Projektowanie i zastosowanie peptydu inhibicyjnego do szybkiej regulacji in vitro w dół poziomów modyfikacji potranslacyjnych w określonym miejscu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który przedstawia specyfikacje projektowe, standardy kontroli jakości i system weryfikacji funkcjonalnej TAT-, peptydu hamującego modyfikacje potranslacyjne.

Streszczenie

Białka są głównymi wykonawcami czynności życiowych i są regulowane na poziomie modyfikacji transkrypcyjnej, translacyjnej i potranslacyjnej (PTM). Co więcej, PTM stanowi bardziej skomplikowany mechanizm regulacji aktywności białka, ponieważ białko na ogół ma różne typy PTM i wiele miejsc dla określonego PTM. Transfekcja plazmidu lub lentiwirus i adenowirus mogą być stosowane we wstępnych badaniach przesiewowych funkcjonalnie ważnego miejsca PTM spośród wszystkich zidentyfikowanych miejsc; Jednak metody te zawsze napotykają wyzwania, takie jak niska wydajność wprowadzania komórek i tkanek, czasochłonność i wysokie koszty, potencjalna reakcja immunologiczna itp. Aby temu zaradzić, niedawno opracowaliśmy i z powodzeniem zastosowaliśmy rodzaj rekombinowanego peptydu o nazwie TAT-, peptyd hamujący PTM sprzężony z TAT. TAT-składa się z modułu TAT, który ułatwia wnikanie komórek i tkanek, oraz modułu, który specyficznie obniża PTM w docelowych miejscach poprzez konkurencyjne wiązanie. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który określa specyfikacje projektowe, standardy kontroli jakości i system weryfikacji funkcjonalnej TAT-. W części dotyczącej projektowania opisujemy spójność, opcjonalną długość, specyfikę i zachowanie TAT-. Następnie wprowadzamy wymagania dotyczące badań jakościowych TAT-, które gwarantują jego skuteczność i bezpieczeństwo. W zastosowaniu części TAT-wprowadziliśmy test gradientu stężeń TAT-, proces inkubacji badanych komórek, a następnie detekcję fenotypową. Podsumowując, opisujemy skuteczną metodę badania przesiewowego miejsc PTM poprzez selektywne strącanie określonego miejsca i obserwację powstałego fenotypu, aby wywnioskować jego funkcję. Ze względu na niski koszt syntezy i wysoką wydajność, metoda ta pokonuje ograniczenia istniejących technologii, takich jak transfekcja plazmidu.

Wprowadzenie

Białka są głównymi wykonawcami czynności życiowych, a ich biologiczne procesy regulacyjne obejmują dwa podstawowe aspekty regulacji ekspresji genów - transkrypcję genów i translację mRNA. Jednak w ciągu ostatnich dziesięcioleci modyfikacja potranslacyjna (PTM) stała się kolejnym niezbędnym mechanizmem regulacji funkcji komórkowych¹. Fosforylacja, najbardziej znany badaczom PTM, odgrywa szczególnie ważną rolę w funkcjach fizjologicznych. Na przykład po fosforylacji kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) przez kinazę MEK w miejscach Thr202 i Tyr204, jej konformacja zmienia się, odsłaniając miejsce aktywne, które aktywuje dalsze białka docelowe, takie jak czynniki transkrypcyjne2. W przeciwieństwie do tego, gdy N-końcowy Ser9 GSK-3β jest fosforylowany przez kinazę Akt / PKB, jego kieszeń wiążąca substrat jest zablokowana, co prowadzi do utraty aktywności kinazy³. Ubikwitynacja to kolejny ważny PTM, który reguluje różne procesy komórkowe poprzez kowalencyjne przyłączanie cząsteczek ubikwityny do białek substratowych. Ubikwityna zawiera 7 reszt lizyny (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) i N-końcową metioninę (M1). Wiązanie łańcuchów ubikwityny w różnych miejscach nadaje białkom substratowym różne przeznaczenie. Podstawową funkcją ubikwitynacji związanej z K48 jest oznaczanie białek substratowych do degradacji przez proteasom⁴. I odwrotnie, podstawową funkcją ubikwitynacji związanej z K63 jest angażowanie się w niedegradatywną transdukcję sygnału, taką jak naprawa uszkodzeń DNA, reakcje zapalne i endocytoza⁵. W ostatnich latach, wraz z szybkim postępem technologii proteomicznych, odkrywa się coraz większą liczbę nowych PTM. Poza klasyczną acetylacją zidentyfikowano nowe acylacje, takie jak propionylacja, krotonylacja i glutarylacja⁶. W dziedzinie modyfikacji histonów, laktozylacja histonów zakłóca RNA m⁶A modyfikacja i homeostaza mikrośrodowiska immunologicznego⁷. W dziedzinie modyfikacji niehistonowych, redukcja krotonylacji ATP5O jest głównym szkodliwym czynnikiem w regulacji metabolizmu fosfolipidów w dół⁸.

