Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja RNA in situ z sekwencyjną immunofluorescencją białek w teście tandemowym

914 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68615

⸱

10 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten szczegółowo opisuje hybrydyzację RNA in situ z sekwencyjną immunofluorescencją białek w tkance na zautomatyzowanej platformie w celu scharakteryzowania ukierunkowanej przestrzennej wielokrotnej omiki na poziomie komórkowym.

Streszczenie

Funkcjonalność komórek w hoście nie zależy od izolowanych sygnałów. Zamiast tego wszystkie składniki, od najmniejszych cząsteczek RNA do największych białek, muszą działać w harmonii i koordynacji w ludzkim ciele. W związku z tym znaczenie podejść, które integrują badania przestrzenne na poziomie komórkowym w wielu omikach, ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia interakcji komórka-komórka i postępu choroby. Analiza proteomu i transkryptomu w tym samym teście przestrzennym pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób nie tylko to, co komórka ma wykonać (RNA), ale także w jaki sposób wykonuje te instrukcje w kontekście niszy mikrośrodowiskowej, w której się znajduje (białko). Niniejszy manuskrypt koncentruje się na integracji sekwencyjnej immunofluorescencji (SeqIF) z hybrydyzacją RNA in situ (ISH) z systemem opartym na mikroprzepływach w tkankach do wysokoprzepustowego badania białek i RNA w kontekście przestrzennym (seqRNA-ISH+seqIF), który pozwoli na dodanie do 12 RNA i 24 celów białkowych w jednym przebiegu, z możliwością dodania dodatkowych celów białkowych za pomocą Przebiegi sekwencyjne. Ta metoda zapewnia sekwencyjną, ukierunkowaną platformę multiomiczną, która nie wymaga rozważania kompatybilności fluoroforów i rozległej optymalizacji w celu uzyskania wyższego pleksowania. Pozwala to zrozumieć, jakie wiadomości komórka przygotowuje lub wysyła do swojego mikrośrodowiska. To ukierunkowane podejście pomaga w walidacji całych metod transkryptomu, jednocześnie badając interakcje między RNA a białkami w bardziej precyzyjny sposób.

Wprowadzenie

Złożone funkcjonowanie komórek w ludzkim ciele opiera się na skomplikowanej interakcji sygnałów, od małych cząsteczek RNA po duże białka, z których wszystkie działają w koordynacji1. Interakcja ta podkreśla znaczenie podejść integracyjnych, które badają interakcje przestrzenne na poziomie komórkowym w różnych warstwach omicznych 2,3. Takie metodologie są niezbędne do zrozumienia złożoności interakcji komórka-komórka i progresji choroby. Wiele tradycyjnych metod, takich jak cytometria przepływowa4 i sekwencjonowanie pojedynczychkomórek5, izolaty komórek są wykorzystywane do badania zdezagregowanych próbek w celu zidentyfikowania masowych proporcji fenotypów obecnych w określonej próbce. Jednak izolowanie komórek do analizy może wywołać aktywację lub zmiany fenotypowe, które mogą nie odzwierciedlać dokładnie ich rodzimej biologii i funkcji in situ6. Zaawansowane metody biologii przestrzennej oferują nowe strategie badania komórek i ich mikrośrodowiska bez naruszania kontekstu architektury tkanek i relacji przestrzennych z sąsiednimi komórkami w wielu typach molekularnych 2,7.

Integracja analiz transkryptomu i proteomu w ramach tego samego testu przestrzennego, bez izolowania pojedynczych komórek, zapewnia kompleksowy wgląd w funkcje komórkowe8. Metoda ta opiera się na metodach hybrydyzacji fluorescencyjnego iin situ (FISH) jednocząsteczkowego RNA, ale nie obejmuje trawienia proteinaz, które komplikują sekwencyjne badania białek8. Elastyczność podejścia, które można zastosować do pojedynczego przekroju, zapewnia wyższą rozdzielczość przestrzenną i mniejsze przetwarzanie obrazu w celu integracji i wyrównania sekcji. Podejście to zapewnia wgląd zarówno w instrukcje otrzymywane przez komórkę (RNA), jak i ich wykonywanie (białko) w określonej niszy mikrośrodowiskowej. Łącząc te warstwy informacji, naukowcy mogą uzyskać głębszy wgląd w zachowanie i komunikację komórkową.

Chociaż istnieją metody ręczne, ostatnie postępy w technologiach omiki przestrzennej umożliwiły bardziej złożone analizy z większą liczbą markerów proteomicznych badanych przy użyciu ręcznego multipleksowania9. Podejścia te obejmowały postęp zarówno w testach białkowych, jak i RNA-ISH 10,11,12,13,14 oraz zautomatyzowane metodologie, które wymagają specyficznych dla systemu przeciwciał sprzężonych 15,16,17, obrazowania cytometrii masowej (IMC)18,19,20 oraz inne zautomatyzowane metodologie proteomiki fluorescencyjnej sekwencyjnej, które wykorzystują gotowe pierwotne i wtórne antyboedie 2,21,22. Technologie te ułatwiły proteomikę lub łączoną transkryptomikę i proteomikę przy użyciu ukierunkowanych podejść i zwykle wizualizują zarówno RNA za pomocą sond, jak i białka za pomocą przeciwciał opartych na podobnych koniugatach, umożliwiając jednoczesne lub sekwencyjne wykrywanie RNA i białka przy użyciu tej samej metodologii lub instrumentów. Zapewniając kompleksowy wgląd w aktywność komórkową, tego typu podejścia mają na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat komunikacji komórkowej między komórkami i ich mikrośrodowiska. Jest to cenne narzędzie do rozszyfrowywania złożoności interakcji komórkowych, potencjalnie ujawniając nowe informacje na temat normalnych procesów fizjologicznych i mechanizmów chorobowych.

