Method Article

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

DOI:

10.3791/68619

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzenny skład komórek wewnątrz gospodarza, a także bakterie lub ładunki wirusowe w tkance, mogą wpływać na interakcje typów komórek i analitów, które napędzają komórkę przez procesy specyficzne dla typu. Stereo-seq dla tkanek FFPE wykorzystuje losowe primowanie kodów przestrzennych, co różni się od standardowych metod transkryptomiki przestrzennej, które wykorzystują A'tailing do przechwytywania mRNA posłannika (mRNA) lub opartego na sondach do przechwytywania transkryptów specyficznych dla gatunku. Metody te nie uwzględniają nowszej wiedzy o wpływie i znaczeniu innych typów RNA pochodzących z długiego niekodującego RNA, mitochondrialnego, mikroRNA lub innych gatunków RNA, takich jak mikroby, wirusowe i grzybowe. Poniżej przedstawiono krok po kroku procedurę od przecięcia tkanek aż po przygotowanie biblioteki do zastosowań stereo-seq niezależnych od gatunków przestrzennych z detekcją RNA, wykorzystującą metodologię sondy randomer, która jest kompatybilna z tkankami formalinowo osadzonymi w parafinie (FFPE). Ta metoda stereo-seq wykorzystuje losowy kulkę przechwytu o rozmiarze 0,22 μm, która pojawia się w tablicy co 0,5 μm, co pozwala na rozdzielczość subkomórkową dzięki technologii opartej na sekwencjonowania. Ponieważ metoda ta wykrywa zarówno RNA gospodarza, jak i nie-gospodarza, protokół wymaga specyficznych kwestii, aby określić, co znajduje się wewnątrz tkanki, a co zostało zdeponowane podczas pobierania, konserwacji, cięcia i wykrywania (czyli środowiskowe i obsługa zanieczyszczeń). Na koniec, protokół ten pozwala uzyskać wysoką (pojedynczą) rozdzielczość gatunków wielokomórkowych w kontekście przestrzennym, dostarczając wglądu w dokładność i inter-aaktom typów komórek oraz gatunków patologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie przestrzennej omiki zrewolucjonizowały badania heterogeniczności komórek tkanek, umożliwiając jednoczesną ilościową identyfikację wielu celów: DNA (genomika), RNA (transkryptomika), metabolitów (metabolomika) lub białek (proteomika)1. Rozdzielczość tych różnych testów często się różni, co daje różne ograniczenia przy pomiarze analitów, zarówno przy większej rzadkości przy pomiarze pojedynczej komórki 2,3, jak i natywnego kontekstuprzestrzennego 4. Natomiast metody masowe, takie jak sekwencjonowanie RNA, zapewniają jedynie średnią ekspresję genów w całych próbkach i zaciemniają heterogeniczność komórkową2, lub sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq)2,3, które wymaga dysocjacji tkanek do sekwencjonowania pojedynczych komórek, często wymaga filtrowania. Dlatego metody te wykluczają duże komórki i agregaty, podczas gdy metody bioinformatyczne próbują usuwać fragmenty i dublety, które wywołują błędy 5,6,7. Transkryptomika przestrzenna zachowuje architekturę tkanek, dostarczając kluczowych informacji na temat organizacji i interakcji komórkowych. Większość metod sekwencjonowania przestrzennego nieukierunkowanego nie posiada rozdzielczości pojedynczych komórek, co wymaga dekonwolucji obszarów przechwytywania przestrzennego zawierających od 10 do 100 komórek 8,9,10. Jednak w ostatniej dekadzie transkryptomika przestrzenna wyprzedziła potrzeby tych metod, ponieważ nastąpiły postępy w rozdzielczości, większych obszarach rejestracji oraz integracji podejść multiomicznych, zarówno przy użyciu strategii eksperymentalnej, jak i nowych technik 1,11,12.

Sekwencjonowanie omiksów o zwiększonej rozdzielczości przestrzennej (Stereo-seq) zapewnia rozdzielczość w skali nanoskali (500 nm) oraz obszar przechwytu w skali centymetra, a całkowite transkryptomie niezależne od gatunku umożliwia przechwytywanie kodowania, niekodującego i nie-gospodarza RNA13. Ta metoda ma obecnie najwyższą rozdzielczość dla transkryptomiki przestrzennej i oferuje opcje zapewniające największe pola widzenia. Jednak ta metoda ma pewne istotne ograniczenia, w tym wymagania czasowe i robocizne wynoszące około 15 godzin praktycznego czasu, obejmujące 4 dni na ukończenie bibliotek gotowych do sekwencjonowania. Dla porównania, inne technologie transkryptomiki przestrzennej oparte na sekwencjonowaniu, takie jak transkryptomika przestrzenna oparta na sondzie, transkryptomika przestrzenna oparta na tablicy wieloA-capture, Slide-seq oraz deterministyczne kodowanie kreskowe w tkankach dla sekwencjonowania przestrzennej omiki (DBiT-seq), zazwyczaj wymagają od 5 do 8 godzin praktycznego czasu przez 2 do 3 dni (Tabela 1). Dla wielu badaczy te postępy przewyższają wyzwania techniczne i są idealne do tworzenia pełnych atlasów transkryptomicznych przestrzennych do badania postępu choroby na poziomie komórkowym i subkomórkowym, szczególnie jeśli są połączone z innymi technologiami1.

Protokół Stereo-seq ma możliwości wykraczające poza tradycyjną transkryptomikę mRNA, która opiera się na sondach poli-T do wychwytywania polyadenylowanych transkrypcji mRNA. Metody te można modyfikować, dodając poliadenylację do świeżych tkanek14 lub sondy specyficzne dla gatunku dla docelowych zestawów genów15 do analizy ekspresji przestrzennej. Zamiast tego Stereo-seq wykorzystuje losowe sondy nukleotydowe do wyboru różnorodnych RNA niezależnie od gatunku, w tym RNA mikrobiologicznego, grzybowego, wirusowego oraz niepoliadenylowanego RNA, takiego jak enhancer RNA, okrągły RNA oraz długie niekodujące RNA (lncRNA)16. Teoretycznie możliwe jest wychwycenie mniejszych RNA lub elementów reparacyjnych, takich jak małe interferujące RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) oraz transpozony17. Obecnie jednak bioinformatyka i mapowanie tych RNA pozostają wyzwaniem i często są filtrowane podczas początkowego wyrównania, które zazwyczaj stosuje się 30 bp cutoff.

Przedstawiono szczegółowy protokół, z naszymi modyfikacjami dotyczącymi losowego wychwytywania nukleotydów na chipach DNA (DNB) przez producenta, aby zapewnić lepsze zrozumienie i obsługę protokołu Stereo-seq, przedstawionego na Rysunku 1. Protokół ten obejmuje strategie dla biologów molekularnych testujących nowe tkanki FFPE na Stereo-seq z losowym wychwytywaniem nukleotydów, aby uzyskać bardziej spójne, wyższe wyniki z niższej jakości zarchiwizowanych próbek i tkanek tłuszczowych. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem próbek FFPE z większości narządów, niezależnie od gatunku pochodzenia. Jednak protokół ten nie obejmuje obecnych modyfikacji potrzebnych do obsługi trudnych tkanek, takich jak szpik kostny, które wymagają odwapnienia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule metodycznym nie podano danych klinicznych dla pacjentki z rakiem surowiczym, wysokiej klasy w wysokiej jakości. Jednak powiązane dane kliniczne zostały zebrane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB) na University of Texas MD Anderson Cancer Center, Katedrze Onkologii Ginekologicznej i Medycyny Rozrodu, od uczestników, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę.

