Method Article

Sekwencyjne wykrywanie biomolekuł w próbkach utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie z obrazowaniem za pomocą spektrometrii mas

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania spektrometrii mas do sekwencyjnego wykrywania metabolitów, glikanów sprzężonych z N i peptydów tryptycznych w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki to złożone środowiska komórkowe, składające się z szerokiej gamy typów komórek i biomolekuł, z których wszystkie oddziałują ze sobą w celu wykonywania funkcji narządu. Tradycyjnie, techniki analizy biomolekuł, takich jak metabolity, glikany i białka, polegały na homogenizacji tkanki, niszcząc wszystkie informacje przestrzenne. Te tradycyjne metody utrudniały pełne zrozumienie złożonych wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych interakcji molekularnych. Z drugiej strony obrazowanie spektrometrią mas (MSI) nie tylko zachowuje informacje przestrzenne biomolekuł w tkance, ale także umożliwia wykrywanie wielu klas analitów z tego samego wycinka tkanki poprzez sekwencyjną analizę w rozdzielczości zbliżonej do pojedynczej komórki. Dzięki temu możemy uzyskać pełniejszy obraz interakcji molekularnych w różnych klasach biomolekuł. Przedstawiony tutaj protokół przedstawia etapy wykonywania obrazowania spektrometrią mas metabolitów, glikanów sprzężonych z N i peptydów tryptycznych sekwencyjnie z tego samego wycinka tkanki z rozdzielczością 20 μm. Sumienne rozważenie kolejności, w jakiej klasy analitów są obrazowane, wraz z ostrożnym obchodzeniem się z sekcjami w celu zapewnienia integralności, pozwala na zebranie wielu wysokiej jakości obrazów z tej samej sekcji. Dane te można następnie zintegrować z innymi przestrzennymi danymi omicznymi (transkryptomika, immunohistochemia itp.) zebranymi z odcinków szeregowych, gdzie ta sama komórka może być analizowana w tych sąsiednich sekcjach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężna technika, która pozwala na wykrywanie i wizualizację setek do tysięcy biomolekuł z cienkich skrawków tkanek, bez konieczności posiadania a priori wiedzy na temat dokładnych cząsteczek obecnych w tkance, co czyni ją doskonałym narzędziem do odkrywania biomarkerów1. Podczas gdy kilka rodzajów MSI jest używanych przez różne laboratoria, w tym desorpcja jonizacji elektrorozpylającej (DESI)2,3, jonizacja elektrorozpylania wspomagana matrycą laserową w podczerwieni (IR-MALDESI)4 i spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS)5, desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) pozostaje najczęściej stosowana i najbardziej wszechstronna. Większość klas biomolekuł można wykryć za pomocą MSI poprzez dostosowanie przygotowania próbki, w tym mycia/wstępnej obróbki tkanki, trawienia enzymatycznego i zastosowanej matrycy/rozpuszczalnika 6,7. MALDI MSI jest stosowany do wykrywania metabolitów, lipidów, glikanów, białek i peptydów proteolitycznych.

Badania MSI zostały wykorzystane w różnych badaniach klinicznych i przedklinicznych w celu lepszego zrozumienia mechanizmów choroby 8,9, poprawy oceny i stopnia zaawansowania raka10,11, przewidywania wyników leczenia12, poprawy diagnozy13 i określenia molekularnych marginesów guza14. Większość z tych badań koncentrowała się na wykrywaniu tylko jednej klasy analitów. Jednak często interesująca jest analiza więcej niż jednej klasy biomolekuł z tej samej próbki. Tradycyjnie wykonywano to za pomocą seryjnych odcinków tkanek. Jednak ostatnio pokazano przykłady sekwencyjnej analizy wielu klas analitów z tego samego przekroju tkanki. Na przykład Yagnik i wsp. wykazali obrazowanie lipidowe zamrożonej tkanki, a następnie immunohistochemię MALDI z tej samej sekcji dla klasyfikacji typu komórki15. Clift i wsp. wykazali sekwencyjne stosowanie PNGazyF, kolagenazy i trypsyny do utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) skrawków tkanek w celu obrazowania odpowiednio glikanów sprzężonych z N, białek macierzy zewnątrzkomórkowej i białek ogólnych16. Escobar i wsp. zademonstrowali sekwencyjną analizę glikanów sprzężonych z N, O-GlcNAc i peptydów tryptycznych z tego samego odcinka zamrożonej tkanki17. Tego typu eksperymenty są przeprowadzane poprzez staranne planowanie eksperymentów, aby najpierw przeanalizować najłatwiej tracone anality, a następnie te, które są bardziej stabilne w tkance. W wielu przypadkach płukanie, które są używane do usuwania niepożądanych klas cząsteczek, pomaga wzmocnić inne klasy cząsteczek6, właściwość, którą można wykorzystać, ponieważ każde płukanie, które usuwa poprzednio nałożoną matrycę, pomaga również wzmocnić sygnał następnej klasy analitów, które mają być zobrazowane.

