Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przy użyciu tradycyjnych metod wykrywania in situ hybrydyzacji (ISH) opartych na sondach mikroRNA (miRNA) jest trudne do wychwycenia ze względu na ich rozmiar, który wynosi od 19 do 25 nukleotydów. Jednakże, ponieważ miRNA są kluczowymi regulatorami epigenetycznymi, które przyczyniają się do normalnej fizjologii i licznych schorzeń patologicznych, zrozumienie zachowania przestrzenno-czasowego miRNA jest istotne, aby rozwikłać ich funkcję na poziomie komórkowym i podkomórkowym. To wyraźnie wskazuje na zastosowanie odpowiednich technik wykrywania i wizualizacji. Dlatego stworzyliśmy Amplifikację i Rozpoznawanie MicroRNA poprzez hybrydyzację in situ z zamkniętym kwasem nukleinowym (MARLIN), które zostało opracowane i zoptymalizowane z wykorzystaniem multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego oraz sond z zamkniętymi kwasami nukleinowymi (LNA) skierowanymi do miRNA. Ta metoda pozwala ilościowo określić miRNA z multipleksowaną ekspresją białek, co pozwala na ilościowe określenie miRNA wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego w mikrośrodowisku nowotworowym (TME) z wysoką czułością i powtarzalnością. Połączone wykorzystanie testów wykrywania miRNA i wychwytywania białek może również dostarczyć kompleksowego zrozumienia funkcji komórkowych i mechanizmów regulacyjnych w ramach tego TME.
Wprowadzenie
mikroRNA
Chociaż mikroRNA (miRNA) są niezwykle małe, mają długość od 19 do 25 nukleotydów, te jednoniciowe cząsteczki RNA są silnymi regulatorami ekspresji genów, modulując RNA posłańcze (mRNA) po transkrypcji poprzez interakcje specyficzne dla sekwencji1. W istocie miRNA działają jako negatywne regulatory, wiążąc się z docelowymi mRNA, co albo zapobiega ich translacji, albo wspiera degradację poprzez rozszczepienie mRNA, w zależności od stopnia komplementarności, co ostatecznie prowadzi do zmniejszenia produkcji białek z docelowego genu. Chociaż miRNA to zasadniczo niekodujące RNA, około 40% wszystkich miRNA znajduje się w intronach lub egzonach genów kodujących białka2. Funkcjonalny cel miRNA obejmuje kilka kluczowych procesów biologicznych, takich jak proliferacja komórek, angiogeneza, apoptoza itp. Warto zauważyć, że dysregulacja miRNA została powiązana z nowotworem, ponieważ nieprawidłowa ekspresja specyficznych miRNA oraz regulacja genów pośredniczona przez miRNA były powiązane z transformacją onkogenną w wielu typach nowotworów3.
Od czasu odkrycia miRNA były szeroko badane w różnych chorobach ze względu na specyficzną ekspresję tkankową i funkcje regulacyjne, a ich dysregulacja wiąże się z wieloma chorobami, w tym chorobami neurodegeneracyjnymi, autoimmunologicznymi oraz różnymi nowotworami 4,5,6. Wzorce ekspresji miRNA mogą być korelowane z typem, stadium i zmiennymi klinicznymi nowotworu, co czyni profilowanie miRNA cennym narzędziem do diagnozowania i prognozowania nowotworów 4,5,6,7. Odkrycie nowych miRNA zostało również przyspieszone dzięki postępom w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, co pogłębia zrozumienie udziału miRNA w różnorodnych procesach biologicznych8. Znaczenie miRNA podkreśliła Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny przyznana w 2024 roku Victorowi Ambrosowi i Gary'emu Ruvkunowi za odkrycie funkcji miRNA w regulacji posttranskrypcyjnej9.