UWAGA: Zaleca się noszenie maseczki chirurgicznej i rękawiczek przez cały okres trwania protokołu, aby zapobiec zakażeniu RNazą. Naukowcom z długimi włosami zaleca się związanie ich do tyłu lub nawet noszenie siatki na włosy. Zawsze używaj beznukleazowej wody (NFW) oraz rurek DNA/RNA bez nukleazy, o niskim wiążeniu, aby zmaksymalizować wydajność. Tkanki niessakowe, takie jak tkanki roślinne, mogą wymagać optymalizacji przylegania, z udziałem poli-L-lizyny (PLL) oraz wydłużonych czasów permeabilizacji ze względu na ściany komórkowe. Chociaż wychwytywanie molekularne pozostaje teoretycznie możliwe, potrzebna jest walidacja eksperymentalna, ponieważ tkanki roślinne pozostają nieprzetestowane w naszym obecnym procesie.

1. Ocena jakości RNA i wartości dystrybucji fragmentów RNA 200

  1. Ocena jakości RNA za pomocą wartości rozkładu fragmentów RNA 200 (DV200), która mierzy procent RNA powyżej 200 bp.
  2. Wykorzystaj dwa przekroje 10 μm z tego samego bloku tkankowego, przeznaczone do przetwarzania stereo-seq.
    UWAGA: Optymalne jest natychmiastowe przetwarzanie, ale próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia, w -20 °C przez 4 tygodnie lub w -80 °C przez 6 miesięcy.
  3. Ekstrakcja RNA za pomocą protokołu ekstrakcji RNA bez rozmiaru, opisanego przez Patela i in.18 , aby umożliwić dokładną ocenę rozkładu rozmiarów fragmentów RNA.
  4. Oceń jakość RNA za pomocą jednego z poniższych parametrów, używając analizatora fragmentów, aby określić wynik DV200, czyli procent powierzchni pod krzywą, który reprezentuje fragmenty RNA dłuższe niż 200 bp. Idealnie tkanka powinna mieć wynik DV200 (> 50%) i stężenie (> 10 ng/μL).

2. Sprzątanie przestrzeni roboczej

  1. Czyść wszystkie powierzchnie 30% wybielaczem. Pozwól powierzchniom wyschnąć przez co najmniej 30 minut, aby zapobiec powstawaniu chloroformu w połączeniu wybielacza i etanolu.
  2. Przetrzyj powierzchnie chusteczkami do dekontaminacji DNA (DDW). Spryskaj wszystkie powierzchnie roztworem dekontaminacyjnym RNazy (RDS), a następnie 70% etanolem przygotowanym w NFW.
    UWAGA: Nigdy nie mieszaj wybielacza ani żadnego innego alkoholu. Ta kombinacja wywołała chloroform, który jest wysoce toksyczny i może powodować utratę przytomności, uszkodzenia narządów lub śmierć nawet przy niskim narażeniu.

3. Przygotowanie losowego chipa oligonukleotydowego (N-chip) w stereo-seq

  1. Oczyść przestrzeń roboczą zgodnie z krokami 2.1 i 2.2, w tym wszystkie systemy używane w tym kroku.
  2. Wyjmij chip N-chip Stereo-seq z opakowania, zapisz ID układu i wyczyść krawędzie N-chipa Stereo-seq oraz szkła za pomocą 100% etanolu, nie dotykając chipa. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
  3. Aplikacja żywicy do mocowania układu do zamka (opcjonalne dla użytkowników Xylenes).
    UWAGA: Chociaż środki czyszczące niebędące ksylenem są często zalecane przez komercyjnych dostawców, zaobserwowano, że środki czyszczące bez ksylenu mogą być mniej skuteczne w zależności od mieszaniny parafiny. Często nie są kompatybilne z niektórymi tworzywami sztucznymi, syntetycznymi żywicami czy tkankami osadzonymi w wosku pszczelim, a także nie usuwają silnie sieciowanych lub wysokotemperaturowych parafin. Jeśli nie jest pewien składu parafiny użytej do osadzenia próbki, zaleca się użycie ksylenów do optymalnego oczyszczania. Ponadto ksyleny lepiej oczyszczają tkanki tłuszczowe, takie jak pierś, jajnik, komórka jajowa czy mózg.
    1. Dobrze wstrząśnij lub wymieszaj żywicę, aby uzyskać jednorodną biel. Za pomocą mikropipety ostrożnie nałóż 10 μL utwardzalnej żywicy ceramicznej wokół krawędzi chipa N-chip Stereo-seq (Rysunek 2A).
      UWAGA: Żywica może powodować podrażnienia skóry i oczu oraz prowadzić do reakcji alergicznych przy powtarzającej się ekspozycji. Podczas pipetowania lub obsługi tej żywicy zawsze noś rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Pracuj w dobrze wentylowanym miejscu i zakładaj maskę przy używaniu dużych ilości lub przy rozgrzewaniu oraz unikaj bezpośredniego kontaktu ze skórą lub oczami.
    2. Użyj szczelnie zamkniętego wymazu piankowego, usuń nadmiar żywicy, zostawiając tylko cienką linię wokół krawędzi wyprysku. Włóż szkiełkę do urządzenia do utwardzania UV, uważając, by nie dotykać powierzchni chipu.
    3. Umieść nałożony na żywicę odprysk na nieprzezroczystą maskę na 405 nm świetle UV, aby rozświetlić tył szkiełka i utwardzić przez 5 minut. Ilustruje to Rysunek 2B.
      UWAGA: Nie prześwietlaj układu Stereo-seq N-chip na światło UV i nie dotykaj żywicy na powierzchni chipa, ponieważ może to negatywnie wpływać na nanokulki.
    4. Po utwardzeniu użyj szczelnie zamkniętych wymazów z pianki nasączonych w następujących składnikach: etanol o jakości 100% molekularnej; 70% etanolu; i na koniec NFW, by wyczyścić krawędź, gdzie umieszczono żywicę. Jeśli znikną białe plamki, wyczyść krawędź ponownie. Nigdy nie dotykaj powierzchni układu scalonego (rysunek 2C).
    5. Pozwól zjeżdżalce całkowicie wyschnąć na powietrzu. Po inspekcji przechowuj chipsy na noc w 4 °C z środkiem osuszającym, jeśli to konieczne. Zaleca się jednak natychmiastowe kontynuowanie przygotowania chipów i sekcjonowania, jeśli to możliwe.
      UWAGA: Zawsze nosz odpowiedni sprzęt ochronny, w tym okulary ochronne UV, podczas pracy ze światłem UV. Obchodz się z etanolem i żywicą w dobrze wentylowanym miejscu, najlepiej w okapie spalanym. Utylizacja odpadów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  4. Przygotowanie chipów z poli-L-lizyną (opcjonalne dla tkanek tłuszczowych lub tkanek z problemami z przyczepnością).
    1. Oczyść przestrzeń roboczą zgodnie z krokami 2.1 i 2.2, w tym wszystkie systemy używane w tym kroku.
      UWAGA: Nie spryskuj chemikaliów bezpośrednio do maszyny PCR. We wszystkich etapach przed PCR pracuj w okapu PCR, jeśli to możliwe, aby zapobiec skażeniu, w tym wcześniejszemu amplifikacji cDNA.
    2. Zanurz chip trzy razy w świeżym NFW, używając stożkowej rurki o pojemności 50 mL.
    3. Susz chip za pomocą sprężonego powietrza, używając pełnej siły sprężonego powietrza pod kątem około 60° do 80°, przemierzając powierzchnię chipu z odległości około 5 cm od powierzchni chipu (Rysunek 2E). Jeśli powierzchnia wydaje się mętna, powtórz mycie z świeżym NFW i wysusz ponownie (powierzchnia mętna zwykle oznacza, że ceramika nie została wystarczająco umyta lub utwardzona w poprzednich etapach).
    4. Nałóż 150 μL roztworu PLL, aby pokryć całą powierzchnię układu. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22 °C do 25 °C). Jest to zilustrowane na Rysunku 2D.
    5. Usuń roztwór PLL i przemyj chip dwukrotnie wodą wolną od nukleazy przez 10-15 sekund.
    6. Po drugim myciu ostrożnie wysusz krawędzie zamka (bez dotykania odprysku).
    7. Mocno wysusz chip za pomocą sprężonego powietrza, używając pełnej siły sprężonego powietrza pod kątem około 60° do 45°, przesuwając się po przekątnej przez powierzchnię chipu z odległości około 5 cm od powierzchni (Rysunek 2E).
      UWAGA: Złapanie musi być całkowicie suche w ciągu 30 sekund lub mniej. Jeśli zajmie to więcej czasu, DNB zostanie zakłócone, co spowoduje artefakty podczas przechwytywania.
    8. Przystąpi do montażu w ciągu 1 godziny i utrzymuj wiór suchy.
      UWAGA: Jeśli powierzchnia wyprysku po wyschnięciu jest mętna, umyj świeżym NFW i powtórz proces suszenia. Jeśli po wyschnięciu na powierzchni odcinka pojawią się artefakty, może to powodować problemy z przechwytywaniem w tych miejscach. Unikaj używania PLL do przylegania, jeśli tkanka tego nie wymaga. Dotknięcie chipa może powodować rysy i utratę obszarów przechwytywania przed uwolnieniem cDNA lub nierówne przechwytywanie po uwolnieniu. Żywica na powierzchni układu powoduje utratę obszarów przechwytu. Umieszczenie chipu zbyt blisko dyszy sprężonego powietrza może powodować powstawanie kryształów i rozprysku uszkodzonych śladów DBN na powierzchni układu; Jednak jest to rzadkie i zwykle występuje tylko wtedy, gdy dysza niemal dotyka chipu, a butla ze sprężonym powietrzem jest zbyt zimna. Zaleca się ćwiczenie tej procedury kilkukrotnie z użyciem chipów oceniających, ponieważ jest to technicznie wymagający krok.