Niedawno opublikowaliśmy przepływ pracy do sekwencyjnej analizy metabolitów, glikanów sprzężonych z N i peptydów tryptycznych z tego samego odcinka tkanki raka jajnikaFFPE 18. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy przebieg analizy tych trzech klas biomolekuł z tego samego przekroju tkanki; przegląd protokołu jest szczegółowo opisany na rysunku 1. O ile nam wiadomo, jest to pierwszy protokół szczegółowo opisujący ten przebieg procesu sekwencyjnego obrazowania z tkanki FFPE. Krótko mówiąc, skrawki tkanek są odparafinowane ksylenem przed pokryciem matrycą 1,5-diaminonaftalenową (10 mg/ml w 50% acetonitrylu) w celu obrazowania metabolitów w trybie jonów ujemnych. Matryca jest następnie usuwana, skrawki ponownie nawilżane i pobierany z antygenu, a następnie spryskiwany PNGazą F (0,1 μg / μl w wodorowęglanie amonu) w celu uwolnienia glikanów połączonych z N in situ. Po inkubacji skrawki są powlekane matrycą kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) (10 mg/ml w 70% acetonitrylu, 0,1% kwasu trifluorooctowego) i obrazowane w trybie jonów dodatnich. Matryca jest następnie ponownie usuwana, ponowne uwodnienie i pobieranie antygenu powtarzane, a skrawki są spryskiwane trypsyną (0,075 μg / μl w wodorowęglanie amonu) i inkubowane przed ponownym pokryciem matrycą CHCA (10 mg / ml w 70% acetonitrylu, 0,1% kwasu trifluorooctowego) i obrazowane w trybie jonów dodatnich. Wszystkie roztwory powinny być świeże, bezpośrednio przed użyciem, a jeśli to w ogóle możliwe, eksperymenty należy przeprowadzać przez 3 kolejne dni. W przypadku wystąpienia opóźnień, skrawki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w stanie wysuszenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykorzystuje tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie pobrane od wcześniej nieleczonych pacjentek poddawanych pierwotnej operacji cytoredukcyjnej z powodu surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości. Wszystkie dane kliniczne uzyskano z repozytorium raka jajnika na Wydziale Ginekologii Onkologicznej i Medycyny Rozrodu zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Review Board Uniwersytetu Teksańskiego MD Anderson. Pisemna świadoma zgoda pacjentów została uzyskana przez personel recepcji, a badania zostały przeprowadzone zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi.

1. Przygotowanie próbki do obrazowania metabolitów

UWAGA: Protokół ten zakłada, że skrawki tkanki utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (o grubości 4 μm) zostały już zamontowane na szklanych szkiełkach mikroskopowych, ponieważ próbki kliniczne muszą być zazwyczaj cięte w rdzeniu patologii klinicznej przez histotechników. Ponieważ prezentowana tutaj praca jest wykonywana na referencyjnym instrumencie TOF, ortogonalny pomiar TOF zmniejsza potrzebę stosowania przewodzących szkiełek tradycyjnie stosowanych w eksperymentach MSI. Stosowanie standardowych preparatów mikroskopowych bardziej sprzyja również standardowym przepływom pracy w laboratoriach patologii klinicznej, a także umożliwia wykorzystanie tkanki archiwalnej już na szkiełkach.

  1. Wykonaj znaki referencyjne w czterech rogach szkiełka za pomocą rysika diamentowego.
  2. Odparafinować skrawki przez zanurzenie w ksylenie histologicznym na 3 min.
    UWAGA: Ksylen jest szkodliwy i powinien być stosowany w dygestoriach chemicznych.
  3. Zanurz sekcje w świeżym ksylenie na 3 minuty.
  4. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  5. Umieść suwak w tarczy adaptera suwaka.
  6. Uzyskaj optyczny obraz slajdu za pomocą skanera płaskiego o rozdzielczości 4 800 dpi.
  7. Wykonać matrycę MALDI, rozpuszczając 15 mg 1,5-diaminonaftalenu (DAN) w 1,5 ml 50% ACN. Sonikować aż do całkowitego rozpuszczenia, ~5 min. Przefiltrować roztwór matrycy przed załadowaniem do pętli próbki.
    UWAGA: DAN jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy i powinien być stosowany z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej. Natryskiwanie matrycowe powinno odbywać się w dygestoriach chemicznych.
  8. Spryskaj szkiełko roztworem DAN za pomocą zrobotyzowanego rozpylacza odczynników o następujących parametrach: Prędkość toru - 1 200 mm/s; Rozstaw ścieżek - 3 mm; temperatura dyszy - 60 °C; Wysokość dyszy - 40 mm; Natężenie przepływu - 100 μL/min; Karnety - 4; N 2 Ciśnienie - 10 psi; Wzór - CC
  9. Nanieść 0,5 μl czerwonego fosforu zawieszonego w metanolu w znane miejsce na szkiełku.

