Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Summary

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Abstract

Przestrzenny skład komórek wewnątrz gospodarza, a także bakterie lub ładunki wirusowe w tkance, mogą wpływać na interakcje typów komórek i analitów, które napędzają komórkę przez procesy specyficzne dla typu. Stereo-seq dla tkanek FFPE wykorzystuje losowe primowanie kodów przestrzennych, co różni się od standardowych metod transkryptomiki przestrzennej, które wykorzystują A'tailing do przechwytywania mRNA posłannika (mRNA) lub opartego na sondach do przechwytywania transkryptów specyficznych dla gatunku. Metody te nie uwzględniają nowszej wiedzy o wpływie i znaczeniu innych typów RNA pochodzących z długiego niekodującego RNA, mitochondrialnego, mikroRNA lub innych gatunków RNA, takich jak mikroby, wirusowe i grzybowe. Poniżej przedstawiono krok po kroku procedurę od przecięcia tkanek aż po przygotowanie biblioteki do zastosowań stereo-seq niezależnych od gatunków przestrzennych z detekcją RNA, wykorzystującą metodologię sondy randomer, która jest kompatybilna z tkankami formalinowo osadzonymi w parafinie (FFPE). Ta metoda stereo-seq wykorzystuje losowy kulkę przechwytu o rozmiarze 0,22 μm, która pojawia się w tablicy co 0,5 μm, co pozwala na rozdzielczość subkomórkową dzięki technologii opartej na sekwencjonowania. Ponieważ metoda ta wykrywa zarówno RNA gospodarza, jak i nie-gospodarza, protokół wymaga specyficznych kwestii, aby określić, co znajduje się wewnątrz tkanki, a co zostało zdeponowane podczas pobierania, konserwacji, cięcia i wykrywania (czyli środowiskowe i obsługa zanieczyszczeń). Na koniec, protokół ten pozwala uzyskać wysoką (pojedynczą) rozdzielczość gatunków wielokomórkowych w kontekście przestrzennym, dostarczając wglądu w dokładność i inter-aaktom typów komórek oraz gatunków patologicznych.

Introduction

Technologie przestrzennej omiki zrewolucjonizowały badania heterogeniczności komórek tkanek, umożliwiając jednoczesną ilościową identyfikację wielu celów: DNA (genomika), RNA (transkryptomika), metabolitów (metabolomika) lub białek (proteomika)^1. Rozdzielczość tych różnych testów często się różni, co daje różne ograniczenia przy pomiarze analitów, zarówno przy większej rzadkości przy pomiarze pojedynczej komórki ^2,3, jak i natywnego kontekstu^{przestrzennego 4}. Natomiast metody masowe, takie jak sekwencjonowanie RNA, zapewniają jedynie średnią ekspresję genów w cał....

Protocol

W tym artykule metodycznym nie podano danych klinicznych dla pacjentki z rakiem surowiczym, wysokiej klasy w wysokiej jakości. Jednak powiązane dane kliniczne zostały zebrane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB) na University of Texas MD Anderson Cancer Center, Katedrze Onkologii Ginekologicznej i Medycyny Rozrodu, od uczestników, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę.

UWAGA: Zaleca się noszenie maseczki chirurgicznej i rękawiczek przez cały okres trwania protokołu, aby zapobiec zakażeniu RNazą. Naukowcom z długimi włosami zaleca się związanie ich do tyłu lub nawet noszenie siatki na włosy. Zaws....

Results

Poniższe dane pokazują zdolność do segmentacji pojedynczych komórek za pomocą pipeline'u SAW oraz mapowania na niepolialno-adenylowane RNA, takie jak tRNA (TRDMT1), z sekcji FFPE. Obiektywne dane ze Stereo-seq pozwalają zbadać znaczenie nie tylko mRNA, ale także tRNA, rRNA oraz RNA niebędących gospodarzem (jeśli są istotne). Korzystając z bezpośredniego wyjścia z pipeline^{SAW 16} oraz stereopii do oceny jakości wyjścia stereo-seq na Rysunku 3A-G<.......

Discussion

Protokół Stereo-seq jest bardzo szczegółowy i obejmuje kilka kluczowych kroków, które wymagają precyzji, wyczucia czasu i czystego środowiska, aby zapewnić sukces, zwłaszcza przy profilowaniu mikrobiomu lub nie-gospodarza, które mogą wymagać szczególnych środków ostrożności.