Jako cenne biomarkery do diagnozy i prognozowania chorób, miRNA były badane terapeutyczne możliwości, co doprowadziło do opracowania leków celujących w miRNA. Terapeutyczny potencjał miRNA w leczeniu nowotworów polega na ich zdolności do koordynacji modułów genów, potencjalnie przywracając prawidłowe funkcje komórkowe10. Wcześniej terapie przeciwnowotworowe oparte na miRNA były opracowywane jako monoterapia lub w połączeniu z istniejącymi terapiami celowanymi, aby poprawić odpowiedzi na leczenie i zwiększyć wskaźniki wyleczenia11. Dynamiczne spektrum miRNA uczyniło je kluczowymi zasobami dla innowacyjnych strategii leczenia raka. W kontekście oporności terapeutycznej, celowanie w miRNA wykazuje obiecujące efekty w zmniejszaniu nawrotów i oporności na tradycyjne metody leczenia nowotworów, potencjalnie poprawiając przeżywalność pacjentów poprzez celowanie w komórki nowotworowe12. Poprzez badanie roli miRNA w modulowaniu aktywności różnych typów komórek w mikrośrodowisku nowotworowym (TME), można potencjalnie odkryć unikalne i klinicznie istotne metody leczenia nowotworów.
Dostępne testy wykrywające miRNA
Obecnie najpowszechniej stosowana metoda pomiaru miRNA opiera się na ekstrakcyjnym RNA do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (q-RT-PCR) lub sekwencjonowania następnej generacji (NGS), tracąc kontekst przestrzenny. Istnieją firmy oferujące testy mikroRNA TaqMan, które wykorzystują primery pętli pętli docelowej do syntezy cDNA oraz chemie barwników SYBR Green z uniwersalną syntezą cDNA. Testy te mogą oferować wysoką czułość i specyficzność oraz mogą być wykonywane na różnych instrumentach q-RT-PCR. Niestety, testy TaqMan nie są w stanie zapewnić bezwzględnej ilościości, co może prowadzić do problemów takich jak fałszywe pozytywy i zmienność wyników13. Ponadto, pomimo wysokiej czułości, stosowanie tych testów w różnych typach próbek może być ograniczone przez konieczność intensywnego przygotowania próbki oraz potencjalne zakłócenia ze strony innych składników próbki.
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS): miRNA-seq staje się coraz popularniejsze do analizy różnicowej ekspresji w całym miRNomie biopłynów. Zaletą technologii NGS, takich jak miRNA-seq, jest umożliwienie masowych analiz równoległych analiz genomowej ekspresji miRNA, co umożliwia ilościowe określenie poszczególnych miRNA, identyfikację zmienności sekwencji oraz odkrywanie nowych miRNA. Istotną wadą metod opartych na sekwencjonowaniach, takich jak IlluminaTruSeq Small RNA Sample Preparation Kit, jest indukcja ilościowych uprzedzeń, wpływająca na dokładność analiz różnicowych ekspresji, w dużej mierze ze względu na homologię i krótsze długości odczytu miRNA14. Co więcej, obecność izomiR (wariantów różniących się sekwencją lub długością od kanonicznej sekwencji miRNA) oraz artefaktów technicznych może utrudniać interpretację danych, potencjalnie prowadząc do błędnych wykryć i czynników zakłócających w testach biomarkerów14. Ponadto różne narzędzia do analizy danych miRNA-seq, takie jak sRNAbench i miRDeep2, mogą dawać różne wyniki, wpływając na spójność i wiarygodność odkrywania nowych miRNA15,16. Nawet technologia mikromacierzy może być w większości przypadków niewystarczająca. Chociaż może stanowić potężną, wysokoprzepustową platformę do wykrywania poziomów miRNA lub ekspresji genów, co czyni ją odpowiednią do badań całego genomu, technologia jest nadal ograniczona liczbą wcześniej zidentyfikowanych miRNA i nie może bezpośrednio zweryfikować interakcji miRNA-cel, co ogranicza ich użyteczność w badaniach funkcjonalnych17.