2. Gromadzenie danych obrazowych metabolitów

  1. Umieść przygotowane szkiełko (szkiełka) w adapterze suwakowym II i załaduj do spektrometru mas timsTOF fleX MALDI QTOF.
  2. Załaduj odpowiednią metodę zbierania danych w trybie jonów ujemnych w timsControl z wyłączonymi timami. Jeżeli przyrząd nie był jeszcze w trybie jonów ujemnych, należy odczekać co najmniej 25 minut po zmianie biegunowości w celu zrównoważenia przed kalibracją i zebraniem danych z następującymi parametrami przyrządu dla metabolitów: zakres m/z - 50 - 600; Zakres skanowania laserowego - 16,0 μm zarówno w osi X, jak i Y; Wynikowa wielkość pola - 20,0 μm zarówno w X, jak i Y; strzały laserowe - 150; Płynność lasera - ~30%; Lejek 1 RF - 150.0 Vpp; Lejek 2 RF - 200.0 Vpp; Wielobiegunowy RF - 200.0 Vpp; energia zderzenia - 10,0 eV; Kolizja RF - 500.0 Vpp; Czas transferu - 55,0 μs; Magazynowanie PrePulse - 5,0 μs (rysunek uzupełniający S1).
  3. Wykonaj Profil docelowy (kliknij przycisk Generuj teraz ) i Regulacja ostrości (kliknij przycisk Dostosuj teraz ) na karcie Sample Carrier (Nośnik próbki). Dostosuj pozycję lasera w X i Y, w razie potrzeby na wypustce lasera , aby upewnić się, że laser jest dokładnie wyrównany z krzyżem nitkowym.
  4. Zbierz widmo czerwonego fosforu, sumując co najmniej pięć zestawów strzałów laserowych z miejsca na szkiełku.
  5. Wykonaj kalibrację, klikając przycisk Kalibruj na karcie Kalibracja. Usuń wszystkie piki o bardzo niskiej intensywności lub wysokim błędzie ppm.
    UWAGA: Nawet klastry fosforu (P2 i P4) na ogół dają bardzo słaby sygnał. Wynik kalibracji powinien wynosić 100% przed kliknięciem przycisku akceptacji. Jeśli nie, wyczyść zsumowane widmo i zdobądź nowe.
  6. Uruchom oprogramowanie flexImaging . Graficzny interfejs użytkownika pobierania obrazu rozpocznie się automatycznie.
  7. Wybierz opcję Skonfiguruj nowy przebieg obrazowania w oknie Wybierz przebieg obrazowania .
  8. Wybierz pozycję Klasyczny przepływ pracy w oknie Wybieranie przepływu pracy .
  9. W oknie Magazyn danych podaj nazwę przebiegu obrazowania i katalog wyników dla danych.
    UWAGA: Spacje nie powinny być używane w nazwach plików.
  10. W oknie Ustawienia akwizycji wybierz opcję Regiony pomiaru zdefiniowane przez użytkownika i wpisz wartość 20 w polu Szerokość rastra . Kliknij przycisk Przeglądaj , aby wybrać wcześniej utworzoną metodę timsControl .
  11. W oknie Przykładowy obraz kliknij przycisk Przeglądaj , aby wybrać obraz optyczny uzyskany za pomocą skanera płaskiego.
  12. W oknie Teach Sample (Naucz przykład ) wykonaj trzypunktowe wyrównanie między obrazem optycznym a slajdem; następnie przesuń nośnik próbki do pierwszego wytrawionego wzorca na szkiełku i wyrównaj krzyż nitkowy w timsControl z wyraźną cechą wytrawiania. Powiększ obraz (zalecane powiększenie 100%), ustaw Przykładowy obraz na Ustaw punkty uczenia i kliknij to samo miejsce na obrazie optycznym. Powtórz ten proces jeszcze 2 razy, aby uzyskać w sumie trzy punkty uczenia. Kliknij przycisk Dalej , aby zakończyć nauczanie.
  13. Kliknij przycisk OK , aby wyjść z Kreatora uruchamiania nowego obrazowania.
  14. Sprawdź dokładność nauczania, klikając przycisk Position Sample Carrier w oprogramowaniu. Powiększ i kliknij na wyraźną cechę czwartego (nieużywanego) punktu odniesienia na obrazku; nośnik próbki zostanie przeniesiony do tej pozycji w timsControl. Upewnij się, że krzyż nitkowy pokrywa się z wybranym elementem. Jeśli nie są one wyrównane, wyczyść nauczanie w flexImaging i powtórz proces uczenia, aby poprawić dokładność.
  15. W oprogramowaniu wybierz narzędzie Dodaj region pomiaru wielokąta i obrysuj tkanki, które mają być obrazowane. Każde kliknięcie myszką utworzy punkt kontrolny. Naciśnij przycisk Backspace na klawiaturze, aby usunąć punkty jeden po drugim. Po narysowaniu regionu kliknij dwukrotnie myszą, aby zamknąć wielokąt.
  16. Sprawdź sygnał, wystrzeliwując laser w kilka miejsc w tkance. Kliknij miejsce na obrazie za pomocą przycisku Position Sample Carrier , jak w kroku 2.14, aby sprawdzić uczenie. Widmo będzie zdominowane przez piki matrycy w okolicach m/z 157 i 313; Powiększ obszar M/Z poniżej 154 i 250-300, aby pokazać odpowiednio wiele pików metabolitów małocząsteczkowych i kwasów tłuszczowych. Dostosuj fluencję lasera zgodnie z potrzebami, aby uzyskać optymalny sygnał.
  17. Zapisz metodę timsControl.
  18. Rozpocznij akwizycję obrazowania, klikając przycisk Start AutoXecute Run w oprogramowaniu
    UWAGA: Obrazowanie w trybie jonów ujemnych za pomocą matrycy DAN powoduje wykrycie licznych metabolitów z cyklu TCA, między innymi aminokwasów i kwasów tłuszczowych.

