Potencjalna rola osi sygnalizacyjnej PGE 2-EP4-CA2+ w pourazowej chorobie zwyrodnieniowej stawów

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół systematycznego nakreślania metod ustanawiania i oceny szczurzych modeli choroby zwyrodnieniowej stawów, poprzez porównanie, dostarczając dowodów naukowych na różną patogenezę między ostrą chorobą zwyrodnieniową stawów wywołaną urazem mechanicznym a przewlekłą chorobą zwyrodnieniową stawów wywołaną czynnikami metabolicznymi / środowiskowymi. Główny nacisk kładziony jest na model ACLT, kładący nacisk na zmiany w szlaku sygnałowym dysfunkcji mitochondriów EP4-Ca²⁺.

Streszczenie

Pourazowa choroba zwyrodnieniowa stawów (PTOA) jest chorobą zwyrodnieniową stawów wywołaną urazem lub intensywnym obciążeniem mechanicznym, prowadzącą do zwyrodnienia chrząstki stawowej i upośledzenia funkcjonalnego. Prostaglandyna E2 (PGE₂) w znacznym stopniu przyczynia się do degradacji chrząstki po urazie mechanicznym poprzez aktywację swojego receptora, receptora prostaglandyny E 4 (EP4), na błonach chondrocytów. Homeostaza chrząstki stawowej opiera się przede wszystkim na dynamicznej równowadze między degradacją a naprawą chrząstki, procesem precyzyjnie regulowanym przez chondrocyty. Wykazano, że szlak sygnałowy kinazy białkowej II zależnej od^Ca2+/kalmoduliny (CAMKII) odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w przywracaniu funkcji chondrocytów. W tym badaniu zaobserwowaliśmy zwiększoną ekspresję EP4, receptora 1,4,5-trisfosforanu inozytolu (IP3R) i fosforylowanego CaMKII w chondrocytach stymulowanych interleukiną-1 beta (IL-1β), co sugeruje możliwy związek między sygnalizacją EP4 a rozregulowaniem wapnia. Wciąż jednak brakuje bezpośrednich dowodów potwierdzających udział osi EP4-Ca²⁺/CaMKII w PTOA. Potrzebne są dalsze badania z wykorzystaniem interwencji genetycznych lub farmakologicznych, aby wyjaśnić ten potencjalny mechanizm. Odkrycia te stanowią wstępną podstawę do zbadania homeostazy wapnia i sygnalizacji EP4 jako celów leczenia PTOA.

Wprowadzenie

Chociaż aktywność fizyczna jest szeroko promowana ze względu na korzyści zdrowotne, pozostaje główną przyczyną urazów mięśniowo-szkieletowych kończyn dolnych, które mogą prowadzić do różnych niekorzystnych skutków¹. Wśród nich PTOA staje się coraz większym obciążeniem dla nastolatków i młodych dorosłych, którzy doświadczają urazów stawów w wieku² lat. Niepokojące jest to, że około 48-52% osób, które doznały urazów stawów związanych ze sportem, rozwija PTOA w ciągu 11-17 lat ^3,4. Staw kolanowy, jeden z najczęściej kontuzjowanych stawów w młodzieżowych zajęciach sportowych i rekreacyjnych, jest szczególnie narażony w procesie od urazu stawu do PTOA. Badanie prospektywne wykazało, że osoby z urazami kolana mają 10-krotnie wyższe ryzyko rozwoju potwierdzonej radiologicznie choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego 12-20 lat po urazie w porównaniu^{z osobami bez} urazu5. Co więcej, u młodych dorosłych oceny radiologiczne wykazały, że piłkarki z urazami przecięcia więzadła krzyżowego przedniego (ACLT) mają 51% ryzyko rozwoju PTOA w ciągu 12 lat, podczas gdy zawodnicy płci męskiej mają 41% ryzyko w ciągu 14 lat⁵. Wyniki te podkreślają długoterminowy negatywny wpływ urazów stawów związanych ze sportem na zdrowie układu mięśniowo-szkieletowego. W związku z tym zrozumienie nieodwracalnych mechanizmów patologicznych leżących u podstaw rozwoju PTOA ma kluczowe znaczenie dla określenia odpowiednich strategii interwencyjnych mających na celu złagodzenie postępu choroby.

