Czynność tętnic nerkowych i histopatologia związane z metabolitami osocza i kału u pacjentów z niewydolnością serca

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowania multimodalnej platformy do wyjaśnienia dysfunkcji naczyń nerkowych wywołanej metabolitami serca w zespole sercowo-nerkowym.

Streszczenie

Mikrobiota jelitowa i związane z nią kometabolity gospodarz-mikroorganizmy są coraz częściej uznawane za kluczowe regulatory ogólnoustrojowej równowagi metabolicznej i osi krążeniowo-nerkowej, szczególnie w kontekście zespołu sercowo-nerkowego. Chociaż dowody kliniczne wskazują, że dysfunkcja serca może inicjować lub nasilać patologiczne zmiany w nerkach, kluczowe metaboliczne cząsteczki sygnałowe pośredniczące w osi sercowo-nerkowej i ich mechanizmy leżące u ich podstaw pozostają nieuchwytne. Badanie to ustanawia nowatorską, systematyczną platformę badawczą integrującą sygnatury kardiometaboliczne z analizą funkcji naczyń nerkowych, obejmującą: (1) izolację i ekstrakcję metabolitów osocza/kału od pacjentów z niewydolnością serca; (2) Techniki izolacji naczyń nerkowych ex vivo i hodowli pierwotnej; (3) Multimodalne ramy oceny interakcji metabolicznych układu krążenia-nerki, obejmujące testy czynnościowe naczyń krwionośnych, molekularne testy biochemiczne markerów uszkodzenia naczyń nerkowych oraz analizy histopatologiczne. W porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej, metabolity pochodzące od pacjentów z niewydolnością serca upośledzały czynność naczyń nerkowych i indukowały reakcje zapalne, co podkreśla ich potencjał jako funkcjonalnych biomarkerów w zespole sercowo-nerkowym. Badanie to nie koncentruje się na konkretnym metabolicie; w związku z tym w przyszłych badaniach z wykorzystaniem technik analitycznych, takich jak LC-MS/MS i NMR, konieczna będzie dalsza identyfikacja i walidacja określonych typów metabolitów, które wywierają skutki chorobotwórcze. Zastosowanie tej platformy ujawniło, że metabolity związane z chorobami serca upośledzają czynność naczyń krwionośnych i homeostazę nerek. Odkrycia te dostarczają mechanistycznego wglądu w czynniki metaboliczne wpływające na interakcje sercowo-nerkowe i oferują narzędzie translacyjne do identyfikacji nowych biomarkerów i celów terapeutycznych.

Wprowadzenie

Zespół sercowo-nerkowy (CRS) jest złożonym stanem patologicznym charakteryzującym się dwukierunkowym uszkodzeniem między sercem a nerkami. Zawiła współzależność między tymi dwoma narządami została po raz pierwszy opisana przez Roberta Brighta w 1836 roku, który systematycznie dokumentował znaczące zmiany strukturalne w sercu związane z zaawansowaną^chorobą nerek1. Częstość występowania CRS jest silnie związana ze współistnieniem chorób układu krążenia (CVD) i przewlekłej choroby nerek (PChN). Badania wskazują, że około 30% pacjentów z niewydolnością serca ma również PChN, podczas gdy 44%-51% zgonów u pacjentów z PChN jest bezpośrednio przypisywanych zdarzeniom sercowo-naczyniowym².

Zarządzanie KSR wiąże się z kilkoma istotnymi wyzwaniami. Po pierwsze, opieka kliniczna pozostaje rozdrobniona, brakuje interdyscyplinarnej koordynacji i mechanizmów wczesnego ostrzegania, co często prowadzi do opóźnionych interwencji w fazie³ dekompensacji. Po drugie, obecne strategie leczenia stoją przed paradoksalnym dylematem. Konwencjonalne terapie, takie jak leki moczopędne i inhibitory układu renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS), mogą łagodzić objawy niewydolności serca⁴; jednak ich długotrwałe lub wysokie dawki mogą aktywować RAAS i współczulny układ nerwowy (SNS), nasilając niedotlenienie i zwłóknienie nerek, ostatecznie przyczyniając się do oporności na leki moczopędne i pogorszenia czynności nerek⁵. Podobnie, podczas gdy inhibitory konwertazy angiotensyny (ACEI) i blokery receptora angiotensyny (ARB) mogą łagodzić uszkodzenie układu krążenia i nerek, ich zastosowanie kliniczne jest często ograniczone ze względu na obawy związane ze zwiększonym stężeniem kreatyniny w surowicy lub hiperkaliemią, przy czym tylko 30%-40% pacjentów jest w stanie tolerować długotrwałą terapię⁶.