4. Sekcjonowanie i montaż tkanek

  1. Upewnij się, że miejsce pracy jest czyste, zgodnie z krokami 2.1 i 2.2. Upewnij się, że nowe ostrza i NFW są używane do wszystkich kąpieli wodnych i lodu podczas sekcjonowania i montażu tkanek. Nie dotykaj bezpośrednio odprysku i pokrywaj tylko 80% odprysku chusteczką.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie grubości 5 μm dla tkanek standardowych lub 4 μm dla tkanek wysokotłuszczowych. Użyj wstęgi sekcji seryjnych, aby dopasować modalności między próbkami, jeśli to możliwe.
  2. Susz w temperaturze 42 °C przez 3 godziny, albo w piekarniku, albo na maszynie PCR z otwartą pokrywką. Następnie przenieś preparaty lub zmień temperaturę w piekarniku lub PCR do 37 °C i piecz przez noc przez 12-48 godzin. Zaleca się stosowanie około 18 godzin.
  3. Opcjonalny punkt zatrzymania: Po wyschnięciu zamknąć zamki w aluminiowych workach z środkiem osuszającym w temperaturze 4 °C na maksymalnie tydzień przed kontynuacją.
    UWAGA: Dłuższy czas schnięcia może obniżyć integralność RNA. Zbyt krótkie suszenie powoduje mniejszą przyczepność tkanek do szkiełka. Wypiekanie w wyższej temperaturze może obniżyć integralność RNA. Slajdy mogą być przesyłane do przetwarzania zewnętrznego (np. analizy hosta). Jednak transport nie jest zalecany do analizy mikrobiomu ze względu na zwiększone ryzyko skażenia podczas transportu.

5. Deparaffinize slajdów

  1. Upewnij się, że miejsce pracy jest czyste, zgodnie z krokami 2.1 i 2.2.
  2. Przygotuj odczynniki do deparafinizacji i protokołu stereo-seq.
    1. Wymagane odczynniki są dostępne z zaniesienia: dwa 30 mL ksylenów w stożkowych tubkach 50 mL, dwa 30 mL 100% etanolu w stożkowych tubach 50 mL.
    2. Przygotuj następujące rozcieńczone odczynniki z NFW: 96% etanolu na chip (wymagane 2 stożkowe lub 1mL), 90% etanolu na chip, 80% etanolu na chip, 70% etanolu na chip, 50% etanolu na chip, 30% etanolu na chip, 2,5 mL 5x cytrynianu soli i sodu (SSC) z 20x roztworu, 5 mL 0,01N HCl (rozcieńczony 0,1N HCl z NFW do pH 2). Do rozcieńczeń etanolowych przygotuj jeden roztwór 30 mL w stożkowych rurkach 50 mL lub roztwór 500 μL w probówce 1,5 mL, jeśli używasz silikonowych uszczelek.
    3. Przygotuj następujące roztwory i trzymaj je na lodzie: i) 32,5 mL 0,1x SSC z 5x roztworu (trzymaj 30 mL roztworu w stożkowej probówce, a pozostałe 2,5 mL włóż do probówki 5 mL na przyszłość), ii) 400 μL 0,1x SSC z 5% RI, trzymaj na lodzie.
    4. Przygotuj następujące rozcieńczone odczynniki zawierające 0,1 N HCl.
      1. Przygotuj 10x roztwór permeabilizacyjnego (PR), dodając 1 ml 0,1 N HCl do komercyjnie dostarczanego liofilizowanego odczynnika.
        UWAGA: Trzymaj w lodzie tylko przez 1 godzinę, pamiętaj, aby użyć aliquotów na przyszłość i zamrożenie w temperaturze -20 °C.
      2. Przygotuj 500 μL roztworu PR 1x (rozcieńcz roztwór 10x PR aliquot z 0,01 N HCl, trzymaj na lodzie do 6 godzin).
        UWAGA: Kluczowe jest, aby pH 0,01 N HCl mieściło się w granicach 10% pH 2,0, ponieważ enzymy na bazie pepsyny działają optymalnie przy pH 2.
  3. Deparaffinize zamki moczy je w Xylenes (zalecane) przez 2 rundy po 20 minut każda.
  4. Natychmiast nawilż próbkę etanolem (100%, 96%, przez 2 rundy, po 5 minut każda, następnie 90%, 70%, 50% i 30% przez 1 rundę, 2 minuty). Na koniec nawadnij się NFW przez 1 minutę. Do rozcieńczeń etanolu używaj 30 mL roztworu w stożkowej probówce o pojemności 50 mL dla każdego preparatu, jeśli przygotowujesz próbki do badań mikrobiomu, lub 30 mL na każde dwa preparaty przy przygotowywaniu próbek niebędących mikrobiomem. Dla wszystkich kolejnych rozcieńczeń przygotuj 30 mL roztworu w stożkowej rurce o pojemności 50 mL lub, jeśli używasz silikonowych uszczelek, użyj 500 μL roztworu na 1 cm2 chip, aby całkowicie pokryć powierzchnię chipu.
    OPCJONALNIE: Zaleca się umieszczenie silikonowej komory z 3-komorowego suwaka do wyjmowania wokół chipu, aby uzyskać uszczelnienie po etapie 100% etanolu, jak pokazano na rysunku 2F-H. Pozwala to na użycie mniejszych ilości odczynników i zmniejsza ryzyko uszkodzenia układu. Alternatywnie, do pełnego zanurzenia Stereo-seq Suwa przez cały zabieg można użyć rurek stożkowych o pojemności 50 mL.