Wczesna dysregulacja homeostazy^Ca2+ jest jednym z kluczowych wskaźników inicjacji PTOA⁶. Ca²⁺ wiąże się z kalmoduliną (CaM), tworząc kompleks Ca^{2 +} / CaM, który może wchodzić w interakcje z CaMKII, łagodząc jego autohamującą konformację i regulując aktywność kinazy⁷. Zarówno w ludzkiej, jak i mysiej chorobie zwyrodnieniowej stawów ekspresja ufosforylowanego CaMKII (aktywowanej formy CaMKII) jest zwiększona, podczas gdy stosowanie inhibitorów CaMKII blokuje ten wzrost poziomu fosforylacji, prowadząc do zniszczenia chrząstki stawowej⁸, co wskazuje na ważną rolę regulacyjną Ca^{2 +} / CaMKII w pośredniczeniu w homeostazie chrząstki zwyrodnieniowej stawów. Zwykle na zmiany te decydujący wpływ ma aktywacja mechanizmów zapalnych w rozwoju PTOA. Wysoki poziom PGE₂, jako kluczowego prozapalnego mediatora bólu, wpływa na progresję choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez aktywację receptora EP4. W szczególności warunkowy nokaut EP4 w chrząstce stawowej zwiększa tworzenie chrząstki i metabolizm anaboliczny, jednocześnie hamując przerost chondrocytów i katabolizm, sprzyjając w ten sposób regeneracji stabilnej, dojrzałej chrząstki stawowej zamiast chrząstki włóknistej i łagodząc ból stawów⁹. Biorąc pod uwagę kluczową rolę szlaku sygnałowego Ca^{2 +} / CaMKII w fizjologii chondrocytów i uznany udział receptora EP4 w progresji choroby zwyrodnieniowej stawów, badanie to miało na celu zbadanie, czy aktywacja EP4 jest związana ze zmianami w sygnalizacji wapnia i dysfunkcją mitochondriów podczas rozwoju PTOA. Chociaż związek przyczynowy między rozregulowaniem EP4 i Ca²⁺ pozostaje do ustalenia, dane sugerują możliwy związek mechanistyczny, który wymaga dalszych badań.

Badanie to koncentruje się na potencjalnych mechanizmach łączących aktywację receptora EP4 z sygnalizacją Ca²⁺ i dysfunkcją mitochondriów podczas rozwoju PTOA. W porównaniu z tradycyjnymi metodami diagnostycznymi, takimi jak techniki obrazowania, które wykrywają progresję PTOA, oraz obecnymi podejściami terapeutycznymi, takimi jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) w celu złagodzenia objawów, nasze podejście ma na celu ujawnienie wczesnych zaburzeń sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w patogenezie PTOA. Ten mechanistyczny wgląd zapewnia bardziej precyzyjne zrozumienie początku i progresji choroby, oferując nowe możliwości wczesnej diagnozy i ukierunkowanych interwencji. W związku z tym w badaniu tym ustanowiono model szczurzy PTOA indukowany przecięciem więzadła krzyżowego przedniego (ACLT) w celu naśladowania urazów mechanicznych powszechnie obserwowanych u sportowców z upośledzoną kontrolą motoryczną podczas ostrej lub przewlekłej aktywności fizycznej. Model ten służy jako optymalna reprezentacja pourazowego mechanicznego uszkodzenia stawów, oferując odtwarzalną platformę do badania zarówno zmian histopatologicznych, jak i leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych. Grupa stosująca dietę wysokotłuszczową oraz narażenie na wilgotne środowisko (FD) służy jako kontrola pozytywna, mająca na celu symulację metabolicznych i środowiskowych czynników ryzyka związanych z przewlekłą chorobą zwyrodnieniową stawów. Pierwsza z nich modeluje ostre urazy spowodowane urazem mechanicznym, podczas gdy druga reprezentuje naturalnie występujący model choroby wywołany zaburzeniami metabolicznymi i czynnikami środowiskowymi, chociaż ostateczna patogeneza w tej grupie może nie przebiegać zgodnie z osią mitochondrialną EP4-Ca².

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Szpitala Prowincji Medycyny Chińskiej w Guangdong (numer zatwierdzenia etycznego: 2024014-2). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych określonymi przez Radę Państwa Chińskiej Republiki Ludowej.

1. Zwierzęta

1. Użyj szczurów SPF rasy Sprague-Dawley (SD), aby zmniejszyć potencjalne efekty zakłócające związane z cyklem rujowym. Do tego eksperymentu wybierz w sumie dziewięć samców szczurów SD w wieku 4 tygodni i o wadze od 90 g do 100 g.
   UWAGA: Szczury te pochodzą od licencjonowanego dostawcy zwierząt laboratoryjnych w Chinach (numer certyfikatu: 20240410Aazz0619000774).
2. Utrzymuj wszystkie zwierzęta w określonym środowisku wolnym od patogenów (SPF). Utrzymuj kontrolowane środowisko w temperaturze 24 ± 2 °C ze średnią wilgotnością 60 ± 1% i 12-godzinnym cyklem światła/ciemności.
3. Upewnij się, że szczury mają swobodny dostęp do zakwaszonej wody i standardowej diety gryzoni.