Protokół ten zawiera wskazówki dotyczące integracji hybrydyzacji RNA in situ (ISH) z sekwencyjną immunofluorescencją (SeqIF) z systemem opartym na mikroprzepływach w tkankach. Zapewnia to wysokoprzepustowe narzędzie do badania RNA i białka w ich natywnym kontekście przestrzennym. Ta metoda (seqRNA-ISH+seqIF), która pozwoli na uzyskanie do 12 celów RNA i 24 białek w jednym przebiegu, z możliwością dodania dodatkowych celów białkowych w sekwencyjnych przebiegach. Chociaż protokół ten koncentruje się na jednym konkretnym układzie mikroprzepływowym, postępowanie z tkankami, zapewnienie jakości RNA oraz wytyczne dotyczące wyboru przeciwciał i miareczkowania można dostosować do innych metodologii. Jednak metoda ta wykorzystuje pobieranie antygenu o pH 9,0 do wydajnego, wolnego od proteazy pobierania epitopów, poprawiając stabilność proteomiki, zapewniając jednocześnie pewną ukierunkowaną transkryptomikę, w przeciwieństwie do tradycyjnego RNA-ISH o pH 6,0 z proteazą w celu zwiększenia dostępności sondy RNA, ale nie zachowuje proteomu8. Metoda seqRNA-ISH+seqIF jest wizualnie przedstawiona na rysunku 1, demonstrując amplifikację RNA FISH, po której następuje rozszczepienie przed zastosowaniem metody parowania przeciwciał pierwszorzędowo-drugorzędowych, która wykorzystuje delikatne chemiczne usuwanie przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych. Sekwencyjny charakter sekwencji, detekcji i detekcji, pozwala przezwyciężyć wiele ograniczeń związanych z kompatybilnością fluoroforów dzięki zastosowaniu metodologii sekwencyjnych23. Zmniejsza to potrzebę szeroko zakrojonej optymalizacji potrzebnej do jednoczesnego barwienia w metodologiach o wysokiej plekspozycji, które wymagają kompensacji nakładania się widma23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten wykorzystuje skrawki tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie pobrane od pacjentek z surowiczym rakiem jajnika o wysokim stopniu złośliwości, które wcześniej nie były leczone, które przeszły pierwotną operację cytoredukcyjną. Wszystkie dane kliniczne uzyskano z repozytorium raka jajnika na Wydziale Ginekologii Onkologicznej i Medycyny Rozrodu zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Review Board Uniwersytetu Teksańskiego MD Anderson. Pisemna świadoma zgoda pacjentów została uzyskana przez personel recepcji, a badania zostały przeprowadzone zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi.

UWAGA: Wszystkie odczynniki, o ile nie zaznaczono inaczej, rozcieńcza się w wodzie dejonizowanej bez nukleaz.

1. Napraw i osadź próbki

UWAGA: Wybór utrwalacza i czasu trwania utrwalenia ma duży wpływ na wydajność testów, a ogólnie testy przestrzenne są najczęściej wykonywane przy użyciu FFPE, ponieważ zachowuje on architekturę patologiczną. Protokół ten określa użycie tkanki FFPE, w związku z czym dla próbek tkanek FFPE sugerowany jest następujący protokół. Na jakość RNA wpływają jednak procesy wiązania, podobnie jak epitopy białek, ale w mniejszym stopniu. Te metody fiksacji, niepełne utrwalenie i degradacja próbki mogą zwiększyć niespecyficzne wiązanie w proteomice opartej na przeciwciałach. Po trzecie, fluorescencja konstytutywna jest zwykle gaszona podczas przetwarzania FFPE, ale niektóre fluorofory będą umiarkowanie trwałe i będą wymagały testów, aby upewnić się, że są wygaszone.

  1. Tkankę należy podzielić na sekcje do grubości ≤ 5 mm, aby zapewnić równomierne utrwalenie i zapobiec powstawaniu barier dyfuzyjnych wywołanych tłuszczem. Natychmiast utrwalić skrawki w 10% buforowanej fosforanem formalinie (pH 7,0) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, aby zoptymalizować RNA i białko24.
  2. Przetwarzaj utrwalone tkanki w procesorze tkanek lub przetwarzaj ręcznie, wykonując następujące czynności
    1. Odwodnić skrawki tkanek w etanolu klasy cząsteczkowej w wodzie wolnej od nukleaz (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x przez 1 godzinę każdy).
    2. Następnie zanurz tkankę w ksylenie 2 razy po 1 godzinie w temperaturze pokojowej (~23 °C).
  3. Rozgrzej wosk parafinowy do temperatury 60 °C. Zanurz pudełko na chusteczki w wosku parafinowym na 2 razy po 1 godzinie.
  4. Umieść napompowaną chusteczkę i zorientuj chusteczki w formie, wypełnij świeżym woskiem parafinowym i szybko schładzaj do 4 °C25.
    UWAGA: Najlepsze wyniki dla RNA uzyskamy wykonując wszystkie kroki w ciągu 48 godzin.