Prowadzenie badań nad PTM wymaga systematycznego pogłębiania analizy proteomu PTM⁹. Dziedzina ta obejmuje dwa główne kierunki badań: analizę profili PTM na całym poziomie proteomu oraz kompleksową identyfikację miejsc PTM określonego białka. Chociaż nowoczesna spektrometria mas może skutecznie identyfikować różne typy PTM i konkretne miejsca, badania przesiewowe i walidacja kluczowych miejsc funkcjonalnych pozostają podstawowym wyzwaniem naukowym, które ogranicza postęp badań. Ustanowienie skutecznych strategii kontroli lokalizacji jest pierwszym krokiem w kierunku rozwiązania kwestii funkcji kluczowych ośrodków regulacyjnych. Tradycyjne metody polegają na konstruowaniu zmutowanych plazmidów dla określonych miejsc (inaktywacja mutacji, aktywacja mutacji), wprowadzaniu ich do komórek docelowych za pomocą technik transfekcji in vitro oraz systematycznej ocenie zmian wskaźników fenotypowych, takich jak proliferacja komórek, apoptoza i stres oksydacyjny. Strategia ta napotyka jednak na poważne przeszkody techniczne w cichych transkrypcyjnie modelach komórek, takich jak oocyty i pierwotne systemy hodowli tkankowych. Chociaż system transdukcji lentiwirusa lub adenowirusa może częściowo przezwyciężyć problem skuteczności transfekcji, jego zastosowanie stoi przed podwójnymi wyzwaniami: wysokimi kosztami ekonomicznymi i niską skutecznością penetracji cząstek wirusa w modelach tkanek in vitro. Podczas gdy strategia konstruowania zmutowanych myszy knock-in jest niezwykle długotrwała i kosztowna. Ogólnie rzecz biorąc, pilne jest opracowanie ekonomicznych i skutecznych strategii wstępnej kontroli ważnych funkcjonalnie miejsc PTM.

W ostatnich latach nasz zespół z powodzeniem opracował i zastosował technikę szybkiej regulacji PTM o nazwie TAT-, skojarzony z PTM peptyd hamujący, oparty na inhibicji konkurencyjnej polipeptydów. Jego główną zaletą jest uniwersalność i wysoka skuteczność w przeprowadzaniu wstępnych badań przesiewowych ważnych funkcjonalnie miejsc PTM, co stanowi kluczową podstawę do dogłębnych analiz mechanizmów molekularnych kluczowych miejsc PTM. Niniejsze badanie systematycznie wyjaśnia główne ramy i proces wdrażania TAT-oraz wykazuje jego skuteczność w regulacji poziomu PTM w określonym miejscu poprzez reprezentatywne dane eksperymentalne.

Protokół

1. Projektowanie sekwencji TAT-

UWAGA: TAT-składa się z dwóch części peptydów (Rysunek 1): N-końcową częścią jest TAT, CYGRKKRRQRRRR, która pozostaje niezmieniona dla każdego TAT-i może pomóc w skutecznym wejściu do komórek hodowanych in vitro lub tkanek in vivo; część C-końcowa to sekwencja polipeptydowa wokół określonego miejsca PTM (Rysunek 1, zwykle lizyna o symbolu "K", podświetlona na czerwono) białka obiektu. Długość wynosi około 10-15 reszt AA (im dłuższy, tym koszt wzrasta; jeśli krótszy, swoistość znacznie maleje).