Najważniejszym czynnikiem, który można tu podkreślić, porównując wszystkie dostępne opcje, jest brak kontekstu przestrzennego. Nie dostarczają żadnego kontekstu dotyczącego morfologii tkanek ani rozkładu przestrzenno-czasowego w komórkach. Wizualizacja zachowania przestrzenno-czasowego miRNA jest konieczna, aby rozwikłać ich funkcję na poziomie komórkowym i podkomórkowym. Obecnie dostępne są testy in situ hybrydyzacji ( ISH) z użyciem miRNAscope, zwykle wykorzystujące metody detekcji chromogenicznej. Chociaż te testy pozwalają na wizualizację miRNA z rozdzielczością pojedynczej komórki, wyniki są słabej jakości, co utrudnia rozróżnienie ekspresji miRNA od tła próbki. Zazwyczaj wiele z nich generuje testy niskiej jakości, które są niewiarygodne i zazwyczaj wymagają ręcznej ilości.
Dlatego opracowaliśmy amplifikację i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z zablokowanym kwasem nukleinowym (MARLIN) z wykorzystaniem multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego (przez barwienie białek opalowych) oraz sond z zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA) ukierunkowanych na miRNA, w tkankach osadzonych w parafinie (FFPE) w formacji formaliny. Osiągnęliśmy to, wdrażając system wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA), który jest aktywowany przez przeciwciało sprzężone przeciwko Digoksygeninie (DIG) i nadoksydazie chrzanowej (HRP). HRP działa jako katalizator dla TSA, podczas gdy Anti-DIG jest powiązany z sondą LNA. Ten test jest szczególnie przydatny do zrozumienia istotnej natury miR w modyfikacji posttranskryptomicznej z białkami, a potencjalnie także z innymi RNA jednocześnie. Ponadto, ze względu na brak komercyjnie dostępnego testu zdolnego do ilościowego określenia zarówno miRNA, jak i ekspresji białek, MARLIN zapewnia skuteczny sposób zrozumienia relacji in situ między miR-ami a białkami w próbkach FFPE.
Początkowe wyniki ilościowego określenia miR-181c-3p za pomocą MARLIN wykazały wykonalność analizy równoległej miRNA i białek w naturalnym kontekście przestrzennym tkanki FFPE na jajnikach u człowieka. Poza tym przykładem, na podstawie składników MARLIN, teoretycznie możliwe jest rozszerzenie do czterech białek przy użyciu komercyjnych fluorescencyjnych multipleksujących fluoroforów, takich jak Alexa Fluor, lub innych barwników o małych cząsteczkach18.
Ponadto, ponieważ ta metoda wykorzystuje wariacje standardowych metod histologicznych, powinna być kompatybilna z innymi tkankami FFPE u ssaków, przy odpowiednim doborze sondy i przeciwciał. Ta metodologia zachowuje architekturę przestrzenną i pozwala na ilościową kolokalizację komórkowego i subkomórkowego miRNA oraz białek. To podejście rozwiązuje kluczową lukę w biologii przestrzennej, mapując wzorce współekspresji miRNA z białkami oraz rozkład przestrzenny, które można bezpośrednio kontekstualizować w ramach natywnych architektur tkanek. Tutaj przedstawiamy MARLIN szczegółowy graficzny przegląd na Rysunku 1. Chociaż prezentowany protokół jest zoptymalizowany pod kątem miR-181c-3p, możliwe są badania innych miR, jeśli zastosowano odpowiedni projekt sondy. Kluczowe parametry tej metody obejmują: ocenę jakości tkanek oraz optymalizację koncentracji sond. Zaleca się ocenę integralności RNA bloku tkankowego za pomocą metryki DV200 poprzez wykorzystanie dwóch sekcji 10 μm i ekstrakcję RNA za pomocą protokołu zachowującego wszystkie rozmiary fragmentów RNA. Próbki z wynikiem DV200 powyżej 50 lub wyższym oraz stężeniami protokołu muszą być systematycznie testowane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół ten wykorzystuje tkanki z parafiną utrwaloną formaliną (FFPE) z przekrojów ludzkiego guza jajnika od pacjentów z HGSC. Próbki te zostały pobrane od wcześniej nieleczonych pacjentek poddawanych pierwotnej operacji cytoredukcyjnej raka jajnika. Wszystkie próbki i dane kliniczne zostały pobrane z repozytorium raka jajnika w Katedrze Onkologii Ginekologicznej i Medycyny Rozrodu zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Przeglądową Instytucji Uniwersytetu Teksaskiego MD Anderson. Pisemna świadoma zgoda pacjentów została uzyskana przez pracowników recepcji, a badania przeprowadzono zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi.
