Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA₂

Fosfatydylinozytol (PI) to fosfolipid anionowy składający się z szkieletu kwasu fosfatydowego powiązanego z inozytolem, sześciowęglowym pierścieniem heksahydroksowym, za pośrednictwem grupy fosforanowej. Inozytol można odwracalnie przekształcać w fosfoinozydy przez fosforylację na pozycjach 2, 3, 4, 5 i 6^{węgla 1}. PI i fosfoinozydy występują w błonach plazmatycznych i organellach różnych komórek zwierząt, roślin i mikroorganizmów. Siedemdziesiąt lat po ich odkryciu przez Mable'a i Lowella Hokina ^2,3,4, PI i fosfoinozydy pozostają przedmiotem szeroko zakrojonych badań mających na celu zrozumienie ich mechanizmów molekularnych i ich znaczenia dla zdrowia ludzi ^5,6,7.

Poza tkanką mózgową, fosfoinozydy występują zazwyczaj w niskich stężeniach, odpowiadając za około 0,5 do 1% całkowitej liczby lipidów w wewnętrznej płatce błony plazmatycznej. Opublikowane dane wskazują, że PI prawdopodobnie nie będzie pełnić głównej roli strukturalnej w warunkach fizjologicznych¹. Jednak w stadiach chorobowych poziomy PI i fosfoinozydów wzrastają, a one przechodzą na zewnętrzną płatkę błony plazmatycznej, co wskazuje, że te fosfolipidy mogą być powiązane z odpornością na chorobę¹. Chociaż od dawna uważa się, że PI odgrywa mniej istotną rolę fizjologiczną w porównaniu do fosfoinozydów, pojawiające się dowody podkreślają znaczenie PI-4-P i PI-4,5-P₂ w różnych procesach fizjologicznych¹. Procesy te obejmują sygnalizację wewnątrzkomórkową, międzykomórkową transdukcję sygnałów ^8,9,10, transport błonowy 11,12,13, modulację ekspresji genów ¹, a także proliferację komórek¹⁴ i przeżywalność¹. Mimo to mechanizmy molekularne, dzięki którym PI i fosfoinozydy napędzają te procesy, pozostają słabo poznane.

PI i fosfoinozydy są obficie obecne w komórkach tkanki mózgowej, gdzie stanowią około 10% wszystkich fosfolipidów, choć ich poziomy mogą przejściowo wzrastać we wczesnych stadiach chorób mózgu, co sugeruje, że fosfoinozydy mogą przeciwdziałać rozwojowi patologii neurologicznych^1, takich jak stwardnienie rozsiane i choroba Alzheimera, wywołane przez demielinizację aksonalną spowodowaną nieprawidłową aktywnością PLA₂^{15, 16,17}. Enzymy te należą do różnych klas i grup, w tym do grupy IIA wydzielniczej fosfolipazy A₂ (sPLA₂)¹⁵. Podwyższone poziomy tej grupy enzymów występują w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i chorobą Alzheimera, gdzie przyczyniają się do rozkładu błon mielinowych prowadzących do demielinizacji¹⁵. Zgłoszono również, że sPLA₂s pochodzące z jadu węża hamuje transmisję na synapsach nerwowo-mięśniowych^18,19, powodując zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego i negatywnie wpływając na obwodowy układ nerwowo-mięśniowy²⁰.

W tym badaniu badaliśmy, czy PI i fosfoinozydy mogą chronić modelowe błony fosfolipidów przed działaniem nieprawidłowo ekspresowanych enzymów sPLA₂. Błony modelowe wykonano z fosfatydylocholiny (PC), najliczniejszego fosfolipidu we wszystkich błonach komórkowych ssaków²¹, wzbogaconego o 20% molowy stosunek PI, PI-4-P lub PI-4,5-P₂. Aby naśladować działanie nieprawidłowo ekspresowanych enzymów sPLA₂ na błony modelowe, użyliśmy podstawowej podjednostki HDP-2P enzymu PLA²² grupy IIA wydzielającej jad żmii grupy IIA, którego aktywność hydrolityczna była wcześniej badana na modelowych błonach mielinowych²³.

W ramach tych prac opracowaliśmy nowatorskie podejście do badania zmian przepuszczalności błon liposomowych dotkniętych przez HDP-2P. Nowatorska metoda opiera się na reakcji podstawiania ligandów w roztworze CuSO₄ poza liposomami, z udziałem ligandu NH₃ uwięzionego wewnątrz liposomów. Jeśli przepuszczalność błony indukowanej przez HDP-2P pozwala na wyciek NH₃ z liposomów, uwolniony amoniak ilościowo zastąpi cztery cząsteczki wody w uwodnionych jonach miedzi poprzez reakcję: [Cu(H₂O)₆]²⁺ (aq) + 4NH₃ (aq) [Cu(H,₂O)₂(NH₃)₄]²⁺ (aq) + 4H₂O (l). Ta wymiana ligandów powoduje charakterystyczny wzrost gęstości optycznej roztworu mierzonej spektrofotometrią (λ = 600 nm), służąc jako ilościowy odczyt zmian przepuszczalności błon. Nasze podejście oparte na podstawieniu ligandów wykazuje wyższą czułość przy ocenie przepuszczalności błony w porównaniu z konwencjonalnymi technikami, takimi jak ¹H-NMR 23,24,25,26,27,28 oraz testy transportu jonowego²⁹, oferując jednocześnie dodatkową zaletę w postaci braku kosztownego instrumentarstwa. Ta prosta i opłacalna metoda, stosowana w połączeniu z pomiarami aktywności hydrolitycznej HDP-2P oraz symulacją in silico wiązania PI, PI-4-P i PI-4,5-P2 z powierzchnią molekularną HDP-2P, pozwoliła nam stwierdzić, że fosforany pierścienia inozytolowego w PI łagodzą zakłócające działanie HDP-2P na membrany PC wzbogacone PI-4-P lub PI-4, 5-P₂. Jeśli to odkrycie zostanie potwierdzone w kolejnych badaniach, zdolność fosforanów pierścieni inozytolowej w PI do ochrony przed szkodliwym działaniem nieprawidłowo działających białek komórkowych, potencjalnie przyczyniających się do stabilności błon w chorobach związanych z nieprawidłową aktywnością białek, może utorować drogę do opracowania nowych leków do leczenia zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane.

