętnic międzyzrazikowych, łukowatych i międzypłatowych) do następujących eksperymentów:
    1. Przygotować odcinki tętnic do obróbki histologicznej, ostrożnie przycinając izolowane tkanki do znormalizowanej długości około 3 mm, która jest odpowiednia do zatapiania parafiny i cięcia histologicznego. Umieść każdą próbkę w 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby zachować morfologię tkanki. Po utrwaleniu przeprowadzić proces za pomocą standardowych protokołów odwadniania, czyszczenia i zatapiania parafiny w celu późniejszego barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) zgodnie z ustalonymi protokołami histologicznymi (ryc. 2).
      UWAGA: W celu potencjalnej oceny histologicznej próbki można poddać barwieniu trichromowemu Massona w celu oceny osadzania kolagenu lub barwieniu Verhoeffa-Van Giesona (EVG) w celu wizualizacji włókien elastycznych, zgodnie z ustalonymi protokołami histologicznymi28,29.
    2. W przypadku badań funkcji naczyń krwionośnych należy przechowywać pierścienie wewnątrznerkowe w lodowatym roztworze Krebsa do czasu badania. Pierścienie tętnicze powinny być całkowicie zanurzone.
      UWAGA: W przypadku kolejnych testów molekularnych, takich jak western blot/qPCR, po rozbiorzeniu należy natychmiast zamrozić świeże próbki w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C zgodnie z wcześniej opublikowanymi procedurami, aby zachować integralność RNA i zapobiec degradacji białka30,31.

4. Montaż pierścienia tętniczego

  1. Zidentyfikuj tętnicę międzypłatową, łukowatą i międzyzrazikową na podstawie ich odrębnych pozycji anatomicznych (ryc. 1C) i zakresów średnic (ryc. 2), a następnie ostrożnie podziel je na pierścienie o długości około 2 mm za pomocą nożyczek do mikrodysekcji do badań funkcji naczyń krwionośnych (ryc. 3A).
    UWAGA: Natychmiast przechowuj każdy izolowany pierścień tętniczy oddzielnie w 5 ml lodowatego roztworu Krebsa do czasu przeprowadzenia testów funkcjonalnych. Do testów funkcjonalnych wybierz nierozgałęzione pierścienie naczyniowe o długości 1,5-2,0 mm z czystymi prostopadłymi nacięciami. Wykluczyć pierścienie przekraczające 2,0 mm, aby zapobiec trudnościom z montażem, lub pierścienie poniżej 1,5 mm, aby uniknąć niestabilnych zapisów naprężeń.
  2. Przygotuj wszystkie pierścienie tętnicze (osobno z tętnic międzypłatowych, łukowatych i międzyzrazikowych), jak wspomniano w kroku 4.1 i doprowadź roztwory Krebsa i 60K+ do temperatury pokojowej. Następnie włącz podłączony komputer, a następnie system miografu przewodowego, upewniając się, że wszystkie komponenty są poprawnie zainicjowane przed przystąpieniem do eksperymentów.
  3. Przed zamontowaniem pierścieni tętniczych w drucianych komorach miograficznych należy dwukrotnie przepłukać każdą komorę 5 ml roztworu Krebsa, aby zapewnić czystość i wyeliminować pozostałości substancji, a następnie dodać 5 ml roztworu Krebsa do każdej komory.
    1. Podgrzej roztwór do temperatury 37 °C za pomocą wbudowanego w miograf systemu kontroli temperatury. Jednocześnie należy w sposób ciągły napowietrzać roztwór gazem (mieszanina 95%O2 i 5%CO2) za pomocą podłączonego przewodu gazowego, aby utrzymać odpowiednie natlenienie i równowagę pH podczas eksperymentu.
  4. Przygotować dwa druty prowadzące o długości 3 cm i średnicy 40 μm dla każdego pierścienia tętniczego i ostrożnie przenieść izolowane pierścienie tętnicze do innego 10-centymetrowego naczynia hodowlanego z czarnym dnem zawierającego roztwór Krebsa.
    UWAGA: Dla naczyń krwionośnych o różnych średnicach należy dobrać różne średnice drutów doprowadzających. W przypadku pierścienia tętniczego o średnicy około 100 μm lub mniejszej wymagany jest drut prowadzący 15 μm; jeżeli średnica wynosi od 100 μm do 200 μm, stosuje się drut prowadnik 25 μm; Jeśli średnica jest większa niż 200 μm, można użyć drutu prowadzącego 40 μm. W celu zapewnienia spójności eksperymentu zaleca się stosowanie tej samej średnicy dla wszystkich naczyń tego samego typu w ramach jednego eksperymentu. Rozdział 19.
  5. Ostrożnie włóż pierwszy przewód doprowadzający do pierścienia tętniczego wewnątrz naczynia, zegnij jedną stronę przewodu doprowadzającego pod kątem 90°, a następnie przenieś go do komory w celu zamocowania na uchwycie na próbkę typu zaciskowego za pomocą dostarczonych przez przyrząd specjalistycznych do dokręcania zgodnie z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 3B).
    UWAGA: Przewód doprowadzający jest wkładany w celu zapewnienia wsparcia strukturalnego podczas przenoszenia pierścienia tętniczego podczas montażu go na uchwycie próbki, minimalizując uszkodzenia lub zniekształcenia spowodowane obsługą.
  6. Przed zamocowaniem pierścienia tętniczego na uchwycie zapisz długość i szerokość naczynia. Umieść pierścień tętniczy między dwoma uchwytami (rysunek 3C) i odczytaj skalę mikrometryczną, gdzie skala 1 oznacza 10 μm. Odejmij wartość skali zmierzoną, gdy uchwyty ledwo się stykają (rysunek 3D), aby określić długość i szerokość pierścienia tętniczego.
  7. Przeciągnij kolejny drut doprowadzający przez naczynie krwionośne i na koniec zamocuj go po drugiej stronie. Nawiń przewód doprowadzający zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół mocujących po obu stronach i upewnij się, że jest mocno przymocowany do powierzchni uchwytu próbki.
    UWAGA: Podczas całego procesu utrwalania należy unikać ciągnięcia naczynia krwionośnego lub drapania wewnętrznej ściany naczynia krwionośnego drutem prowadzącym, aby uniknąć uszkodzenia śródbłonka naczyniowego. Drut doprowadzający powinien być owinięty wokół mocującej w jednej warstwie, nie zachodząc na siebie. Dwa przewody prowadne powinny znajdować się na tej samej płaszczyźnie poziomej, równolegle do siebie i nie przecinać się ze sobą. Ponadto po zamocowaniu przewodu doprowadzającego należy bliżej wyregulować uchwyt próbki po obu stronach; jednak powinny one znajdować się blisko siebie, nie stykając się w rzeczywistości, aby uniknąć użycia siły, jak pokazano na rysunku 3E i rysunku 3F.
  8. Zainstaluj komorę z powrotem w systemie miografu drutowego. Następnie przykryj pokrywę i przewietrz gaz. Podłącz czujnik i otwórz oprogramowanie do akwizycji danych do badania napięcia naczyniowego.