1. Przygotowanie tkanek
- Wszystkie próbki FFPE piecz przez noc w temperaturze 60 °C i czyść każdy sprzęt oraz narzędzia wodą wolną od RNAs. Upewnij się, że przekroje mają grubość około 5 μm.
UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem guzów jajnika, ale po dalszych badaniach może być potencjalnie stosowany z innymi typami tkanek. - Wykonaj deparafinizację trzema rundami ksylenu po 5 minut w każdej rundzie oraz 10 rund nawodniania po 3 minuty (100% etanol (EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x). Raz umyj sólą tris-buffered (TBS) przez 2 minuty.
UWAGA: Ten etap odwoszczenia, choć zalecany, jest opcjonalny i zależy od typu tkanki. - Po deparafinizacji i nawodnieniu należy nałożyć roztwór nadtlenku wodoru 3% (H2O2) przez 10 minut. Prać przez 2 minuty z 1 łyżeczką i 2 razy. Następnie nałóż roztwór 3,7% paradehydu (PFA) przez 10 minut. Prać przez 2 minuty z 1 łyżeczką i 2 razy.
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i powinien być rozważany tylko w przypadku tkanek tłuszczowych lub próbek podatnych na odwarstwienie. - Przejdź do pierwszej rundy pobierania antygenów. Protokół ten wykorzystuje system EZ-Retriever IR. Zgodnie z instrukcjami systemu, podgrzej próbki w mikrofalówce zanurzonych w świeżym buforze EZ-AR1 w temperaturze 95 °C przez 15 minut. Zostaw do ostygnięcia na 20 minut.
- Prać przez 2 minuty z 1 łyżką do przelewki. Potem przez 2 minuty z 1 TBS-T (1 TBS z 0,1% Tween), 2 razy.
2. Zastosowanie białka
- Narysuj barierę wokół każdego fragmentu tkanki za pomocą hydrofobowego długopisu.
- Dodaj 1x roztwór blokujący przeciwciała (wystarczający, by pokryć całą powierzchnię tkanek) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności (wilgotność otoczenia i niekontrolowana).
- Następnie rozcieńcz pierwsze pierwotne przeciwciało tym samym roztworem blokującym, nałóż na tyle, by pokryło całą powierzchnię tkanki, i pozostawij do inkubacji przez godzinę w komorze wilgotności w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Podczas opracowywania tego protokołu używano Anti-CD8 w rozcieńczeniu 1:75. - Prać przez 2 minuty w 1 TBS-T, 3 razy. Następnie dodaj Anti-Ms + Rb HRP i pozostawij próbki do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności (wilgotność otoczenia i niekontrolowana).
- Prać przez 2 minuty w 1 TBS-T, 3 razy. Pierwszy fluorofor rozcieńczaj wzmacniaczem w 1:100 i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności.
UWAGA: Podczas opracowywania tego protokołu użyto fluoroforu o emisji 690 nm. Od tego momentu zaleca się stosowanie minimalnego oświetlenia przez resztę zabiegu po nałożeniu pierwszej dawki fluoroforu. - Prać przez 2 minuty w 1 TBS-T, 3 razy. Rozpocznij drugą rundę barwienia przeciwciał od drugiej rundy pobierania antygenów w mikrofalówce, ponownie zanurzając próbki w świeżym buforze EZ-AR1 w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie chłodząc przez 20 minut.