Biorąc pod uwagę te wyzwania, istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania skutecznych wczesnych biomarkerów i głębszego zrozumienia patogenezy CRS, aby ułatwić odkrycie nowych celów terapeutycznych. Jednak obecne ograniczenia w identyfikacji możliwych do działania mediatorów przesłuchów krążeniowo-nerkowych – w szczególności metabolitów specyficznych dla choroby, które bezpośrednio łączą dysfunkcję serca z uszkodzeniem naczyń nerkowych – utrudniają postęp w rozwiązywaniu tych niezaspokojonych potrzeb klinicznych. Pojawiające się dowody sugerują, że metabolity związane z chorobami serca mogą służyć zarówno jako biomarkery diagnostyczne, jak i mechanistyczne czynniki napędzające CRS poprzez przeprogramowanie homeostazy naczyń nerkowych, jednak ich czasoprzestrzenne role w inicjowaniu lub wzmacnianiu uszkodzenia nerek pozostają słabo scharakteryzowane ^7,8,9. Ostatnie badania wykazały, że endogenne metabolity, takie jak ceramidy, mogą aktywnie nasilać stan zapalny i przebudowę naczyń krwionośnych, szczególnie w stanach sercowo-nerkowych, podkreślając szersze znaczenie wykrywania metabolitów w patologii naczyniowej¹⁰.

Wśród przedziałów nerkowych dotkniętych CRS, układ naczyniowy jest coraz częściej uznawany za główny i wczesny cel urazu. Dysfunkcja śródbłonka w mikrokrążeniu nerkowym - charakteryzująca się upośledzoną biodostępnością tlenku azotu, stresem oksydacyjnym i zwiększoną ekspresją mediatorów prozapalnych i prozakrzepowych - przyczynia się do rozrzedzenia mikronaczyń krwionośnych, zwiększonej przepuszczalności naczyń krwionośnych i regionalnego niedotlenienia¹¹. Równolegle komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), które są niezbędne do regulacji napięcia tętniczego i podatności, są również podatne na rozregulowanie metaboliczne w CRS. Coraz więcej dowodów wskazuje, że metabolity związane z chorobą mogą zaburzać kurczliwość VSMC, sprzyjać nieadaptacyjnej przebudowie i przyczyniać się do zwiększonej sztywności naczyń krwionośnych i upośledzenia perfuzji nerek. Pomimo swojej fundamentalnej roli, mechanizmy dysfunkcji naczyń krwionośnych napędzane przez mięśnie gładkie pozostają niedostatecznie zbadane w obecnych modelach CRS ^8,12. Te patofizjologiczne zmiany nie tylko nasilają uszkodzenie nerek, ale także sprzyjają nieadaptacyjnej aktywacji neurohormonalnej i ogólnoustrojowym zaburzeniom hemodynamicznym, dodatkowo upośledzając czynność serca i utrwalając progresję CRS¹³. W związku z tym ukierunkowanie na uszkodzenie naczyń nerkowych zapewnia mechanistycznie pouczające okno na wczesną patogenezę CRS i zapewnia racjonalne ukierunkowanie na badanie interakcji metabolicznych między sercem a nerką.