1. Symulacja in silico interakcji HDP-2P z PI i fosfoinozydami z wykorzystaniem oprogramowania do modelowania molekularnego

1. Instalacja i przygotowanie oprogramowania
   1. Zainstaluj edytor rysunków chemicznych do konstrukcji cząsteczek ligandów, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Ilustracja Uzupełniająca S1A.
   2. Zainstaluj oprogramowanie do modelowania molekularnego do molekularnego dokowania ligandu do receptora.
   3. Zainstaluj Automatyczne Narzędzia Dokowania do przygotowania ligandów i receptorów.
   4. Ponieważ oprogramowanie do symulacji modelowania molekularnego zależy od środowiska Pythona, zainstaluj Pythona.
2. Przygotowanie ligandów
   1. Po pierwsze, użyj edytora rysunków chemicznych do zbudowania współrzędnych atomowych struktur molekularnych PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, kardiolipiny i fosfatydyloseriny.
      UWAGA: Przykładowy protokół w kolejnych krokach przygotowania ligandu opisuje tylko kroki dla PI.
   2. Zbuduj strukturę molekularną PI za pomocą edytora rysunków chemicznych, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunku Uzupełniającego S1B , i zapisz plik w formacie PDB, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunek Uzupełniający S2.
   3. Otwórz plik PDB w oprogramowaniu narzędzia do automatycznego dokowania, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Rysunek uzupełniający S3A.
   4. Dodaj atomy wodoru zgodnie z Plikiem Uzupełniającym 1-Rysunkiem uzupełniającym S3B i wybierz albo atomy polarne, albo wszystkie atomy wodoru, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1 - Rysunku uzupełniającym S4A.
      UWAGA: Po zakończeniu dokowania PI z HDP-2P wybieraj wyłącznie atomy wodoru polarnego, aby ułatwić wizualizację wiązań polarnych lub wodorowych.
   5. Ustaw cząsteczkę PI jako ligand dla automatycznego narzędzia dokowania, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Rysunku uzupełniającym S4B.
   6. Zapisz ligand jako plik PDBQT, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1 – Rysunek uzupełniający S5A. Upewnij się, że wszystkie obligacje są rotacyjne.
3. Przygotowanie receptorów
   1. Pobierz plik PDB fosfolipazy A₂ HDP-2 (kod PDB 2I0U), składający się z dwóch monomerów: jeden jest kwaśny, enzymatycznie nieaktywny, A, a drugi zasadowy, enzymatycznie aktywny, E. Aby usunąć enzymatycznie nieaktywny monomer A, zaimportuj plik 2I0U do oprogramowania do modelowania molekularnego (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S5B), wybierz wszystkie atomy monomeru A (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S6A), a następnie przejdź do Edytuj i usuń wszystkie atomy monomeru A (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S6B). Utrzymuj enzymatycznie aktywny monomer E, który obecnie jest wyznaczony jako receptor.
   2. Otwórz plik PDB receptora HDP-2P w oprogramowaniu narzędzia do automatycznego dokowania, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Rysunku uzupełniającym S7.
   3. Usuń wszystkie cząsteczki wody, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1 – Rysunku uzupełniającym S8A.
   4. Dodaj atomy wodoru zgodnie z Plikiem Uzupełniającym 1-Rysunkiem uzupełniającym S8B. Prosimy pamiętać, że po zakończeniu dokowania HDP-2P z PI, należy wybrać jedynie wodory polarne, aby ułatwić wizualizację wiązań polarnych i wodorowych.
   5. Ustaw HDP-2P jako receptor, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunku Uzupełniającego S9A, i zapisz go jako plik PDBQT. Upewnij się, że receptor jest ustawiony bez więzów obrotowych.
4. Konfiguracja parametrów dokowania
   1. Otwórz zarówno pliki ligandu, jak i receptora PDBQT.
   2. Wejdź do interfejsu konfiguracji siatki pudełek, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1-Ilustracja uzupełniająca S9B, i zdefiniuj rozmiar siatki (rozmiar x = 44,644; rozmiar y = 74,939; rozmiar z = 43,050) oraz współrzędne (środek x = 25,626; środek y = 9,582; środek z = 41,825), które w pełni obejmują całą powierzchnię cząsteczki receptora, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1 - Ilustracja uzupełniająca S10A.
   3. Zamknij interfejs konfiguracyjny grid box z aktualnymi ustawieniami, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Dodatkowym Rysunku S10B i zapisz parametry dokowania w pliku config.txt, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Dodatkowym Rysunku S11A.
5. Uruchamianie oprogramowania dokującego molekularnego
   1. Uruchom oprogramowanie dokujące molekularne, korzystając z pliku config.txt, jak pokazano w Pliku Uzupełniającym 1-Rysunku Uzupełniającym S11B.
   2. Wykonaj obliczenia dokowania (~30-90 min; Plik uzupełniający 1-Rysunek uzupełniający S12).
   3. Sprawdź plik docking_log.txt, aby przejrzeć wyniki dokowania (powiązanie wiązania).
   4. Wybierz wynik dokowania o najniższej konformacji energetycznej.
6. Analiza danych dokowania
   1. Użyj oprogramowania do automatycznego dokowania, aby otworzyć plik PDBQT z wynikiem dokowania.
   2. Przeanalizuj miejsca wiązania ligand-receptor, koncentrując się na aktywnym centrum receptora oraz interakcjach międzycząsteczkowych, w tym wiązaniach jonowych, jonowo-polarnych, polarnych i wodorowych. Sporządź tabelę dla PI i fosfoinozydydu, które oddziałują z aktywnym miejscem receptora, aby opisać powinowactwa miejsc wiązania w kcal/mol, naładowane i polarne części w głowie polarnej PI/fosfoinozytydowej oraz reszty HDP-2P zaangażowane w wiązania międzycząsteczkowe, a także rodzaje wiązań pokazanych w Tabeli 1 i Tabeli 2. Powtórz dokowanie dla każdej pary receptor-ligand 3 razy, aby upewnić się, że nie ma odchyleń w miejscach wiązania, powinowactwach wiązania, naładowanych i polarnych połowach reszt PI/fosfoinozydydu i HDP-2P oraz rodzaju wiązań.