Wymagane jest użycie wody wolnej od nukleazy we wszystkich etapach, a chip przechwytujący nie może być dotykany niczym innym niż próbką i odczynnikami. Zachowaj szczególną ostrożność przy użyciu zespołu kasetowego, poświęc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL probówek do wirówek zwykłych DNA/RNAse	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	3456	Do mieszania odczynników (inne pasma są w porządku) i nbsp;
100% etanol	Sigma-Aldrich	E7023	Stopień molekularny
15mL stożkowe rurki do wirówek sterylnych z polipropylenem	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339650	Używane do aliquots
20x koncentratu  Bufor soli sodu (SSC)	Sigma-Aldrich	S6639-1L	Używałem do produkcji 5X SSC do bejcowania i 1X SSC do kroków mycia i usuwania pokrywek.
Instrument bioanalizator 2100	Agilent	Dyskontowane	Instrument: Bioanalizator
Komora z 3 studniami, wyjmowana	Ibidi	80381	Komora silikonowa do redukcji objętości podczas rehydratacji i wiązania metanolu.
Źródło UV 405nm	Różne	Nie ma	Do utwardzania żywicy UV
Stożkowe rurki do wirówek z polipropylenem o pojemności 50 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339652	Używany do alikwotów i deparafinizacji
70% sterylny alkohol izopropanolowy	Texwipe	TX3270	Do dekontaminacji powierzchni
Zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości	Agilent	5067-4626	Do charakterystyki cDNA i bibliotek przez bioanalizatory
Zestaw Pico Agilent RNA 6000	Agilent	5067-1513	Do charakterystyki RNA przez bioanalizatory
Folia aluminiowa	Różne	Nie ma	Aby zakryć preparat podczas barwienia ssDNA.
Beckman Coulter SPRIselect	Beckman Coulter Life Sciences	B23317/B23318/B23319	SPRI Beads cDNA i czyszczenie biblioteki
Wybielacz	Różne	Nie ma	Stanowisko sprzątające usuwa zanieczyszczenia mikrobiomu
Uszczelnione wymazy piankowe CONSTIX	Contec	19161023	Dla precyzyjnego czyszczenia żywicy
Slip pokrywkowy	Sigma-Aldrich	BR470045-2000EA
Pakiety osuszające	Różne	Nie ma	Pakiety osuszające bez RNazy, wolne od kurzu.
Jednorazowa maseczka na twarz	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	12-888-001	Ochrona, zanieczyszczenie RNAe i inne sterylność & nbsp;
Chusteczki do wymazywania DNA	Sigma-Aldrich	L9060-250EA	Dekontaminacja przez wycieranie powierzchni (mokre chusteczki)
Rurki LoBind DNA 1,5mL	Eppendorf	22431021	Wykorzystywane do zbierania cDNA i postamplifikacji bibliotecznych.
Rurki DNA LoBind 2mL	Eppendorf	22431048	Wykorzystywany do zbierania cDNA przed amplifikacją.
DNBSEQ OneStep DNB Zestaw Do Produkcji Środków	Genomika kompletna	940-001891-00	Odczynniki do przygotowania i amplifikacji DNA nanoball (DNB)
Zestaw do odczynnika czyszczącego DNBSEQ-T7RS	Genomika kompletna	940-001903-00	Wkład do prania po zakończeniu sekwencjonowania
DNBSEQ-T7RS zestaw odczynników do ładowania DNB	Genomika kompletna	940-001894-00	Odczynniki i płytka do załadunku DNB do komórki przepływowej
Komórka sekwencjonowania DNBSEQ-T7RS	Genomika kompletna	940-001902-00	1 komórka liniowa/przepływowa
DNBSEQ-T7RS zestaw do wizualizacji odczynników stereo-seq	Genomika kompletna	940-001893-00	Wkład i odczynniki do sekwencjonowania.
System DNBSEQ-T7RS	Genomika kompletna		Ten zestaw wizualizacji stereo-seq wykorzystuje technologię DNBSEQ. Sekwencjonowanie rozpoczyna się od hybrydyzacji kotwicy DNA, następnie fluorescencyjną sondę przyłącza się do DNA Nanoball (DNB) za pomocą chemii kombinatorycznego sekwencjonowania sondy i kotwicy (cPAS). Wreszcie, system obrazowania o wysokiej rozdzielczości rejestruje sygnał fluorescencjonalny. Po cyfrowym przetworzeniu sygnału optycznego sekwencer generuje wysokiej jakości i dokładne informacje sekwencyjne.
Sprężone powietrze z odkurzaniem	Matin	M-6318	Ważne jest, aby używać tej marki lub takiej o podobnym paliwie.
Mikrotomowe łopatki Edge-Rite	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	4280L	Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Zamrażarka odporna na wybuchy	Różne	Nie ma	Aby schłodzić metanol przed i w trakcie etapu utrwalania metanolu.
Pędzle histologiczne	Różne	Nie ma	Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Kwas solny	Sigma-Aldrich	2104-50ML	Do rozcieńczania enzymu premuliablizacyjnego w 0,01 N HCl (pH 2). Standardowe stężenie zapasowe w roztworze HCl wynosi 0,1 N.