1. Zoptymalizuj sekwencję poprzez analizę Blast (Rysunek 2).
   1. Zaloguj się do https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, kliknij na blastp wyszukaj sekwencje białek.
   2. Skopiuj docelową sekwencję białka do okna wprowadzania sekwencji zapytania.
   3. W obszarze Wybierz wyszukiwanie wybierz opcję Standardowe bazy danych. Wybierz opcję blastp (białko-białko BLAST) w wyborze programu. Na koniec kliknij przycisk BLAST (Rysunek 2B).
   4. Wybierz segmenty peptydów o najwyższej swoistości jako kandydujące.
2. Przeprowadź porównanie homologii między ludźmi i myszami dla końcowego.
   1. Zaloguj się do https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, kliknij na blastp wyszukaj sekwencje białek.
   2. Skopiuj sekwencje białka zarówno od ludzi, jak i myszy i wklej je do pola sekwencji wejściowej.
   3. Kliknij przycisk Prześlij, aby uzyskać wyniki.
   4. Wybierz ze 100% homologią między człowiekiem a myszą (Rysunek 2C).
3. Określ skład TAT-, który składa się z N-końcowego TAT i C-końcowego.

2. Synteza i weryfikacja jakości TAT-

1. Wybierz firmę z dużym doświadczeniem projektowym, aby zapewnić czystość peptydów nie mniejszą niż 98% za pomocą spektrometrii mas, unikając zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na późniejsze eksperymenty.
   UWAGA: Poziom endotoksyn w polipeptydzie powinien wynosić ≤10 i powinien być wolny od patogenów.

3. Zastosowanie TAT-

1. Użyj ultraczystej wody wolnej od patogenów do rozpuszczenia TAT-, aby osiągnąć stężenie podstawowe 10 mg/ml. Dozuj bulion do małych probówek, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, które spowodują częściową denaturację.
   UWAGA: Dodanie 1% dimetylosulfotlenku (DMSO) pomoże chronić strukturę TAT-.
2. Leczenie komórek za pomocą TAT-.
   1. Hodowla ludzkich embrionalnych komórek nerkowych 293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium firmy Dulbecco, uzupełniona 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO₂).
      UWAGA: Po wysianiu komórki hodowano przez około 12 godzin, a zabieg TAT-wykonywano, gdy zbieg osiągnął około 70%.
   2. Rozcieńczyć rozpuszczony TAT do 1 mg/ml za pomocą PBS, a następnie bezpośrednio dodać do pożywki do hodowli komórkowej w odpowiedniej dawce (zalecane końcowe stężenie pożywki: 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/ml) przez 24 godziny.
   3. Umyj komórki oryginalną pożywką hodowlaną 3 razy.
   4. Wykonaj analizę western blot, aby zweryfikować zakres regulacji w dół PTM.
      UWAGA: Na podstawie doświadczeń i późniejszych wyników eksperymentalnych optymalne stężenie końcowe TAT-wynosi 0,1 mg/ml.