2. Aktywność hydrolityczna HDP-2P w liposomach PC wzbogaconych o PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS lub CL, monitorowana za pomocą koenzymu A asylowanego wolnymi kwasami tłuszczowymi

UWAGA: Chloroform, metanol, NH₃ i CuSO₄ są niebezpieczne. Zawsze używaj rękawiczek nitrylowych, gogli i fartucha laboratoryjnego. Zajmij się wszystkimi protokołami z tymi odczynnikami pod maską oparową. Przechowuj chloroform w butelce z bursztynowego szkła. Przechowuj metanol w łatwopalnych szafkach, z dala od utleniaczy. Trzymaj metanol z dala od płomieni i iskier. Oznaczaj wszystkie pojemniki na odpady z tymi odczynnikami i utylizuj je zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów niebezpiecznych.

1. Przygotuj 100 mL roztworu buforowego do hydrolizy fosfolipidów katalyzowanych przez HDP-2P poprzez rozpuszczenie 5,55 mg CaCl₂ w buforze Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4).
2. Przygotuj 50 mL roztworu zapasowego 1,0 M EDTA poprzez rozpuszczenie 7,31 g EDTA w destylowanej wodzie destylowanej (ddH₂0).
3. Przygotuj 0,54 mM roztworu HDP-2P w buforze Tris-HCl o pojemności 0,10 m (pH 7,4). Masa molowa HDP-2P wynosi 13,827 kDa.
4. Przygotuj następujące roztwory zapasowe fosfolipidów w stężeniu 10,0 M w mieszance chloroformu i metanolu (2 do 1 objętościowo): żółtko jaj L-α-fosfatydylocholina (PC), serce bydła kardiolipina (CL), mózg bydła L-α-fosfatydylo-L-seryna (PS), PI, PI-4-P oraz PI-4,5-P₂. Masy molowe PC, CL, PS, PI, PI-4-P i PI-4,5-P₂ to odpowiednio 768 Da, 1 466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da i 1 057 Da, jak opisano poniżej.
5. Przygotuj pięć próbek liposomów PC. Aby przygotować próbkę liposomów PC, dodaj 75 μL roztworu chloroformu/metanolu PC do szklanej probówki i susz lipidy w temperaturze 25 °C pod próżnią 10 Pa przez godzinę, aż powstanie film lipidowy. Nawadnij błonę lipidową przez 1 godzinę 15 mL roztworu buforowego do hydrolizy fosfolipidów w temperaturze 25 °C w termostacie. Następnie włóż tytanowy pistolet z dozownika ultradźwiękowego 100-150 W do zawiesiny lipidowej w szklanej probówce umieszczonej w kąpieli lodowej i sonikuj zawiesinę na częstotliwości 22 kHz przez 10 minut, nie przekraczając 50% maksymalnej mocy. Aby usunąć cząstki tytanu "pyłowe", wiruj liposomy o temperaturze 200 × g (1 270 obr./min z rotorem 10 cm) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Przygotuj próbki liposomów PC wzbogaconych o CL, PS, PI, PI-4-P lub PI-4,5-P₂ w stosunku PC oraz innych lipidów molowych 4 do 1, mieszając roztwory zapasowe chloroformu/metanolfosfolipidów-60 μL PC z 15 μL CL, PS, PI, PI-4-P lub PI-4,5-P_2-w szklanej tubie. Następnie susz lipidy w próżni 10 Pa lub przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, nawilżaj film lipidowy w roztworze buforowym do hydrolizy fosfolipidów i soniknuj falami ultradźwiękowymi, jak opisano powyżej.
   UWAGA: Dla każdego typu liposomów przygotuj pięć próbek.
7. Umieść 1,0 mL z pięciu próbek każdego typu liposomów opisanych powyżej do oddzielnych probówek i dodaj 10 μL bezbarwnego roztworu koenzymu-A z zestawu NEFA do każdej probówki, a następnie dodaj 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 lub 3,72 μL roztworu zapasowego 0,54 mM HDP-2P do oddzielnych probówek, aby uzyskać w próbkach liposomów molowe proporcje molowe HDP-2P/fosfolipidów wynoszące 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 i 0,004, odpowiednio.
8. Bezpośrednio po dodaniu HDP-2P do liposomów inkubuj próbki liposomów przez 15 minut w temperaturze 37 °C w termostacie, a następnie zatrzymaj hydrolizę fosfolipidów indukowaną przez HDP-2P poprzez dodanie 100 μL roztworu EDTA z bazy. Potem przez 1 minutę przekuwaj próbki w wir.
9. Ilościowo określić aktywność hydrolityczną HDP-2P, mierząc gęstość optyczną próbek liposomatów na 550 nm za pomocą spektrofotometru, który zmierzyłby stopień, w jakim bezbarwny roztwór koenzymu-A staje się fioletowy po asylacji wolnymi kwasami tłuszczowymi.
10. Powyższa procedura powtórz się jeszcze dwa razy, aby uzyskać średnie wartości gęstości optycznej z trzech niezależnych prób.
    UWAGA: Każdy punkt danych uzyskany w tym eksperymentalnym badaniu to średnia wartość gęstości optycznej. Idealnie odchylenie standardowe punktów danych eksperymentalnych powinno mieścić się w granicach ±5% od średniej.