3. Przygotowanie próbki do obrazowania glikanów sprzężonych z azotem

  1. Po wyjęciu próbki ze spektrometru mas należy usunąć matrycę DAN, zanurzając szkiełko w 100% etanolu (200 proof) na 1 min.
  2. Nawilżaj zjeżdżalnię w słoikach Coplin: Fresh 100% etanol przez 1 min; 95% etanolu przez 1 min; 70% etanolu przez 1 min; Woda przez 3 min; Świeża woda przez 3 min.
  3. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na ~15 min.
  4. Pobrać antygen, zanurzając szkiełko w 100 mM buforze Tris (sporządzonym przez rozpuszczenie 6,06 g Tris Base w 500 ml wody i dostosowaniu pH w razie potrzeby), pH 9, w słoiku Coplin z pokrywką umieszczoną luźno na górze, którą umieszcza się w komorze demaskującej z 500 ml wody w komorze. Podgrzewać do 95 °C przez 20 min.
  5. Wyjmij słoik Coplin ze studzienki demonstracyjnej i umieść go na blacie, aby ostygł przez 20 minut.
  6. Wymiana buforowa zjeżdżalni na wodę w ciągu pięciu zmian. W przypadku pierwszych trzech wylej połowę roztworu i zastąp go wodą. W przypadku dwóch ostatnich wylej cały roztwór i zastąp go wodą.
  7. Pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia.
  8. Stworzyć komorę wilgotnościową do inkubacji szkiełka po aplikacji PNGaseF. Wytnij okrąg chłonnej chusteczki, aby przykryć spód szalki Petriego o średnicy 100 mm. Rzuć dwie chusteczki laboratoryjne, aby utworzyć poduszki po obu stronach szalki Petriego (ryc. 2). Dodać 8 ml wody, aby nasycić te chusteczki i przykryć szalkę Petriego pokrywką i wstawić do piekarnika w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut do podgrzania.
    UWAGA: Wnętrze naczynia powinno wydawać się zaparowane.
  9. Przygotować PNGazę, odtwarzając 100 μg liofilizowanego enzymu w 200 μl 100 mM wodorowęglanu amonu o pH 7,8 i wirować do wymieszania. Przenieść roztwór do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozcieńczyć wodą do objętości 1 ml.
  10. Spryskaj szkiełko PNGaseF za pomocą zrobotyzowanego rozpylacza odczynników o następujących parametrach. Pompę strzykawkową należy stosować do zastosowań o małej objętości/niskim natężeniu przepływu: Prędkość toru - 1200 mm/s; Rozstaw ścieżek - 3 mm; temperatura dyszy - 45 °C; Wysokość dyszy - 40 mm; Natężenie przepływu - 25 μL/min; Karnety - 15; N 2 Ciśnienie - 10 psi; Wzór - CC
  11. Umieścić szkiełko na podgrzanej szalce Petriego, chusteczką do góry, jednym końcem na każdej z poduszek laboratoryjnych do wycierania. Załóż suwak i uszczelnij szalkę Petriego samoprzylepną folią uszczelniającą. Umieścić w piekarniku o temperaturze 37 °C i umieścić na szalce Petriego podkładkę grzewczą dla ustawioną na 40 °C.
    UWAGA: Dzięki temu pokrywka jest najcieplejszą częścią naczynia i zapobiega tworzeniu się kondensatu na pokrywce i opadaniu na tkankę, co spowoduje artefakty na obrazach.
  12. Inkubować szkiełko przez 2 godziny, aby umożliwić postęp trawienia.
  13. Zdjąć szkiełko z szalki Petriego i pozostawić do wyschnięcia na ~5 min.
  14. Wykonać matrycę MALDI, rozpuszczając 15 mg kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) w 1,5 ml 70% ACN, 0,1% TFA, 10 mM fosforanu amonu.
    UWAGA: TFA jest i powinien być stosowany w kapturze z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
  15. Sonikować aż do całkowitego rozpuszczenia, ~5 min.
  16. Przefiltrować roztwór matrycy przed załadowaniem do pętli próbki.
  17. Spryskaj szkiełko CHCA za pomocą zrobotyzowanego rozpylacza odczynników o następujących parametrach: Prędkość toru - 1 200 mm/s; Rozstaw ścieżek - 3 mm; temperatura dyszy - 75 °C; Wysokość dyszy - 40 mm; Natężenie przepływu - 120 μL/min; Karnety - 3; N 2 Ciśnienie - 10 psi; Wzór - HH
  18. Nanieść 0,5 μl czerwonego fosforu zawieszonego w metanolu w znane miejsce na szkiełku.

4. Gromadzenie danych obrazowania glikanów sprzężonych z N

  1. Umieść przygotowane szkiełko (szkiełka) w celu adaptera szkiełka i załaduj do spektrometru masowego MALDI QTOF.
  2. Załaduj odpowiednią metodę zbierania danych w trybie jonów dodatnich w timsControl. Jeśli przyrząd nie był jeszcze w trybie jonów dodatnich, odczekaj co najmniej 25 minut po zmianie polaryzacji w celu zrównoważenia przed kalibracją i zebraniem danych z następującymi parametrami przyrządu dla glikanów: zakres m/z - 700-3500; Zakres skanowania laserowego - 16,0 μm zarówno w osi X, jak i Y; Wynikowa wielkość pola - 20,0 μm zarówno w X, jak i Y; strzały laserowe - 200; płynność lasera - ~25%; Lejek 1 RF - 450.0 Vpp; Lejek 2 RF - 500.0 Vpp; Wielobiegunowy RF - 500.0 Vpp; energia zderzenia - 10,0 eV; Kolizja RF - 2,700.0 Vpp; czas transferu - 140,0 μs; Magazynowanie PrePulse - 14,0 μs (rysunek uzupełniający S2).
  3. Wykonaj profil docelowy (kliknij przycisk Generuj teraz ) i regulację ostrości (kliknij przycisk Dostosuj teraz ) na karcie Sample Carrier (Nośnik próbki ). W razie potrzeby dostosuj pozycję lasera w X i Y na karcie lasera , aby upewnić się, że laser jest wyrównany z krzyżem nitkowym.
  4. Zbierz widmo czerwonego fosforu, sumując co najmniej pięć zestawów strzałów laserowych z miejsca na szkiełku.
  5. Wykonaj kalibrację, klikając przycisk Kalibruj na karcie Kalibracja. Usuń wszystkie piki o bardzo niskiej intensywności lub wysokim błędzie ppm.
    UWAGA: Wynik kalibracji powinien wynosić 100% przed kliknięciem przycisku akceptacji. Jeśli nie, wyczyść zsumowane widmo i zdobądź nowe.
  6. Otwórz plik .mis używany wcześniej do obrazowania metabolitów w oprogramowaniu.
  7. Zapisz plik pod nową nazwą wskazującą, że są to dane glikanu.
  8. W obszarze Edycja | Właściwości przebiegu obrazowania, zmień metodę akwizycji na żądaną metodę glikanu.
  9. Czyszczenie poprzedniego nauczania za pomocą punktu menu Edytuj | Wyczyść punkty nauczania.
    UWAGA: Zamek nie znajdzie się dokładnie w tej samej pozycji po wyjęciu go z adaptera prowadnicy i ponownym załadowaniu.
  10. Wykonywanie nowego nauczania za pomocą punktu menu Edycja | Ustawianie punktów nauczania; Ustaw 3 punkty , tak jak to zostało zrobione w oryginalnym Kreatorze obrazowania (krok 2.12).
  11. Sprawdź dokładność nauczania, klikając przycisk Position Sample Carrier w oprogramowaniu. Powiększ i kliknij na wyraźną cechę czwartego (nieużywanego) punktu odniesienia na obrazku. Nośnik próbki zostanie przeniesiony do tej pozycji w timsControl; Upewnij się, że krzyż nitkowy pokrywa się z wybranym elementem.
    UWAGA: Jeśli krzyżyk nitkowy nie jest wyrównany, wyczyść nauczanie i powtórz proces nauczania, aby poprawić dokładność.
  12. Zapisz plik.
  13. Sprawdź sygnał, wystrzeliwując laser w kilka miejsc w tkance. Kliknij miejsce na obrazie za pomocą przycisku Position Sample Carrier (Umieść nośnik próbki ), tak jak w kroku 4.11, aby sprawdzić uczenie. Potwierdź, że widmo ma obfite piki glikanów z dominującymi pikami zwykle na m/z 1,663 i 1,809. Dostosuj fluencję lasera zgodnie z potrzebami, aby uzyskać optymalny sygnał.
  14. Zapisz metodę timsControl.
  15. Rozpocznij pobieranie obrazu, klikając przycisk Start AutoXecute Run .