- Prać przez 2 minuty z 1 łyżką do przelewki. Następnie myj przez 2 minuty z 1 łyżką T, 2 razy.
- Ponownie nałóż 1x roztwór blokujący przeciwciała przez 30 minut w komorze wilgotności w temperaturze pokojowej (wilgotność otoczenia i niekontrolowana).
- Rozcieńcz drugie przeciwciało pierwotne tym samym roztworem blokującym, nałóż tyle, by pokryło całą powierzchnię tkanek, i pozostawij do inkubacji przez noc w komorze wilgotności w temperaturze 4 °C przez co najmniej 16 godzin.
UWAGA: Podczas opracowywania tego protokołu Anti-EpCAM stosowano w rozcieńczeniu 1:200. - Następnego dnia zacznij od mycia przez 2 minuty w 1 TBS-T, 3 razy. Następnie dodaj Anti-Ms + Rb HRP i pozostawij próbki do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności (wilgotność otoczenia i niekontrolowanej).
- Prać przez 2 minuty w 1 TBS-T, 3 razy. Drugi fluorofor rozcieńcz rozcieńczającym wzmacniaczem w 1:100 i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności.
UWAGA: Podczas opracowywania tego protokołu użyto fluoroforu o emisji 620 nm.
3. Zastosowanie sondy
- Prać przez 2 minuty w 1 TBS-T, 3 razy.
- Rozpocznij trzecie i ostatnie pobranie antygenu z EZ-AR1 Elegance w mikrofalówce w temperaturze 107 °C przez 15 minut. Zostaw do ostygnięcia na 20 minut. Pierz przez 3 minuty w 1 łyżce.
- Stosuj RNAscope Protease Plus (wystarczająco, by pokryć całą powierzchnię tkanki) i utrzymuj temperaturę 40 °C przez 30 minut. Użyj piekarnika. Prać przez 5 minut w 1 łyżce, 2 razy.
- Przygotowanie sondy przez denaturację w temperaturze 90 °C przez 4 minuty pracy sondy LNA z miRNA. Następnie natychmiast rozcieńcz sondę za pomocą bufora miRNA-ISH. Wiruj i obróć roztwór sondy.
UWAGA: Podczas opracowywania tego protokołu używano sondy celu miR-181c-3p w rozcieńczeniu 1:250. - Aplikuj sondę (wystarczającą, by pokryć cały obszar tkanki) i włóż z powrotem do piekarnika na 1 godzinę w temperaturze 60 °C. Myj przez 5 minut w buforze 5x solankowym cytrynianem sodu (SSC).
- Wykonaj pięć rygorystycznych płukań w SSC podgrzewanych wstępnie w 60 °C w następującej kolejności oraz rozcieńczenia przez 5 minut w każdej rundzie: jedna runda 5x SSC, dwie rundy 1x SSC i dwie rundy 0,2x SSC.
- Praj przez 5 minut w 0,2x SSC w temperaturze pokojowej. Inkubuj z buforem blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze. Użyj kombinacji 1x łyżeczki i 0,5% proszku blokującego odczynników, pamiętaj, aby przed aplikacją wirować i obrócić roztwór blokujący.
- Zastosowano antydigoksygeninę (mysz) HRP koniugat (do tych próbek zastosowano rozcieńczenie 1:500) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze.
- Myj przez 5 minut w 1x TBS-T, 3x Stosuj zalecane rozcieńczenie 1:50 fluoroforu Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) przez 10 minut w komorze wilgotności w temperaturze pokojowej (wilgotności otoczenia i niekontrolowanej). Upewnij się, że przed aplikacją wykonałeś wir i obróć rozwiązanie TSA+Cy3.
- Prać przez 5 minut w 1x TBS-T, 3x.