3. Wpływ HDP-2P na przepuszczalność błon liposomalnych PC wzbogaconych PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS lub CL mierzone przez reakcję podstawienia ligandu w roztworze CuSO₄, z udziałem ligandu NH₃ uwięzionego wewnątrz liposomów

UWAGA: Chloroform, metanol, NH₃ i CuSO₄ są niebezpieczne. Zawsze używaj rękawiczek nitrylowych, gogli i fartucha laboratoryjnego. Zajmij się wszystkimi protokołami dotyczącymi tych odczynników pod maską oparową. Przechowuj chloroform w butelce z bursztynowego szkła. Przechowuj metanol w łatwopalnych szafkach, z dala od utleniaczy. Trzymaj metanol z dala od płomieni i iskier. Oznaczaj wszystkie pojemniki na odpady z tymi odczynnikami i utylizuj je zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów niebezpiecznych.

1. Przygotuj 20 ml roztworów zapasowych 0,03 M dla każdego z sześciu fosfolipidów – PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P₂- w chloroformie/metanolu (2 do 1 objętości). Masy cząsteczkowe PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P₂ to odpowiednio 768, 1466, 792, 867, 962 i 1057 Da.
2. Przygotuj 100 mL buforu Tris-HCl o zawartości 0,10 M (pH 7,4) z końcowym stężeniem 0,05 M CuSO₄.
3. Przygotuj 4 mL 1,5 × ^10-3 M HDP-2P w buforze 0,05 M CuSO₄, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4). Masa molowa HDP-2P wynosi 13,827 kDa.
4. Aby przygotować 100 mL roztworu NH₃ 0,5 M, należy użyć roztworu 25% NH₃ (gęstość 905 g/L³⁰, równa 13,30 M [905 g/L × 0,25 M ÷ 17,00 g/L = 13,30 M]). Aby przygotować 100 mL 0,5 M NH₃, należy użyć 3,76 mL roztworu NH₃ 25%: (0,5 M × 1000 mL ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 mL roztworu NH₃ 25%. Włóż 3,76 mL roztworu NH₃ 25% do kolby objętościowej 100 mL i zmień objętość do 100 mL za pomocą buforu Tris-HCl (pH 7,4) 0,10 M.
5. Aby przygotować liposomy z NH₃ w wewnętrznej objętości liposomów, umieść 12,5 mL roztworu fosfolipidów 0,03 M w chloroformie/metanolu w tubce i wysusz fosfolipidy w próżni 10 Pa lub przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Nawadnij folię fosfolipidową przez 1 godzinę 12,5 mL 0,5 M NH₃, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) w termostacie 25 °C; następnie sonikować zawiesinę lipidową z częstotliwością 22 kHz, jak opisano w kroku 2.5, aby uzyskać sonikowane liposomy.
   UWAGA: W roztworze z liposomami sonikowanymi NH₃ znajduje się wewnątrz i na zewnątrz liposomów.
6. Aby wyeliminować NH₃ spoza liposomów, dializuj liposomy za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie molekularne 1,0 kDa) o temperaturze pokojowej 5 kap w porównaniu do 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) za pomocą mieszadła magnetycznego.
   UWAGA: Dializa trwająca 5 godzin wystarczyła do całkowitego usunięcia NH₃, ponieważ dodanie 0,5 mL dializowanych liposomów do 0,5 mL buforu Tris-HCl 0,10 M Tris-HCl i 0,05 M CuSO₄ dało taką samą gęstość optyczną przy 600 nm jak liposomy przygotowane bez_{NH 3} i zmieszane z tym samym buforem.
7. Po dializie wiruj liposomy w dawce 200 × g przez 90 minut, zgodnie z krokiem 2.5, aby rozpylić liposomy. Usuń supernatant i ponownie zawiesij liposomy z 5,0 mL buforu 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO₄ (pH 7,4) i podziel ponownie zawiesowane liposomy na pięć próbek po 1,0 mL każda. Do tych pięciu próbek po 1,0 mL osobno należy dodać 80, 60, 40, 20 i 0 μL buforu 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO₄ (pH 7,4), a następnie 0, 20, 40, 60, 80 μL buforu HDP-2P, aby skorygować w próbkach liposomów stosunki molowe HDP-2P/fosfolipidów 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 i 0,004, odpowiednio.
8. Inkubuj próbki liposomów przez 30 minut w termostacie w temperaturze 37 °C; Następnie zmierz gęstość optyczną próbek liposomów przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3 dla wszystkich sześciu próbek liposomów i powtarzaj 3 razy, aby zapewnić potrójne odczyty gęstości optycznej dla każdego punktu danych.
   UWAGA: Odchylenie standardowe punktów danych eksperymentalnych powinno zawsze mieścić się w granicach ±5% od średniej.

Symulacja modelowania molekularnego interakcji HDP-2P z PI i fosfoinozydami
Program modelowania molekularnego oblicza dziewięć najlepszych miejsc wiązania na powierzchni molekularnej receptora (większej cząsteczki), który jest celowany przez ligand (mniejszą cząsteczkę). Miejsca te są określane przez uwolnienie dziewięciu najwyższych entalpii, które wyznaczają miejsca o najlepszych powinowactwach wiązania. Powinowactwa wiązania wyraża się jako wartości ujemne, co wskazuje, że wiązanie międzycząsteczkowe jest procesem egzotermicznym. W przypadku oddziaływania HDP-2P z PI, symulacja przewidywała cztery miejsca wiązania (#3, #6, #7 i #8) dla PI na powierzchni molekularnej HDP-2P w centrum aktywnym (Tabela 1). Dodatkowo pięć miejsc wiązania PI znaleziono poza aktywnym centrum HDP-2P. Oznaczenia naładowanych i polarnych połow w głowie polarnej PI są zilustrowane na Rysunku 1.