2. Ocena jakości RNA

  1. Użyj trzech sekcji szeregowych, prowadząc albo wszystkie trzy suwaki równolegle, albo uruchamiając suwaki sterujące przed docelowym panelem, aby upewnić się, że blokowanie jest wystarczające. Sparowane sondy kontroli pozytywnej celują w geny porządkowe, aby ocenić jakość tkanki i integralność przestrzenną w tkance, na którą mogą mieć wpływ różnice w wytrwałości. Powszechnie stosowane kontrole obejmują UBC (gen o wysokiej ekspresji), PPIB (umiarkowana ekspresja) i POLR2A (niska ekspresja)26. Używaj zestawów sond kontroli negatywnej, takich jak Dab1 (RNA bakterii glebowych) na każdym kanale detekcji. Opcjonalnie należy dołączyć wszystkie sondy kontroli dodatniej i ujemnej na tej samej próbce wraz z sondami docelowymi. W tej konfiguracji umieść kontrole ujemne Dab1 w kanałach T2-T4, przypisz kontrole pozytywne od najniższego do najwyższego wyrażenia do T1, T5 i T9 i upewnij się, że sondy docelowe zajmują pozostałe kanały.
    OPCJONALNIE: Ponadto w przypadku próbek o nieznanej jakości RNA przydatne może być określenie wartości rozkładu 200 (wynik DV200). Zdecydowanie zaleca się uzyskanie wyników DV200 powyżej 30, przy czym preferowane są próbki wyższej jakości wynoszące 50 lub więcej27. Wynik ten wskazuje na jakość RNA, a wyższa jakość próbki zwiększa prawdopodobieństwo, że RNA-ISH będzie działać skutecznie27.

3. Środki ostrożności i preparaty RNA

UWAGA: Najlepszą praktyką jest odkażenie obszaru RNaz i wytarcie go, a następnie spryskanie obszaru roboczego 70% etanolem przed przetwarzaniem, oprócz korzystania z obszaru wolnego od RNazy, zawsze należy nosić czyste rękawice, fartuch laboratoryjny i maskę, aby zminimalizować wprowadzanie RNaz ze skóry lub oddechu. Używaj wyłącznie wody i materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNaz i unikaj sięgania do toreb z zapasami. Te środki ostrożności, a także utrzymywanie tkanek/szkiełek w chłodzie i suchości, są niezbędne do utrzymania integralności RNA podczas eksperymentów.

  1. Wytnij skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach za pomocą mikrotomu i umieść obszar zainteresowania na środku szkiełka, który współgra z obszarem obrazowania (różni się w zależności od systemu; tutaj jest to około 12,5 mm x 12,5 mm).
    UWAGA: Należy pamiętać, że idealna grubość dla każdej sekcji wynosi od 4 do 6 μm dla tkanek FFPE.
  2. Piecz szkiełka FFPE w suchym piekarniku bez RNA, chusteczką do góry, w temperaturze 60 °C przez co najmniej 1 godzinę i do nocy w przypadku tkanek tłuszczowych lub tkanek, które w inny sposób są podatne na odwarstwienie.
  3. OPCJONALNA obróbka wstępna
    UWAGA: Chociaż obróbka wstępna jest opcjonalna, niektóre kroki są dodatkowo opcjonalne, jak opisano poniżej.
    1. Przygotuj 3% nadtlenek wodoru: W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodaj 5 ml 30% nadtlenku wodoru do 45 ml 1x PBS. Pozostały nadtlenek wodoru należy przechowywać w temperaturze pokojowej (~23 °C), pokrywką zabezpieczoną parafilmem, przez okres do trzech miesięcy.
      UWAGA: Nadtlenek wodoru jest silnym utleniaczem. Przechowywać z dala od materiałów palnych, źródeł ciepła i metali. Stosować w obszarze dygestorium chemicznego z osobistymi środkami ochrony osobistej (PPE; np. okularami, rękawicami i fartuchem laboratoryjnym). Unikać kontaktu ze skórą, oczami i wdychania. Płukać skórę wodą przez 15 minut, jeśli jest odsłonięta. Zwrócić się o pomoc medyczną w przypadku połknięcia lub wdychania. Wyższe stężenia mogą spowodować poważne oparzenia i mogą zapalić się lub eksplodować materiałami organicznymi lub niektórymi metalami. Zawsze dodawaj nadtlenek wodoru do wody, aby uniknąć gwałtownych reakcji.
    2. Przygotuj 3,7% formaldehydu: W dygestorium chemicznym dodaj 1 ml 16% formaldehydu na 3,3 ml 1x PBS. Formaldehyd owinięty parafilmem należy przechowywać do trzech miesięcy.
      UWAGA: Formaldehyd może powodować poważne uszkodzenie oczu, podrażnienie dróg oddechowych i podejrzewa się, że powoduje raka. Długotrwałe lub powtarzające się narażenie może prowadzić do uczulenia skóry i reakcji alergicznych. Używać wyłącznie w okapie oparowym i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, okulary/osłonę twarzy, maskę, fartuch laboratoryjny itp.). Unikać kontaktu ze skórą, kontaktu z oczami i wdychania. Przechowywać z dala od źródeł ciepła i otwartego ognia. Utylizuj paraformaldehyd i skażone materiały jako odpady niebezpieczne i przygotuj tylko ilość potrzebną do natychmiastowego użycia, jeśli to możliwe.
    3. Odparafinować przez przemycie szkiełka tkankowego, umieszczając je w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających następujące elementy: Ksylen (40 ml) przez 3 prania po 5 minut każde w dygestorium chemicznym.
      OPCJONALNIE: Zamiast ksylenu można użyć histologicznego środka czyszczącego na bazie nieksylenowej, ale potencjalnie pozostawi on pozostałości po parafinie i wpłynie na jakość obrazu. Polega to na umieszczeniu plastrów w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających następujące elementy: Nieksylenowy środek czyszczący histologiczny (40 ml) na dwa mycia po 15 minut każde. Skrawki z bloków, które są wykonane z wosku pszczelego, mogą być trudne do odparafinowania za pomocą nieksylenu. W przypadku nieznanych mieszanin wosku i parafiny zaleca się stosowanie ksylenu z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności. Ksylen jest substancją niebezpieczną i łatwopalną, a długotrwałe narażenie może spowodować uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego, wątroby i nerek. Używać tylko w dygestorium chemicznym i nosić środki ochrony osobistej (np. rękawice, maski i fartuchy laboratoryjne). Utylizować ksylen i zanieczyszczone materiały jako odpady niebezpieczne. W przypadku narażenia należy natychmiast zwrócić się o pomoc lekarską.
    4. Ponownie nawodnić przez przemycie szkiełka tkankowego, umieszczając w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej: 100% etanol (40 ml) przez 2 prania po 3 minuty każde; 95% etanol (40 ml) na 2 prania po 3 min każde; 70% etanol (40 ml) na 2 prania po 3 min każde; 50% etanol (40 ml), na 2 prania po 3 min każde; 30% etanol (40 ml) na 2 prania po 3 min każde; 1x pranie PBS (40 mL) na 1 pranie po 2 min.
    5. Peroksydaza blokuje tkankę, umieszczając ją w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej (~23 °C) i pokrywając tkankę około 100-200 μL 3% nadtlenku wodoru, przez 1 przemycie po 10 minutach, a następnie umyj tkankę 1x PBS wash (40 ml), przez 2 prania po 2 minuty każde.
      UWAGA: Blokowanie peroksydazy jest opcjonalne i wygasza resztkowe enzymy peroksydazy w tkance w celu zmniejszenia niespecyficznego barwienia i może zmniejszyć autofluorescencję tkanek. Jest to szczególnie ważne w przypadku tkanek o wysokiej autofluorescencji, takich jak szpik kostny, nerki, wątroba, płuca, jelita i mózg, gdzie silne sygnały tła mogą zakłócać obrazowanie w pasmach emisji TRITC i FITC 28,29,30,31,32.
    6. Utrwalenie formaldehydu należy wykonać, umieszczając tkankę w komorze wilgotnościowej o temperaturze pokojowej i przykrywając tkankę około 100-200 μl 3,7% formaldehydu, na 1 pranie po 10 minutach, a następnie umyj chusteczkę 1x płukaniem PBS (40 ml), przez 2 prania po 2 minuty każde.
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale zalecany w przypadku tkanek o wysokiej zawartości tłuszczu lub innych tkanek, które mają problemy z przyleganiem do szkiełek.