Aby wypełnić te luki, nasze badanie priorytetowo traktuje systematyczną identyfikację i funkcjonalną walidację metabolitów związanych z niewydolnością serca jako centralnych regulatorów progresji CRS. Praca ta wypełnia krytyczną rozbieżność między obserwacyjnym odkrywaniem biomarkerów a badaniami nad patogenezą mechanistyczną, określając, w jaki sposób metabolity te indukują dysfunkcję naczyń nerkowych, aktywują kaskady zapalne i upośledzają mechanizmy naprawy tkanek. Tradycyjne modele używane do badania CRS – w tym modele zwierzęce, hodowle komórkowe in vitro i organoidy pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) –^{mają ograniczenia.} Modele zwierzęce cierpią z powodu różnic międzygatunkowych, które ograniczają znaczenie kliniczne. Hodowle in vitro nie są zintegrowane na poziomie narządów, podczas gdy organoidy pochodzące z iPSC - chociaż zdolne do modelowania interakcji między kardiomiocytami a komórkami nabłonka kanalików - pozostają funkcjonalnie niedojrzałe i są ograniczone do^{wczesnych etapów} rozwoju. Co więcej, obecne systemy organoidów naczyniowych składają się głównie z monowarstw śródbłonka lub prymitywnych mikronaczyń, pozbawionych kurczliwej warstwy mięśni gładkich i odczytów funkcjonalnych niezbędnych do oceny odpowiedzi na poziomie naczyń na uszkodzenie metaboliczne¹⁶.

W przeciwieństwie do tego, nasza platforma wykorzystuje metabolity sercowe pochodzenia ludzkiego i ludzkie naczynia krwionośne ex vivo , umożliwiając fizjologicznie istotne i strukturalnie nienaruszone ludzkie tętnice nerkowe ex vivo , umożliwiając fizjologicznie istotną i mechanistycznie pouczającą analizę interakcji metabolicznych układu sercowo-nerkowego na granicy naczyń. Zapewnia to wyjątkową przewagę w modelowaniu międzynarządowej komunikacji metabolicznej, która leży u podstaw progresji zespołu sercowo-nerkowego. Nasza pionierska zintegrowana platforma badań krążeniowo-nerkowych łączy w sobie trzy podstawowe innowacje: profilowanie metabolomiczne metabolitów osocza/kału pochodzących z niewydolności serca, systemy izolacji/hodowli naczyniowo-naczyniowej ex vivo oraz multimodalną ocenę funkcjonalno-molekularno-histopatologiczną. Każdy komponent tej platformy został zoptymalizowany pod kątem odtwarzalności i znaczenia translacyjnego, w tym użycie 200 μl osocza lub 0,1 g materiału kałowego na próbkę, inkubacja 2 mm segmentów ludzkiej tętnicy nerkowej w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez okres do 24 godzin oraz ilościowe wykrywanie markerów uszkodzenia naczyniowego w oparciu o reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). System ten nie tylko rozszyfrowuje potencjał diagnostyczny sygnatur metabolitów, ale także bezpośrednio łączy ich przyczynowy wkład w patologię CRS, umożliwiając identyfikację celu terapeutycznego poprzez mapowanie międzynarządowej dysregulacji metabolicznej na poziomie molekularnym. Łącząc odkrycia mechanistyczne z translacją kliniczną, ten dwukierunkowy paradygmat przesuwa zarządzanie CRS z reaktywnej kontroli objawów na proaktywne interwencje oparte na biomarkerach.

Protokół

Protokoły eksperymentalne i metodologie przypadków zastosowane w tym badaniu zostały etycznie zatwierdzone przez Oddział Urologii w Pierwszym Szpitalu Uniwersytetu Pekińskiego (Kodeks Oceny Etycznej: 2023yan500-002) i Szpital Peking Union Medical College (zatwierdzenie nr I-23PJ585), przy ścisłym przestrzeganiu zasad określonych w Deklaracji Helsińskiej. Do tego badania zrekrutowaliśmy pacjentów płci męskiej lub żeńskiej hospitalizowanych w Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) od lipca 2019 r., u których zdiagnozowano niewydolność serca (HF) przez co najmniej dwóch doświadczonych kardiologów. Łącznie czterech pacjentów z niewydolnością serca (HF1-HF4) zostało włączonych do ekstrakcji metabolitów z osocza i kału. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników przed włączeniem ich do badania. Aparatura doświadczalna i odczynniki są przedstawione w Tabeli Materiałów.