Aktywne centrum HDP-2P składa się z pięciu kluczowych reszt aminokwasowych: Gly30, Gly32, His48, Asp49 i Lys69, które umożliwiają prawidłowe ustawienie substratu fosfolipidowego w aktywnym środku, aby zapewnić katalityczną hydrolizę. Niektóre reprezentatywne struktury zadokowane wykazują wiązanie PI z niektórymi aminokwasowymi resztami centrum aktywnego, podczas gdy w miejscu wiązania #6 PI angażuje się we wszystkie pięć kluczowych reszt aminokwasowych centrum aktywnego poprzez wiązania jonowe, jonowo-polarne i wodorowe (Tabela 1). Rysunek 2 ilustruje, jak PI oddziałuje ze wszystkimi pięcioma kluczowymi resztami aminokwasowymi w aktywnym centrum HDP-2P w miejscu wiązania #6.

Symulacja dokowania interakcji między HDP-2P a PI-4-P, który zawiera grupę fosforanową na pozycji 4 pierścienia inozytolowego, przewidywała jedynie miejsce wiązania #1 jako miejsce, gdzie PI-4-P wiąże się z aktywnym centrum HDP-2P. Konkretnie, w tym miejscu PI-4-P oddziałuje z trzema kluczowymi resztami aminokwasowymi aktywnego centrum — Gly30, Gly32 i Lys69 — poprzez wiązania jonowe, jonowo-polarne i wodorowe (Tabela 2). Rysunek 3 ilustruje interakcję PI-4-P z aktywnym centrum HDP-2P. W pozostałych ośmiu miejscach wiązania na powierzchni molekularnej HDP-2P PI-4-P wiąże się z miejscami poza aktywnym ośrodkiem.

Symulacje molekularnego dokowania interakcji HDP-2P z PI-4,5-P2 (zawierającym grupy fosforanowe na pozycjach 4 i 5 pierścienia inozytolowego) wykazały brak wiązania z aktywnym centrum enzymu we wszystkich dziewięciu przewidywanych miejscach wiązania. Zamiast tego PI-4,5-P2 konsekwentnie wiąże się z rowkowatą wnęką przylegającą do aktywnego centrum (Rysunek 4), tworząc wiązania jonowo-polarne i wodorowe z trzema resztami HDP-2P: Trp31, Gly33 i Gln34).

Chociaż wiązanie PI-4,5-P2 z rowkowatą jamą w pobliżu aktywnego centrum komórkowego lub jadowitego PLA2nie zostało wcześniej udokumentowane, strukturalnie analogiczne cechy są dobrze udokumentowane w dziedzinach homologii pleckstrin31 (PH) oraz epsin N-terminalnej32 (ENTH). Te domeny sygnalizacyjne wykorzystują podobne hydrofobowe-biegunowo-kationowe architektury rowków do specyficznego rozpoznawania PI-4,5-P2 31,32, mimo ich nieenzymatycznego charakteru. Obecność porównywalnego motywu strukturalnego w HDP-2P rodzi intrygujące możliwości albo ewolucyjnej mimikry, albo ewolucji zbieżnej, co ułatwia rozpoznawanie domeny błonowej przez HDP-2P. Jeśli zostanie to potwierdzone innymi metodami, badanie to może stanowić pierwszy zgłoszony przypadek jadu PLA2 wykorzystującego taki mechanizm rozpoznawania fosfoinozytydu.

Co ciekawe, symulacje dokowania molekularnego interakcji CL i PS z HDP-2P przewidziały wiązanie obu fosfolipidów z aktywnym centrum HDP-2P w ośmiu z dziewięciu miejsc wiązania, podczas gdy jedyne miejsce wiązania CL i PS poza aktywnym centrum nie znajdowało się w rowkowatej jamie (dane nie pokazano). Warto również zauważyć, że podobnie jak PI, PC wiąże się z aktywnym centrum HDP-2P w czterech z dziewięciu miejsc wiązania, a zarówno PI, jak i PC, podobnie jak CL i PS, nie łączą się z rowkowatą wnęką (dane nie pokazane). Te odkrycia sugerują, że grupy fosforanowe na pierścieniu inozytolowym PI mają wysokie powinowactwo wiązania z rowkowatą wnęką przylegającą do aktywnego centrum. Analizy strukturalne zidentyfikowały analogiczne jamy przypominające bruzdę z hydrofobowo-polarno-kationowymi plamami powierzchniowymi w pobliżu centrum katalitycznego zarówno w enzymachkomórkowych 33, jak i jadu34 PLA2. Wiązanie fosfoinozydów z tymi jamami może wywołać fizjologicznie istotne zmiany konformacyjne, potencjalnie hamując aktywność enzymatyczną. Warto zauważyć, że wśród fosfoinozydów PI-4,5-P2 wykazuje szczególnie słabe cechy podłoża – ludzkie izoformy PLA2 (cytosoliczne, niezależne od wapnia i wydzielane) wykazują minimalną lub niewykrywalną aktywność hydrolityczną w kierunku PI-4,5-P2,35. Sugeruje to, że wiązanie fosfoinozytydu z tymi zachowanymi cechami strukturalnymi może pełnić odrębną funkcję fizjologiczną (np. hamowanie allosteryczne), a nie katalityczną w całej superrodzinie PLA2, co wymaga przyszłej weryfikacji eksperymentalnej.