System obrazowania	różne	Nie ma	GC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap Roztwór Dekontaminacji RNazy	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9780	Stanowisko robocze czyszczące usuwające zanieczyszczenia RNAe
Kimtech Delicate Task Furs	Kimtech	34155	Do suszenia stołów, sprzętu, pipet itd.
Fartuch laboratoryjny	Różne	Nie ma	Środki ochrony osobistej (PPE)
Papier soczewkowy	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	11-997	Różne rozwiązania do suszenia szkieł bez wycierania
Chusteczki DNA Purse Lookout	Sigma-Aldrich	L9060	Stanowisko sprzątające usuwające zanieczyszczenia PCR
Szafka separacyjna magentic 5uL - 0,2	Permagen Labware	MSRLV08	Do seperzji kulek w rurkach PCR
Stelaża magjet 12x1,5 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	MR02	Do sekwacji kulek w probówkach 1,5 mL
Manualny mikrotom obrotowy	Leica	RM2235	Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Methonal ≥ 99,9%, odpowiednie do immunofluorescencji, HPLC	Sigma-Aldrich	34860	Do fiksacji (musi być klasy HPLC)
Kleszcze mikro-rozcinające	Sigma-Aldrich	F4142-1EA	Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Mikropipeta	Różne	Nie ma
Woda o jakości molekularnej z wolną nukleazą, bez DPEC	Różne	Nie ma	Rozcieńczenia i wydzielanie paciorków
Rękawice nitrylowe	Różne	Nie ma	Środki ochrony osobistej
Piekarnik	Różne	Nie ma	Żeby upiec chipsy
Rurki PCR 0,2 mL z dołączonymi kapslami	Różne	Nie ma	Do zastosowań PCR
Pokrycia PCR & nbsp;	Różne	Nie ma	Wymiana, jeśli klej na dostarczonej okładce jest słaby
Maska PCR i okap Stacja robocza	Mystaire	MY-PCR24-010	Dla etapów pre-PCR (RNA do cDNA)
Miernik pH	Różne	Nie ma	Miernik pH do potwierdzenia pH HCl.
Roztwór poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	A005-C	Opcjonalnie zwiększa przyczepność tkanek do odprysku
Fluorometr Qubit 4	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q33226	Insuterment; Pomiar ilości DNA
Zestawy do kwantyfikacji qubitu dsDNA	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q32851	Do pomiaru kwantyfikacji cDNA i bibliotek
Qubit ssDNA Test Kit	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q10212	Barwienie ssDNA (Używany tylko barwnik)
Blok lodowy wolny od RNAs	Różne	Nie ma	Histologia – Stosowana podczas krojowania próbek w celu nawodnienia bloków przed sekcją
Roztwór RNazy RNaze RNaseZap	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9782	Roztwór dekontaminacji powierzchniowej, który niszczy RNA
Zestaw RNeasy FFPE	Qiagen	73504 & 19093	Do ekstrakcji RNA i Pomiar DV200
Sculpt Ultra White Resin	Siraya Tech	Nie ma	Odporna na wysoką temperaturę żywica utwardzalna UV
Zestaw do przygotowania biblioteki kodów kreskowych stereo-seq 16	STOmics / Kompletna genomika	111KL160	Do budowy biblioteki Stereo-seq OMNI FFPE
Zestaw akcesoriów stereo-seq FFPE	STOmics / Kompletna genomika	310AK002	Elementy akcesoriów OMNI przestrzennych zestawu 211SN114
Suwak stereo-seq N-chip (1cm x 1cm)	STOmics / Kompletna genomika	210CN114	Część układu OMNI przestrzennego zestawu 211SN114
Stereo-seq adapter PCR & nbsp;	STOmics / Kompletna genomika	301AUX001	Dla kroków hybrydyzacji PCR zmodyfikowane tak, aby pasowały do trzech podobnych do adaptera hybrydyzacji PCRmax Situ
Stereo-seq Transcriptomics N Kit	STOmics / Kompletna genomika	211KN114	Przestrzenny OMNI regent część zestawu 211SN114
Projektowanie chirurgiczne ogólnego przeznaczenia Przemysłowa żyletka	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-812-236	Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Roztwór buforowy TE pH 8,0	Sigma-Aldrich	8890	Do elucii cDNA i bibliotek
Cyklery termiczne	BioRad / różne	1861096 /12015392 / różne	Maszyna PCR z ręczną pokrywką lub opcjami głębokiej studni (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler itd.)
Zestawy bufora pH Thermo Scientific Orion All-in-One	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-624-500
Kąpiel do wypływania tkanek - Digital XH-1003	Premiera	NC0779538	Histologia – Stosowana podczas przekroju próbek
Okulary ochronne przed UV	Różne	Nie ma	Dla bezpieczeństwa podczas utwardzania UV
Ksyleny	Sigma-Aldrich	247642	Dla deparafinizacji