4. Barwienie i montaż jądrowy
- Stosuj roztwór roboczy 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) (wystarczający, by pokryć całą powierzchnię tkanki) przez 5 minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze (wilgotność otoczenia i niekontrolowana).
UWAGA: Dla tego protokołu zastosowano rozcieńczenie 1:1000, przy czym roboczy materiał DAPI był rozcieńczony w TBS.) - Prać przez 5 minut w 1x TBS-T, 3x. Po zakończeniu nałóż pokrywki za pomocą materiału montażowego i pozostawij szkiełki do wyschnięcia przez 10 minut. Preparaty przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności między 24 a 72 godzinami przed obrazowaniem oraz do trzech miesięcy po nim.
5. Obrazowanie i analiza
- Do obrazowania używaj mikroskopu szkiełkowego skanującego (preferowany) z powiększeniem 40x.
- Przeprowadz kolejną analizę ilościową w celu wyliczenia punktów, wykorzystując DAPI i barwienie przeciwbarwne białek do segmentacji i fenotypowania komórek.
UWAGA: W trakcie tego protokołu korzystaliśmy z obrazowania za pomocą HT Phenoimager. Pełne szkielety wykonano z powiększeniem 40x, wykorzystując odpowiednie filtry dla obecnych fluoroforów, a następnie wyeksportowano multipleksowane obrazy jako pliki OME-TIFF. Zeskanowane obrazy były następnie przesyłane do oprogramowania Visiopharm Image Analysis Software do analizy ilościowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podczas testowania tego protokołu ważne jest posiadanie dwóch sekcji seryjnej tej samej reprezentatywnej próbki dla dokładności i porównania. W tym przypadku do porównania wyników użyto próbki raka jajnika wysokiego stopnia (HGSC). Zastosowano preparat kontrolny (rysunek 2A-B), który przechodził wyłącznie przez barwienie miRNA, oraz preparat testowy, który poddawał się barwieniu zarówno białkowym, jak i miRNA (rysunek 2C-...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż znaczenie miRNA jest uznawane i rozumiane, obserwacje zarówno prawidłowego rozwoju, jak i stanów chorobowych są obecnie utrudnione przez trudności w badaniu miRNA przy użyciu standardowych metod. Niedobór metod in situ doprowadził do opracowania MARLIN (test miRNA FISH). Biorąc pod uwagę homologię i krótki czas trwania miRNA, trudno jest zobrazować ich lokalizację i wpływ na regulację posttranskryptomiczną. Rozwój tego protokołu wykorzystuje sondy z zamkniętymi kwasami nukleinowymi (LNA). LNA to zmodyfik...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować następującym osobom: Chi Lam Au Yeung i Manjunath Nimmakayalu, którzy byli członkami komisji pracy dyplomowej Basanta podczas opracowywania testu. Również Samuel Mok, który podzielił i dostarczył użyte próbki. Na koniec dziękujemy Johanowi Doré i Danowi Winkowskiemu, którzy zapewnili szeroką pomoc podczas analizy i korzystania z oprogramowania Visiopharm. Badania te były częściowo finansowane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Fundację Sie oraz Fundusz Endowment Stephanie C. Stelter. Badania te zostały przeprowadzone we współpracy z Facility Cytometrii Przepływowej i Obrazowania Komórkowego, które jest częściowo wspierane przez National Institutes of Health poprzez grant wsparcia Centrum Onkologicznego M. D. Andersona P30 CA016672 oraz specjalistę badawczego NCI Jareda Burksa 1 R50 CA243707-01A1. Fundusz ORCA dr. Au Yeungsa nr 89165 wspierał zakup odczynników do amplifikacji mircoRNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x buforowana sól fizjologiczna TRIS (TBS) pH 7,6 | Thermo Fisher Scientific | J62662 K7 | Do przerywanych płukań między krokami |
| 1x rozcieńczalnik/blok przeciwciał opalowych | Akoya Biosciences | ARD1001EA | Roztwór blokujący białko |
| 1x Plus Automation Ampliment Diluent | Akoya Biosciences | FP1609 | Używane do rozcieńczania fluoroforów opalowych |
| 20x koncentratu Bufor soli sodu (SSC) | Sigma-Aldrich | S6639-1L | Dla płukania miRNA po hybrydyzacji sondowej |
| 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific/ Invitrogen | EN62248 / 62248 | Do barwienia jądrowego |