Aktywność hydrolityczna HDP-2P w liposomach PC wzbogaconych o PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS lub CL monitorowanych za pomocą koenzymu A asylowanego wolnymi kwasami tłuszczowymi
Aktywność hydrolityczną HDP-2P na próbkach liposomatów oceniono za pomocą roztworu koenzymu A. Roztwór koenzymu A jest bezbarwny, ale po acylacji przez wolne kwasy tłuszczowe uwalniane podczas hydrolizy fosfolipidów katalizowanej przez HDP-2P staje się fioletowy. Powstały wzrost gęstości optycznej, odpowiadający zakresowi acylacji koenzymu A, został zmierzony spektrofotometrycznie na 550 nm. Dlatego wzrost gęstości optycznej w próbkach liposomatów poddanych koenzymom A i HDP-2P jest bezpośrednio proporcjonalny do aktywności hydrolitycznej HDP-2P.

Rysunek 5 przedstawia krzywe aktywności hydrolitycznej jako funkcję molowego stosunku HDP-2P/fosfolipidów w różnych próbkach liposomalnych. Aktywność hydrolityczna HDP-2P wyrażana jest w dowolnych jednostkach (a.u.) gęstości optycznej (OD) mierzonej na 550 nm. Nie skonstruowaliśmy krzywej kalibracyjnej łączącej wartości a.u. z molowymi stężeniami wolnych kwasów tłuszczowych, ponieważ nasze eksperymentalne badania wykazały, że kwasy tłuszczowe w rozpuszczalnikach organicznych, dodane do wodnych roztworów zawierających koenzym A i syntetazę akylkoenzymu A, nie powodowały wykrywalnej zmiany przedawkowania przy 550 nm. Wskazuje to, że takie kwasy tłuszczowe tworzą micele, a nie wiążą się z koenzymem A. Natomiast tylko kwasy tłuszczowe generowane przez błonę (produkowane przez aktywność PLA2 ) wiążą się z koenzymem A powiązanym z błoną, co skutkuje mierzalną zmianą przedawkowania. Amfipatyczny charakter koenzymu A — posiadającego zarówno obszary hydrofobowe, jak i hydrofilowe na powierzchni cząsteczkowej — preferencyjnie lokalizuje go na granicy błona-woda, co ułatwia wiązanie kwasów tłuszczowych produkowanych przez aktywność PLA2 z koenzymem A. Jednak w tych warunkach testu nie jest możliwe określenie molowego stężenia kwasów tłuszczowych. Z tego powodu badacze stosujący test koenzymu A wyrażają aktywność hydrolityczną PLA2 w dowolnych jednostkach OD mierzonej na poziomie 550 nm20.

Najwyższy wzrost gęstości optycznej, odpowiadający największej aktywności hydrolitycznej HDP-2P, zaobserwowano w liposomach PC wzbogaconych CL lub PS. To odkrycie dobrze pokrywa się z największą liczbą miejsc wiązania CL i PS w aktywnym centrum HDP-2P. Aktywność hydrolityczna HDP-2P w liposomach PC wzbogaconych o PI była odpowiednio 3,0- i 2,5-krotnie niższa niż w liposomach wzbogaconych o CL lub PS, ale wyższa niż w czystych liposomach PC. Sugeruje to, że powinowactwo wiązania do aktywnego centrum HDP-2P PI jest wyższe niż u PC, mimo że oba lipidy mają taką samą liczbę miejsc wiązania w aktywnym centrum.

Ta pozorna rozbieżność może być wyjaśniona różnicami strukturalnymi w grupach głów biegunowych PI i PC. Chociaż PC jest cząsteczką neutralną, jego kationowa grupa trimetyloammonowa rozciąga się na zewnątrz w roztworze, natomiast grupa fosforanowa anionowa znajduje się bliżej hydrofobowej części błony. Ten rozkład ładunku w grupie głowy PC może powodować elektrostatyczne odpychanie wobec podstawowego HDP-2P, zmniejszając jego powinowactwa wiązania. Natomiast kwaśny charakter PI sprawia, że jest on bardziej atrakcyjnym gatunkiem lipidowym do interakcji z zasadowym HDP-2P, co może tłumaczyć jego wyższą aktywność hydrolityczną w porównaniu z czystymi liposomami PC.

Aktywność hydrolityczna HDP-2P w liposomach PC wzbogaconych PI-4-P, jak pokazano na Rysunku 5, sugeruje minimalną katalityczną hydrolizę fosfolipidów. Co ciekawe, krzywa gęstości optycznej uzyskana z liposomów PC wzbogaconych PI-4,5-P wskazuje na całkowite wyeliminowanie aktywności hydrolitycznej przez HDP-2P w tej próbce liposomu. Wyniki te dobrze pokrywają się z symulacjami dokowania, które przewidują jedno miejsce wiązania PI-4-P w aktywnym centrum HDP-2P, podczas gdy PI-4,5-P2 nie wykazuje żadnego powinowactwa do centrum aktywnego. Sugeruje to, że grupy fosforanowe związane z pierścieniem inozytolowym utrudniają wiązanie fosfolipidów z aktywnym centrum HDP-2P. Proponujemy, że grupy fosforanowe na pierścieniu inozytolowym rozchodzą się na zewnątrz w roztworze, a poprzez wiązanie się z HDP-2P poprzez interakcje jonowe i jonowo-polarne utrzymują HDP-2P w odległości od powierzchni błony, chroniąc tym samym błonę przed aktywnością hydrolityczną HDP-2P. Jest to zgodne z najnowszymi ustaleniami wskazującymi, że ludzkie enzymy cytosolowe, niezależne od wapnia i wydzielane PLA2 wykazywały ledwo wykrywalną lub żadną aktywność hydrolityczną wobec substratów PI-4-P i PI-4,5-P235.