1. Przetwarzanie próbek osocza i kału - ekstrakcja metabolitów polarnych

1. Pobieranie próbek
   1. Zbierz wszystkie próbki osocza i kału w sterylnych, wstępnie schłodzonych probówkach zbiorczych i natychmiast zamroź je w ciekłym azocie po pobraniu. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.
   2. Aby zapewnić stabilność metabolitów, należy przetworzyć wszystkie próbki w jednym cyklu zamrażania i rozmrażania i nie dopuścić do tego, aby odstęp czasu między pobraniem próbki a ekstrakcją przekroczył 2 tygodnie.
      UWAGA: Środki te zostały podjęte w celu zminimalizowania degradacji metabolitów i zapewnienia odtwarzalności w dalszych analizach metabolomicznych.
   3. Ekstrahować metabolity z próbek kału i osocza zgodnie z krokami protokołu odpowiednio 1.3 lub 1.4.
2. Badana populacja
   1. Wykonaj podstawowe pomiary ciśnienia krwi i zapisz historie leków wszystkich uczestników.
   2. Pobrać próbki od pacjentów przed jakimkolwiek ostrym pogorszeniem klinicznym, z wyłączeniem osób z głównymi chorobami współistniejącymi metabolicznymi (np. cukrzyca, pierwotne nadciśnienie), aby zminimalizować czynniki zakłócające w analizie metabolomicznej (tabela uzupełniająca S1).
   3. Uzyskaj informacje kliniczne dla każdego pacjenta przy użyciu standardowych procedur.
3. Ekstrakcja osocza
   1. Odwirować surowicę w temperaturze 14 000 × g przez 10 minut (4-8 °C). Zebrać supernatant do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   2. Dodać schłodzony (-80 °C) metanol klasy HPLC, aby osiągnąć stężenie metanolu 80% (v/v). Delikatnie wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze -80 °C przez 6-8 godzin.
   3. Wirować przy 14 000 × g przez 10 minut (4-8 °C). Przenieść supernatant metanolowy do świeżych probówek w celu profilowania metabolomicznego.
      UWAGA: Próbki osocza po pobraniu umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C w ciągu 2 godzin i zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, aby zapewnić stabilność metabolitów.
4. Ekstrakcja kału
   1. Dodać 500 μl metanolu klasy HPLC (wstępnie schłodzonego do -80 °C) do świeżych lub mrożonych próbek kału w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Homogenizować za pomocą mikrotłuczka/homogenizatora tkankowego na suchym lodzie przez 1-2 minuty, następnie wirować (1 min w temperaturze 4-8 °C) i inkubować w temperaturze -80 °C przez 4 godziny.
   2. Wirować przy 14 000 × g przez 10 minut (4-8 °C) za pomocą wirówki z chłodzeniem. Przenieść supernatant do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; przechowywać w temperaturze -80 °C do etapu 1.4.4.
   3. Zawiesić osad za pomocą 400 μl wstępnie schłodzonego (-80 °C) metanolu klasy HPLC. Dokładnie przetworzyć wir (1 min w temperaturze 4-8 °C) i inkubować w temperaturze -80 °C przez 30 minut.
   4. Powtórzyć wirowanie (14 000 × g, 10 min, 4-8 °C). Połączyć supernatanty z obu faz ekstrakcji.
   5. Przeprowadzić odwirowanie końcowej klaryfikacji (14 000 × g, 10 min, 4-8 °C). Przenieść oczyszczony supernatant do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml w celu dalszej analizy.
      UWAGA: Próbki kału po pobraniu umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C w ciągu 2 godzin i zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, aby zapewnić stabilność metabolitów.

