Ten protokół chirurgiczny to krok po kroku przewodnik po wprowadzeniu cewnika wewnątrz kręgosłupa podtwardówkowego gryzonia, aby zapewnić ukierunkowane leczenie.
Artykuł metodologiczny
Dostęp do przestrzeni podtwardówkowej rdzenia kręgowego gryzoni w celu przeprowadzenia leczenia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Leczenie chorób lub urazów rdzenia kręgowego jest trudne, częściowo ze względu na trudności w opracowaniu skutecznych metod leczenia bezpośrednio na pępowi. Obecne leczenie urazu rdzenia kręgowego (SCI) polega na tym głównie na znieczuleniu zewnątrzoponowym. Jednak terapie zewnątrzoponowe nie pozwalają na bezpośrednią interakcję z rdzeniem kręgowym, co zmniejsza potencjalny efekt leczenia. Tutaj proponowano metodę dostępu do przestrzeni podtwardówkowej w modelu gryzoni, aby uzyskać bardziej bezpośredni efekt danego zabiegu. Korzystając z opisanego protokołu, przeprowadzono pomyślną implantację podtwardówkową urządzenia bioelektronicznego do rejestracji/stymulacji rdzenia kręgowego oraz bezpieczne wprowadzenie hydrożelu obciążonego neurotrofiną-3. Zwierzęta poddane temu protokołowi w obu zastosowaniach nie wykazały zmian w funkcji kończyn tylnych ani przednich po zabiegu oraz nie rozwijały się dysfunkcje przez okres do 12 tygodni po zabiegu. Chociaż przedstawione tutaj przykłady są bardzo szczegółowe, proponowany protokół może być stosowany w różnych zastosowaniach, aby umożliwić skuteczniejsze, lokalizowane leczenie zaburzeń neurologicznych rdzenia kręgowego.
Wprowadzenie
Choroby i urazy rdzenia kręgowego mogą mieć druzgocące skutki dla milionów ludzi na całym świecie, powodując poważne obciążenia społeczne, ekonomiczne i zdrowotne 1,2. Urazy rdzenia kręgowego oraz choroby neurodegeneracyjne mogą prowadzić do przewlekłych dysfunkcji ruchowych, sensorycznych i autonomicznych, które obniżają jakość życia i niezależność osób dotkniętych. Obecne leczenie, takie jak interwencje chirurgiczne i farmakoterapia, koncentrują się na łagodzeniu początkowej traumy i zarządzaniu powikłaniami wtórnymi3. Jednak te podejścia rzadko osiągają znaczącą regenerację nerwową lub funkcjonalną regenerację, co pozostawia pilną potrzebę skuteczniejszych interwencji ukierunkowanych na mechanizmy leżące u podstaw.
Głównym zastrzeżeniem obecnych strategii leczenia jest lokalizacja i sposób realizacji pożądanego leczenia. Leczenia takie jak neuromodulacja czy interwencja farmaceutyczna mają zdolność wpływania na aktywność neuronów, ułatwiania funkcjonalnej regeneracji oraz potencjalnego przywracania połączeń w uszkodzonych obwodach kręgowych4. Stymulacja rdzenia kręgowego może prowadzić do poprawy kontroli motorycznej i zmniejszenia bólu5. Jednak obecnie strategie te ograniczają się do pośredniego podawania do uszkodzonej tkanki, koncentrując się na przestrzeni zewnątrzoponowej, nie biorąc pod uwagę bariery rdzenia twardego rdzenia kręgowego 6,7,8. Chociaż leczenie zewnątrzoponowe wykazało korzyści kliniczne, są one ograniczone ze względu na pośredni dostęp do docelowych populacji neuronów, co może prowadzić do zmniejszenia efektów leków terapeutycznych.
Nasza grupa pracowała nad przezwyciężeniem tych ograniczeń związanych ze strategiami skoncentrowanymi na zewnątrzoponie oraz badała potencjał bezpośredniego leczenia podtwardówkowego w modelach urazów rdzenia kręgowego (SCI). Wprowadzenie cewników w przestrzeń podtwardówkowa pozwala na bezpośrednie leczenie rdzenia kręgowego, zapewniając lepszą interakcję z dotkniętą tkanką nerwową 9,10. Podanie podtwardówkowe również zmniejsza efekty barierowe mięśnia twardego mater, poprawiając skuteczność stymulacji elektrycznej i ukierunkowanych systemów podawania leków11,12. Ta metoda może poprawić precyzję i skuteczność leczenia, potencjalnie prowadząc do lepszych wyników w funkcjonalnej rekonwalescencji.