Zmiany przepuszczalności wywołane przez HDP-2P w błonach liposomalnych PC wzbogaconych PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS lub CL: Ocena za pomocą reakcji podstawiania ligandów w roztworze CuSO4 z enkapsulowanym NH3

Wpływ aktywności hydrolitycznej HDP-2P na przepuszczalność błon liposomów PC wzbogaconych o PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS lub CL był badany za pomocą reakcji podstawiania ligandów w układzie jonów złożonych, gdzie ligand podstawiony był zamknięty wewnątrz wewnętrznej objętości liposomów. Ta prosta i niezawodna metoda opiera się na przemieszczeniu czterech cząsteczek wody działających jako ligandy w jonie złożonym [Cu(H2O)6]2+ przez NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

Podczas zastąpienia cząsteczek wody przez NH3 w jonie złożonym [Cu(H2O)6]2+, bladoniebieski kolor [Cu(H2O)6]2+ przechodzi w ciemnoniebieski kolor [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. W układzie, w którym NH3 jest zamknięty wewnątrz wewnętrznej objętości liposomów, a [Cu(H2O)6]2+ jest obecny w roztworze zewnętrznym, ta zmiana koloru — monitorowana spektrofotometrycznie — wskazuje na wzrost przepuszczalności błony liposomalnej dla NH3.

Aby stworzyć taki system, sonikowaliśmy dyspersję fosfolipidów w buforze Tris-HCl zawierającym NH3, tworząc sonikowane liposomy z NH3 wewnątrz i na zewnątrz liposomów. Zewnętrzny NH3 został usunięty dializą, po czym do próbki liposomu zawierającej NH3 w wewnętrznej objętości dodano roztwórCuSO4. Następnie potraktowaliśmy liposomy HDP-2P i monitorowaliśmy zmiany gęstości optycznej spektrofotometrycznie.

Aby określić optymalną długość fali do pomiaru zmian gęstości optycznej, zarejestrowaliśmy widma absorpcji [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ w roztworze 0,025 M CuSO4, 0,100 M NH3 oraz [Cu(H2O)6]2+ w roztworze 0,025 M CuSO4 , używając światła widzialnego w zakresie od 500 nm do 900 nm. Jak pokazano na Rysunku 6, napromieniowanie przy 600 nm dało maksymalną absorpcję dla [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ oraz minimalną absorpcję dla [Cu(H2O)6]2+, co skłoniło nas do wyboru 600 nm jako optymalnej długości fali dla naszych eksperymentów z przepuszczalnością błon.

Rysunek 7 pokazuje, że przepuszczalność błony dla NH3 jest najwyższa w liposomach PC wzbogaconych o anionowe CL i PS. Obserwacja ta jest zgodna z naszymi wcześniej raportowanymi danymi pokazującymi, że HDP-2P, grupa IIA PLA2, efektywnie oddziałuje z anionowym fosfolipidem palmitoyloleoyl-glicerofoglikerolu, prowadząc do hydrolizy substratu – efektu nieobserwowanego u neutralnej fosfolipidowej palmitoyloleoylglicerofocholiny36. Ogólnie rzecz biorąc, większość enzymów PLA2 grupy IIA wykazuje znacząco wyższą aktywność hydrolityczną wobec fosfolipidów anionowych 33,37,38. Przepuszczalność liposomów PC+PI jest niższa niż w liposomach PC+CL i PC+PS, ale pozostaje wyższa niż w czystych liposomach PC. Wyniki te dobrze pokrywają się z wynikami symulacji dokowania oraz testów aktywności hydrolitycznej HDP-2P. Innymi słowy, próbki liposomatów wykazujące niską przepuszczalność mają być stabilne strukturalnie ze względu na niezdolność HDP-2P do hydrolizy fosfolipidów oraz niższą afinitet HDP-2 do wiązania z PI i fosfoinozydami, co przewidują dane dokowania molekularnego (Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4). Dlatego aktywność hydrolityczna enzymów przez HDP-2P (rysunek 5) oraz przepuszczalność błon, jak pokazano na Rysunku 7, powinny być dodatnio skorelowane.

Jednak w liposomach PC+PI-4-P i PC+PI-4,5-P2 przepuszczalność nie wzrosła po leczeniu HDP-2P. Chociaż wyniki przepuszczalności liposomów PC+PI-4,5-P2 dobrze korelują z symulacjami dokowania i danymi aktywności hydrolitycznej HDP-2P dla tych samych liposomów, brak zwiększonej przepuszczalności w liposomach PC+PI-4-P nie jest w pełni zgodny z wynikami aktywności hydrolitycznej, ponieważ w tych liposomach odnotowano niewielki stopień aktywności hydrolitycznej. Wyniki te sugerują, że niewielki lokalny wzrost aktywności hydrolitycznej w liposomach PC+PI-4-P nie zakłóca upakowania fosfolipidów dwuwarstwowych w stopniu, który zmieniałby przepuszczalność błony na NH3.

