Artykuł metodologiczny

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

DOI:

10.3791/68616

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość wykrywania białka i mRNA w tym samym badaniu pomaga zrozumieć, jak komórka przygotowuje się na przybycie i jakie sygnały otrzymuje podczas podróży i interakcji w środowisku, w którym się znajduje. Obrazowanie wyższego pleksu pozwala obecnie na jednoczesną charakterystykę przestrzennie rozdzielonego mRNA (transkryptomika przestrzenna) i białka (proteomika przestrzenna). Aby uniknąć redundancji, analizowane substancje można analizować w pojedynczym przekroju tkanki. Istnieje wiele technologii umożliwiających tworzenie wielu białek i niewielu mRNA lub odwrotnie, ale ponieważ centralnie działające anality to białka, ten artykuł koncentruje się na integracji obrazowania białek (IMC) z hybrydyzacją mRNA in situ (ISH) z wykorzystaniem sond metalowych. Pozwala nam to zrozumieć, jakie sygnały komórka wysyła lub wysyła szybko do świata, komunikując się w swoim mikrośrodowisku. Pozwala także pokonać ograniczenia związane z wykrywaniem wydzielanych białek lub wymagających markerów, które zwykle trudno ilościowo określić i zobrazować wyłącznie przy użyciu przeciwciał. Protokół ten minimalizuje również potrzebę kompensacji lub postprocessingu, co występuje w metodach opartych na fluorescencji o wyższym plexie, ponieważ w systemie detekcji opartym na metalowych sondach nie występuje fluorescencyjne przelewanie spektralne, ani nie uwzględnia się specyficznych dla tkanek autofluorescencji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowotwory wykazują zróżnicowanie strukturalne i funkcjonalne u różnych pacjentów. Mikrośrodowisko nowotworowe (TME), złożone z komórek normalnych i złośliwych, jest zróżnicowane wśród pacjentów. Przerzuty powstają w wyniku ucieczki reszty pierwotnego guza do krwiobiegu w formie skupisk komórek i pojedynczych komórek, co dostarcza wskazówek dotyczących postępu choroby i odpowiedzi terapeutycznej 1,2. Złożoność tych mikrośrodowisk wymaga zrozumienia:1. Chociaż guzy zawierają wiele typów komórek, standard kliniczny opiera się na jednym markerze, który zaczyna się zmieniaćw 1,2. Technologie obrazowania multipleksowego otworzyły nowe kierunki w patologii. Przestrzennie rozdzielona proteomika, genomika, metabolomika i lipidomika nowotworów ludzkich są obecnie możliwe przy rozdzielczości pojedynczej komórki lub blisko niej 3,4,5,6.

Technologie te mogą analizować heterogeniczne lokalizacje komórek i interakcje w guzach. Wykorzystanie odpowiedniej metodologii bioobrazowania pojedynczych komórek pozwala na tworzenie profili wielu biomarkerów białek związanych z chorobą w biopsjach pacjentów, co pozwala na projektowanie terapii onkologicznych. Wnioski z map komórkowych przestrzennych pozwolą na wybór terapii skojarzonej, która skutecznie eliminuje nowotwory przy zmniejszonej liczbie nieprawidłowości, oporności i nawrotach1. Chodzi o możliwość zrzeszania tych wielu różnorodnych technologii, które zazwyczaj nie działają ze sobą na tym samym odcinku tkanki7. Protokół ten, przedstawiony wizualnie na Rysunku 1, daje możliwość przestrzennego badania zarówno proteomiki, jak i docelowego podzbioru mRNA w tym samym przekroju tkanki i tej samej komórce, jednocześnie z większą plekscytacją niż jest to możliwe przy jednoczesnym fluorescencyjnym białku+RNA-ISH8. Może to również służyć jako pomost do analizy równoległej 3,4,6, mającej na celu rozproszenie analizy danych. Chociaż obecne jest podwójne wykrywanie, można również badać komórki, które szybko zainicjowały produkcję mRNA, ale dla których wydzielane białko pozostaje niewykrywalne ze względu na ograniczoną czułość i brak amplifikacji sygnału, charakterystyczną dla bezpośrednio znakowanych metod przeciwciał pierwotnych, co czyni wykrywanie wydzielanych cząsteczek szczególnie trudnym. Poniższy protokół został zaadaptowany z detekcji fluorescencyjno-chromogenicznej 12-plex do wykrywania metalowego za pomocą sond zmodyfikowanych o redukcji tiolu do jednoczesnego wykrywania w IMC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykorzystuje tkanki z parafiną utrwaloną formaliną (FFPE) pobrane od wcześniej nieleczonych pacjentów poddawanych pierwotnej operacji cytoredukcyjnej w leczeniu wysokostopieńowego surowiczego raka jajnika. Wszystkie dane kliniczne zostały pozyskane z repozytorium Katedry Onkologii Ginekologicznej i Medycyny Rozrodu zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Instytucjonalną Uniwersytetu Teksańskiego MD Anderson. Uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentów, a badania przeprowadzono zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi.