4. Western blot

1. Przygotuj próbki białek komórkowych.
   1. Przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 3 razy, dodać 200 μl silnego buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (z dodatkiem inhibitora proteazy fluorku fenylometylosulfonylu [PMSF]) do osadu komórkowego i inkubować przez 5 minut w celu wstępnej lizy, zeskrobać je skrobakiem do komórek.
   2. Sonikować mieszaninę za pomocą kruszarki ultradźwiękowej przy 12% intensywności energii przez 5 s.
   3. Schładzać lizat komórkowy na lodzie przez 30 minut i odwirowywać w temperaturze 13400 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
   4. Przenieść supernatant zawierający białka do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/4 objętości 5x buforu próbki do supernatantu (stężenie końcowe 1x).
   5. Mieszaninę należy zmieszać wirowo, podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut w suchym termostacie i schładzać na lodzie przez 2 minuty.
   6. Zmierz całkowite stężenie białka za pomocą testu Bradforda na Nanodrop.
2. Wykonać elektroforezę w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE).
   1. Użyj 12% żelu rozdzielczego i 4% żelu do układania w stos dla SDS-PAGE.
   2. Pobrać pipetować próbki białka do studzienek zgodnie z określoną objętością.
   3. Włącz aparat do elektroforezy i najpierw uruchom go pod napięciem 80 V, 300 mA przez 30 minut, aby wyrównać pasma na granicy między żelami układającymi się w stosy i rozdzielczymi. Następnie uruchom przy napięciu 120 V, 300 mA przez 45 minut, aby rozpuścić białka.
   4. Przenieś białka z żelu do błony z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą aparatu do szybkiego przenoszenia.
3. Wykonaj blokowanie, inkubację przeciwciał i wizualizację.
   1. Zablokuj membranę PVDF w 5% odtłuszczonym mleku w soli fizjologicznej buforowanej Tris zawierającej 0,1% Tween 20 (TBST) i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
   2. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w 5% odtłuszczonym mleku/PBST przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.
   3. Umyj membranę trzykrotnie TBST (po 10 minut).
   4. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w 5% mleku odtłuszczonym/TBST w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   5. Umyj membranę trzykrotnie TBST (po 10 minut).
   6. Naświetlić membranę w szeregu czasowym (5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s), aby uzyskać optymalny obraz pod urządzeniem do chemiluminescencji generowanej elektrolitycznie (ECL).

5. Funkcjonalna walidacja TAT-w komórkach hodowanych in vitro

1. Wykrywanie poziomów komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS).
   1. Płytki 293T o optymalnej gęstości 1 x 10⁵ komórek/basenik w 24-dołkowej płytce hodowlanej.
   2. Traktuj komórki peptydem hamującym krotonylację histonu Histone3 lizyny 116 krotonylacji (THCIP) (0,1 mg / ml) przez 24 godziny, a następnie przemyj komórki PBS.
   3. Inkubować komórki z 10 μM dioctanem dichloro-dihydrofluoresceiny (DCFH-DA) w DMEM bez surowicy w temperaturze 37 °C w ciemności przez 20 minut.
   4. Rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i mierz intensywność fluorescencji za pomocą funkcji Zmierz w ImageJ.
      UWAGA: Zastosowano zestaw filtrów FITC, z filtrem emisyjnym 465-495 nm, zwierciadłem dichroicznym 505A i drugim filtrem emisyjnym 512-550 nm.
2. Test proliferacji komórek
   1. Umieść komórki 293T w optymalnej gęstości 1 x 10 5 komórek na basenie na 24-dołkowej płytce hodowlanej.
   2. Dodać 10 μl odczynnika CCK-8 do każdego dołka.
   3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
   4. Zapisać absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i odjąć sygnał tła od studzienek ślepej próby (pożywka + CCK-8).
   5. Znormalizuj dane, aby obliczyć żywotność komórki.
3. Wykrywanie komórkowych poziomów ATP
   1. Lizuj komórki za pomocą buforu do lizy. Odwirować lizat o stężeniu 12 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do dalszej analizy.
   2. Rozcieńczyć roztwór wzorcowy ATP buforem do lizy, aby uzyskać gradient stężeń 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM i 5 μM.
   3. Dodać 20 μl roztworu do wykrywania ATP do każdej studzienki zawierającej supernatant komórkowy lub wzorzec ATP.
   4. Natychmiast zmierz sygnał luminescencyjny za pomocą czytnika mikropłytek.
      1. Kliknij opcję Układ blachy, wybierz odpowiedni szablon blachy w polu Zmień szablon blachy, aby skonfigurować próbki (normy i próbki).
      2. Następnie kliknij Protokół po lewej stronie, wybierz przycisk Chemiluminescencja, a następnie kliknij Start, aby rozpocząć wykrywanie.
   5. Wygeneruj krzywą wzorcową z sygnałów luminescencyjnych wzorców ATP i użyj jej do ilościowego określenia stężenia ATP w supernatancie komórki.