2. Budowa i interwencja modelu zwierzęcego

1. Zaaklimatyzuj szczury przez okres 2 tygodni w centrum żywienia. Losowo przypisz szczury do trzech grup w wieku 6 tygodni: grupa kontrolna, grupa PTOA i grupa FD, z trzema szczurami w każdej grupie.
2. Utrzymuj grupę kontrolną w standardowych warunkach.
3. Znieczulenie grupy PTOA izofluranem (4% do indukcji i 1%-2% do leczenia podtrzymującego).
4. Chirurgiczne odsłonięcie obustronnych stawów kolanowych poprzez podłużne nacięcie skóry przy użyciu przyśrodkowego dostępu przyrzepkowego.
5. Wykonaj ACLT za pomocą skalpela i potwierdź całkowite przecięcie, wykonując pozytywny test przedniej szuflady.
   UWAGA: Obustronne przecięcie ACL przeprowadzono w celu zapewnienia spójności modelu i zmniejszenia zmienności osobniczej. Dane z obu kolan zostały uśrednione, aby uzyskać jedną wartość dla każdego zwierzęcia do analizy.
6. Okresowo przenoś szczury z grup FD do komory z kontrolowaną temperaturą, znajdującej się w tym samym obiekcie. Poddaj te szczury diecie wysokotłuszczowej.
   UWAGA: Dieta wysokotłuszczowa zawierała 20% sacharozy, 15% smalcu, 1,2% cholesterolu, 0,2% cholanu sodu, 10% kazeiny, 0,6% wodorofosforanu wapnia, 0,4% proszku wapiennego, 0,4% premiksu i 52,2% paszy podstawowej. Profil składników pokarmowych paszy kontrolnej był następujący: 19% białka, 31% tłuszczu i 50% węglowodanów, przy stosunku kalorycznym 17% białka, 37% tłuszczu i 46% węglowodanów.
7. Utrzymuj warunki środowiskowe w komorze klimatycznej na poziomie 24 ± 2 °C, wilgotności 90 ± 4% i 12-godzinnym dziennym cyklu świetlnym.
   UWAGA: Ze względu na zwiększone ryzyko rozwoju bakterii w tak wysokiej temperaturze i wilgotności, sterylizuj wodę pitną i żywność oraz uzupełniaj je codziennie, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Całkowity czas trwania interwencji eksperymentalnej wynosił 12 tygodni.

3. Analiza chodu (ślady stóp)

1. Przeprowadzić analizę śladu stopy 12 tygodni po rozpoczęciu leczenia u szczurów modelowych, stosując metodę opisaną wcześniej¹⁰.
2. Posmaruj brzuszne powierzchnie tylnych łap szczurów czerwonym tuszem i pozwolono im chodzić po ścieżce o długości 100 cm i szerokości 8 cm, która została pokryta białym papierem.
3. Aby zachęcić szczury do poruszania się, umieść ciemną komorę na końcu ścieżki, aby zachęcić do ruchu do przodu.
4. Wykonaj trzy sekwencyjne pomiary, aby uzyskać średnie wartości dla każdego parametru, w tym długości kroku i długości kroku, które zostały wykorzystane do oceny nieregularności.
5. Określ długość kroku (cm), mierząc odległość przebytą przez tę samą tylną łapę między dwoma kolejnymi krokami.
6. Określ długość kroku (cm) jako odległość poziomą między lewą i prawą tylną łapą.
7. Zmierz kąt łapy (°) jako kąt między drugim palcem u nogi a kością piętową względem linii poziomej¹¹.
8. Mierz długość kroku, długość kroku i kąt łapy bezpośrednio na zeskanowanych obrazach odcisków stóp za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus (wersja 6.0), wykorzystującego wbudowane narzędzia do pomiaru odległości i kąta.
   UWAGA: Te parametry chodu mają kluczowe znaczenie dla identyfikacji subtelnych zaburzeń funkcjonalnych we wczesnych stadiach choroby zwyrodnieniowej stawów. Pacjenci mogą wykazywać zmniejszony krok i długość kroku w celu ochrony bolesnych stawów, podczas gdy zwiększony kąt wysunięcia palców i asymetria chodu często występują jako reakcje kompensacyjne na niestabilność stawów wywołaną bólem.

4. Pomiar średnicy złącza

1. Zmierz średnicę złącza za pomocą skalibrowanego mikrometru spiralnego (mm) po modelowaniu w każdej grupie.
   UWAGA: W miarę postępu choroby zwyrodnieniowej stawów pacjenci zazwyczaj wykazują obrzęk i ból stawów. Większy stopień obrzęku może wskazywać na cięższy etap choroby.

5. Pomiar siły chwytu

1. Zmierz siłę chwytu kończyn tylnych za pomocą cyfrowego miernika siły chwytu wyposażonego w siatkę trakcyjną, miernika siły wyposażonego w siatkę trakcyjną (90 mm × 90 mm).
   1. Delikatnie chwyć szczura za ogon i skórę z tyłu szyi.
   2. Opuść zwierzę, aż jego tylne kończyny mocno chwyci siatkę, a następnie równomiernie pociągnij zwierzę poziomo wzdłuż osi czujnika siły, aż zwolni uchwyt.
   3. Powtórzyć test trzy razy na zwierzę. Zapisz najwyższą wartość jako maksymalną siłę chwytu.
      UWAGA: Podczas badania siły chwytu kończyn tylnych należy unieruchomić kończyny przednie, przyklejając je taśmą do tekturowej powierzchni, aby zapobiec przypadkowemu połączeniu kończyn przednich z siatką trakcyjną. Zmniejszona siła chwytu wskazuje na zmniejszoną funkcję mięśni i potencjalne deficyty motoryczne związane z bólem związane z postępem choroby zwyrodnieniowej stawów.