4. Pobieranie antygenu

UWAGA: Zalecana i opisana tutaj metoda odparafinowania i odzyskiwania antygenu różni się od metody zalecanej przez producenta dla seqRNA-ISH+seqIF, która wykorzystuje kontrolowane urządzenie do odzyskiwania antygenu cieplnego o dużej pojemności.

  1. Odzyskiwanie antygenu indukowane ciepłem (HEIR) za pomocą kuchenki mikrofalowej
    1. Używając kuchenki mikrofalowej z monitorowaną temperaturą, dodaj wystarczającą ilość dostępnego w handlu roztworu buforowego HEIR o pH 9,0 (około 250 ml), aby przykryć szkiełka w uchwycie szkiełka poniżej termometru, jeśli ma to zastosowanie.
      UWAGA: Pobieranie antygenu dla RNA odbywa się zwykle przy pH 6,0, jednak poniższe metodologie dotyczą pH 9,0 w celu uzyskania wyższej skuteczności wiązania przeciwciał.
  2. Włóż szkiełka w roztworze buforowym do kuchenki mikrofalowej i zrównoważ puste komory, jeśli to dotyczy, wodą podwójnie destylowaną. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 15 minut w temperaturze 107 °C (całkowity czas to zwykle 30 minut, aby bufor HEIR osiągnął temperaturę).
  3. Schłodzić szkiełka, umieszczając je pod wyciągiem chemicznym w temperaturze pokojowej na około 20 minut.
  4. Umyj szkiełka w 1x PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (40 ml), na 1 pranie przez 2 min.
  5. Przechowywać szkiełka w zakręcanej skrzynce pocztowej lub stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 1x PBS (lub komercyjnym buforem do barwienia wielobarwnego) i natychmiast kontynuować lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 7 dni, ale najlepiej krócej niż 72 godziny przed przystąpieniem do stosowania seqRNA-ISH+seqIF.

5. Przygotuj roztwory podstawowe

  1. Przygotowanie 40-krotnego bufora do obrazowania RNA
    1. Przygotuj 40-krotny bufor do obrazowania RNA, łącząc 400 mg sproszkowanego buforu do obrazowania RNA i 25 ml wody dejonizowanej wolnej od nukleaz
    2. Powstały roztwór należy roztrząsać aż do całkowitego rozpuszczenia, a następnie rozdzielić na 1,5 ml probówek do mikrowirówek (1 ml na probówkę)
    3. Zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do trzech miesięcy, unikając cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Przygotować 20x bufor solno-sodowo-cytrynianowy (SSC)
    1. Rozpuścić 157,3 g chlorku sodu (NaCl) i 88,2 g cytrynianu sodu (Na3C6H5O7) w 800 ml wody dejonizowanej wolnej od nukleaz.
    2. Zmierz pH i miareczkuj kroplami do pH 7,0 za pomocą 1 M kwasu solnego (HCl).
    3. Autoklaw do sterylizacji.
      UWAGA: Sterylne 20x SSC można również kupić w różnych firmach. Po otwarciu przechowywać w temperaturze pokojowej do 4 °C.
    4. Przygotuj 4x bufor SSC, łącząc 1 ml 20x SSC stock z 4 ml wody dejonizowanej wolnej od nukleaz