5. Przygotowanie próbki do obrazowania peptydów tryptycznych

  1. Usunąć matrycę CHCA, zanurzając szkiełko w 100% etanolu (200 proof) na ~1 min
  2. Ponownie nawodnij szkiełko w słoikach Coplin w następujący sposób: Świeży 100% etanol przez 1 minutę; 95% etanolu przez 1 min; 70% etanolu przez 1 min; Woda przez 3 min; Świeża woda przez 3 min.
  3. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na ~15 min.
  4. Przeprowadzić pobieranie antygenu, zanurzając szkiełko w 100 mM buforze Tris o pH 9 w słoiku Coplin z pokrywką umieszczoną luźno na górze, którą umieszcza się w komorze demaskującej z 500 ml wody w komorze. Podgrzewać do 95 °C przez 20 min.
    UWAGA: To drugie pobranie antygenu jest niezbędne do denaturacji białek w celu bardziej efektywnego dostępu trypsyny do miejsc rozszczepienia.
  5. Wyjmij słoik Coplin ze studzienki demonstracyjnej i umieść go na blacie, aby ostygł przez 20 minut.
  6. Wymiana buforowa zjeżdżalni na wodę w ciągu pięciu zmian. W przypadku pierwszych trzech wylej połowę roztworu i zastąp go wodą. W przypadku dwóch ostatnich wylej cały roztwór i zastąp go wodą.
  7. Pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia.
  8. Przygotować trypsynę, odtwarzając 100 μg liofilizowanego enzymu w 200 μl 100 mM kwasu octowego i pipetować w górę iw dół do wymieszania. Porcjować do odpowiednich rozmiarów do eksperymentu (zazwyczaj 40 μl) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotuj 40 μl porcji trypsyny, dodając 350 μl 100 mM wodorowęglanu amonu o pH 7,8 i 39 μl ACN. Dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Acetonitryl (10% ACN) zwiększa aktywność trypsyny w porównaniu z roztworem wodnym i zmniejsza napięcie powierzchniowe roztworu do rozpylania19.
  10. Spryskaj szkiełko trypsyną za pomocą automatycznego rozpylacza odczynników o następujących parametrach. Pompę strzykawkową należy stosować do zastosowań o małej objętości/niskim natężeniu przepływu: Prędkość toru - 750 mm/s; Rozstaw ścieżek - 3 mm; temperatura dyszy - 30 °C; Wysokość dyszy - 40 mm; Natężenie przepływu - 10 μL/min; Karnety - 12; N 2 Ciśnienie - 10 psi; Wzór - HH
  11. Umieścić kwadrat chłonnej chusteczki na dnie szalki Petriego o średnicy 100 mm; Upewnij się, że rogi dotykają krawędzi naczynia i rozprowadź 1 ml wody na chusteczce.
  12. Umieść szkiełko na chusteczce, chusteczką do góry, przykryj pokrywką szalkę Petriego i uszczelnij szalkę Petriego samoprzylepną folią uszczelniającą.
  13. Inkubować szkiełko przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, aby umożliwić postęp trawienia.
  14. Zdjąć szkiełko z szalki Petriego i pozostawić do wyschnięcia na ~5 minut.
  15. Wykonać matrycę MALDI, rozpuszczając 15 mg kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) w 1,5 ml 70% ACN, 0,1% TFA, 10 mM fosforanu amonu.
  16. Sonikować aż do całkowitego rozpuszczenia, ~5 min.
  17. Przefiltrować roztwór matrycy przed załadowaniem do pętli próbki.
  18. Spryskaj szkiełko CHCA za pomocą zrobotyzowanego rozpylacza odczynników o następujących parametrach: Prędkość toru - 1200 mm/s; Rozstaw ścieżek - 3 mm; temperatura dyszy - 75 °C; Wysokość dyszy - 40 mm; Natężenie przepływu - 120 μL/min; Karnety - 4; N 2 Ciśnienie - 10 psi; Wzór - HH
  19. Nanieść 0,5 μl czerwonego fosforu zawieszonego w metanolu w znane miejsce na szkiełku.