6. (Opcjonalnie) Obrazowanie jądrowe i barwienie ssDNA

UWAGA: Pozwól, aby odczynnik odłączający FFPE osiągnął temperaturę pokojową (~25 °C) przed użyciem w 6.1. Możliwe są inne roztwory barwienia, ale fluorescencyjne barwienie jądrowe jest obecnie wymagane do segmentacji pojedynczych komórek i binowania danych transkryptomicznych.

  1. Barwienie fluorescencyjne za pomocą barwnika DNA jednoniciowego (ssDNA)
    1. Przygotuj 2 μL roztworu barwienia ssDNA w buforze SSC, rozcieńczając odczynnik Qubit ssDNA buforem 5x SSC w rozcieńczeniu 1:1 na 1 do 2 chipów.
      UWAGA: Rozcieńczenie ssDNA może się zmieniać w zależności od mikroskopu używanego podczas obrazowania. Dlatego nowe mikroskopy powinny być testowane z zestawem rozcieńczeń barwników ssDNA przy użyciu chipa oceniającego i tkanki testowej, aby określić najlepszy zakres dynamiczny.
    2. Stwórz mieszankę główną roztworu barwiącego (200 μL na chip) przy użyciu rozcieńczenia 1:20 inhibitora RNazy (RI), rozcieńczenia ssDNA w stosunku 1:200 oraz pozostałych 5x SSC.
    3. Dodaj roztwór barwiący (150 μL na chip) i inkubuj w ciemności przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie usuń roztwór barwiący z rogu odprysku pipetą.
      UWAGA: Jeśli używasz wyjmowanej komory silikonowej, usuń ją przed zabarwieniem chipu mieszanką barwnika ssDNA.
    4. Myj chip dwukrotnie 0,1x SSC (150 μL na chip za każdym razem) przez 10-15 sekund. Po drugim myciu ostrożnie wysusz krawędzie slajdu papierem do obiektywu (bez dotykania odprysku).
    5. Dodaj ~3-5 μL glicerolu (mniej zużywaj do mikroskopu odwróconego), aby zamontować koniczynę (uważaj na pęcherzyki).
      UWAGA: Upewnij się, że na powierzchnię szkiełka nałożono odpowiednią ilość glicerolu, zazwyczaj około 4 μL dla układu o wymiarach 1 cm2. Zbyt duża ilość glicerolu może spowodować przesunięcie pokrywy podczas trzymania zamka pionowo. Stosowanie zbyt małej ilości glicerolu zwiększa ryzyko uszkodzenia tkanek po usunięciu pokrywy i może wprowadzić pęcherzyki, co negatywnie wpływa na wyniki obrazowania i segmentacji pojedynczych komórek.
    6. Zrzuć pokrywkę z wysokości około 1 cm na chip. Jeśli używasz mikroskopu interweniowego, upewnij się, że pokrywa nie zsuwa się podczas trzymania pionowo. Jeśli to zrobi, ponownie zamontuje się bez dodawania kolejnego gliceru.
    7. Wykonanie fluorescencjowych obrazów tkanek barwionych ssDNA mikroskopem szerokopolowym z 10% nakładaniem się kafelków obrazowych.
      UWAGA: Zaleca się wykonanie ręcznej mapy ostrości 9-13 punktów mikroskopem szerokokątnym z użyciem obiektywu 10x. Można użyć mikroskopu konfokalnego, ale jest on znacznie bardziej czuły na zmiany ogniskowe w tkance i odłamku.
    8. Stitch w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów, takim jak ImageJ, wykorzystując teoretyczne nakładanie się do generowania przybliżonego położenia każdego kafelka, a następnie wykonywanie nakładania się pikseli w celu precyzyjnego dostrojenia mozaiki obrazów
    9. Przetwarzaj obrazy w oprogramowaniu StereoMap i upewnij się, że kontrola jakości obrazu przebiega przed kontynuacją.
    10. Zanurz szkieł Stereo-seq w 30 mL 0,1x SSC, aż slip się odłączy.

7. Proces odłączania

UWAGA: Unikaj dotykania lub przechylania chipu podczas tego etapu i delikatnie pipetuj.

  1. Upewnij się, że odczynnik FFPE do odłączania jest w ciepłej temperaturze pokojowej (~25 °C) i sprawdź, czy nie ma cząstek, które powodują mętność roztworu. Jeśli cząsteczki są widoczne, podgrzej do 55 °C i schłodzi do 30 °C przed użyciem.
  2. Włącz termocykler na następujących ustawieniach: 30 °C dla równowagi (podgrzewana pokrywa 85 °C); 95 °C podczas 30-minutowej inkubacji; 4 °C – nieskończony czas utrzymania.
  3. Złóż uszczelkę kasety, a następnie umieść suwak układu Stereo-seq do kasety.
  4. Dodaj odczynnik do odłączania FFPE (400 μL na układ) do wnętru kasety zawierającej układ. Przyklej taśmę uszczelniającą na kasetę i upewnij się, że jest szczelnie zamknięta.
  5. Rozpocznij 30-minutową inkubację w 95 °C od kroku 7,2. Po upływie 10 minut umieść 10 ml metanolu w pojemniku o pojemności 15 ml (potrzebne będzie około 1 ml na zlewkę) w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  6. Ostrożnie wyjmij chip z termocyklera, przełóż kasetę na stoł i zdejmij taśmę uszczelniającą.
  7. Usuń i wyrzuć odczynnik odłączający FFPE za pomocą pipety. Po usunięciu wszystkich odczynników do odłączania odłącza, odłącz i wyrzuć kasetę oraz uszczelkę.
  8. Wyrównaj suwak stereo-seq do temperatury pokojowej ~23 °C. Pod sterylnym kapturem wysusz krawędź zamka i nałóż nową komorę silikonową (jeśli dotyczy). Dodaj 500 μl schłodzonego metanolu z zamrażarki o temperaturze -20 °C, upewniając się, że cała sekcja jest całkowicie zanurzona przez 20 minut.
    UWAGA: Alternatywnie, cały slajd Stereo-seq można zanurzyć w stożkowej rurce o pojemności 50 mL wypełnionej 30 mL schłodzonego metanolu.
  9. Podgrzej 1x roztwór PR na suchym bloku o temperaturze 37 °C przez 10 minut przed użyciem, około 5 minut przed końcem utrwalania metanolu (krok 7.8).
  10. Po zakończeniu stabilizacji przenieś suwak do sterylnego okapu spalinowego. Zetrzyj nadmiar metanolu na szkiełku i poczekaj na odparowanie pozostałego metanolu na chipie (~5 min). Złóż nową kasetę i uszczelkę. Gdy metanol całkowicie wyparuje, umieść suwak chipu Stereo-seq do kasety.