1. Środki ostrożności i przygotowania

  1. Zawsze używaj wody wolnej od nukleazy (NFW) do przygotowania wszystkich potrzebnych odczynników.
  2. Wszystkie kroki wykonuj przy użyciu plastikowych pojemników i bez użycia szkła, aby zmniejszyć wiązanie metalu ze szkłem i zanieczyszczenie metalami.
  3. Utrzymuj miejsce pracy w czystości i spryskuj powierzchnie oraz pipety roztworem dekontaminacyjnym RNazy, a następnie 70% etanolem przygotowanym w NFW.
  4. Skonżone tiolowane sondy wykrywające mRNA (T1-T12) do właściwych metali za pomocą linkera malemidowego, opisanego przez Schulza i in.7, szczegółowo opisanego w protocol.io roku w Tabeli Materiałów.
    UWAGA: Należy wybierać cele białkowe, aby wskazać lokalizację komórki w tkance (markery strukturalne), identyfikować, które komórki są obecne (markery fenotypowe) oraz co komórki robią (markery funkcjonalne). Ponieważ niektóre markery funkcjonalne są ekspresyjne przejściowo, włączenie celów mRNA umożliwia identyfikację komórek generujących te cele.

2. Przygotowanie próbki i wstępne przetwarzanie

  1. Upiecz kawałki chusteczki na noc w suchym piecu w temperaturze 60 °C.
  2. Wykonaj deparafinizację: trzy rundy ksylenu po 5 minut w każdej rundzie oraz 10 rund nawodniania (100% etanolu (EtOH) raz2, 95% EtOH 2, 70% EtOH 2, 50% EtOH 2, 30% EtOH 2), przez 3 minuty na każdą rundę. Raz umyj sólą tris-buffered (TBS) przez 2 minuty. W zależności od liczby próbek przetwarzanych jednocześnie, należy używać stożkowych lamp o pojemności 50 mL (maksymalnie 2 szkiełka) lub kaset barwiących IHC o pojemności 350 mL (maksymalnie 24 szkiełki).
    UWAGA: Ten etap odwoszczenia, choć zalecany, jest opcjonalny i zależy od typu tkanki.
  3. Należy nałożyć roztwór 3,7% paradehydu (PFA) przez 10 minut, inkubując szkiełka tkankowe w probówce 50 mL z wystarczającą ilością roztworu PFA, aby pokryć przekrój tkanki.
  4. Pobieranie antygenów indukowanych cieplem (HEIR) za pomocą mikrofali: Używając mikrofalówki monitorowanej temperaturą, napełnij jedną tackę buforem pobierającym antygen HEIR o pH 6 (350 mL), a pozostałe tacki NFW. Umieść fragmenty tkanek w stojaku do barwienia do szkiełek mikroskopowych i dodaj je do tacy z buforem antygenowym.
    UWAGA: Podczas pobierania antygenów upewnij się, że bufor antygenowy znajduje się w temperaturze pokojowej (RT) przed użyciem.
  5. Wykonaj pobieranie antygenów w temperaturze 107 °C przez 15 minut, a następnie pozwól tkanki schłodzić się w RT przez 20 minut w okapu chemicznym.
  6. Podczas pobierania antygenów opłucz papier nawilżający wodą, umieść go w tacce do plamowania z kontrolą wilgotności i umieść tackę w piekarniku hybrydyzacyjnym w temperaturze 60 °C.
  7. Płukam w TBS bez RNazy przez 3 minuty, potem suszę przez 3 minuty.