6. Gromadzenie danych z obrazowania peptydów tryptycznych

  1. Umieść przygotowane szkiełko (szkiełka) w adapterze szkiełkowym i załaduj do spektrometru mas timsTOF MALDI QTOF.
  2. Załaduj odpowiednią metodę zbierania danych w trybie jonów dodatnich w timsControl. Jeśli przyrząd nie był jeszcze w trybie jonów dodatnich, odczekaj co najmniej 25 minut po zmianie polaryzacji w celu zrównoważenia przed kalibracją i zbieraniem danych przy użyciu następujących parametrów przyrządu dla peptydów: zakres m/z - 600-4500; Zakres skanowania laserowego - 16,0 μm zarówno w osi X, jak i Y; Wynikowa wielkość pola - 20,0 μm zarówno w X, jak i Y; strzały laserowe - 200; płynność lasera - ~25%; Lejek 1 RF - 450.0 Vpp; Lejek 2 RF - 500.0 Vpp; Wielobiegunowy RF - 600.0 Vpp; energia zderzenia - 10,0 eV; Kolizja RF - 3400.0 Vpp; czas transferu - 180,0 μs; Magazynowanie PrePulse - 18,0 μs (rysunek uzupełniający S3).
  3. Wykonaj Profil docelowy (kliknij przycisk Generuj teraz ) i Regulacja ostrości (kliknij przycisk Dostosuj teraz ) na karcie Sample Carrier (Nośnik próbki). W razie potrzeby dostosuj położenie lasera w X i Y na karcie lasera , aby upewnić się, że laser jest wyrównany z krzyżem nitkowym.
  4. Zbierz widmo czerwonego fosforu, sumując co najmniej pięć zestawów strzałów laserowych z miejsca na szkiełku.
  5. Wykonaj kalibrację, klikając przycisk Kalibruj na karcie Kalibracja. Usuń wszystkie piki o bardzo niskiej intensywności lub wysokim błędzie ppm. Upewnij się, że wynik kalibracji wynosi 100%, zanim klikniesz przycisk Akceptuj. Jeśli nie, wyczyść zsumowane widmo i zdobądź nowe.
  6. Otwórz plik .mis używany wcześniej do obrazowania glikanów.
  7. Zapisz plik pod nową nazwą wskazującą, że są to dane peptydowe.
  8. W obszarze Edycja | Właściwości przebiegu obrazowania, zmień metodę akwizycji na żądaną metodę peptydową.
  9. Czyszczenie poprzedniego nauczania za pomocą punktu menu Edytuj | Wyczyść punkty nauczania.
    UWAGA: Zamek nie znajdzie się dokładnie w tej samej pozycji po wyjęciu go z adaptera prowadnicy i ponownym załadowaniu.
  10. Wykonywanie nowego nauczania za pomocą punktu menu Edycja | Ustawianie punktów nauczania; Ustaw trzy punkty, tak jak to zostało zrobione w oryginalnym Kreatorze obrazowania (krok 2.12).
  11. Sprawdź dokładność nauczania, klikając przycisk Position Sample Carrier . Powiększ i kliknij na wyraźną cechę czwartego (nieużywanego) punktu odniesienia na obrazku. Nośnik próbki zostanie przeniesiony do tej pozycji w timsControl; Upewnij się, że krzyż nitkowy pokrywa się z wybranym elementem.
    UWAGA: Jeśli krzyżyk nitkowy nie jest wyrównany, wyczyść nauczanie i powtórz proces nauczania, aby poprawić dokładność.
  12. Zapisz plik.
  13. Sprawdź sygnał, wystrzeliwując laser w kilka miejsc w tkance. Kliknij miejsce na obrazie za pomocą przycisku Position Sample Carrier (Umieść nośnik próbki ), tak jak w kroku 6.11, aby sprawdzić uczenie. Potwierdź, że widmo ma obfite piki peptydowe z dominującymi pikami zwykle na m/z 944, 1,105 i 1,198. Dostosuj fluencję lasera zgodnie z potrzebami, aby uzyskać optymalny sygnał.
  14. Zapisz metodę timsControl.
  15. Rozpocznij pobieranie obrazu, klikając przycisk Start AutoXecute Run .

7. Barwienie histologiczne

UWAGA: Dostępnych jest kilka metod dla hematoksyliny i eozyny. Przedstawiona tutaj jest zmodyfikowana metoda Carazziego często stosowana w tym laboratorium.

  1. Usunąć matrycę CHCA, zanurzając szkiełko w 100% etanolu na 1 min.
  2. Zabarwić szkiełko w następujący sposób: 95% etanolu przez 30 s; 70% etanolu przez 30 s; Woda przez 30 s; Hematoksylina przez 2 min; Woda przez 30 s; 70% etanolu przez 30 s; 95% etanolu przez 30 s; Eozyna przez 1 min; 95% etanolu przez 30 s; 100% etanol przez 30 s; Ksylen przez 2,5 min; Szkiełko nakrywkowe z podłożem montażowym.
  3. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na >1 godziny i usuń wszelkie pęcherzyki, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe.
  4. Digitalizacja za pomocą cyfrowego skanera slajdów.

8. Wizualizacja danych

UWAGA: Istnieje obszerna analiza, którą można przeprowadzić za pomocą SCiLS Lab, która wykracza poza zakres tego protokołu. W tym miejscu opiszemy tylko podstawowe tworzenie plików, wizualizację danych i wyszukiwanie pików w bazach danych w celu przypuszczalnej identyfikacji.