6. Sekwencyjny RNA-ISH + sekwencyjna immunofluorescencja

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w niniejszym dokumencie są zaadaptowane z protokołu producenta dla seqRNA-ISH+seqIF opisanego w Tabeli materiałów, ponieważ większość odczynników jest identyfikowana jako odczynniki kompatybilne z systemem, komercyjne. Odczynniki te są identyfikowane i/lub dostarczane przez producenta i zaprojektowane tak, aby były kompatybilne z systemem. Modyfikacje są możliwe i opisane w dyskusji, ale mogą wymagać dodatkowych testów i mycia płynów, aby zapobiec gromadzeniu się. Oprogramowanie obliczy całkowitą objętość odczynników potrzebnych po zaprojektowaniu i wprowadzeniu panelu i protokołu. Przedstawiono jednak zalecane modyfikacje. Całkowita objętość zawsze będzie się różnić w zależności od liczby cykli i celów używanych w każdym protokole. Jednak rozcieńczenia przeciwciał i RNA-ISH nie zostaną obliczone przez system, chyba że każda pojedyncza kombinacja zostanie wprowadzona jako unikalna pozycja w bazie danych. Do tego protokołu wymagane jest 400 μl koktajlu przeciwciał na szkiełko z próbką.

  1. Przygotowanie systemu
    1. Przed seqRNA-ISH+seqIf należy dokładnie przepłukać wszystkie mikrofluidyki wodą wolną od nukleaz.
    2. Rozpyl na zewnątrz systemu roztwór do odkażania RNAzy, a następnie 70% etanol.
  2. Przygotuj odczynniki ogólne
    1. Bufor do mycia: 50 ml 20x kompatybilnego z systemem, komercyjnego, wielobarwnego buforu + 950 ml wody dejonizowanej wolnej od nukleaz
    2. Woda: 100 ml wody dejonizowanej wolnej od nukleaz.
    3. Etanol: 100 ml 70% etanolu.
    4. Bufor do obrazowania: 16 ml 10 ml kompatybilnego z systemem, komercyjnego roztworu do obrazowania + 140 ml wolnej od nukleaz wody dejonizowanej + 4 ml kompatybilnego z systemem, komercyjnego, materiału do obrazowania.
    5. Bufor elucyjny: 152 kompatybilny z systemem, komercyjny, roztwór elucyjny 1 + 8 kompatybilny z systemem, komercyjny, roztwór elucyjny 2
    6. Bufor hartowniczy: 130 ml wolnej od nukleaz wody dejonizowanej + 14 ml kompatybilnego z systemem, komercyjnego, roztworu hartującego 1 + 16 ml kompatybilnego z systemem, komercyjnego, roztworu hartowniczego 2.
  3. Przygotuj odczynniki barwiące do protokołu RNA-ISH
    UWAGA: Ten krok można wykonać poprzedniego wieczoru i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Chociaż zalecenia producenta stwierdzają, że sondy z pulą mogą być używane przez okres do jednego roku, nie zaleca się łączenia sond z wyprzedzeniem większym niż tydzień ze względu na obawy związane z zanieczyszczeniem. W przypadku sond najlepiej jest stukać lub delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać i delikatnie odwirować je do odwirowania przed użyciem.
    1. Załaduj kompatybilny z systemem, komercyjny, wolny od proteinaz roztwór przepuszczalny w ilości 500 μl na szkiełko w probówce do mikrowirówki kompatybilnej z systemem.
    2. Wzmacniacze puli RNA-ISH oparte na cyklu (tabela 1) o łącznej ilości 500 μl na szkiełko podstawowe na każdy z następujących elementów w probówce mikrowirówki kompatybilnej z systemem: i) drzewa ogonowe ZZ dla ogonów T1 do T4, ii) drzewa ogonowe ZZ dla ogonów T5 do T8, iii) drzewa ogonowe ZZ dla ogonów T9 do T 12.
    3. Specyficzne dla drzewa ogonowego basenu, dopasowanie wzmacniacza, fluorofory o łącznej ilości 500 μl na szkiełko na każdy z następujących elementów w probówce mikrowirówki kompatybilnej z systemem: i) Fluorofor dla drzewa T1 do T4, ii) Fluorofor dla drzewa T5 do T8, iii) Fluorofor dla T9 do T 12.
      UWAGA: Ten krok jest wrażliwy na światło
    4. Przygotować 1 ml komercyjnego DAPI w rozcieńczeniu 1:200 (stężenie podstawowe 1 mg/ml) w komercyjnym buforze do barwienia wykonanym z wolnej od nukleaz wody dejonizowanej na szkiełko
      UWAGA: Zabieg został wykonany zgodnie z zaleceniami producenta, który zalicza DAPI do standardowych odczynników. W przypadku stosowania niestandardowych preparatów DAPI, które są rozcieńczone N,N-dimetyloformamidem (DMF), rozcieńczenia mogą się różnić i konieczne będzie przeprowadzenie testów miareczkowania. Zaleca się jednak stosowanie stężenia około 1:1000-1:2000 o stężeniu podstawowym 1 mg/ml. Zazwyczaj jest to stężenie wyższe niż normalne niż w przypadku ręcznych protokołów barwienia, ponieważ musi przetrwać wiele rund obrazowania i usuwania. Świeże preparaty DAPI w DMF są zwykle jaśniejsze niż dostępne na rynku preparaty DAPI. Odczynniki z formamidem, takie jak DAPI, należy umieścić pod wyciągiem chemicznym. Formamid może działać szkodliwie na rozrodczość i powodować uszkodzenia narządów i podejrzewa się, że jest rakotwórczy. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (np. rękawic i fartucha laboratoryjnego).