8. Permeabilizacja i transkrypcja odwrotna

UWAGA: W krokach 8.1-8.11 pipetuj powoli i nie dotykaj chipa. Nadmierne ciśnienie powoduje dyfuzję lub ślady w DNB.

  1. Dodaj 200 μL odczynnika permeabilizacyjnego do układu. Przyklej taśmę uszczelniającą na kasetę Stereo-seq slide i upewnij się, że jest szczelnie zamknięta.
  2. Inkubuj w 37 °C przez 30 minut.
  3. Przygotuj bufor płukania, dodając 380 μL 0,1x SSC oraz 20 μL inhibitora RNA (inhibitor RNA) dla każdego preparatu. Zrób 400 μL na jedno szkiełko i trzymaj na lodzie do momentu użycia.
  4. Wyciągnij odczynniki do transkrypcji odwrotnej FFPE (FFPE RT), następnie skręcaj wszystkie poniższe i trzymaj mieszankę enzymów, oligometry i dimery na lodzie. Podgrzej bufor RT FFPE do temperatury pokojowej (~23 °C).
  5. 5 minut przed minus przed końcem permeabilizacji przygotować 200 μL na chip mieszanki FFPE RT. Dodaj bufor FFPE RT (158 μL), mieszankę enzymów FFPE RT (30 μL), oligo FFPE RT (10 μL) oraz dimer FFPE (2 μL). Wymieszaj delikatnie i trzymaj na lodzie.
  6. Utrzymując chip na termocyklerze, zmień temperaturę inkubacji na stan pokojowy (~23 °C). Usuń uszczelkę i delikatnie wyrzuć roztwór PR 1x.
  7. Delikatnie myj chip 200 μL 0,1x SSC (z 5% RI) na układ 1 cm2 .
  8. Usuń 0,1x mycia SSC (z 5% RI) z rogu chipa.
  9. Dodaj 200 μL roztworu FFPE RT do rogu układu.
  10. Przyklej taśmę uszczelniającą na kasetę Stereo-seq i upewnij się, że jest szczelnie zamknięta; w przeciwnym razie parowanie zmniejsza plon.
  11. Rozpocznij protokół inkubacji FFPE RT izotermicznej w 42 °C z podgrzewaną pokrywką 45 °C przez (5 do 24 godzin).
    UWAGA: Zaleca się inkubację przez 12 do 16 godzin i konsekwentność we wszystkich eksperymentach.

9. Uwalnianie i oczyszczanie cDNA

UWAGA: W krokach 9.6-9.7 pipetuj powoli i nie dotykaj chipa. Nadmierne ciśnienie powoduje dyfuzję lub ślady w DNB.

  1. Przygotuj 400 μL buforu uwalniającego cDNA, podgrzewając bufor uwalniający cDNA w temperaturze 55 °C, aby rozpuścić ewentualne wydzieliny, które mogły się utworzyć.
  2. Wyrównuj bufor uwalniający cDNA do ciepłej temperatury pokojowej (25 °C). Nie odkładaj na lód.
  3. Przed użyciem przekręć bufor uwalniający cDNA oraz enzym uwalniający cDNA w ilości 100 x g w wirówce stołowej.
  4. Przygotuj bufor cDNA, dodając 20 μL enzymu uwalniającego do 380 μL buforu uwalniającego cDNA.
  5. Utrzymując chip na termocyklerze, zmień temperaturę inkubacji na stan pokojowy (~23 °C). Usuń uszczelkę i delikatnie usuń oraz wyrzuć roztwór FFPE RT.
  6. Umyj chip raz, bardzo delikatnie, z 0,1x SSC na chip (200 μL).
  7. Usuń 0,1x SSC z rogu chipa, pipetując bardzo ostrożnie.
  8. Dodaj 400 μL przygotowanego roztworu uwalniającego cDNA do każdego chipa.
  9. Uszczelnij kasetę Stereo-seqs, przykładając taśmę uszczelniającą (lub osłonę PCR) na kasetę. Upewnij się, że kaseta jest szczelnie zamknięta, aby zapobiec parowaniu, wyciekom lub zanieczyszczeniom.
  10. Inkubuj w temperaturze 55 °C przez ≥ 5 godzin (minimum od 5 do 24 godzin) z pokrywką podgrzaną do 60 °C.
    UWAGA: Zaleca się inkubację przez 5 do 7 godzin lub spójność między eksperymentami po 2 godziny.

10. Zbieranie mieszanki uwalniającej cDNA

  1. Podgrzej NFW do 37 °C (co najmniej 500 μL na układ o pojemności 1 cm2).
  2. Usuń uszczelnienie i energicznie pipetuj każdy róg i środek odprysku na chusteczce, ale nie skrobaj ani nie dotykaj chusteczki. Zbierz całą mieszankę uwalniającą cDNA z chipa i przełóż do probówki wirówki o pojemności 1,5 lub 2,0 mL. Zapisz numery identyfikacyjne układu (chip ID) na każdej lampie.
  3. Dodaj 350 μL podgrzanego NFW bezpośrednio na powierzchnię układu. I ponownie energicznie pipetuj mniejszą pipetą (P100 lub P200), przechylając końcówkę, by wywierać większą siłę ścinającą, ale nie dotykaj tkanki ani nie skrobaj odprysku.
  4. Połącz wash z kroku 10,3 (350 μL) z mieszanką uwalniającą cDNA z etapu 10,2 (400 μL). Upewnij się, że łączysz tylko próbki z jednego chipa.
  5. Umieść 100 μL NFW na chipie, zamknij suwak chipu Stereo-seq w kasecie i przechowuj w lodówce do końca protokołu.
    UWAGA: W przypadku niskiej wydajności rozważ ponowne udostępnienie cDNA. Obecność DNA na chipie można ocenić za pomocą barwnika ssDNA i ponownego obrazowania z lub bez pokrywki.