  1. Uruchom SCiLS Lab 2025b i wybierz Nowy.
  2. Wybierz plik(i) danych, które mają zostać załadowane do oprogramowania.
    UWAGA: Dzięki SCiLS Lab Pro wiele plików danych, które zostały zebrane z tymi samymi parametrami, może być ładowanych razem w celu normalizacji do siebie i jednoczesnej wizualizacji.
  3. Ułóż próbki w preferowanym układzie. Przenieś próbki, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając. Obróć próbki, klikając prawym przyciskiem myszy i przeciągając. Wybierz pozycję Dalej.
  4. W oknie Ustawienia osi masy dokonaj niezbędnych korekt. Wartości domyślne zazwyczaj działają dobrze w przypadku danych timsTOF. Kliknij Dalej.
  5. W oknie Znajdowanie funkcji ustaw odpowiednie wartości dla automatycznego pobierania szczytów podczas importu. Kliknij Dalej.
    UWAGA: Nie działa to dobrze w przypadku danych dotyczących metabolitów z tkanek FFPE i należy je pominąć.
  6. Ustawienia importu zostaną wyświetlone w oknie Podsumowanie importu . Kliknij przycisk Importuj.
  7. Podaj nazwę pliku i lokalizację, w której chcesz zapisać plik SCiLS.
    UWAGA: W zależności od rozmiaru pliku importowanie może potrwać od kilku minut do kilku godzin.
  8. Po zakończeniu zostanie wyświetlone okno podsumowania . Kliknij opcję Otwórz zaimportowany zestaw danych , aby wejść w interakcję z plikiem SCiLS.
  9. W prawym górnym rogu oprogramowania kliknij menu rozwijane obok opcji Normalizacja i wybierz opcję Średnia kwadratowa.
    UWAGA: Jest to najodpowiedniejsza metoda dla danych timsTOF, biorąc pod uwagę rzadkość importowanych danych centroidów i zapewni najlepszą wizualizację.
  10. W obszarze Plik | Właściwości pliku, ustaw szerokość interwału na odpowiednią wartość, zwykle 10 - 15 ppm dla danych timsTOF. Upewnij się, że wartość jest odpowiednia, oceniając, czy obejmuje szerokość piku w średnim spektrum.
  11. Powiększ średnie widmo u dołu oprogramowania, klikając i przeciągając lub obracając kółko myszy do przodu.
  12. Wybierz szczyt do wizualizacji, umieszczając krzyżyk na wierzchołku i klikając lewym przyciskiem myszy kółko myszy.
  13. Dodaj interesujące Cię jony do listy aktywnych obrazów jonów, naciskając Control + Spacja.
  14. Zapisz wyselekcjonowaną listę funkcji, klikając przycisk Zapisz jako listę funkcji u dołu okna obrazów jonowych po prawej stronie oprogramowania.
  15. Otwórz zapisaną listę funkcji, klikając Plik | Tabela funkcji i wyszukiwanie za pomocą MetaboScape przypuszczalnych identyfikatorów metabolitów lub glikanów, jeśli MetaboScape jest zainstalowany i skonfigurowany w tej samej sieci. Alternatywnie przekonwertuj pliki SCiLS na pliki .imzML w celu zaimportowania do METASPACE (https://metaspace2020.org/) w celu domniemanej identyfikacji.
    UWAGA: Pełny opis możliwości SCiLS Lab znajduje się w Instrukcji Obsługi w opcji menu Pomoc .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukończenie tego protokołu powinno zaowocować trzema solidnymi zestawami danych MSI z tego samego odcinka tkanki. W wizualizacji pełnego spektrum danych metabolitowych, widmo będzie silnie zdominowane przez piki matrycowe na m/z 157 i 315. Jest to normalne w przypadku tkanki FFPE. Wiele sygnałów metabolitów i kwasów tłuszczowych będzie obserwowanych poprzez przybliżenie zakresów m/z <155 i od 250 do 300. Rysunek 3 przedstawia przykłady pełnego spektrum i powiększonych zakresów, podkreślają...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zbieranie sekwencyjnych danych MSI z pojedynczego odcinka tkanki wymaga szczególnej dbałości o szczegóły. Jest kilka kroków, które są absolutnie niezbędne do uzyskania wysokiej jakości danych. Po pierwsze, należy zachować ostrożność, jeśli w tym samym czasie przygotowywany jest więcej niż jeden szkiełko. Podczas umieszczania szkiełek w słoikach Coplin lub przemieszczania się między nimi należy uważać, aby nie umieścić dwóch szkiełek w tej samej pozycji w słoiku. Spowoduje to niewystarczające naświetlenie powierzchni tkan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS i University of Texas at Austin Mass Spectrometry Imaging Facility są wspierane przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas Award (RP240559). Badania te zostały częściowo sfinansowane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Sie Foundation i Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Badania te przeprowadzono we współpracy z Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, który jest częściowo wspierany przez National Institutes of Health poprzez M. D. Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 oraz Jared Burks's NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-diaminonaftalenFisher NaukowyD010125GMacierz MALDI do obrazowania metabolitów
AcetonitryluFisher NaukowyA955-4Rozpuszczalnik klasy LC-MS stosowany do przygotowania matrycy
Kwas &alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowySigma-Aldrich70990-1G-FMacierz MALDI do obrazowania glikanów i peptydów
Wodorowęglan amonuFisher NaukowyA643-500Bufor dla enzymów
Fosforan amonuSigma-Aldrich467782-50GDodatek redukujący skupiska matryc podczas obrazowania
Komora demaskatorska NxGenBiocare MedycznyN/ASłuży do pobierania antygenu z tkanki