5. Normalizacja specyficzna dla naczynia w celu optymalnego określenia napięcia początkowego

UWAGA: Ustalenie stabilnych warunków podstawowych, zdefiniowanych jako optymalne napięcie spoczynkowe dla maksymalnej reakcji na skurcz, ma kluczowe znaczenie dla powtarzalnych pomiarów funkcjonalnych. Jednak ze względu na nieodłączne międzyosobnicze różnice fizjologiczne, ludzkie naczynia krwionośne wykazują większą zmienność podstawowych właściwości mechanicznych w porównaniu z naczyniami krwionośnymi zwierząt 32,33,34,35,36. Czynniki te, w połączeniu z wewnętrzną niejednorodnością naczyń krwionośnych (np. strukturalne i funkcjonalne różnice w średnicy, grubości ścianek i właściwościach skurczowych), łącznie prowadzą do znacznych różnic w napięciu wyjściowym. Dlatego, aby zapewnić powtarzalność eksperymentalną, zaleca się normalizację każdego naczynia krwionośnego z osobna. System miografu drutowego zawiera dedykowany moduł normalizacyjny, który umożliwia precyzyjne określenie napięcia linii podstawowej dla każdego naczynia.

  1. Zamontuj pierścienie tętnicze w komorze zgodnie z opisem w krokach od 4.1 do 4.8. Rozpocznij nagrywanie wykresu, wyzeruj kanał (Rysunek 4A), pozwól na stabilizację przez co najmniej 30 minut, a następnie ponownie wyzeruj kanał przed przystąpieniem do normalizacji.
  2. Wybierz Ustawienia normalizacji z menu DMT (Rysunek 4B) i ustaw parametry w następujący sposób (Rysunek 4C):
    1. Kalibracja okularu (mm/dz.): 1; Ciśnienie docelowe (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Czas uśredniania online (sekundy): 3; Czas opóźnienia (sekundy): 60.
      UWAGA: IC1 oznacza wewnętrzny obwód naczynia przy maksymalnym wytwarzaniu siły czynnej, podczas gdy IC100 reprezentuje obwód odpowiadający ciśnieniu przezściennemu 100 mmHg. Ludzkie tętnice nerkowe wykazują znaczną zmienność między próbkami, wymagającą standaryzacji, w przeciwieństwie do modeli zwierzęcych, które mają spójne właściwości naczyniowe do eksperymentalnego określania i ponownego wykorzystania proporcji IC1 / IC100. Ze względu na znaczne różnice w średnicy naczynia, grubości ścianki i właściwościach mechanicznych między poszczególnymi próbkami ludzkimi, każde naczynie musi przejść niezależną normalizację, aby ustalić jego unikalne cechy podstawowe. Współczynnik 0,9 został zatem ustalony jako symbol zastępczy dla inicjalizacji protokołu i nie jest używany w praktyce w tym protokole.
  3. Wybierz kanał odpowiadający tętnicy docelowej i otwórz ekran normalizacji z menu DMT (Rysunek 4C), wypełnij go odpowiednimi danymi:
    1. Punkty końcowe tkanki: a1 powinno wynosić 0, a2 powinno być długością naczynia (w mm); średnica drutu: 40 μm (wprowadź średnicę użytego drutu); odczyt mikrometru: wartość ze skali mikrometrycznej, kliknij Dodaj punkt , aby zapisać punkt.
  4. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk Dodaj punkt , aby zapisać pierwszy punkt i rozpocząć procedurę normalizacji.
  5. Zastosuj pasywne rozciąganie, odczekaj 3 minuty, wprowadź odczyt mikrometru jako następny punkt, a następnie dodaj 5 ml 60K+ , aby wywołać skurcz naczynia za pośrednictwem potasu (ryc. 5).
  6. Poczekaj, aż skurcz osiągnie plateau. Następnie przepłucz roztwór 60K+ 5 ml roztworu Krebsa 3 razy i oblicz dane dotyczące siły czynnej ze śladu, odejmując siłę bierną na każdym odcinku od siły aktywowanej potasem (rysunek 5).