3. Leczenie proteazą

  1. Narysuj barierę hydrofobową wokół każdego fragmentu tkanki za pomocą długopisu bariery hydrofobowej. Pozwól barierze całkowicie wyschnąć przez około 2 minuty.
  2. Załaduj suche zamki do uchwytu na suwak wilgoci, otwierając zacisk obrotowy.
  3. Dodaj wystarczająco dużo proteazy, aby całkowicie pokryć tkankę. Wyjmij wcześniej podgrzaną tacę kontrolną wilgotności (60 °C, krok 2,6) z piekarnika hybrydyzacyjnego i włóż uchwyt do tacy kontroli wilgotności. Ponownie uszczelnij tacę do kontroli wilgotności i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego. Inkubuj w 40 °C przez 30 minut.
  4. Podczas tej inkubacji przygotuj materiały do testu RNA-ISH.
    1. Przygotuj 500 mL bufora prania 1x RNA-ISH przez rozcieńczenie 50x buforu NFW. Przechowywać w RT do miesiąca.
      UWAGA: Jeśli w buforze płukania 50x występuje opadanie, należy ponownie zawiesić przez podgrzewanie bufora do 40 °C przez 10-20 minut przed przygotowaniem buforu 1x płukania.
  5. Przygotuj 1 litr DTBS-T (0,5% Tween) w NFW, dodając 5 ml Tween do 1 L DPBS-T.
  6. Przygotuj sondy docelowe w parze RNA-podobnej do ZZ:
    1. Ogrzej sonda mRNA i rozcieńczalnik RNA-ISH w temperaturze 40 °C w suchym piekarniku przez 10 minut. Zwij sondy i obróć je w mini wirówce stołowej.
    2. Przygotuj 1x mieszankę (do 12 sond, Tabela 1) rozcieńczając oryginalne sondy 50x w rozcieńczalniku RNA-ISH, upewniając się, że jest wystarczająco dużo końcowej objętości, by pokryć cały fragment tkanki.
    3. Dobrze zawortkuj i zostawij mieszane sondy oraz rozcieńczalnik RNA-podobny do RT aż do użycia.
  7. Wyjmij tackę do kontroli wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i zdejmij uchwyt na suwak. Wróć blachę do piekarnika.
  8. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Myj slajdy w NFW z lekkim poruszeniem przez 5 minut.
  9. Powtórz krok mycia z świeżym NFW przez 5 minut.

4. Hybrydyzacja sond docelowych

  1. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy.
  2. Dodaj wystarczająco dużo odpowiedniej mieszanki sondy, aby całkowicie pokryć każdą część tkanki. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika na 2 godziny w 40 °C.
  3. Umieść odczynnik RNA-ISH Amplifier 1 (drzewa ogonowe ZZ dla ogonów T1 do T4) tak, aby wyrównał się w RT 30 minut przed końcem inkubacji, aby użyć go w kroku 5.2.
  4. Po zakończeniu inkubacji wyjmij tacę kontrolną wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i wyjmij uchwyt na zsuwanie. Wróć blachę do piekarnika.
  5. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.
  6. Powtarzam proces mycia z świeżym 1x Wash Buffer przez 2 minuty w RT.

5. Hybrydyzuj wzmacniacz RNA-ISH 1

  1. Usuń nadmiar płynu z preparatów i umieść je w uchwytie na podnoszenie wilgoci. Włóż uchwyt na suwak do tacy do kontroli wilgotności.
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 i dodaj go, aby całkowicie objąć każdą sekcję. Zamknij tackę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w temperaturze 40 °C. Umieść RNA-ISH Amplifier 2 (ZZ tail trees dla ogonów T5 do T8) odczynnik w RT, aby użyć go w kroku 6.2.
  3. Wyjmij tackę do kontroli wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i zdejmij uchwyt na suwak. Wróć blachę do piekarnika.
  4. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.
  5. Powtórz proces mycia z nowym 1x buforem przez 2 minuty w RT.