    5. Przygotować bufor do obrazowania RNA-ISH bezpośrednio przed użyciem z 12.125 wodą dejonizowaną wolną od nukleaz, 1.5 ml 10x buforu do obrazowania B i 275 μl 40x buforem do obrazowania A (rozmrożonym lub świeżo przygotowanym)
    6. Przygotować do 10 par przeciwciał pierwszorzędowych (pierwszorzędowe przeciwciała białkowe przedstawiono w tabeli 2) do seqIF zgodnie z testowanymi rozcieńczeniami miareczkowania w komercyjnym buforze do barwienia wielobarwnego, co daje łącznie 400 μl na szkiełko w probówce do mikrowirówek kompatybilnej z systemem. Upewnij się, że każdy cykl seqIF zawiera tylko jedno przeciwciało pierwszorzędowe na gatunek gospodarza.
    7. Przygotować fluorofory drugorzędowe (Tabela 3) plus DAPI zgodnie z pierwszorzędowymi kombinacjami przeciwciał w kroku 6.3.7 dla seqIF zgodnie z rozcieńczeniami testowanymi miareczkowaniem. Rozcieńczyć w buforze do barwienia w łącznej ilości 400 μl na cykl w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z minimalną objętością martwą 1 ml. Przykładowe stężenia drugorzędowych przeciwciał Alexa Fluor i DAPI są następujące: rozcieńczenie 1:200 dla Alexa Fluor 555, rozcieńczenie 1:400 dla Alexa Fluor 647, rozcieńczenie 1:1800 dla DAPI (od 1 mg/ml DAPI w DMF)
      UWAGA: Ten krok jest wrażliwy na światło. Dodanie DAPI do wtórnych nie jest zgodne z protokołem producenta, ponieważ może pomóc w utrzymaniu ekspresji DAPI przez wiele cykli seqIF, co pomaga w wyrównaniu obrazów po uruchomieniu. Większość programów do przetwarzania obrazu, takich jak te dołączone do tego systemu, wykorzystuje sygnał DAPI do potwierdzania wyrównania obrazowania cyklicznego pod kątem kolokalizacji fluorescencyjnej.
  4. Inicjalizacja systemu
    1. Załaduj każdy z odczynników z kroku 6.3 w kolejności określonej przez system. Należy pamiętać, że generalnie kolejność będzie taka jak powyżej, ale zawsze upewnij się, że odczynniki pasują do miejsca, w którym są ładowane
    2. Załaduj szkiełko pobrane z antygenu do uchwytu i upewnij się, że okienko obrazowania szkiełka jest wyrównane na środku przestrzeni obrazowania przed umieszczeniem kompatybilnego z systemem chipa mikroprzepływowego na górze i zablokowaniem go na miejscu.
      UWAGA: Chipy mikrofluidyczne mogą być ponownie wykorzystane do testów miareczkowania sekwencji, jeśli zostaną odpowiednio oczyszczone i przechowywane do jednego dodatkowego razu, o ile uszczelki pozostaną nienaruszone. Chipy mikrofluidyczne nie mogą być ponownie użyte, jeśli uruchamiany jest panel RNA ze względu na potencjalne zanieczyszczenie.
    3. Przygotuj roztwór do rozszczepiania, mieszając 1,35 ml 4x SSC i 150 ml dostępnego w handlu 10x roztworu do rozszczepiania.
      UWAGA: 10x roztwór do rozszczepiania szybko się utlenia i jest przechowywany w szklanej ampułce, którą należy rozbić tylko bezpośrednio przed użyciem w eksperymentalnym przebiegu seqRNA-ISH+seqIF.

7. Uruchomienie systemu

  1. Uruchom system zgodnie z instrukcjami producenta, przybliżony czas pracy dla dwóch szkiełek w 12-plex seqRNA-ISH z 20-plex protein seqIF wynosi 48 godzin dla okna obrazowania 12,5 cm x 12,5 cm.
  2. Po zakończeniu przebiegu seqRNA-ISH+seqIF, szkiełko można usunąć i przechowywać w 1x PBS lub natychmiast wykorzystać do dodatkowego seqIF (dla maksymalnie 40 białek).
    UWAGA: Ważne jest, aby czyścić i przepłukiwać mikrofluidykę układu wodą wolną od nukleaz przed i po każdym uruchomieniu, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.

8. OPCJONALNIE: Analiza obrazu i analiza statystyczna

  1. Kontynuuj analizę obrazu i analizę statystyczną za pomocą narzędzi do analizy obrazu lub analizy patologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako przykład tej metody przeprowadziliśmy następujące sekwencje RNA-ISH (Tabela 1) + SeqIF (Tabela 2 i Tabela 3) na dwóch slajdach z ludzkiego surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości.