  7. Powtarzaj kroki od 5,5 do 5,6 ("Rozciąganie-60K+ stymulacja-Mycie"), aż aktywna siła osiągnie maksimum, a następnie określ optymalne napięcie podstawowe, przy którym aktywna produkcja siły w naczyniu jest maksymalna (Rysunek 5).
  8. Wyrównaj pierścień tętniczy w komorze przez 10 minut przed przejściem do kolejnych etapów eksperymentu.

6. Wykrywanie reaktywności pierścienia tętnicy nerkowej

  1. Upewnij się, że objętość Krebsa w każdej komorze wynosi 5 ml przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Aby ocenić skurcz zależny od stężenia fenylefryny, należy zastosować skumulowany Phe w odstępach co pół logarytmu (10-9 do 10-4 M)37.
  3. Zacznij od najniższego stężenia Phe (10-9 M). Dodać 5 μl bulionu Phe (10-6 M) do komory zawierającej 5 ml buforu Krebsa, stale monitorować i czekać, aż skurcz się ustabilizuje (2-3 minuty niezmienionego napięcia), zaznaczyć punkt, a następnie dodać kolejne stężenie w odstępie pół logarytmu. Powtarzać tę czynność aż do osiągnięcia końcowego stężenia (10-4 M), utrzymując stałe monitorowanie przez cały czas (ryc. 6).
  4. W celu przeprowadzenia dodatkowych testów na obecność narkotyków należy przemyć komorę ciepłym 5 ml roztworu Krebsa co najmniej 5 razy, aż napięcie powróci do wartości wyjściowej i pozostanie stabilne przez co najmniej 10 minut.
  5. Aby ocenić rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane stężeniem acetylocholiny, należy zastosować skumulowany ACh w odstępach co pół logarytmu (10-8 do 10-5,5 M).
    UWAGA: W prawidłowym unaczynieniu odpowiedź na acetylocholinę (ACh) służy jako funkcjonalny wskaźnik integralności śródbłonka37,38. Odpowiedź rozszerzająca naczynia krwionośne na ACh odzwierciedla funkcję śródbłonka poprzez relaksację za pośrednictwem NO w zdrowych naczyniach. Jednak w warunkach patologicznych odpowiedź ta może być osłabiona lub zniesiona z powodu upośledzonej biodostępności tlenku azotu (NO) i/lub zmienionych szlaków sygnałowych receptora.
  6. Naczynia przed zawarciem umowy z 10-4 M Phe, dodać 5 μl materiału wyjściowego (10-1 M) do komory zawierającej 5 ml buforu Krebsa i inkubować przez 15 minut. Zaczynając od najniższego stężenia ACh, dodaj 5 μL zapasu Ach (10-5 M) do komory zawierającej 5 ml buforu Krebsa, stale monitoruj i czekaj na odpowiedź rozszerzeniem naczyń krwionośnych (potwierdzoną przez trwałe wykrywanie śladów), zaznacz punkt, a następnie przejdź do następnego stężenia. Powtarzaj, aż wszystkie zostaną przetestowane (Rysunek 7).
  7. Zakończ eksperyment, zapisując plik i usuwając pierścienie tętnicze. Dokładnie wyczyść komorę, inkubując z 10 ml 8% roztworu kwasu octowego przez 3 minuty, a następnie spłucz 10 ml wody 3 razy. Następnie inkubować w 10 ml 95% etanolu przez 3 minuty i ponownie spłukać 10 ml wody 3 razy. Na koniec wyłącz zarówno grzałkę, jak i gaz, upewniając się, że cała ciecz została usunięta przed odcięciem gazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W ludzkiej nerce tętnica międzypłatowa biegnie między piramidami nerkowymi wzdłuż odpowiadającej jej żyły. Charakteryzująca się stosunkowo grubą ścianą naczyniową i znacznym pokryciem tkanki tłuszczowej, tętnica ta wymaga szczególnie starannego rozwarstwienia. Otaczająca tkanka tłuszczowa powinna być skrupulatnie usunięta, aby uniknąć przyłożenia nadmiernej siły podczas procedury izolacji (ryc. 1C).