6. Hybrydyzuj wzmacniacz RNA-ISH 2

  1. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 i dodaj go, aby pokryć każdą sekcję. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w 40 °C.
  3. Umieść reagent RNA-ISH Amplifier 3 (drzewa ogonowe ZZ dla ogonów T9 do T 12) na RT, aby użyć go w kroku 7.2. Wyjmij uchwyt na suwak z tacy. Włóż blachę z powrotem do piekarnika.
  4. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.
  5. Powtórz proces mycia z nowym 1x buforem przez 2 minuty w RT.

7. Hybrydyzuj wzmacniacz RNA-ISH 3

  1. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 i dodaj go, aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w 40 °C.
  3. Podczas inkubacji przygotuj mieszankę metalu oligosystemyczną do kroku 8. Każdy oligo stosuje się w stężeniu 1:15 (z zapasu 10uM, dbając o wystarczającą objętość na cały fragment tkanki). Dobrze zacznij wirować i zostawić oligometryki z mieszanką metali w stanie RT do użycia. Wyjmij blachę do kontroli wilgotności z piekarnika, a następnie zdejmij uchwyt na suwak z blachy. Następnie odłóż blachę do piekarnika
  4. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.
  5. Powtarzam proces mycia z świeżym 1x Wash Buffer przez 2 minuty w RT.

8. Hybrydyzacja oligomorfoidów metali

  1. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy. Dodaj oligometryki z mieszanką metali przygotowane w kroku 7.3 (wir przed użyciem).
  2. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 45 minut w temperaturze 40 °C.
  3. Wyjmij tackę do kontroli wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i zdejmij uchwyt na suwak. Wróć blachę do piekarnika.
  4. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.
  5. Powtarzam proces mycia z świeżym 1x Wash Buffer przez 2 minuty w RT.

9. Przeciwciała sprzężone z metalami

  1. Aby zablokować miejsca niespecyficzne, nałóż wystarczającą objętość buforu blokującego, aby pokryć cały przekrój tkanki i inkubuj przez 30 minut w RT.
  2. Podczas inkubacji przygotuj mieszankę przeciwciał do użycia w kroku 10.1, rozcieńczając je (Tabela 1) w buforze rozcieńczającym przeciwciała.

10. Inkubacja z przeciwciałami sprzężonymi z metali

  1. Po zablokowaniu inkubacji buforowej usuń bufor blokujący z tkanek i wydaj wystarczającą objętość mieszanki Ab (od kroku 9.2), aby pokryć cały przekrój tkanki.
  2. Umieść preparat w komorze wilgotności i inkubuj przez noc (~16 h) w temperaturze 4 °C.

11. Barwienie DNA

  1. Przygotuj świeży roztwór Ir-Intercalatora.
    1. Z roztworu zapasowego 500 μM przygotuj roztwór roboczy w skali 1:2000 w TBS wolnym od RNazy. Roztwór roboczy można alicytować i przechowywać w temperaturze -20 °C (nie zamarzać i rozmrażać).
  2. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Płucz szkiełka w buforze TBS-T z lekkim pomieszaniem przez 5 minut.
  3. Powtarzaj pranie w TBS-T.
  4. Bejcuj roztworem roboczym IR (od kroku 11.1.1) przez 5 minut w RT.
  5. Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Płucz szkiełka w buforze TBS-T z lekkim pomieszaniem przez 5 minut.
  6. Powtarzaj pranie w TBS-T.
  7. Pierz dwa razy w TBS, 5 minut (mieszaj powoli).
  8. Szybko zanurz szkiełko w ddH2O, aby uniknąć krystalizacji soli obecnych w TBS na tkance.
  9. Susz preparat pod chemiczną okrycią (10 min) i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania zdjęcia.