6. Pierwotna izolacja i hodowla chondrocytów

1. Wyizoluj pierwotne chondrocyty od 6-tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley.
2. Wypreparuj głowy kości udowej i płaskowyże piszczelowe, aby zebrać około 100-150 mg tkanki chrzęstnej.
3. Dwukrotnie przemyć tkankę PBS zawierającym 1% penicyliny-streptomycyny.
4. Trawić chrząstkę w 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 3 °C przez 30 minut.
5. Pokrój chrząstkę na 1-2 mm³ kawałki i dalej trawij w 10 ml 0,2% kolagenazy II w temperaturze 37 °C przez 4 godziny na shakerze o stałej temperaturze.
6. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm, odwirować przy 300 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
7. Zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.
8. Inkubować komórki w temperaturze 3 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO_{2 .}

7. Leczenie komórkowe

1. Policz izolowane chondrocyty za pomocą hemocytometru.
2. Wysiewaj chondrocyty na 6-dołkowe płytki o gęstości 2 × 10⁵ komórek na dołek w 0,1 ml kompletnej pożywki hodowlanej (DMEM/F12 uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną).
3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 24 godziny, aby umożliwić adhezję.
4. Aby ustalić model PTOA stanu zapalnego in vitro , należy traktować przylegające chondrocyty IL-1β (10 ng / ml) przez 48 godzin, gdy zbieg komórek osiągnie około 80%.
5. W celu kontroli pozytywnej FD rozpuścić kwas palmitynowy (PA, nr CAS 57-11-4) w chloroformie w rozcieńczeniu 1:1000 w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 500 μM.
   1. Gdy zbieg komórek osiągnął około 80%, dodać 1 μl roztworu podstawowego PA na 1 ml pożywki hodowlanej, aby osiągnąć końcowe stężenie PA 500 nM. Traktuj chondrocyty tym roztworem przez 48 godzin.
6. Dodać 1 μl chloroformu (kontrola nośnika) na 1 ml pożywki hodowlanej do komórek kontrolnych bez PA.

8. Pobieranie próbek, odwapnianie i przygotowanie do zatapiania

1. Poddać zwierzęta eutanazji po 12 tygodniach od interwencji poprzez wdychanie przedawkowanej dawki izofluranu (≥5%) w szczelnie zamkniętej komorze przez co najmniej 5 minut i potwierdzić całkowite zaprzestanie oddychania i bicia serca.
   UWAGA: Metoda ta została zatwierdzona przez Komitet ds. Etyki Zwierząt i jest zgodna z krajowymi wytycznymi dotyczącymi humanitarnej eutanazji zwierząt laboratoryjnych.
2. Zbierz oba stawy kolanowe od trzech szczurów w grupie (n = 3, łącznie = 6 kolan) w celu oceny histologicznej.
3. Utrwalać próbki w 4% paraformaldehydzie (PFA) w stosunku objętości tkanki do utrwalacza większym niż 1:20 przez ponad 48 godzin na wytrząsarce w temperaturze °C.
4. Opłucz chusteczki pod bieżącą wodą z kranu przez 1-2 godziny, aby usunąć resztki utrwalacza.
5. Odwapnić tkanki w 0,5 M roztworze EDTA (pH 7,4, ~15%) w stosunku tkanka do roztworu 1:20 przez 21 dni w temperaturze 3 °C i zastąpić świeżym roztworem co 3 dni.
6. Oceń zakończenie odwapnienia, sondując kość igłą w celu zmiękczenia.
7. Odwapnione chusteczki myj pod bieżącą wodą z kranu przez 2 godziny i umieść je w kasetach do zatapiania.
8. Próbki należy odwadniać za pomocą serii stopniowanych etanoli: 75% etanolu przez 2 godziny (lub przez noc), 80% etanolu przez 2 godziny, 95% etanolu przez 0,5 godziny i etanolu absolutnego dwa razy przez 60 minut. Następnie zanurzyć w 1:1 ksylen:etanol na 20 minut.
9. Oczyść tkanki w ksylenie dwukrotnie (10 min i 60 min).
10. Naciekać tkanki parafiną w następującej kolejności: ksylen:parafina (1:1) przez 15 min, miękka parafina w temperaturze 52-5 °C przez 1 h (dwukrotnie), następnie twarda parafina w temperaturze 56-5 °C przez 30 min.
11. Osadź tkanki za pomocą systemu zatapiania parafiny (np. Leica, ustawiony na 6 °C) i przenieś bloki na zimną płytę o temperaturze -2 °C na 2 godziny.
12. Przekrojenie bloków parafinowych w odległości strzałkowej przy grubości μm za pomocą mikrotomu.
13. Zanurzyć wstążki w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C i zamontować na czystych szkiełkach podstawowych.
14. Wysuszyć zamontowane sekcje na powietrzu i piec je w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 2 godziny, aby usunąć resztki parafiny.
15. Odparafinować skrawki, zanurzając kolejno w ksylenie (10 min), świeżym ksylenie (10 min), etanolu absolutnym (5 min), świeżym etanolu absolutnym (5 min), 90% etanolu (5 min) i 75% etanolu (5 min), a następnie spłukać wodą z kranu przed barwieniem.

9. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE)

1. Zanurzone odparafinowane i uwodnione skrawki tkanek zanurzono w 0,5% roztworze barwiącym hematoksyliną na 3-5 minut w temperaturze pokojowej (RT; ~2 °C), a następnie dokładnie spłukano pod bieżącą wodą z kranu.
2. Krótko potraktuj skrawki roztworem różnicującym hematoksylinę przez 2-5 sekund i spłucz pod bieżącą wodą z kranu.
3. Wykonaj niebieszczenie, zanurzając sekcje w roztworze do niebieszczenia hematoksyliny na 2-5 s, a następnie spłukując.
4. Odwodnić skrawki w 85% i 95% etanolu przez 5 minut każda, a następnie zabarwić w 0,05% eozynie Y (alkoholowej) przez 5 minut.
5. Dwukrotnie odwodnić w absolutnym etanolu (5 min każdy), następnie oczyścić w ksylenie (5 min), a następnie w świeżym ksylenie (5 min).
6. Zamontuj sekcje neutralnym balsamem i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
   UWAGA: W dobrze zachowanej chrząstce hematoksylina barwi jądra na niebiesko, a eozyna barwi macierz na różowo. Uszkodzona chrząstka wykazuje utratę chondrocytów, migotanie i zdezorganizowaną macierz.

10. Safranin O - szybkie barwienie na zielono (SOFG)

1. Skrawki bejcowania 2% roztworem Fast Green przez 1-5 minut w temperaturze pokojowej. Myć pod bieżącą wodą z kranu, aż chrząstka stanie się bezbarwna.
2. Krótko rozdzielić skrawki w 1% kwasie solnym przez 10-15 s, a następnie dokładnie spłukać bieżącą wodą.
3. Zabarwić skrawki 0,2% roztworem Safraniny O przez 5-10 s, a następnie szybko odwodnić przez cztery zmiany absolutnego etanolu (3-5 s każda).
4. Oczyść skrawki w ksylenie (5 min), a następnie w świeżym ksylenie (5 min).
5. Zamontuj szkiełka neutralnym balsamem i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
   UWAGA: Safranina O barwi proteoglikany chrząstki na czerwono, podczas gdy Fast Green barwi kości / tkanki włókniste na zielono. Utrata koloru czerwonego wskazuje na wyczerpanie i zwyrodnienie proteoglikanów.
6. Oceń zmiany histologiczne za pomocą systemu punktacji Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową Stawów (OARSI). Zmierz szerokość przestrzeni stawowej i grubość chrząstki, aby ocenić zwyrodnienie strukturalne. Rejestruj obrazy pod mikroskopem świetlnym (np. ECLIPSE Ti2-E) pod kątem 4× (podziałka = 50 μm) i 20x (podziałka = 10 μm).
   UWAGA: Do przechwytywania obrazu należy używać oprogramowania do obrazowania systemu, a do analizy ImageJ (v1.48v). Kalibruj obrazy za pomocą funkcji Analizuj > Ustaw skalę za pomocą mikrometru. Dla każdego stawu określ ilościowo pięć losowych pól z trzech odcinków strzałkowych, korzystając z zaślepionej analizy przeprowadzonej przez trzech niezależnych obserwatorów.

