W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania spektrometrii mas do sekwencyjnego wykrywania metabolitów, glikanów sprzężonych z N i peptydów tryptycznych w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania spektrometrii mas do sekwencyjnego wykrywania metabolitów, glikanów sprzężonych z N i peptydów tryptycznych w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.
Tkanki to złożone środowiska komórkowe, składające się z szerokiej gamy typów komórek i biomolekuł, z których wszystkie oddziałują ze sobą w celu wykonywania funkcji narządu. Tradycyjnie, techniki analizy biomolekuł, takich jak metabolity, glikany i białka, polegały na homogenizacji tkanki, niszcząc wszystkie informacje przestrzenne. Te tradycyjne metody utrudniały pełne zrozumienie złożonych wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych interakcji molekularnych. Z drugiej strony obrazowanie spektrometrią mas (MSI) nie tylko zachowuje informacje przestrzenne biomolekuł w tkance, ale także umożliwia wykrywanie wielu klas analitów z tego samego wycinka tkanki poprzez sekwencyjną analizę w rozdzielczości zbliżonej do pojedynczej komórki. Dzięki temu możemy uzyskać pełniejszy obraz interakcji molekularnych w różnych klasach biomolekuł. Przedstawiony tutaj protokół przedstawia etapy wykonywania obrazowania spektrometrią mas metabolitów, glikanów sprzężonych z N i peptydów tryptycznych sekwencyjnie z tego samego wycinka tkanki z rozdzielczością 20 μm. Sumienne rozważenie kolejności, w jakiej klasy analitów są obrazowane, wraz z ostrożnym obchodzeniem się z sekcjami w celu zapewnienia integralności, pozwala na zebranie wielu wysokiej jakości obrazów z tej samej sekcji. Dane te można następnie zintegrować z innymi przestrzennymi danymi omicznymi (transkryptomika, immunohistochemia itp.) zebranymi z odcinków szeregowych, gdzie ta sama komórka może być analizowana w tych sąsiednich sekcjach.
Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężna technika, która pozwala na wykrywanie i wizualizację setek do tysięcy biomolekuł z cienkich skrawków tkanek, bez konieczności posiadania a priori wiedzy na temat dokładnych cząsteczek obecnych w tkance, co czyni ją doskonałym narzędziem do odkrywania biomarkerów1. Podczas gdy kilka rodzajów MSI jest używanych przez różne laboratoria, w tym desorpcja jonizacji elektrorozpylającej (DESI)2,3, jonizacja elektrorozpylania wspomagana matrycą laserową w podczerwieni (IR-MALDESI)4 i spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół ten wykorzystuje tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie pobrane od wcześniej nieleczonych pacjentek poddawanych pierwotnej operacji cytoredukcyjnej z powodu surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości. Wszystkie dane kliniczne uzyskano z repozytorium raka jajnika na Wydziale Ginekologii Onkologicznej i Medycyny Rozrodu zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Review Board Uniwersytetu Teksańskiego MD Anderson. Pisemna świadoma zgoda pacjentów została uzyskana przez personel recepcji, a badania zostały przeprowadzone zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi.