Wyniki

To badanie opisuje strategię, która wykorzystuje TAT-do obniżenia poziomu PTM docelowego białka w określonym miejscu w oparciu o inhibicję kompetycyjną. W typowym przykładzie TAT-został tutaj przemianowany na THCIP. Składa się z dwóch modułów funkcjonalnych: (1), N-końcowego peptydu penetrującego komórki TAT (CYGRKKRRQRRR), który umożliwia THCIP przenikanie do komórek; (2) C-końcowa sekwencja wokół K116 H3, AIHAKRVTIMPKD, która specyficznie konkuruje z endogennym H3 o krotonylację w K116 (Rysunek 2A)....

Dyskusja

W tym protokole kluczowe znaczenie mają następujące kroki. Po pierwsze, projekt TAT-odnosi się do specyficzności peptydu. Po drugie, zoptymalizuj aplikację i końcowe stężenie; Zoptymalizowane stężenie musi być dokładnie przetestowane, aby osiągnąć skuteczne i szybkie knockdown. Po trzecie, w celu zweryfikowania efektu TAT-zaleca się przeprowadzenie wielu eksperymentów, zamiast polegania na jednym eksperymencie w celu potwierdzenia jego dodatkowych efektów.

Porównując istniejące metody, metoda ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Automatyczny wielofunkcyjny system obrazowania	Tanon	4600	Miernik ekspozycji identyfikuje i wizualizuje docelowe pasma białkowe, wykrywając sygnały fluorescencyjne lub chemiluminescencyjne na membranie po zabiegu rozwojowym.
Zestaw do liczenia komórek-8	GLPBIO	GK10001	W oparciu o korelację między żywotnością metaboliczną komórek a liczbą komórek, metoda ta ocenia zdolność proliferacyjną komórek poprzez pomiar zdolności redukcyjnej komórek do odczynników CCK-8
Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)	Gibco	11995065	Zmodyfikowana pożywka Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco jest szeroko stosowaną pożywką podstawową wspomagającą wzrost szerokiej gamy komórek ssaków.
Podłoże chemiluminescencyjne ECL	Biosharp	BL520B	Substraty ECL generują sygnały świetlne w reakcjach chemiluminescencyjnych, które umożliwiają wykrycie określonych białek lub kwasów nukleinowych.
Aparat do elektroforezy	Tanon	EPS600	Główną rolą aparatu do elektroforezy jest oddzielanie i analizowanie makrocząsteczek biologicznych ‌
Ulepszony zestaw do oznaczania ATP	Beyotime	S0027	Zestaw może skutecznie wykrywać poziom ATP w próbkach
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Gibco	16000-044	Surowica bydlęca płodu (FBS) dostarcza niezbędnych składników odżywczych i czynników wzrostu do utrzymania i wzrostu komórek.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	Urządzenie jest bardzo wydajne i jest w stanie szybko osiągnąć transfer białka z żelu poliakrylamidowego do membrany PVDF w ciągu 15 minut
Mikroskop fluorescencyjny odwrócony	Olympus Corporation	IX73	Mikroskopia fluorescencyjna wykorzystuje światło ultrafioletowe jako źródło światła do naświetlania badanego obiektu, aby emitował fluorescencję, a następnie obserwować kształt i położenie obiektu pod mikroskop.
Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop2000 do mikroobjętości	Thermo Scientific	2000	NanoDrop został użyty do określenia stężenia DNA lub RNA
Membrana PVDF	BioRAD	1620177	Ten typ membrany PVDF ma doskonałą odporność chemiczną i wysoką zdolność wiązania białek
Zestaw testowy ROS	Beyotime	S0033S	Zestaw może dokładnie wykryć poziom reaktywnych form tlenu w komórkach
TAT-koniugator H3K16 Peptyd hamujący krotonylację	Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD	CN218107533U	Może specyficznie konkurować z endogennym H3, który ma być krotonylowany w K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST może czyścić nieistotne substancje na membranie, zmniejszać błędy eksperymentalne i zapewniać dokładność wyników eksperymentalnych ‌
Kruszarka ultradźwiękowa	LICHEN	LC-AUD-150P	Główne funkcje aparatu obejmują fragmentację komórek, dyspersję cząstek i emulgację
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Czytniki mikropłytek mogą osiągać wysokoprzepustową analizę ilościową próbek biologicznych poprzez wykrywanie sygnałów optycznych (takich jak absorbancja, fluorescencja lub luminescencja) próbek w mikropłytkach