11. Tomografia komputerowa mikro-μ

1. Wypreparuj stawy kolanowe szczura 12 tygodni po interwencji i natychmiast utrwal je w 4% paraformaldehydzie w RT przez 24 godziny, aby zachować morfologię tkanki.
2. Przepłucz utrwalone próbki PBS i przechowuj je w 70% etanolu do czasu skanowania.
3. Zamontuj każdą próbkę stawu kolanowego na dedykowanym uchwycie na próbkę przed skanowaniem. Wyrównaj złącze wzdłuż jego długiej osi, aby zminimalizować artefakty ruchu.
4. Skanowanie mikro-μCT należy wykonać za pomocą systemu micro-μCT o następujących parametrach skanowania: napięcie promieniowania rentgenowskiego 70 kV, prąd 100 μA i moc 7 W.
5. Uchwyć cztery klatki na projekcję i ułóż je w stos, aby poprawić jakość obrazu, z krokiem obrotu o 0,72°, kończąc pełny obrót o 360°.
6. Ustaw wynikowy rozmiar woksela (grubość warstwy) na 15 μm, uzyskując obrazy o wysokiej rozdzielczości odpowiednie do analizy kości beleczkowej.
7. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) między bliższą płytką wzrostu kości piszczelowej a płaskowyżem piszczelowym, koncentrując się na kości podchrzęstnej zarówno kości udowej, jak i piszczelowej.
8. Zrekonstruuj surowe dane skanowania w obrazy przekrojowe za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji.
9. Zaimportuj zrekonstruowane stosy obrazów do odpowiedniego oprogramowania do ilościowej analizy morfometrycznej.
10. Oceń kluczowe parametry, w tym frakcję objętościową kości (BV/TV, %), gęstość mineralną kości (BMD, g/cm³) i separację beleczkową (Tb.Sp, mm).
11. W przypadku jakościowej i trójwymiarowej wizualizacji użyj oprogramowania do wizualizacji 3D, aby wygenerować wolumetryczne renderingi mikroarchitektury kości.
12. Przeprowadzić ocenę wizualną, aby potwierdzić integralność strukturalną i zmiany morfologiczne zaobserwowane w danych ilościowych.
    UWAGA: Całe przetwarzanie i analiza obrazu zostały przeprowadzone przez zaślepionych operatorów, aby zapewnić bezstronne wyniki.

12. Eliza

1. Znieczulenie szczurów należy wykonać 12 tygodni po interwencji. Ostrożnie odsłoń i wypreparuj aortę brzuszną, aby pobrać próbki krwi.
2. Pozostawić zebraną krew do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie odwirować ją z prędkością 755 × g (co odpowiada 3000 obr./min, używając wirówki o promieniu wirnika 7,5 cm) w temperaturze °C przez 15 minut.
3. Oddzielić surowicę i przechowywać ją w celu późniejszego pomiaru poziomu PGE₂ za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA.
4. Równolegle wysiewa pierwotne chondrocyty i hoduje je przez 24 godziny, a następnie poddaje działaniu IL-1β i PA przez 48 godzin, zgodnie z ustalonym protokołem leczenia komórek. Po interwencji należy zebrać i przeanalizować supernatanty hodowlane pod kątem stężenia PGE₂ przy użyciu tego samego zestawu ELISA.

13. Ilościowy RT-PCR

1. Ekstrahuj całkowite RNA z próbek komórkowych za pomocą komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA (TRIzol).
2. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji (z narzędziem do usuwania gDNA) i przechowuj powstałe cDNA w temperaturze -8 °C do późniejszej analizy.
3. Przeprowadzić ilościową reakcję PCR przy użyciu SYBR Green i obliczyć względne poziomy ekspresji za pomocą metody 2−ΔΔCt.
   UWAGA: Użyte sekwencje starterów były następujące: β-aktyna do przodu: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-aktyna odwrotna: CTGACCCATACCCACCATCACAC; EP4 napastnik: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 napastnik: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; COX-2 napastnik: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 rewers: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Analiza Western blot

1. Lizować komórki za pomocą buforu RIPA na lodzie przez 30 minut.
2. Próbki białek należy oddzielić za pomocą SDS-PAGE przez 90 minut, a następnie przenieść je na membrany nitrocelulozowe na 2 godziny.
3. Zablokuj membrany 5% BSA i przemyj je roztworem buforowanym fosforanem.
4. Wykonaj immunoblotting przy użyciu specyficznych przeciwciał.
   UWAGA: Przeciwciała i ich odpowiednie rozcieńczenia były następujące: anty-MMP9 (1:1000), anty-kolagen II (1:1000), anty-COX2 (1:1000), anty-CaMKII (1:1000), anty-p-CaMKII (1:1000), anty-IP3R (1:1000), anty-Cyt-C (1:1000) i anty-β-aktyna (1:2000).
5. Po całonocnej inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przemyć błony TBST i inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałami drugorzędowymi: mysie-HRP (1:2000) lub królikiem-HRP (1:2000) w ciemności.
6. Po kolejnym przemyciu TBST wykonaj detekcję białek za pomocą ulepszonego zestawu chemiluminescencyjnego.
7. Analizuj dane za pomocą oprogramowania ImageJ (wersja 1.48v).

15. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Hoduj chondrocyty na szkiełkach nakrywkowych na płytkach 12-dołkowych, aż osiągną 80% konfluencji.
2. Po leczeniu IL-1β i PA przez 48 godzin lub bez leczenia jako kontroli, utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 15 minut w RT.
3. Przepuszczalność komórek za pomocą PBS zawierającego 0,2% Triton X-100 przez 15 minut.
4. Przemyć komórki trzykrotnie PBS (5 min każda), a następnie inkubować je z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-IP3R, rozcieńczenie 1:200) w buforze do rozcieńczania przeciwciał w temperaturze °C przez noc.
5. Wystaw komórki na rozcieńczenie 1:500 koziego przeciwciała drugorzędowego IgG przeciwko królikom znakowanym izotiocyjanianem fluoresceiny przez 1 godzinę.
6. Przeciwbarwić komórki roztworem DAPI o stężeniu 5 μg/ml przez 10 minut.
   UWAGA: Obrazy fluorescencyjne uzyskano przy użyciu obiektywu 40x (podziałka = 2 μm). Wszystkie obrazy zostały przetworzone za pomocą oprogramowania ZEN i określone ilościowo za pomocą ImageJ (wersja 1.48v), zgodnie ze spójnymi procedurami kalibracji.