2. Izolacja tętnicy nerkowej

1. Selekcja uczestników i pobieranie tkanek
   1. Badania przesiewowe pacjentów poddawanych radykalnej nefrektomii w kierunku raka nerkowokomórkowego. Uwzględnij tylko osoby w wieku od ≥ 18 lat bez współistniejących chorób metabolicznych (np. pierwotne nadciśnienie, cukrzyca). Podczas zabiegu należy pobrać histologicznie prawidłowy miąższ nerki znajdujący się co najmniej 3 cm od brzegów guza.
   2. Zebrane próbki należy natychmiast zanurzyć w natlenionym buforze Krebs-Henseleit (4 °C, pH 7,4; skład w mM: 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 25,0 NaHCO₃, 1,2 KH₂PO₄, 11,0 glukozy). Procedury izolacji należy zakończyć w ciągu 6 godzin od zabiegu.
2. Opracowanie tkanki nerkowej
   1. Przeprowadzić przekrój koronalny w buforze Krebsa o temperaturze 4 °C w celu uzyskania próbek heminefrycznych zawierających nienaruszone struktury wnękowe. Wykonaj mikrodysekcję za pomocą systemu stereomikroskopowego (40-krotne powiększenie), aby odsłonić gałęzie tętnic łukowatych nerek i zidentyfikować tętnice łukowate.
3. Rozwarstwienie mikronaczyniowe
   1. Osiągnij precyzyjną izolację odcinków tętniczych poprzez sekwencyjne usuwanie okołonaczyniowej tkanki przybyszowej za pomocą nożyczek mikrorogówkowych.
   2. Zachować odcinki tętnic o średnicy około 500 μm.
   3. Zminimalizuj naprężenia ścinające śródbłonka poprzez beznapięciową manipulację za pomocą mikrokleszczyków. Przeprowadzić sekcję w warunkach hipotermii (4 °C) z buforem Krebsa odnawianym co 15 minut w celu zachowania fizjologicznego pH i homeostazy jonowej.
      UWAGA: Wyraźne ilościowe określenie wymiarów tętnic i składu bufora, regulowany termicznie przepływ pracy od pobrania (4 °C) do przetwarzania (4 °C) oraz pełna dyssekcja mikronaczyniowa w ciągu 6 godzin po pobraniu próbki zapewniają optymalną żywotność tkanek i integralność funkcjonalną.

3. Inkubacja tętnicy nerkowej z metabolitami uszkodzenia serca

1. Przygotowanie tkanki naczyniowej: Wyciąć tętnice nerkowe mikrochirurgicznie w sterylnych warunkach i skrupulatnie usunąć przylegającą okołonaczyniową tkankę łączną za pomocą cienkich kleszczy okulistycznych. Izolowane tętnice nerkowe należy podzielić na 2 mm segmenty za pomocą sterylnych mikronożyczek w celu późniejszej hodowli organotypowej.
2. Odkażanie antybiotykami: Płukać segmenty naczyń krwionośnych przez 3 x 5 minut solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) uzupełnioną potrójnym koktajlem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, aby zminimalizować zanieczyszczenie mikrobiologiczne i zapewnić sterylność przed ekspozycją na metabolit.
3. Grupowanie eksperymentalne: Losowo przypisz segmenty naczyniowe do czterech kohort eksperymentalnych i przenieś na 24-dołkowe płytki hodowlane zawierające 500 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle na studzienkę.
4. Interwencja metabolitowa
   1. Dodać metabolity z następujących grup: 1) Metabolity pochodzące z osocza w stanie zdrowia (HC-P); 2) Metabolity pochodzące z osocza u pacjentów z niewydolnością serca (HF-P); 3) Zdrowe metabolity pochodzące z kału kontrolnego (HC-F); 4) Metabolity pochodzące z kału (HF-F) u pacjentów z niewydolnością serca.
   2. Rozpuść ekstrakty metabolitów w metanolu (klasy HPLC) i podaj 10 μl każdego ekstraktu do odpowiedniego dołka na 24-dołkowej płytce hodowlanej, która zawiera 500 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco i segmenty tętnicy nerkowej (końcowe stężenie rozpuszczalnika 2% (v/v)). Dodać równoważne objętości nośnika (mieszaniny metanolu/PBS) do studzienek kontrolnych.
5. Warunki hodowli: Inkubować zestawy płytek w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO₂, 95 % wilgotności) przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze.