11. Zbieranie sprzątania koralików cDNA

  1. Ponowne zawieszenie cDNA od kroku 10.4 przy użyciu równoważnej ilości kulek Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI). Mieszaj, aż kulki będą równomiernie rozmieszczone w roztworze, aby wybrać fragmenty DNA powyżej ~100 bp.
  2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze od 27 °C do 37 °C (zalecane 30°C).
    1. Podczas inkubacji. Przygotuj 5 ml 80% świeżego etanolu w NFW na każde 2 przetworzone chipy.
  3. Weź probówki z inkubowaną mieszanką kulek i krótko skręć w wirówce stołowej na 100 x g .
  4. Umieść rurki na magnetycznym stojaku separacyjnym i inkubuj przez co najmniej 5 minut (aż ciecz stanie się przezroczysta).
  5. Ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając kulek, i przechowuj go w czystej, oznaczonej tubce. Wydanie cDNA na etykiecie z identyfikatorem chipu i datą.
  6. Dodaj 1,5 mL etanolu 80% do rurek bez naruszania kulek i inkubuj przez 30 sekund przed usunięciem etanolu.
  7. Powtórz krok 11.6 jeszcze raz, tym razem usuwając jak najwięcej etanolu za pomocą małej końcówki pipety, nie naruszając kulek.
  8. Susz koraliki w tubach na powietrzu, aż przestaną być odbijające. Czas będzie się różnił, więc regularnie sprawdzaj, aby zapobiec przesuszeniu (pęknięciom), co skutkuje niską wydajnością.
    UWAGA: Zmierz wilgotność i temperaturę w pomieszczeniu. W wysokich temperaturach (27 °C) i niskiej wilgotności (poniżej 20%) koraliki bardzo szybko schną (3 do 5 minut). Przy niskich temperaturach (23 °C) i wysokiej wilgotności (ponad 40%) koraliki schną znacznie wolniej (7 do 15 minut).
  9. Wyjmij rurki kulkowe z regału magnetycznego, dodaj 22 μL NFW i mieszaj przez wirowanie.
  10. Inkubuj w suchej kąpieli lub maszynie PCR w temperaturze 27 °C przez 5 do 15 minut.
  11. Krótko wiruj i umieść rurkę z powrotem na magnetycznym stojaku separacyjnym, aż ciecz stanie się przezroczysta (2 do 5 minut).
  12. Przenieś 21 μL supernatantu zawierającego cDNA do probówki PCR o pojemności 0,2 mL oznaczonej próbką bez naruszania kulek.
  13. Powtórz kroki od 11,9 do 11,12 dla każdej probówki, zbierając łącznie 42 μL cDNA. Kontynuuj bezpośrednio amplifikację cDNA (kroki 12.1 do 12.8).
    UWAGA: Opóźnienie w rozpoczęciu amplifikacji spowoduje zmniejszenie wydajności, dłuższe krótkie odczyty oraz degradację jednoniciowego szablonu DNA.

12. Amplifikacja cDNA

  1. Wyjmij mieszankę wzmacniającą cDNA i zapalniki cDNA FFPE z zamrażarki i umieść je na mokrym lodzie, aby się rozmroziły.
  2. Rozmiesz mieszankę amplifikacyjną cDNA i primery cDNA FFPE na wirówce stołowej o pojemności ~100 x g.
  3. Dodaj 50 μL roztworu amplifikacyjnego cDNA i 8 μL starterów cDNA FFPE do każdej probówki cDNA od 42 μL od 42 μL od (krok 11.13) i umieść w termocyklerze z adapterem z płaskim nasadką, aby zapobiec deformacji rurki.
  4. Uruchom program thermocycler do amplifikacji cDNA: początkowa denaturacja: 95 °C przez 5 minut; cyklowanie: [98 °C przez 20 s, 58 °C przez 20 s, 72 °C przez 3 min] × 15 cykli; ostateczne przedłużenie: 72 °C przez 5 minut; Temperatura utrzymywająca: 12 °C (jeśli przetwarza się natychmiast) / 4°C (jeśli jest przechowywana przez noc).
  5. Zmierz stężenie DNA 1 μL cDNA przed i po czyszczeniu koralików.
    UWAGA: Ilość produktu cDNA przed czyszczeniem powinna być obliczona tak, aby przekraczała 1 μg dla każdego układu o powierzchni 1 cm². Stężenie po oczyszczeniu powinno wynosić co najmniej 10 ng/μL. Niższe plony zazwyczaj wiążą się ze zmniejszoną różnorodnością bibliotek. Znacząca utrata próby na tym etapie koreluje z wynikami DV200; jednak DV200 nie jest doskonałym predyktorem wyników.
  6. Powtórz czyszczenie kulek cDNA od kroku 11 (czyszczenie koralików) z wykorzystacją produktu PCR z etapu 12.4, z trzema modyfikacjami: użyj mniejszego regału magnetycznego PCR, dodaj tylko 200 μL etanolu 80% w kroku 11.6 oraz ponownie zawiesij 22 μL buforu Tris-EDTA (TE) (pH 8) w kroku 11.9.
  7. Przechowuj koraliki w tubce z 20 μL NFW, oznaczonych nazwami próbek, kodem kreskowym, datą i identyfikatorem chipu.
  8. Zmierz rozkład fragmentów cDNA za pomocą analizatora fragmentów. Zakres rozmiarów fragmentów powinien wynosić od 250 do 400 bp. Jeśli fragmenty są zbyt małe, powtórz czyszczenie koralików, ale używaj temperatury pokojowej (~25 °C) zamiast 27 °C.
    OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA: Po pomiarze cDNA można przechowywać go w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 miesiąc oraz w -80 °C przez maksymalnie 1 rok. Koraliki można przechowywać w NFW przez tydzień w temperaturze 4 °C. Nie zamrażaj koralików.

13. Przygotowanie do biblioteki (dzień 4)

  1. Przygotowanie mieszanki reakcji amplifikacyjnej
    1. Usuń rozwiązanie do amplifikacji PCR w bibliotece, zestawy kodów kreskowych biblioteki, produkt cDNA oraz NFW. Rozmroz cDNA i odczynniki na lodzie i wodzie w temperaturze pokojowej, a następnie skręcaj w czasie 100 x g przez 10 sekund.
  2. Określ strategię kodów kreskowych biblioteki dla każdego 25 μL mieszanki primerów PCR.
    UWAGA: W przypadku tego sekwencera wszystkie bazy muszą być reprezentowane równo na każdej pozycji w zestawie kodów kreskowych. Większość komercyjnych zestawów kompatybilnych z tym jest więc projektowana z predefiniowanymi tetradami kodów kreskowych (zestawy po cztery). Tetrady te mogą być stosowane do pojedynczych próbek podczas podziału na ścieżkę sekwencjonowania lub mogą być łączone w jednej próbce przy sekwencjonowaniu jednej próbki na tor. Utrzymanie zrównoważonych kodów kreskowych jest niezbędne, ponieważ niezbalansowane kody kreskowe zmniejszają ilość użytecznych danych generowanych przez sekwencer.
  3. Określ objętość cDNA dla 20 ng (np. 10 ng/μL wymagałoby 2 μL). Za pomocą tego przygotuj roztwór NFW (25 μL) rozcieńczonego cDNA (rozcieńczonego do ~1 ng/μL).
  4. Połącz mieszankę wzmacniającą bibliotekę (50 μL) z rozcieńczonym cDNA w NFW (25 μL) oraz mieszanką primerów PCR (25 μL) z rurką PCR o pojemności 0,2 mL.
  5. Wymieszaj dołek przez pipetowanie i skręć w dół przy 100 x g przez 10 sekund. (Nie wiruj)
  6. Włóż rurki PCR 0,2 mL do termocyklera i upewnij się, że masz wkładkę, która zapobiega zgniatkowaniu.
  7. Uruchom program thermocycler do amplifikacji cDNA: początkowa denaturacja: 95 °C przez 5 minut; cyklowanie: [98 °C przez 20 s, 58 °C przez 20 s, 72 °C przez 3 min] × 8 cykli; ostateczne przedłużenie: 72 °C przez 5 minut; Temperatura przechowywania: 12 °C (przy natychmiastowym przetwarzaniu) / 4 °C przy przechowywaniu przez noc.
    UWAGA: Możliwe jest wykorzystanie różnych ilości wejściowego cDNA do przygotowania biblioteki. Jednak ilość użytej energii wpłynie na liczbę cykli PCR potrzebnych do amplifikacji. Na przykład dostawca zaleca 20 ng wejściowego DNA i stosowanie 8 cykli. Możliwe jest także użycie 40 ng przy 7 cyklach lub 80 ng przy 6 cyklach. Nie zaleca się używania mniej niż 20 ng lub więcej niż 80 ng wejściowego cDNA.