Artykuł opisuje krok po kroku protokół bezpiecznego dostępu do przestrzeni podtwardówkowej rdzenia kręgowego gryzoni. Zabieg ten koncentruje się na okolicy piersiowej kręgosłupa (T10-T12), jednak może być wykonywany w różnych miejscach na pępowinie, w zależności od potrzeb. Określa się punkty orientacyjne anatomiczne, umożliwiające identyfikację regionu, a szczegółowe instrukcje dotyczące laminektomii, durotomii i penetracji opona twarda. Przedstawiono również dwa zastosowania tego protokołu, w tym implantację urządzenia do stymulacji elektrycznej oraz dostarczanie hydrożelowego systemu dostarczania leku (Rysunek 1). Opisane kroki są łatwe do powtórzenia przez naukowców z doświadczeniem w chirurgii gryzoni. Protokół ten jest napisany w kontekście modelu stłuczenia rdzenia rdzeniowego; jednak konkretny model urazu można modyfikować w zależności od pożądanych wyników eksperymentalnych. Opisana tutaj technika nie tylko daje nadzieję na postępy w leczeniu SCI, ale może także stanowić podstawę do przyszłych badań nad naprawą i regeneracją rdzenia kręgowego poprzez precyzyjne, lokalne interwencje.
Protokół
Wszystkie procedury były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi etycznymi na Uniwersytecie w Auckland i zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt (AEC) oraz uniwersyteckich Oficerów ds. Dobrostanu Zwierząt (AWO). Samice szczurów Sprague-Dawley ważące 240-260 g zostały użyte i umieszczone w grupach (21 °C; 12 h:12 h, światło: ciemność) i otrzymały ad libitum dostęp do standardowej diety dla gryzoni przed i po operacji. Zaleca się najpierw wypróbowanie tego protokołu w przypadku braku modelu urazu, ponieważ celem jest zapewnienie bezpiecznego dostępu do przestrzeni podtwardówkowej rdzenia kręgowego gryzoni. To ważny pierwszy krok, aby wykazać, że protokół można stosować bez powodowania urazu, co pozwala na dokładniejszą analizę pożądanego modelu urazu. Protokół ten nadaje się do łączenia z wieloma różnymi modelami urazów stosowanymi przez grupy badawcze. Dlatego protokół nie opisuje konkretnych kroków porodu urazu, ponieważ będą one różnić się w zależności od zastosowania. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Sterylizuj wszystkie narzędzia (Rysunek uzupełniający 1) oraz odpowiednie materiały eksploatacyjne.
- Zważ szczura (szczury) na operację następnego dnia.
- Obliczanie odpowiednich dawek leków do podania; bupivakaina (lek przeciwbólowy) @ 2 mg/kg, dawka - 0,08 mL/100 g; Meloksykam (lek przeciwbólowy) @ 2 mg/kg, dawka - 0,04 mL/100 g; buprenorfina (lek przeciwbólowy) @ 0,03 mg/kg, dawka - 0,1 mL/100 g; Enrofloksacyna (antybiotyk) @ 10 mg/kg, dawka - 0,08 mL/100 g12,13.
UWAGA: Bupiwakaina była podawana podskórnie w 3-4 miejscach wzdłuż miejsca operacji przed pierwszym nacięciem.
2. Przygotowanie chirurgiczne
- Upewnij się, że system znieczulenia jest prawidłowo skonfigurowany (sprawdź, czy wszystkie rurki związane z systemem tlenu i znieczulenia są prawidłowo ustawione).
- Przygotuj wymagane zastrzyki w zależności od wagi szczurów oraz zastrzyk 3 mL soli fizjologicznej, który należy podać przed rozpoczęciem.
- Upewnij się, że podkładka grzewcza (temperatura konserwacyjna 37 °C), lampa, mikroskop i golarka są ustawione i sprawne.
UWAGA: Mikroskop rozcinający nie jest wymagany do stosowania specyficznego powiększenia, ponieważ powiększenie będzie się różnić w zależności od preferencji użytkownika i widoczności podczas zabiegu.
UWAGA: Upewnij się, że temperatura zwierzęcia nie spadnie poniżej 35°C ani nie przekroczy 40°C podczas zabiegu
3. Przygotowanie zwierząt
- Upewnij się, że wszystkie rurki związane z systemem znieczulenia i butlą tlenową są podłączone. Jeśli używasz systemu znieczulenia stosowanego w tym badaniu (patrz Tabela materiałów), ustaw indukcję izofluranu na 3% i wprowadź wagę zwierzęcia do systemu znieczulenia, aby ustawić przepływ tlenu do znieczulenia podtrzymującego (Rysunek uzupełniający 1A).
UWAGA: Utrzymuj znieczulenie na poziomie podtrzymującym odpowiednim dla każdego zwierzęcia. Może się to różnić od 1,3% do 2% w zależności od zwierzęcia. - Włóż szczura do komory indukcyjnej, aż nie będzie w stanie się wyprostować, przełącz się na pożądany poziom utrzymania izofluranu i przenieś szczura do stożka nosowego.