16. Analiza statystyczna

1. Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu GraphPad Prism (wersja 8.0.2).
2. Przed zastosowaniem testów parametrycznych należy ocenić dane pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu Shapiro-Wilka oraz pod kątem jednorodności wariancji za pomocą testów Browna-Forsythe'a i Bartletta.
3. Użyj jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya do porównań między wieloma grupami i zastosuj dwustronny niesparowany test Studenta do porównań dwóch grup.
4. Uznaj, że wartość P mniejsza niż 0,05 jest statystycznie istotna.
5. Przedstaw wszystkie dane jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów.

Wyniki

PTOA indukowany przez ACLT wykazuje przedwczesne zniszczenie chrząstki i deficyty behawioralne w porównaniu z przewlekłym KOA wywołanym przez FD (ryc. 2 i ryc. 3)
Zwężenie przestrzeni stawowej i zwyrodnienie chrząstki są głównymi skutkami choroby zwyrodnieniowej stawów. Wcześniejsze badania zidentyfikowały nadwagę i czynniki środowiskowe (np. wilgotny klimat) jako potencjalne czynniki przyczyniające się do wy...

Dyskusja

W porównaniu z przewlekłą chorobą zwyrodnieniową stawów wywołaną czynnikami środowiskowymi i dietetycznymi, uraz stawu wywołany ACLT prowadzi do szybszego postępu choroby. Nasze wyniki, oparte na ocenach behawioralnych, w tym obrzęku stawów, siły chwytu kończyn tylnych i analizie chodu, ujawniły istotne różnice między grupą kontrolną, grupą PTOA i grupą kontroli pozytywnej wywołane czynnikami środowiskowymi i dietetycznymi. Po 12 tygodniach interwencji w grupie PTOA zaobserwowano nadmierny obrzęk stawów, któremu towarzys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2% Kolagenaza II	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	Nr CAS: 9001-12-1	Pierwotna izolacja i hodowla chondrocytów
0,2% Tryton X-100	Beyotime, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał ST795	Immunofluorescencji
0,25% trypsyna-EDTA	Wuhan Boster Biological Technology Co., Sp. z o.o.	Zobacz materiał AR1071	Odwapnienie
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	25200072	Pierwotna izolacja i hodowla chondrocytów
4% roztwór utrwalający paraformaldehyd	Biyuntian, Chińska Republika Ludowa	P0099-3L	Utrwalanie tkanek
Przeciwciało anty-CaMKII	Huabio, Chińska Republika Ludowa	ET1608-47	Western blot (1:1000)
Przeciwciało anty-kolagenowe II	Abcam, Wielka Brytania	ab34712 powiedział:	Western blot (1:1000)
Przeciwciało anty-COX2	Abcam, Wielka Brytania	ab179800 powiedział:	Western blot (1:1000)
Przeciwciało anty-Cyt-C	Selleck, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał F2534	Western blot (1:1000)
Przeciwciało anty-IP3R (B-2)	Santa Cruz, Stany Zjednoczone Ameryki	SC-377518	Western blot (1:1000)
Przeciwciało anty-MMP9	Abcam, Wielka Brytania	ab76003 powiedział:	Western blot (1:1000)
Przeciwciało anty-p-CaMKII	Selleck, Chińska Republika Ludowa	F0342 powiedział:	Western blot (1:1000)
Przeciwciało anty-&beta-aktynowe	Technologia sygnalizacji komórkowej (CST), Stany Zjednoczone	8H10D10 powiedział:	Western blot (1:2000)
Rozwiązanie blokujące BSA	Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone	N/A	5% BSA dla blokowania Western blot
Wirówka (5424 R)	Eppendorf, Niemcy	N/A	755 i razy; g Prędkość wirowania
Chloroform	Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone	N/A	Rozpuszczalnik do PA
Komora z klimatyzacją (RXZ-158A)	Producent krajowy, Chiny	N/A	Model wilgotnego środowiska
Zestaw do odwrotnej transkrypcji kolorów	Invitrogen, Suzhou, Chiny	N/A	Synteza cDNA
Oprogramowanie CTAn	Bruker	Wersje 1.9 i 4.1	Do ilościowej analizy morfometrycznej
Oprogramowanie CTVol	Bruker	Wersja 2.0	Do jakościowej i trójwymiarowej wizualizacji
Roztwór do barwienia DAPI	Beyotime, Chińska Republika Ludowa	N/A	Barwienie jądrowe (5 &mikro; g/ml)