14. Czyszczenie koralików wzmacniających w bibliotece

  1. Ilościowo określ surowy produkt biblioteczny zgodnie z krokiem 12.5.
  2. Powtarzaj czyszczenie koralików od kroku 11 (czyszczenie koralików) z wykorzystującym surowy produkt biblioteczny z kroku 13.7 z trzema modyfikacjami: stosunek kulki 0,8:1 do produktu, mniejszy pół magnetyczny PCR, użycie tylko 200 μL etanolu 80% w porównaniu do kroku 11,7 oraz ponowna zawieszka w 22 μL buforu TE (pH 8) w kroku 11.9. Przygotuj około 1 ml świeżego etanolu 80% na dwa chipy o pojemności 1cm 2 .
  3. OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA: Po zmierzeniu biblioteki można ją przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 miesiąc oraz w -80 °C do 1 roku. Koraliki można przechowywać w NFW przez tydzień w temperaturze 4 °C. Nie zamrażaj koralików.

15. System DNBSEQ-T7RS do sekwencjonowania DNB z Stereo-Seq Random Oligonukleotide Primed

  1. Korzystając z zestawu PE75 w systemie DNBSEQ-T7RS, przydziel cykle na 25 dla odczytu 1 i 62 dla odczytu 2 (PE25+62), a następnie indeks 10 bp:
    1. Pierwszy odczyt (czytaj 1 z 25 cykli) rejestruje przestrzenny identyfikator układu (CID) lub informacje lokalizacyjne z kodów kreskowych opartych na chipach.
    2. Drugi odczyt (odczyt 2 z 62 cykli) rejestruje Identyfikator Molekularny (MID), losową sekwencję o długości 6 bp, bezpośrednio dołączoną do wstawek genów z 3 dodatkowymi ciemnymi cyklami używanymi do korekcji fazowej i kalibracji offsetu kodów kreskowych. Następnie następuje wkładka genowa o wartości 30-59 bp z odczytu 2, którą identyfikowa się poprzez mapowanie do znanych genomów lub transkryptomów.
      UWAGA: Dłuższe wkładki genowe są możliwe, ale wymagałyby innych zestawów parowanych i modyfikacji procesu mapowania.
    3. Cykl indeksowy demultipleksowania obejmuje 10 bps na podstawie kodów kreskowych sekwencjonowania połączonych w kroku 13.2.
      UWAGA: Typowy czas sekwencjonowania to około 10-12 godzin dla komórki przepływowej 75 PE. Sekwencjonowanie najczęściej odbywa się w rdzeniu sekwencjonującym lub zakładzie komercyjnym, a nie jest procesem wewnętrznym w większości laboratoriów, ponieważ wymaga DNBSEQ-T7RS lub podobnego instrumentu sekwencjonowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe dane pokazują zdolność do segmentacji pojedynczych komórek za pomocą pipeline'u SAW oraz mapowania na niepolialno-adenylowane RNA, takie jak tRNA (TRDMT1), z sekcji FFPE. Obiektywne dane ze Stereo-seq pozwalają zbadać znaczenie nie tylko mRNA, ale także tRNA, rRNA oraz RNA niebędących gospodarzem (jeśli są istotne). Korzystając z bezpośredniego wyjścia z pipelineSAW 16 oraz stereopii do oceny jakości wyjścia stereo-seq na Rysunku 3A-G<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół Stereo-seq jest bardzo szczegółowy i obejmuje kilka kluczowych kroków, które wymagają precyzji, wyczucia czasu i czystego środowiska, aby zapewnić sukces, zwłaszcza przy profilowaniu mikrobiomu lub nie-gospodarza, które mogą wymagać szczególnych środków ostrożności.

Wymagane jest użycie wody wolnej od nukleazy we wszystkich etapach, a chip przechwytujący nie może być dotykany niczym innym niż próbką i odczynnikami. Zachowaj szczególną ostrożność przy użyciu zespołu kasetowego, poświęc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy twierdzą, że prace te nie były finansowane przez Complete Genomics. Jednak Complete Genomics pokrywa koszty publikacji tego artykułu. Nie otrzymali oni kopii wstępnej ani informacji o treści.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były częściowo finansowane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Fundację Sie oraz Fundusz Endowment Stephanie C. Stelter. Badania te zostały przeprowadzone we współpracy z Facility Flow Cytometry and Cellular Imaging Core, Department of Veterinary Medicine & Surgery oraz Advanced Genomics Technology Core, które są częściowo wspierane przez National Institutes of Health poprzez grant Wsparcia Centrum Onkologii M. D. Andersona P30 CA016672 oraz Specjalistę ds. Badań NCI Jareda Burksa 1 R50 CA243707-01A1.