| System hybrydyzacji ACD HybEZ II | ACD Biotechne | 321711 | Piekarnik używany do regulacji temperatury podczas protokołu miRNAscope |
| Anti-CD8 (D8A8Y), Rabbit mAb | Technologie sygnalizacji komórkowej | 85336S | Przykład pierwotnego przeciwciała użytego do optymalizacji tego protokołu |
| Antydigoksygenina (mysz) HRP sprzężona | Revvity Health Sciences Inc | NEF832001EA | Odczynnik wtórny używany do wykrywania miRNA |
| Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAb | Technologie sygnalizacji komórkowej | 93790 | Przykład pierwotnego przeciwciała użytego do optymalizacji tego protokołu |
| Proszek blokujący | Akoya Biosciences | FP1012 | Roztwór blokujący miRNA |
| Alkohol etylowy 100% (200 proof) | Pharmco | 111000200 | Dla deparafinizacji |
| Bufor EZ-AR1 | BioGeneX | HK521-XAK | Wykorzystywany do pobierania antygenów przekrojów tkanek FFPE na etapie białka |
| Bufor elegancji EZ-AR1 | BioGeneX | HK546-XAK | Wykorzystywany do pobierania antygenów przekrojów tkanek FFPE na etapie badania miRNA |
| EZ-Retriever IR System | BioGeneX | MW015-IR | Mikrofala używana do pobierania antygenów z przekrojów tkanek FFPE |
| Roztwór nadtlenku wodoru 30% | Sigma-Aldrich | HX0640-5 | Do przygotowania tkanek. Pomaga blokować endogenną aktywność nadoksydazy i daje produkty o silnych kolorach |
| miR-181c-3p sonda miRNA | Qiagen | 339112 | Przykład sondy miRNA użytej do optymalizacji tego protokołu |
| miRCURY LNA miRNA ISH Zestaw (FFPE) | Qiagen | 339450 | Używany do rozcieńczania sondy miRNA |
| Opal 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorofor do identyfikacji przeciwciał pierwotnych |
| Opal 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorofor do identyfikacji przeciwciał pierwotnych |
| Opal Anti-Ms + Rb HRP | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Przeciwciało wtórne stosowane jako środek wykrywający |
| Pierce 16% Formaldehyd (z metanolem), bez metanolu | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Do produkcji 3,7% PFA do przygotowania tkanek |
| ProLong Diamond Antifade | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Nośniki montażowe |
| RNAscope Protease Plus | ACD Biotechne | 322331 | Przenikanie przekrojów tkanek poprzez częściowe trawienie białek i Ekspozycja docelowych cząsteczek miRNA |
| Woda wolna od RNA | Corning | 46-000-CM | Do czyszczenia i przygotowania całego sprzętu oraz do stosowania jako rozcieńczalnika, gdy jest to konieczne. |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-25ML | Aby stworzyć TBS-T |
| Wzmacnianie sygnału tyramidowego plus cyjanina 3 | Akoya Biosciences | NEL744001KT | Fluorofor do identyfikacji miRNA |
| Sondy miRNA U6 i Scramble | Qiagen | 339459 | Opcjonalne sondy sterujące |
| Histologiczny stopień ksyleny | Thermo Fisher Scientific | UN1307 | Dla deparafinizacji |
Bibliografia
- Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
- Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
- Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
- Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
- Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
- Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
- Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
- Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
- Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
- Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
- Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
- Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
- Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
- Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
- Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
- Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
- Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
- Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
- Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
- Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