Rycina 2 ilustruje nakładanie seqRNA-ISH+seqIF na próbkę tkanki guza jajnika. Strukturalne markery białkowe, takie jak kolagen 1, są wykorzystywane do identyfikacji regionów guza, podczas gdy markery fenotypowe i funk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym krokiem w przygotowaniu i obchodzeniu się z próbkami jest obniżenie zanieczyszczenia RNAzą. Można to osiągnąć, stosując maski zapobiegające zanieczyszczeniu z dróg oddechowych oraz wycierając powierzchnie robocze roztworem odkażającym RNaza i 70% etanolem wykonanym z wody wolnej od nukleaz. W przypadku szkiełek FFPE najlepiej jest wyciąć wiele sąsiadujących ze sobą szkiełek z bloków FFPE w celu seqRNA-ISH+seqIF i przechowywać je w temperaturze 4 °C ze środkiem osuszającym. W celu kontroli jakości, oprócz b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te zostały częściowo sfinansowane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Sie Foundation i Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Badania te przeprowadzono we współpracy z Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, który jest częściowo wspierany przez National Institutes of Health poprzez M. D. Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 oraz Jared Burks's NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1.

Chcielibyśmy również podziękować Emily Martersteck z Lunaphore za pomoc techniczną i szkolenie.

Autorzy otrzymali zestaw sond celowanych i kontrolnych RNAScope w ramach programu wczesnego dostępu od Bio-Techne po obniżonej cenie, a niektóre odczynniki zostały dostarczone bezpłatnie do wykorzystania w tym badaniu. Producent nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych ani w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Do barwienia jądrowego (produkt używany podczas tego badania, 62247 został wycofany)
50 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkoweThermo Fisher Naukowy339652Używany do podwielokrotności & mieszane roztwory wtórne
70% sterylny alkohol izopropanolowyCzyszczenie tekstuTX3270 powiedział:Do odkażania powierzchni
PrzeciwciałaRozmaityRozmaityUżywany dla głównych celów, różni się w zależności od używanego kanału
APOE - Host: Mysz, Klon: 960318R& DMAB41443-100(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
aSMA - Host: Mysz, Klon: 1A4CSTZobacz materiał 69319SF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
Mikrotom AutocutKsięga Leica14051956472Cięcie tkanki
CD10 - Gospodarz: Królik, Klon: E5P7SCST65534S(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD11c - Gospodarz: Królik, Klon: D3V1ECSTZobacz materiał 93233SF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD163 - Gospodarz: Królik, Klon: D6U1JCSTNumer katalogowy: 93498S(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD163 - Gospodarz: Królik, Klon: ja51-30InvitrogenMA5-32684 powiedział:(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD20 - Host: Mysz, Klon: L26Betyl powiedział:A500-017ACF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD31 - Host: Mysz, Klon: 3F8E2Technologia Białkowa66065-2-IG(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD33 - Gospodarz: Królik, Klon: BLR061GBetyl powiedział:A700-061CF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD4 - Gospodarz: Królik, Klon: EPR6855Księga Abcamab181724 powiedział:(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD45 - Gospodarz: Królik, Klon: BL-178-12C7Betyl powiedział:A700-012(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD45RO - Host: Mysz, Klon: UCHL1Betyl powiedział:A500-020ACF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD56 - Gospodarz: Królik, Klon: BLR152JBetyl powiedział:99746(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD66b - Gospodarz: Królik, Klon: BLR111HInvitrogenMA5-44413 powiedział:(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD68 - Host: Mysz, Klon: KP-1Legenda biologiczna916104(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD8 - Host: Mysz, Klon: C8/144BLegenda biologiczna372902(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
CD86 - Gospodarz: Królik, Klon: E2G8PCSTZobacz materiał 76755SF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
Kolumna 1A1 - Gospodarz: Mysz, Klon: E3E1XCSTNr kat. 66948S(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
Probówki DNA LoBind 2mLEppendorf powiedział:22431048Używany do mieszanych roztworów sond RNA
Drierite 21005 wskazujący na środek osuszającyCole'a-Palmera21005Środek osuszający do eksykatora
Ostrza mikrotomu Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistologia - Używana podczas cięcia próbek
Alkohol etylowy 100% (200 proof)Pharmco111000200Do deparafinowania
EZ-AR2 Elegancja BuforBioGeneXHK547-XAKSłuży do pobierania antygenu z wycinków tkanek FFPE
FOXP3 - Gospodarz: Królik, Klon: PoliklonalnyBetyl powiedział:A700-034CF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
Kozia anty-mysia IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21425(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) F(ab')2-Goat anty-mysie przeciwciało anty-IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor™ 555
Kozia anty-mysia IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-48289/A-21237(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) F(ab')2-Goat anty-mysie przeciwciało anty-IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor™ plus 647
Kozia anty-królicza IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21430(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) F(ab')2-kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo drugorzędowe, Alexa Fluor™ 555