Tętnica łukowata jest anatomicznie umieszczona na skrzyżowaniu ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stabilność perfuzji nerek służy zarówno jako krytyczny cel terapeutyczny, jak i okno na patofizjologię hemodynamiczną39,40. Przedstawiamy protokół hierarchicznej izolacji i oceny funkcjonalnej ludzkich tętnic nerkowych na podstawie świeżych próbek nefrektomii, wypełniając istotne luki w obecnych metodologiach. W przeciwieństwie do istniejących metod ograniczonych do próbek zwłok lub modeli zwierzęcych, nasza technika umożliwia niezawodną izolację żywotnych tętnic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować ochotnikom za ich udział w tym badaniu, a także podziękować personelowi chirurgicznemu na Oddziale Urologii Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego za dostarczenie tkanki nerkowej. Prace te były wspierane przez Miejską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (F251013 do Y. Z., 7232096 do Y. L.); Chińska Narodowa Fundacja Naukowa (82325004, 92168114 do Y. Z., 82170422 do Y. L.); Krajowy kluczowy program badawczo-rozwojowy Chin (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 do Y. Z., 2021YFF0501404 do Y. L., 2023YFC2415500 do L. Y.); Projekt badawczy Trzeciego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego w Państwowym Kluczowym Laboratorium Homeostazy i Remodelingu Naczyń (Uniwersytet Pekiński; 2024-VHR-SY-07 do Y.Z.); 2023 Miejska Komisja Zdrowia w Pekinie Stolica Transformacja Doskonałości Programu Promocji Nauk Medycznych i Technologii Transformacja Doskonałego Programu Promocji (YC202301QX0162 do LY); Krajowe finansowanie badań klinicznych szpitali wysokiego szczebla (projekt Funduszu Doradztwa Inkubacji Transformacji Osiągnięć Naukowych i Technologicznych Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego, 2024CX24 do L. Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek acetylocholinySigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, NiemcyNr kat. A6625
Naczynie hodowlane z czarnym dnemDanish Myo Technology, Aarhus, Dania300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA501330
D-glukozaSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA610219
Kleszcze DumontaDanish Myo Technology, Aarhus, Dania300413
Nożyczki do rozwarstwiania GeuderDanish Myo Technology, Aarhus, Dania400431
Przewód doprowadzającyDanish Myo Technology, Aarhus, Dania400447Średnica 40 i mikro; m
KclSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100781
LabChart Professional wersja 8.3 ADInstruments, Australia-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100288
System Multi miograph Danish Myo Technology, Aarhus, Dania620 mln
Zawartość NaClSangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, ChinyA100865
FenylefrynaSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, NiemcyZobacz materiał P6126 powiedział:

Bibliografia

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika mikrosekcjimiografia drucianadysfunkcja naczyniowaizolacja tętnicy wewnątrznerkowejodpowiedzi naczynioruchowezależność długość-napięcie mięśniabarwienie hematoksyliną i eozynąskurcz indukowany fenylefrynąnormalizacja tętnicza
Wielopoziomowa mikrodysekcja i profilowanie funkcjonalno-strukturalne gałęzi tętniczych ludzkiego nerki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.