12. Akwizycja obrazu

  1. Załaduj szkiełko do komory ablacyjnej IMC.
  2. Wykonaj zdjęcie panoramy, aby zidentyfikować obszar zainteresowania (ROI).
  3. Zmapuj zwroty z inwestycji w oprogramowaniu do akwizycji obrazów.
  4. Zastosuj szablon akwizycji.
  5. Dostosuj moc lasera (energię ablacji) w zależności od typu próbki. Domyślne ustawienie jest na 0 dB.
    UWAGA: Zaleca się badanie energii ablacji na wielu małych obszarach tkanek (30 μm x 30 μm), zwiększając moc o 1 dB za każdym razem. Wybierz najniższą energię ablacji, która oczyszcza próbkę bez wypalania preparatu. Zazwyczaj daje to moc lasera na poziomie 3-4 dB. Czasami, jeśli tkanka jest grubsza niż zalecano, moc lasera wzrasta do 5 dB.
  6. Rozpocznij ablację laserową. System kieruje laser na ROI i abluje białka oznaczone metalem, generując strumienie aerozoli przenoszone do indukcyjnie sprzężonego palnika plazmy (ICP), gdzie te strumy są odparowywane, atomizowane i jonizowane w plazmie.
  7. Zmierz ilość każdego izotopu mierzonego przez detektor i przekształcanego w dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość wykrywania białka i mRNA w tym samym badaniu pomaga nam zrozumieć, jak komórka przygotowuje się na przybycie, ale także jakie kolejki otrzymuje podczas podróży i interakcji ze środowiskiem. Jak widać w reprezentatywnych danych, wykrywanie mRNA i białek jest kluczowym elementem badań biologii przestrzennej, ponieważ dolne granice wykrywania mogą być dość trudne w zależności od postępów znakowania, wykrywania i/lub obrazowania. Samo włączenie proteaz może komplikować krytyczne markery w protokołach połączonych, d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-omika multipleksów to kluczowa ewolucja w zbieranych danych, ukierunkowana na interakcje komórka do komórki oraz komórka z sąsiedztwem, które wpływają na postęp choroby i leczenie. Analiza tych danych w tej samej próbce, a więc w tej samej komórce, jest kluczowa, ponieważ wiele celów białkowych jest ekspresowanych przejściowo lub różni się w poziomie mRNA i ekspresji białek, co pozwala na akomodację trudnych do wykrycia lub różnicowych celów21. Najnowsze osiągnięcia w integracji technologii ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jared K. Burks jest konsultantem w Standard BioTools.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały przeprowadzone we współpracy z Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, które jest częściowo wspierane przez National Institutes of Health poprzez grant M. D. Andersona na wsparcie ośrodków onkologicznych P30 CA016672. Badania te były również częściowo wspierane przez grant rozwojowy MD Anderson's Cancer Center, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. Wysiłki JKB były częściowo wspierane przez CA016672 P30 oraz NCI Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1. Działania SFB były częściowo wspierane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Fundację Honorable Tina Brozman na rzecz badań nad rakiem jajnika, MDACC Ovarian Cancer SPORE Developmental Research Program, NIH 1R01CA261952-01A1. Wysiłki SFB, JKB i BG były częściowo wspierane przez grant 1U01CA294459-01. Autorzy pragną podziękować Samuelowi Mokowi, który podzielił i udostępnił użyte próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Konjugacja oligonukleotyd-polimer do obrazowania cytometrii masowej V.2 
10x TBS RNAse wolnych odThermo Fisher Scientific  J62780. K7Do przerywanych płukań między krokami
System hybrydyzacji ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Piekarnik do preparatów do pieczenia