Cyfrowy miernik siły chwytu	Puxin Instrument	N/A	Pomiar siły chwytu kończyn tylnych
DMEM/F12 Średni	Corning, Stany Zjednoczone Ameryki	N/A	Pożywka do hodowli komórkowych
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)	Aladdin	N/A	Odwapnienie tkanek kostnych
Zestaw ELISA dla PGE2	Elabscience, Wuhan, Chińska Republika Ludowa	PGE2E-EL-0034	Wykrywanie testu ELISA
Ulepszony zestaw do chemiluminescencji	Millipore, Stany Zjednoczone Ameryki	WBKLS0500	Wykrywanie Western blot
Etanol	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 64-17-5	Odwodnienie tkanek
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Corning, Stany Zjednoczone Ameryki	N/A	10% stężenie dla kultury
Kozia IgG IgG z oznaczeniem FITC	Beyotime, Chińska Republika Ludowa	Zestaw P0179	Immunofluorescencja (1:500)
Pryzmat GraphPad	GraphPad Software, Stany Zjednoczone	Wersja 8.0.2	Analiza danych
Hematoksylina i eozyna (H& E) Zestaw do barwienia	Servicebio, Wuhan	Klasa G1005	Histologia
IL-1 i beta;	PeproTech, Stany Zjednoczone	400-01B	10 ng/ml dla modelu komórki PTOA
ObrazJ	NIH, Stany Zjednoczone	Wersja 1.48v	Analiza obrazu
Oprogramowanie Image-Pro Plus	Cybernetyka mediów	Wersja 6.0	Ilościowa analiza chodu na podstawie zeskanowanych śladów stóp
Izofluran	Szanghaj Yaji Biologiczny	YS1412C	Znieczulenie do chirurgii zwierząt
Centrum osadzania Leica	Mikrosystemy Leica	EG1160	Zatapianie parafiny
Mikrotom Leica	Mikrosystemy Leica	Zobacz materiał RM2235	Cięcie tkanek zatopionych w parafinie
Kąpiel wodna Leica	Mikrosystemy Leica	HI1210	Pływające sekcje parafinowe
Mikroskop świetlny (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Japonia	N/A	Obserwacja histologiczna
Skaner mikrotomograficzny (ZKKS-MCT-Sharp)	Producent krajowy, Chiny	N/A	Obrazowanie kości
Przeciwciało drugorzędowe Mouse-HRP	Technologia sygnalizacji komórkowej (CST), Stany Zjednoczone	7076	Rozcieńczenie 1:2000
Oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements	Nikon	N/A	Przechwytywanie i analizowanie obrazów mikroskopowych
Oprogramowanie NRecon	Bruker, Niemcy	Wersja 1.6	Rekonstrukcja tomografii komputerowej
Kwas palmitynowy (PA)	Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P0500	500 i mikro; Kolba M do modelu ogniwa FD
Wosk parafinowy do cięcia, stopień patologiczny, temperatura topnienia 52-54 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500g	Służy do zatapiania parafiny podczas przetwarzania tkanek
Wosk parafinowy do cięcia, stopień patologiczny, temperatura topnienia 56-58 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500g	Służy do końcowego zatapiania twardego wosku w sekcji tkanek
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	Mycie komórek i płukanie tkanek
Penicylina-Streptomycyna	Corning, Stany Zjednoczone Ameryki	N/A	1% na hodowlę komórkową
Membrana PVDF (0,45 &mikro; m)	Millipore, Stany Zjednoczone Ameryki	IPVH00010	Membrana Western blot
Przeciwciało drugorzędowe królika-HRP	Technologia sygnalizacji komórkowej (CST), Stany Zjednoczone	7074	Rozcieńczenie 1:2000
Czerwony atrament	BOHATER	BOHATER 204	Śledzenie śladów stóp w analizie chodu
Bufor do lizy RIPA	Keygen, Chiny	N/A	Ekstrakcja białek
Safranin O– Zestaw do szybkiego barwienia na zielono	Servicebio, Wuhan	Zobacz materiał G1053	Barwienie histologiczne
Mikrometr spiralny (suwmiarka z noniuszem)	Huangshan, Chińska Republika Ludowa	N/A	Pomiar szerokości spoiny
Oprogramowanie do analizy kości podchrzęstnej (CTAn)	Bruker, Niemcy	Wersje 1.9 i 4.1	Analiza morfometryczna
SYBR Zielona mieszanka wzorcowa PCR	AG Scientific, Chiny	N/A	Analiza qPCR
Odczynniki Western blot (bufor RIPA, składniki żelu SDS-PAGE, bufor ładujący, TBST, itp.)	Beyotime Biotechnology (Chiny)	Nie dotyczy (używane jako wpis grupowy)	Wszystkie rutynowe odczynniki używane do zabiegów Western blot
Ksylen	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 1330-20-7	Oczyszczanie tkanek