1. Przygotowanie próbki....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ukończenie tego protokołu powinno zaowocować trzema solidnymi zestawami danych MSI z tego samego odcinka tkanki. W wizualizacji pełnego spektrum danych metabolitowych, widmo będzie silnie zdominowane przez piki matrycowe na m/z 157 i 315. Jest to normalne w przypadku tkanki FFPE. Wiele sygnałów metabolitów i kwasów tłuszczowych będzie obserwowanych poprzez przybliżenie zakresów m/z <155 i od 250 do 300. Rysunek 3 przedstawia przykłady pełnego spektrum i powiększonych zakresów, podkreślają.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zbieranie sekwencyjnych danych MSI z pojedynczego odcinka tkanki wymaga szczególnej dbałości o szczegóły. Jest kilka kroków, które są absolutnie niezbędne do uzyskania wysokiej jakości danych. Po pierwsze, należy zachować ostrożność, jeśli w tym samym czasie przygotowywany jest więcej niż jeden szkiełko. Podczas umieszczania szkiełek w słoikach Coplin lub przemieszczania się między nimi należy uważać, aby nie umieścić dwóch szkiełek w tej samej pozycji w słoiku. Spowoduje to niewystarczające naświetlenie powierzchni tkan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
EHS i University of Texas at Austin Mass Spectrometry Imaging Facility są wspierane przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas Award (RP240559). Badania te zostały częściowo sfinansowane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Sie Foundation i Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Badania te przeprowadzono we współpracy z Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, który jest częściowo wspierany przez National Institutes of Health poprzez M. D. Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 oraz Jared Burks's NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5-diaminonaftalen | Fisher Naukowy | D010125G | Macierz MALDI do obrazowania metabolitów |
| Acetonitrylu | Fisher Naukowy | A955-4 | Rozpuszczalnik klasy LC-MS stosowany do przygotowania matrycy |
| Kwas &alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy | Sigma-Aldrich | 70990-1G-F | Macierz MALDI do obrazowania glikanów i peptydów |
| Wodorowęglan amonu | Fisher Naukowy | A643-500 | Bufor dla enzymów |
| Fosforan amonu | Sigma-Aldrich | 467782-50G | Dodatek redukujący skupiska matryc podczas obrazowania |
| Komora demaskatorska NxGen | Biocare Medyczny | N/A | Służy do pobierania antygenu z tkanki |
| Etanol | Fisher Naukowy | 04-355-223 | Rozpuszczalnik klasy LC-MS stosowany do przygotowania i barwienia matrycy |
| Zrobotyzowany opryskiwacz odczynników M5 | Obrazowanie HTX | N/A | Służy do nakładania enzymów i matryc na tkanki |
| Metanol | Fisher Naukowy | A456-4 | Rozpuszczalnik klasy LC-MS do wytwarzania czerwonej zawiesiny fosforu |
| Trypsyna klasy MS | Fisher Naukowy | PI90058 | Enzym do trawienia białek |
| Adapter suwakowy MTP II | Daltoniki Bruker | 8235380 | Adapter do wkładania szkiełek mikrofonowych do spektrometru masowego |
| Cyfrowy skaner slajdów NanoZoomer SQ | Korporacja Hamamatsu | N/A | Służy do generowania cyfrowych obrazów mikroskopowych barwionej tkanki |
| Skaner płaski Perfection V600 | Firmy Epson | N/A | Służy do generowania obrazu optycznego szkiełka do zbierania danych MSI |
| Pieczęć Petriego | Fisher Naukowy | 50-212-518 | Do uszczelniania szalki Petriego podczas trawienia enzymatycznego |
| Format PNGaseF | Życiorys buldoga | NZPP550LY | Enzym do rozszczepiania glikanów sprzężonych z N z białek |
| Czerwony fosfor | Sigma-Aldrich | Numer katalogowy: 04004-250G | Kaliber MALDI zarówno dla trybu jonów dodatnich, jak i ujemnych |
| Laboratorium SCiLS (2025b) | Daltoniki Bruker | N/A | Oprogramowanie do wizualizacji danych MSI |
| Spektrometr masowy timsTOF fleX QTOF | Daltoniki Bruker | N/A | Służy do zbierania danych ze spektrometrii mas |
| Kwas trifluorooctowy | Fisher Naukowy | 85183 | Dodatek matrycowy do obniżania pH do obrazowania w trybie jonów dodatnich |
| Baza Tris | Fisher Naukowy | Zobacz materiał BP152-500 | Bufor do pobierania antygenu |
| Woda | Fisher Naukowy | Zobacz materiał W64 | Rozpuszczalnik klasy LC-MS stosowany do matryc, enzymów i barwienia |
| WypAll X60 | Fisher Naukowy | 19-413-113 | Chusteczka chłonna do inkubacji nawilżonych enzymów |
| Ksylen | Fisher Naukowy | X3P-1GAL | Środek czyszczący do barwienia |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.