4. Test pierścienia tętnicy nerkowej

1. Zawiesina i stabilizacja pierścienia tętniczego nerki
   1. Przygotowanie drutu: Przeciągnij dwa równoległe druty ze stali nierdzewnej o długości 2 cm (wstępnie zrównoważone w Krebs, 95% O₂/5% CO₂) przez światło tętnicy pod mikroskopią optyczną, zapewniając równy występ drutu na obu końcach.
   2. Montaż miografu: Włącz system grzewczy i gaz, aby utrzymać fizjologiczną temperaturę i natlenienie. Zabezpiecz przewody poziomo w wannie miografowej z drutu o kontrolowanej temperaturze (Krebs, 95% O₂/5% CO₂). Wyreguluj pokrętła śrubowe, aby utrzymać naturalne rozluźnienie naczyń.
2. Określenie optymalnego napięcia początkowego z normalizacją specyficzną dla naczynia
   UWAGA: Napięcie spoczynkowe zostało dostosowane przy użyciu procedury normalizacji w celu standaryzacji warunków wyjściowych, optymalizacji reakcji naczyń i zapewnienia odtwarzalności. Równoważ przez 30 minut przed przystąpieniem do normalizacji.
   1. Wybierz Ustawienia normalizacji z menu DMT , używając następujących parametrów: kalibracja okularu: 1 mm/dz.; ciśnienie docelowe: 13,3 kPa; Stosunek IC1/IC100: 0,9 C; Uśrednianie online: 3 s; Czas opóźnienia: 60 s.
      UWAGA: Dodatkowe informacje ogólne i szczegółowe informacje na temat konfiguracji systemu znajdują się w przywołanym dokumencie¹⁷.
   2. Aby znormalizować naczynie, wybierz interesujący Cię kanał i wypełnij ekran normalizacji danymi. Ustaw punkty końcowe tkanki na podstawie odczytu mikrometru i średnicy drutu 40 μm.
   3. Zastosuj pasywne rozciąganie i odczekaj 3 minuty. Podawaj 60K⁺ , aby wywołać skurcz za pośrednictwem potasu i poczekaj, aż skurcz osiągnie plateau. Płukać preparat 3 x 5 min roztworem Krebsa, aby wypłukać 60K⁺. Obliczyć siłę czynną, odejmując siłę bierną na każdym poziomie rozciągania od siły indukowanej potasem zarejestrowanej na ścieżce.
   4. Powtarzaj krok 4.2.3, aż do osiągnięcia maksymalnej siły czynnej. Zdefiniuj optymalne napięcie spoczynkowe jako poziom zapewniający maksymalne napięcie czynne w każdej tętnicy, z szczytowymi reakcjami na wysokie K⁺ używane jako skurcze odniesienia.
   5. Równoważ pierścień tętniczy przez 10 minut przed dalszymi eksperymentami.
      UWAGA: Ze względu na znaczną zmienność międzyosobniczą w stopniach, grubościach i pochodzeniu naczyń, należy znormalizować każde naczynie krwionośne indywidualnie, aby zapewnić odtwarzalność. Użyj modułu normalizacji systemu miografu drutowego, aby określić odpowiednie napięcie podstawowe w oparciu o średnicę pasywną i właściwości mechaniczne każdego naczynia. Zastosuj procedurę spójnie we wszystkich próbkach przed testami funkcjonalnymi.
3. Wykrywanie reaktywności pierścieni tętnicy nerkowej
   1. Aby zbadać wpływ różnych metabolitów na kurczliwość naczyń krwionośnych, należy wykonać testy czynnościowe skurczu naczyń krwionośnych przy użyciu tętnic nerkowych inkubowanych z wyekstrahowanym osoczem i metabolitami kałowymi od zdrowych ochotników i pacjentów z niewydolnością serca przez 12 godzin. Szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 3.
   2. Użyj 60K⁺ , aby wywołać skurcz za pośrednictwem potasu. Upewnij się, że w każdej komorze znajduje się 5 ml roztworu Krebsa.
   3. Aby określić wywołane fenylefryną (Phe), zależne od stężenia skurcze w pierścieniach tętniczych, dodawaj Phe w odstępach półlogarytmicznych od ^10-9 do ^10-4 M. Zacznij od najniższego stężenia Phe, wprowadź je do komory i poczekaj na stały skurcz.
   4. Zaznacz miejsce, w którym osiągany jest stały skurcz (tj. zapisz wartość napięcia na plateau), a następnie przejdź do następnego stężenia. Powtarzać tę czynność, aż końcowe stężenie zostanie pomyślnie dodane.
   5. Po zakończeniu eksperymentu zapisz plik danych i usuń pierścienie tętnicze. Dobrze oczyść komorę 8% roztworem kwasu octowego, a następnie inkubuj przez 3 minuty.
   6. Wyłącz system grzewczy i gaz, upewniając się, że cała ciecz została usunięta przed wyłączeniem gazu.