Kozia anty-królicza IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21246(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) F(ab')2-kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo drugorzędowe, Alexa Fluor™ 647
GZMB - Gospodarz: Królik, Klon: PoliklonalnyTechnologia Białkowa13588-1-AP(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
HS-POLR2A-T1ACD Biotechne310457-T1Ludzka sonda o niskiej ekspresji
HS-PPIB-T5ACD Biotechne313907-T5Kontrola sondy z ekspresją środkową u człowieka
HS-UBC-T9ACD Biotechne310047-T9Ludzka kontrola wysokiego ekspresji
Roztwór nadtlenku wodoru 30%Sigma-AldrichHX0640-5Do przygotowania tkanek. Pomaga blokować endogenną aktywność peroksydazy i uzyskiwać produkty o silnym zabarwieniu. Aby zrobić 3% roztwór nadtlenku wodoru
Ker8/18 - Host: Mysz, Klon: PoliklonalnyTechnologia Białkowa66187-1-PBS(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
LRP5 - Gospodarz: Królik, Klon: HPA030505SigmaHPA030505-100UL(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
Lunaphore 20x Bufor do barwieniaFirma Bio-TechneBU06 powiedział:Stosowany jako rozcieńczalnik i do mycia COMET
Układ Lunaphore COMETFirma Bio-TechneMK03 powiedział:Układ mcirofluidics do instrumentu COMET
Lunaforowa kometaFirma Bio-TechneCM10-SAutomatyczny barwnik Seq-IF
Zestaw bufora elucyjnego LunaphoreFirma Bio-TechneBU07-LRozwiązanie 1 & Roztwór 2 dla etapów elucji COMET
Zestaw bufora do obrazowania LunaphoreFirma Bio-TechneBU09 powiedział:Substancja rozpuszczona & Rozpuszczalnik używany do obrazowania podczas przebiegu COMET
hartownicze LunaphoreFirma Bio-TechneBU08-LRozwiązanie 1 & Rozwiązanie 2 dla etapów hartowania COMET
MikropipetaRozmaityN/Ado przygotowania odczynnika
Periostin - Gospodarz: Mysz, Klon: 1A11A3Technologia Białkowa66491-1-PBS(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
Pierce 16% formaldehyd (w/v), bez metanoluThermo Fisher Naukowy28908Aby wytworzyć 3,7% PFA do przygotowania tkanek
Wejście sondy 320102 (kanał T2)ACD Biotechne300040Kontrola ujemna DapB w T2
Wejście sondy 320102 (kanał T3)ACD Biotechne300040Kontrola ujemna DapB w T3
Wejście sondy 320102 (kanał T4)ACD Biotechne300040Kontrola ujemna DapB w T4
Roztwór podstawowy do rozszczepiania RNAscope HiPlexFirma Bio-TechneNr kat. 324399Odczynnik do rozszczepiania podczas testu RNAScope
RNAscope HiPlex Pro do zestawu COMET 12-plex, 20 slajdówFirma Bio-Techne322075Odczynniki i odczynniki dla RNAScope
Sonda RNAscope HiPlex - HS-APOE-T2ACD BiotechneNumer katalogowy: 433093-T2(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-APOE-T2
Sonda RNAscope HiPlex - HS-ARG1-T4ACD BiotechneNumer katalogowy: 401581-T4(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-ARG1-T4
Sonda RNAscope HiPlex - HS-CD274-T1ACD Biotechne600863-T1(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-CD274-T1
Sonda RNAscope HiPlex - HS-CD40-T6ACD BiotechneNumer katalogowy: 445973-T6(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-CD40-T6
Sonda RNAscope HiPlex - HS-CXCL1-01-T12ACD Biotechne1256473-T12(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-CXCL1-01-T12
Sonda RNAscope HiPlex - HS-GZMB-T7ACD Biotechne468453-T7(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-GZMB-T7
Sonda RNAscope HiPlex - HS-IFNG-T3ACD Biotechne310503-T3(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS- HS-IFNG-T3
Sonda RNAscope HiPlex - HS-IL23a-T8ACD Biotechne562853-T8(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-IL23a-T8
Sonda RNAscope HiPlex - HS-IL6-T9ACD Biotechne400883-T9(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-IL6-T9
Sonda RNAscope HiPlex - HS-TNFa-T11ACD Biotechne310423-T11(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-TNFa-T11
Sonda RNAscope HiPlex - HS-VEGFa-T5ACD BiotechneNumer katalogowy: 423163-T5(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-VEGFa-T5
Sonda RNAscope HiPlex - HS-VISTA-T10ACD BiotechneNumer katalogowy: 491513-T10(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Wczesny dostęp RNAscope™ Sonda HiPlex CS - HS-VISTA-T10
Sonda kontroli ujemnej RNAscope HiPlex12 CSACD Biotechne324347Pełny 12-pleksowy panel kontroli negatywnej zalecany przez producenta. DapB w T1-T12.
RNAscope HiPlex12 CS Sonda kontroli pozytywnej-HsACD Biotechne324317Pełny 12-poziomowy panel kontroli pozytywnej człowieka zalecany przez producenta. Hs -RTU do śledzenia genu porządkowego w kanałach T1 do T12: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
Woda wolna od RNAzyCorning46-000-CMDo czyszczenia i przygotowania całego sprzętu oraz do stosowania jako rozcieńczalnik w razie potrzeby
Roztwór do odkażania RNazaz RNaseZapThermo Fisher NaukowyZobacz materiał AM9782Roztwór do dekontaminacji powierzchni, który niszczy RNazy
Zestaw RNeasy FFPEQiagen powiedział:73504 & 19093Do ekstrakcji RNA i Pomiar DV200
Koperta slajdówSimport NaukowyM9504MAdo przechowywania szkiełek w buforze cieczy.
Konstrukcja chirurgiczna Przemysłowa żyletka ogólnego przeznaczeniaThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histologia - Używana podczas cięcia próbek
TOX 1/2 - Gospodarz: Królik, Klon: E613QCSTZobacz materiał 62886SF(Uwaga: Specyficzne dla tego badania) Pierwszorzędowe przeciwciało białkowe
Stopień histologiczny ksylenuThermo Fisher NaukowyUN1307 powiedział:Do deparafinowania

Bibliografia

  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencyjna immunofluorescencjaprzestrzenna transkryptomikaplatforma multiomicznamikro rodowisko kom rkowecele bia kowehybrydyzacja RNAmikroprzep ywy na tkanceoddzia ywania mi dzykom rkowe

Powiązane artykuły