Rysunek 1: Notacje naładowanych i polarnych części polarnej głowy fosfatydylinozytolu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Interakcja PI z aktywnym centrum HDP-2P przewidziana dla miejsca wiązania #6 przez oprogramowanie dokujące molekularne. PI jest podana w formie przedstawienia patyczkowego, a HDP-2P w liniach (diagram po lewej) oraz powierzchni molekularnej (diagram po prawej). W przypadku przedstawień patyczkowych szmaragd oznacza węgiel, pomarańczowy fosfor, czerwony tlen, a biały wodór. Dla powierzchni i linii molekularnych zieleń oznacza węgiel, niebieski azot, czerwony tlen, biały wodór, a żółty siarkę. Żółte przerywane linie identyfikują wiązania międzycząsteczkowe. Strzałki wskazują na reszty aminokwasowe w aktywnym centrum. Skróty: PI = Phosphatydylinozytol; HDP-2P = podstawowa podjednostka fosfolipazy jadu żmije. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Interakcja PI-4-P z aktywnym centrum HDP-2P przewidziana dla miejsca wiązania #1 przez oprogramowanie dokujące molekularne. PI-4-P jest przedstawiony w formie patyczkowej, a HDP-2P w liniach (diagram po lewej) i powierzchni molekularnej (diagram po prawej). Dla patyków szmaragd oznacza węgiel, pomarańczowy fosfor, czerwony tlen, a biały wodór. Dla powierzchni i linii molekularnych zieleń oznacza węgiel, niebieski azot, czerwony tlen, biały wodór, a żółty siarkę. Żółte przerywane linie identyfikują wiązania międzycząsteczkowe. Strzałki wskazują na reszty aminokwasowe w aktywnym centrum. Skróty: PI-4-P = Fosfatydylinozytol-4-fosforan; HDP-2P = podstawowa podjednostka fosfolipazy jadu żmije. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Interakcja PI-4,5-P2 z powierzchnią cząsteczkową HDP-2P przewidziana dla miejsca wiązania #6 przez oprogramowanie dokujące molekularne. PI-4,5-P2 wiąże się z rowkowatą jaskinią znajdującą się poniżej aktywnego centrum HDP-2P. Pięć kluczowych reszt aminokwasowych w aktywnym centrum podano w trzyliterowej notacji. PI-4,5-P2 jest przedstawiony w przedstawieniu patyczkowym, a HDP-2P w liniach (diagram po lewej) i powierzchni molekularnej (diagram po prawej). Dla patyków szmaragd oznacza węgiel, pomarańczowy fosfor, czerwony tlen, a biały wodór. Dla powierzchni i linii molekularnych zieleń oznacza węgiel, niebieski azot, czerwony tlen, biały wodór, a żółty siarkę. Skróty: PI-4,5-P2 = Fosfatydylinozytol-4,5-difosforan; HDP-2P = podstawowa podjednostka fosfolipazy jadu żmije. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Krzywe aktywności hydrolitycznej z próbek liposomów przy różnych stosunkach molowych HDP-2P/fosfolipidów. Liposomy wykonane z PC+CL (ciemnozielony), PC+PS (pomarańczowy), PC+PI (ciemnoniebieski), PC+PI-4-P (niebieski), PC+PI-4,5-P2 (zielony) oraz PC (fioletowy). Wartości gęstości optycznej w dowolnych jednostkach reprezentują średnie odczyty potrójnych na 550 nm. Paski błędu wskazują SD potrójnych odczytów. Istotność statystyczna różnic w gęstości optycznej między próbkami liposomów została oceniona za pomocą ANOVA, przy czym wszystkie wartości p były znacznie poniżej 0,05. Skróty: PC = fosfatydylocholina; CL = kardiolipina sercowa dla bydła; PS = fosfatydyloseryna; PI = fosfatydylinozytol; PI-4-P = fosfatydylinozytol-4-fosforan; PI-4,5-P2 = Fosfatydylinozytol-4,5-difosforan; a.u. = dowolne jednostki; HDP-2P = podstawowa podjednostka fosfolipazy jadu żmije. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Widma absorpcji wodnych roztworów kompleksów miedzi. Kompleksy miedzi [Cu(H,2O)6]2+ (linia pomarańczowa) oraz [Cu(H,2O)2(NH3)4]2+ (niebieska linia), napromieniowane światłem widzialnym w zakresie od 500 nm do 900 nm. Kompleks miedzi [Cu(H,2O)6]2+ powstał w roztworze 0,025 M CuSO4 , a kompleks miedzi [Cu(H,2O)2(NH3)4]2+ powstał w roztworze 0,025 M CuSO4 zawierającym 0,100 M NH3. Wartości absorbancji na tym rysunku dla każdego punktu danych to średnie odczyty absorbancji wykonane w potrójnym egzemplarze. Paski błędów reprezentują SD z potrójnych odczytów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7: Krzywe przepuszczalności błony z próbek liposomów. Liposomy złożone z PC+CL (fioletowy), PC+PS (niebieski), PC+PI (ciemnoniebieski), PC+PI-4-P (ciemnozielony), PC+PI-4,5-P2 (pomarańczowy) oraz PC (zielony) o różnych stosunkach molowych HDP-2P/fosfolipidów. Wartości przepuszczalności błony wyrażane są jako wartości gęstości optycznej w dowolnych jednostkach (a.u.) wymierzone na 600 nm. Każdy punkt danych reprezentuje średnią potrójnych odczytów. Paski błędu wskazują SD potrójnych odczytów. Istotność statystyczna różnic w gęstości optycznej między próbkami liposomów została oceniona za pomocą ANOVA, przy czym wszystkie wartości p były znacznie poniżej 0,05. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Przewidywane energie wiązania powinowactwa dla kandydatów na kompleksy cząsteczkowe HDP-2P z PI. Symulacje modelowania molekularnego zostały wykorzystane do przewidywania typów wiązań i powinowactw miejsc wiążących, a także naładowanych i polarnych części zarówno grupy głowowej fosfatydylinozytolu, jak i reszt aminokwasowych HDP2P, które uczestniczą w ich interakcjach międzycząsteczkowych. Grupy naładowane i polarne fosfatydylinozytolu są zaznaczone na Rysunku 1. Należy zauważyć, że Pb w NHpbδ+ oznacza wiązanie peptydowe. Skróty: PI = Phosphatydylinozytol; HDP-2P = podstawowa podjednostka fosfolipazy jadu żmije. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przewidywane energie wiązania powinowactwa dla kandydatów na kompleksy cząsteczkowe HDP-2P z PI-4-P. Symulacje modelowania molekularnego zostały wykorzystane do przewidywania typów wiązań i powinowactw miejsc wiązania, a także naładowanych i polarnych części zarówno grupy głowowej fosfatydyloinoino-4-fosforanu (PI-4-P), jak i reszt aminokwasowych HDP2P, które uczestniczą w ich interakcjach międzycząsteczkowych. Należy zauważyć, że Pb w NHpbδ+ oznacza wiązanie peptydowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Workflow dokowania molekularnego. Przegląd procedury dokowania molekularnego z użyciem AutoDock, w tym konstrukcja ligandów, przygotowanie receptorów, konfiguracja siatki oraz wykonanie symulacji dokowania w celu przewidywania interakcji PI-HDP-2P. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.