5. Badanie histopatologiczne tętnicy nerkowej: barwienie hematoksyliną-eozyną

UWAGA: Odczynniki niebezpieczne i odpady biologiczne należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego i higieny chemicznej. W szczególności ksylen i paraformaldehyd powinny być zbierane w oznakowanych, zamykanych pojemnikach na odpady chemiczne i przechowywane w wyznaczonym obszarze dygestoria przed usunięciem przez certyfikowane osoby zajmujące się odpadami niebezpiecznymi. Kwas octowy używany do czyszczenia komory miografu musi zostać zneutralizowany i zutylizowany zgodnie ze standardowymi procedurami usuwania odpadów kwasowych. Nie wylewaj żadnego z tych odczynników do zlewów laboratoryjnych.

1. Umyj tętnice w zimnym PBS i utrwal w 4% paraformaldehydzie (pH 7,4) przez noc. Wyciąć odcinki szeregowe pod kątem 4 μm i poddać procesowi histologicznemu.
2. Skrawki tkanek zamontowane na szkiełkach podstawowych należy inkubować w suszarce do szkiełek podstawowych w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę, a następnie natychmiast przenieść do ksylenu. Zanurz sekcje w ksylenie (3 x 5 min).
3. Poddaj sekcje stopniowemu uwodnieniu etanolu: 100% etanol (2 x 5 min), 95% etanol (1 x 5 min), 90% etanol (1 x 5 min), 80% etanol (1 x 5 min), 70% etanol (1 x 5 min), spłukanie wodą ultraczystą (1 x 5 min).
4. Barwienie hematoksyliną (0,5% w/v) przez 5 min; Następnie spłucz pod bieżącą wodą.
5. Różnicować z 1% kwaśnym alkoholem (HCl-etanolem) przez 5-10 s i spłukać pod bieżącą wodą.
6. Niebieskie sekcje w 0,6% wodzie amoniakalnej i spłucz pod bieżącą wodą.
7. Zanurz skrawki w roztworze eozyny (1% w/v) na 2 minuty.
8. Odwodnić i oczyścić skrawki w 95% etanolu (2 x 5 min), 100% etanolu (2 x 5 min) i ksylenie (2 x 5 min).
9. Suszyć krótko na powietrzu, aż do uzyskania przezroczystości optycznej, zamontować w medium montażowym, przykryć szkiełkami nakrywkowymi i uszczelnić szkiełka nakrywkowe neutralnym środkiem montażowym.
10. Wykonaj obrazowanie w jasnym polu i ocenę histomorfometryczną.