EtanolFisher Naukowy04-355-223Rozpuszczalnik klasy LC-MS stosowany do przygotowania i barwienia matrycy
Zrobotyzowany opryskiwacz odczynników M5Obrazowanie HTXN/ASłuży do nakładania enzymów i matryc na tkanki
MetanolFisher NaukowyA456-4Rozpuszczalnik klasy LC-MS do wytwarzania czerwonej zawiesiny fosforu
Trypsyna klasy MSFisher NaukowyPI90058Enzym do trawienia białek
Adapter suwakowy MTP IIDaltoniki Bruker8235380Adapter do wkładania szkiełek mikrofonowych do spektrometru masowego
Cyfrowy skaner slajdów NanoZoomer SQKorporacja HamamatsuN/ASłuży do generowania cyfrowych obrazów mikroskopowych barwionej tkanki
Skaner płaski Perfection V600Firmy EpsonN/ASłuży do generowania obrazu optycznego szkiełka do zbierania danych MSI
Pieczęć PetriegoFisher Naukowy50-212-518Do uszczelniania szalki Petriego podczas trawienia enzymatycznego
Format PNGaseFŻyciorys buldogaNZPP550LYEnzym do rozszczepiania glikanów sprzężonych z N z białek
Czerwony fosforSigma-AldrichNumer katalogowy: 04004-250GKaliber MALDI zarówno dla trybu jonów dodatnich, jak i ujemnych
Laboratorium SCiLS (2025b)Daltoniki BrukerN/AOprogramowanie do wizualizacji danych MSI
Spektrometr masowy timsTOF fleX QTOFDaltoniki BrukerN/ASłuży do zbierania danych ze spektrometrii mas
Kwas trifluorooctowyFisher Naukowy85183Dodatek matrycowy do obniżania pH do obrazowania w trybie jonów dodatnich
Baza TrisFisher NaukowyZobacz materiał BP152-500Bufor do pobierania antygenu
WodaFisher NaukowyZobacz materiał W64Rozpuszczalnik klasy LC-MS stosowany do matryc, enzymów i barwienia
WypAll X60Fisher Naukowy19-413-113Chusteczka chłonna do inkubacji nawilżonych enzymów
KsylenFisher NaukowyX3P-1GALŚrodek czyszczący do barwienia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Dehoog, R. J., et al. Preoperative metabolic classification of thyroid nodules using mass spectrometry imaging of fine-needle aspiration biopsies. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21401-21408 (2019).
  3. Eberlin, L. S., et al. Pancreatic cancer surgical resection margins: Molecular assessment by mass spectrometry imaging. PLoS Med. 13 (8), e1002108(2016).
  4. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by UV-MALDI and IR-MALDESI mass spectrometry imaging coupled to FT-ICR-MS. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  5. Fletcher, J. S., Vickerman, J. C., Winograd, N. Label free biochemical 2D and 3D imaging using secondary ion mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 733-740 (2011).
  6. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  7. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  8. Ščupáková, K., et al. Spatial systems lipidomics reveals nonalcoholic fatty liver disease heterogeneity. Anal Chem. 90 (8), 5130-5138 (2018).
  9. Goncalves, J. P. L., et al. MALDI-MSI: A powerful approach to understand primary pancreatic ductal adenocarcinoma and metastases. Molecules. 27 (15), 4811(2022).
  10. Janssen, C., et al. Robust subtyping of non-small cell lung cancer whole sections through MALDI mass spectrometry imaging. Proteomics Clin Appl. 16 (4), e2100068(2022).
  11. Oezdemir, R. F., et al. Proteomic tissue profiling for the improvement of grading of noninvasive papillary urothelial neoplasia. Clin Biochem. 45 (1-2), 7-11 (2012).
  12. Bauer, J. A., et al. Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation. Clin Cancer Res. 16 (2), 681-690 (2010).
  13. Lazova, R., et al. Histopathology-guided mass spectrometry differentiates benign nevi from malignant melanoma. J Cutan Pathol. 47 (3), 226-240 (2020).
  14. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J Proteome Res. 9 (5), 2182-2190 (2010).
  15. Yagnik, G., Liu, Z., Rothschild, K. J., Lim, M. J. Highly multiplexed immunohistochemical MALDI-MS imaging of biomarkers in tissues. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 977-988 (2021).
  16. Clift, C. L., Drake, R. R., Mehta, A., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of the extracellular matrix using serial enzyme digests from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Anal Bioanal Chem. 413 (10), 2709-2719 (2021).
  17. Escobar, E. E., Seeley, E. H., Serrano-Negron, J. E., Vocadlo, D. J., Brodbelt, J. S. In situ imaging of O-linked beta-N-acetylglucosamine using on-tissue hydrolysis and MALDI mass spectrometry. Cancers (Basel). 15 (4), 1224(2023).
  18. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3d targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers. 16 (5), 846(2024).
  19. Wall, M. J., Crowell, A. M. J., Simms, G. A., Liu, F., Doucette, A. A. Implications of partial tryptic digestion in organic-aqueous solvent systems for bottom-up proteome analysis. Analytica Chimica Acta. 703 (2), 194-203 (2011).
  20. Goncalves, J. P. L., Bollwein, C., Schwamborn, K. Mass spectrometry imaging spatial tissue analysis toward personalized medicine. Life (Basel). 12 (7), 1037(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ImagingFormalin Fixed SamplesParaffin Embedded TissueSequential Biomolecule DetectionSpatial OmicsMetabolite ImagingGlycan ImagingTryptic Peptide ImagingTissue Section AnalysisMolecular Interactions

Related Articles