Rozcieńczalnik przeciwciałDakoS0809 Bufor rozcieńczający przeciwciała
Przeciwciało: B7-H3BethylA700-025CF, A700-026CFKlon: BLR025F, BLR026F
Przeciwciało: B7-H4Thermo Fisher Scientific  14-5949-82Klon: H74
Przeciwciała: BRD4(6F11)BethylA700-005CFKlon: BL-151-6F11
Przeciwciało: CCR6R& DMAB195-100Klon: 53103
Przeciwciało: CD11bAbcam ab209970Klon: EPR1344
Przeciwciało: CD25Abcam ab215378Klon: EPR6452
Przeciwciała: CD278/ICOSCST 89601BFKlon: D1K2T
Przeciwciało: CD31Abcam ab207090Klon: EPR3094
Przeciwciało: CD33Abcam ab238784Klon: SP266
Przeciwciało: CD3e CST85061BFKlon: D7A6E
Przeciwciało: CD4Abcamab181724Klon: EPR6855
Przeciwciało: CD44Thermo Fisher Scientific  MA1-10225Klon: IM7
Przeciwciało: CD45Thermo Fisher Scientific  14-9457-82Klon: CD45-2B11
Przeciwciało: CD8aCST 85336BFKlon: D8A8Y
Przeciwciało: CXCL13R& DAF801Klon: Poliklonalny
Przeciwciało: CXCR5R& DMAB190-100Klon: CXCR5
Przeciwciało: gamma-H2AXBethylA700-053CFKlon: BLR053F
Przeciwciało: Granzym BSanta CruzSC-8022 XKlon: 2C5
Przeciwciało: KAP1BethylA700-014CFKlon: BL-248-2G6
Przeciwciało: Ki67BethylA700-021CFKlon: BLR021E
Przeciwciało: LCK CST2984BFKlon: D88
Przeciwciała: MFAP5Nie maNie maPMID: 31332047 / Klon: 130A  (Uwaga: zaprojektowane na zamówienie)  
Przeciwciało: SMACST56856BFKlon: 1A4
Przeciwciała: VEGFSTB-Fluidigm3163028DKlon: G153-494
Przeciwciało: VISTACST64953BFKlon: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKBufor odzyskiwania antygenów
Alkohol etylowy 100% (200 proof)Pharmco111000200Dla deparafinizacji
EZ – Retriever IRBioGeneXMW016-IRSystem pobierania antygenów dla przekrojów tkanek FFPE
System hybrydyzacji HybEZ IIACD Biotechne321710System składa się z: piekarnika HybEZ (PN 321710/321720), tacy do kontroli wilgotności (PN 310012) oraz papieru nawilżającego HybEZ (2 arkusze PN 310025), tacy do prania EZ-Batch (PN 321717), uchwytu na ślizgi EZ-Batch (PN 321716)
ImmEdge Hydrofobowa Bariera PAP Pen VectorLabsH-4000Hydrofobowe zagroda barierowe
Rozwiązanie Interkalatora IRThermo Fisher Scientific  NC1038184Wykorzystywane do identyfikacji komórek jądrowych
KERATYNA 8/18CST 4546BFKlon: C51
Metalowe OligosRóżneRóżneMetalowy tag w zakresie od T1 do T12, w zależności od potrzebnego
Woda wolna od nukleazy (NFW)Corning  46-000-CM Do czyszczenia i przygotowania całego sprzętu oraz do używania go jako rozcieńczacza, gdy jest to konieczne
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 Wykorzystywane do przepuszczania błon komórkowych próbek
Uchwyt szkiełka RNAscope EZ-BatchACD Biotechne310017Zaprojektowany do ręcznego przetwarzania wsadowego do 20 slajdów efektywnie
RNAscope HiPlex12 Reagent Kit v2 ACD Biotechne324409Reagenty do RNASkopy
RNAscope HiPlex sonda - sondy doceloweACD BiotechneRóżneZakres od T1 do T12, w zależności od tego, który jest potrzebny
Roztwór RNazy RNaze RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9782Roztwór dekontaminacji powierzchni, który niszczy RNazy
Uchwyt na uchwyt na uchwyt na szkiełko mikroskopu do barwienia 24 miejsca, plastik odporny na chemikaliaOptymalna nauka3028Do barwienia wielu szkiełów
Tween 20Thermo Fisher Scientific  AAJ20605APDo przerywanych płukań między krokami
Blok białkowy ultrawizjiThermo Fisher Scientific  TA125PBQBufor blokujący

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transkryptomika przestrzennahybrydyzacja in situdetekcja sond metalicznychbiomarkery raka jajnikalimfocyty T CD8fibroblasty zwi zane z rakiemproteomika przestrzenna

Powiązane artykuły