6. Wykrywanie biomarkerów molekularnych związanych z uszkodzeniem nerek

1. Ekstrakcja mRNA z tętnicy nerkowej
   1. Dodać kriokonserwowaną tkankę naczyniową w ciekłym azocie do 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA i przenieść do wstępnie schłodzonego homogenizatora tkankowego w celu dokładnej homogenizacji.
   2. Dodać 250 μl chloroformu na 100 μl odczynnika ekstrakcyjnego, energicznie wirować przez 30 s i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
   3. Odwirować przy 12 000 × g (10 min, 4 °C) i przenieść fazę wodną do świeżej probówki.
   4. Dodać 500 μl izopropanolu do fazy wodnej, wymieszać przez odwrócenie i inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 °C.
   5. Odwirować przy stężeniu 12 000 × g (10 min, 4 °C) i odrzucić supernatant.
   6. Przemyć osad 1 ml 75% etanolu (2 x 5 min), wysuszyć na powietrzu osad RNA i ponownie zawiesić w DEPC-H₂O (0,1% v/v).
      UWAGA: Sprawdź czystość RNA (OD₂₆₀ / OD₂₈₀ = 1,9-2,0) i potwierdź nienaruszone prążki 28S / 18S rRNA.
2. Synteza cDNA
   1. Wymieszać 2 μg mRNA + 1 μl startera oligo(dT), dostosować do 8 μl z DEPC-H₂O (0,1% v/v), ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 5 minut i schładzać na lodzie przez 5 minut.
   2. Przygotuj główną mieszaninę odwrotnej transkrypcji w 10 μl 2x TS Reaction Mix, 1 μl RT/RI Enzyme Mix i 1 μL gDNA Remover. Dodać 12 μl mieszanki wzorcowej do 8 μl mieszaniny RNA/startera z kroku 6.2.1, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji wynoszącą 20 μl.
   3. Podgrzej mieszaninę z kroku 6.2.2. w temperaturze 42 °C przez 60 minut i zakończyć proces ogrzewaniem w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
   4. Rozcieńczyć 20 μl reakcji odwrotnej transkrypcji, dodając 80 μl H₂O bez nukleaz, co daje końcową objętość 100 μl (4x rozcieńczenie). Użyj rozcieńczonego cDNA jako matrycy do ilościowego PCR.
3. Ilościowa analiza PCR
   1. Rozpocznij reakcję, mieszając 2,0 μl matrycy cDNA, 0,5 μl startera do przodu (10 μM), 0,5 μl startera odwrotnego (10 μM), 10 μl mieszanki głównej SYBR Green (2x) i 7 μl ddH₂O.
   2. Przeprowadzić PCR przy użyciu następujących ustawień: początkowa denaturacja: 95 °C/3 min; 40 cykli: 95 °C/30 s; Tm-5 °C/30 s; 72 °C/30 s; krzywa topnienia: 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
   3. Analiza ekspresji genów metodą 2-ΔΔct. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli uzupełniającej S2.

Wyniki

Kohorta składała się z dwóch kobiet i dwóch mężczyzn w wieku od 46 do 73 lat (średni wiek: 64,0 lat). Wyjściowe pomiary ciśnienia krwi wykazały skurczowe ciśnienie krwi w zakresie od 109 do 168 mmHg i ciśnienie rozkurczowe od 68 do 115 mmHg. Wszyscy pacjenci z niewydolnością serca mieli rejestrowane historie leków, w tym popularnych leków kardioprotekcyjnych, takich jak beta-blokery, statyny i leki przeciwpłytkowe, z indywidualnymi różnicami w inhibitorach układu renina-angiotensyna i diuretykach. Do grupy kontrolnej zre...

Dyskusja

Ostatnie badania nad CRS zidentyfikowały przeprogramowanie metaboliczne jako kluczowy mechanizm patologiczny, w którym metabolity regulują homeostazę naczyń nerkowych ^7,8,9. Podczas gdy VSMC odgrywają kluczową rolę w regulacji napięcia naczyniowego i podatności w CRS, nasze badanie dostarcza bezpośrednich dowodów na to, że metabolity związane z uszkodzeniem serca upośledzają kurczliwość i integralność strukturalną mięśni gładkic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM Wysoki poziom glukozy	Gibco (firma Gibco)	Kot# 06-1055-57-1-ACS
PBS	Solarbio (Słoneczna Biologia)	Kot# P1010
Penicylina-Streptomycyna-amfoterycyna B	Thermo Fisher Naukowy	Kot# 15240062
Fenylefryna	MCE (Certyfikat MCE)	Kot#HY-B0769
System odwrotnej transkrypcji	Preparat Promega	Kot# A5001
System stereomikroskopowy	Księga Leica	Zobacz materiał M80
SYBR Zielony master mix	Thermo Fisher Naukowy	Kot# 4309155
System pomiaru napięcia naczyniowego	DMT	620 mln