Chcielibyśmy również podziękować Compete Genomics, a konkretnie Brandonowi Vanderbushowi i Tanzeen Yusuff za szkolenie techniczne i rozwiązywanie problemów, a także Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong i Erin Petrilli. Autor(i) otrzymali zestaw odczynników FFPE OMNI i sekwencjonowania oraz dostęp do programu wczesnego dostępu T7 od Complete Genomics po obniżonej cenie. Dodatkowo, niektóre odczynniki zostały udostępnione bezpłatnie do wykorzystania w tym badaniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL probówek do wirówek zwykłych DNA/RNAseThermo Fisher Scientific / Invitrogen3456Do mieszania odczynników (inne pasma są w porządku) i nbsp;
100% etanolSigma-AldrichE7023Stopień molekularny
15mL stożkowe rurki do wirówek sterylnych z polipropylenemThermo Fisher Scientific / Invitrogen339650Używane do aliquots 
20x koncentratu  Bufor soli sodu (SSC)Sigma-AldrichS6639-1LUżywałem do produkcji 5X SSC do bejcowania i 1X SSC do kroków mycia i usuwania pokrywek.
Instrument bioanalizator 2100AgilentDyskontowaneInstrument: Bioanalizator
Komora z 3 studniami, wyjmowanaIbidi80381Komora silikonowa do redukcji objętości podczas rehydratacji i wiązania metanolu.
Źródło UV 405nmRóżneNie maDo utwardzania żywicy UV
Stożkowe rurki do wirówek z polipropylenem o pojemności 50 mLThermo Fisher Scientific / Invitrogen339652Używany do alikwotów i deparafinizacji 
70% sterylny alkohol izopropanolowyTexwipe TX3270Do dekontaminacji powierzchni  
Zestaw DNA Agilent o wysokiej czułościAgilent5067-4626Do charakterystyki cDNA i bibliotek przez bioanalizatory
Zestaw Pico Agilent RNA 6000Agilent5067-1513Do charakterystyki RNA przez bioanalizatory
Folia aluminiowaRóżneNie maAby zakryć preparat podczas barwienia ssDNA.
Beckman Coulter SPRIselectBeckman Coulter Life Sciences B23317/B23318/B23319SPRI Beads cDNA i czyszczenie biblioteki
WybielaczRóżneNie maStanowisko sprzątające usuwa zanieczyszczenia mikrobiomu
Uszczelnione wymazy piankowe CONSTIXContec19161023Dla precyzyjnego czyszczenia żywicy
Slip pokrywkowySigma-AldrichBR470045-2000EA
Pakiety osuszająceRóżneNie maPakiety osuszające bez RNazy, wolne od kurzu.
Jednorazowa maseczka na twarzThermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001Ochrona, zanieczyszczenie RNAe i inne sterylność & nbsp;
Chusteczki do wymazywania DNASigma-AldrichL9060-250EADekontaminacja przez wycieranie powierzchni (mokre chusteczki)
Rurki LoBind DNA 1,5mLEppendorf 22431021Wykorzystywane do zbierania cDNA i postamplifikacji bibliotecznych.
Rurki DNA LoBind 2mLEppendorf 22431048Wykorzystywany do zbierania cDNA przed amplifikacją.
DNBSEQ OneStep DNB Zestaw Do Produkcji ŚrodkówGenomika kompletna940-001891-00Odczynniki do przygotowania i amplifikacji DNA nanoball (DNB)
Zestaw do odczynnika czyszczącego DNBSEQ-T7RSGenomika kompletna940-001903-00Wkład do prania po zakończeniu sekwencjonowania
DNBSEQ-T7RS zestaw odczynników do ładowania DNBGenomika kompletna940-001894-00Odczynniki i płytka do załadunku DNB do komórki przepływowej
Komórka sekwencjonowania DNBSEQ-T7RSGenomika kompletna940-001902-001 komórka liniowa/przepływowa
DNBSEQ-T7RS zestaw do wizualizacji odczynników stereo-seqGenomika kompletna940-001893-00Wkład i odczynniki do sekwencjonowania.
System DNBSEQ-T7RSGenomika kompletnaTen zestaw wizualizacji stereo-seq wykorzystuje technologię DNBSEQ. Sekwencjonowanie rozpoczyna się od hybrydyzacji kotwicy DNA, następnie fluorescencyjną sondę przyłącza się do DNA Nanoball (DNB) za pomocą chemii kombinatorycznego sekwencjonowania sondy i kotwicy (cPAS). Wreszcie, system obrazowania o wysokiej rozdzielczości rejestruje sygnał fluorescencjonalny. Po cyfrowym przetworzeniu sygnału optycznego sekwencer generuje wysokiej jakości i dokładne informacje sekwencyjne.
Sprężone powietrze z odkurzaniemMatinM-6318Ważne jest, aby używać tej marki lub takiej o podobnym paliwie.
Mikrotomowe łopatki Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Zamrażarka odporna na wybuchyRóżneNie maAby schłodzić metanol przed i w trakcie etapu utrwalania metanolu.
Pędzle histologiczneRóżneNie maHistologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Kwas solnySigma-Aldrich2104-50MLDo rozcieńczania enzymu premuliablizacyjnego w 0,01 N HCl (pH 2). Standardowe stężenie zapasowe w roztworze HCl wynosi 0,1 N.
System obrazowaniaróżneNie maGC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap Roztwór Dekontaminacji RNazyThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780Stanowisko robocze czyszczące usuwające zanieczyszczenia RNAe
Kimtech Delicate Task Furs Kimtech34155Do suszenia stołów, sprzętu, pipet itd.
Fartuch laboratoryjnyRóżneNie maŚrodki ochrony osobistej (PPE)
Papier soczewkowyThermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997Różne rozwiązania do suszenia szkieł bez wycierania
Chusteczki DNA Purse LookoutSigma-AldrichL9060Stanowisko sprzątające usuwające zanieczyszczenia PCR
Szafka separacyjna magentic 5uL - 0,2 Permagen LabwareMSRLV08Do seperzji kulek w rurkach PCR
Stelaża magjet 12x1,5 mLThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR02Do sekwacji kulek w probówkach 1,5 mL
Manualny mikrotom obrotowyLeicaRM2235Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Methonal ≥ 99,9%, odpowiednie do immunofluorescencji, HPLCSigma-Aldrich34860Do fiksacji (musi być klasy HPLC)
Kleszcze mikro-rozcinająceSigma-AldrichF4142-1EAHistologia – Stosowana podczas przekroju próbek
MikropipetaRóżneNie ma
Woda o jakości molekularnej z wolną nukleazą, bez DPECRóżneNie maRozcieńczenia i wydzielanie paciorków
Rękawice nitryloweRóżneNie maŚrodki ochrony osobistej
PiekarnikRóżneNie maŻeby upiec chipsy
Rurki PCR 0,2 mL z dołączonymi kapslamiRóżneNie maDo zastosowań PCR
Pokrycia PCR & nbsp;RóżneNie maWymiana, jeśli klej na dostarczonej okładce jest słaby
Maska PCR i okap Stacja roboczaMystaireMY-PCR24-010Dla etapów pre-PCR (RNA do cDNA)
Miernik pHRóżneNie maMiernik pH do potwierdzenia pH HCl.
Roztwór poli-L-lizynySigma-AldrichA005-COpcjonalnie zwiększa przyczepność tkanek do odprysku
Fluorometr Qubit 4Thermo Fisher Scientific / InvitrogenQ33226Insuterment; Pomiar ilości DNA
Zestawy do kwantyfikacji qubitu dsDNAThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ32851Do pomiaru kwantyfikacji cDNA i bibliotek
Qubit ssDNA Test KitThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ10212Barwienie ssDNA (Używany tylko barwnik)
Blok lodowy wolny od RNAsRóżneNie maHistologia – Stosowana podczas krojowania próbek w celu nawodnienia bloków przed sekcją
Roztwór RNazy RNaze RNaseZapThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9782Roztwór dekontaminacji powierzchniowej, który niszczy RNA
Zestaw RNeasy FFPEQiagen73504 & 19093Do ekstrakcji RNA i Pomiar DV200 
Sculpt Ultra White ResinSiraya TechNie maOdporna na wysoką temperaturę żywica utwardzalna UV
Zestaw do przygotowania biblioteki kodów kreskowych stereo-seq 16STOmics / Kompletna genomika111KL160Do budowy biblioteki Stereo-seq OMNI FFPE
Zestaw akcesoriów stereo-seq FFPESTOmics / Kompletna genomika310AK002Elementy akcesoriów OMNI przestrzennych zestawu 211SN114
Suwak stereo-seq N-chip (1cm x 1cm)STOmics / Kompletna genomika210CN114Część układu OMNI przestrzennego zestawu 211SN114
Stereo-seq adapter PCR & nbsp;STOmics / Kompletna genomika301AUX001Dla kroków hybrydyzacji PCR zmodyfikowane tak, aby pasowały do trzech podobnych do adaptera hybrydyzacji PCRmax Situ
Stereo-seq Transcriptomics N KitSTOmics / Kompletna genomika211KN114Przestrzenny OMNI regent część zestawu 211SN114
Projektowanie chirurgiczne ogólnego przeznaczenia Przemysłowa żyletkaThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Roztwór buforowy TE pH 8,0Sigma-Aldrich8890Do elucii cDNA i bibliotek
Cyklery termiczneBioRad / różne1861096 /12015392 / różneMaszyna PCR z ręczną pokrywką lub opcjami głębokiej studni (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler itd.)
Zestawy bufora pH Thermo Scientific Orion All-in-OneThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-624-500
Kąpiel do wypływania tkanek - Digital XH-1003PremieraNC0779538Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Okulary ochronne przed UVRóżneNie maDla bezpieczeństwa podczas utwardzania UV
KsylenySigma-Aldrich247642Dla deparafinizacji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsStereo seqFFPE TissueSpecies Agnostic ProfilingSpatial RNA DetectionSingle Cell SegmentationMicrobiome ProfilingNon Polyadenylated RNATumor MicroenvironmentSpatial Barcoding

Related Articles