- Przed goleniem podawano 3 mL soli fizjologicznej i wymagane zastrzyki leków podskórnych.
UWAGA: Po zastrzykach z soli fizjologicznej i goleniu należy wstrzyknąć bupivakainę w kilka miejsc w miejscu planowanego nacięcia - Podczas monitorowania poziomu znieczulenia u zwierzęcia przygotuj wszystkie instrumenty (mikroskop, narzędzia, sterylne zasłony) w sali operacyjnej. Umieść sterylną zasłonę na narzędzia w wybranym miejscu i uporządkuj narzędzia na zasłonie, utrzymując sterylne pole.
- Ogol sierść wzdłuż grzbietu zwierzęcia, od nasady szyi do górnej części bioder.
- Dezynfekuj obszar peelingiem chlorheksowym (chlorheksydyna glukonian 4% w/v), następnie nalewka chlorheksydyna (chlorheksydyna glukozanina 0,5% w/v i etanol 70% v/v), wykonując ruch okrężny wychodzący od środka ogolonego obszaru (3x), i nałóż lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
- Przenieś szczura na poduszkę grzewczą pod mikroskopem, przyłóż zasłonę prasową i uszczelniającą na ogolonym miejscu oraz wytnij otwór na tyle duży, by odsłonić pole chirurgiczne, ale nie na tyle, by odsłonić nieogoloną sierść.
- Załóż sondę do pomiaru temperatury odbytu, aby monitorować temperaturę zwierzęcia i utrzymywać ją na poduszce grzewczej. Przeprowadzaj kontrole dobrostanu zwierząt co 5-10 minut.
- Podaj odruch pedałowy, aby potwierdzić plany znieczulenia chirurgicznego i rozpocząć zabieg.
4. Rozwarstwienie tkanek kręgosłupa
- Używając ostrza skalpela, wykonaj liniowe nacięcie (~6-8 cm) w kierunku rostralnym do ogonowego (rysunek 2A), zaczynając poniżej podstawy szyi i rozciągając się nad garb klatki piersiowej, odsłaniając kręgi T9-T13.
- Delikatnie połącz tkankę łączną pod miejscem nacięcia za pomocą kleszczy Graefe lub mikro-sprężynowych nożyczek, aby bezpośrednio odsłonić tkankę mięśniową kręgosłupa.
- Zidentyfikowaj wyrostek T13, lokalizując dwa białe ścięgna w kształcie litery V w pobliżu połowy nacięcia ogonowego. Wyrostek kolczasty bezpośrednio rostralnie do litery V po stronie ogona zwierzęcia to T13 (Rysunek 2B).
- Od T13 i przechodząc do T9, wykonuj małe nacięcia w tkankach łącznych między każdym procesem, aby je rozdzielić przed oczyszczeniem mięśnia, aby pomóc utrzymać lokalizację w trakcie zabiegu (Rysunek 2C). Następnie wycinam kanały w mięśniu biegnące równolegle do obu stron wyrostków kolczastych za pomocą mikroscriperów. Rób to po obu stronach kręgosłupa, aby odsłonić blaszkę każdego segmentu kręgosłupa (Rysunek 2D).
- Przymocuj zaciski serrefine po obu stronach ścian mięśni, aby utrzymać otwarte pole widzenia na kręgosłup. Przyłącz jedną parę po bokach T13, drugą na granicy T11/T12 oraz trzecią przy T11/T10 (Rysunek 2E).
- Gdy utworzą się przezroczyste kanały, odcinaj tkankę łączną pomiędzy każdym procesem za pomocą mikronożyczek lub rongeurów (Rysunek 2F).
- Oczyścić kanały, aż tkanka łączna i mięśnie zostaną czysto rozdzielone od każdej błonki, od części rostralnej T13 do części ogonowej T9, odsłaniając segmenty T10-12 do zabiegu laminektomii. Pomyślne zakończenie jest oznaczane wyraźnie widocznymi laminami po obu stronach wyrostków.
UWAGA: Mikroskop nie jest wymagany do kroku 4, ale jest zdecydowanie zalecany.
5. Laminektomia
- Zlokalizuj część ogonową błony T12, która zachodzi na część rostralną T13, umieść czubek rongeurów pod nią i delikatnie zacznij usuwać fragmenty błonki, zgodnie ze standardowymi protokołami JoVE14,15 (Rysunek 2G).
UWAGA: Użyj kleszczy, aby chwycić kolczasty wyrostek każdej laminy, aby utrzymać stabilność i delikatnie "unieść" płytki podczas każdego cięcia rongeurami (rysunek 2G). Podczas przesuwania czubka rongeurs pod błonkę, utrzymuj nacisk na zewnątrz z dala od rdzenia kręgowego, aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia.
UWAGA: Uważaj, aby nie wcisnąć rongeurów zbyt głęboko pod spód podczas cięcia, ponieważ mogą uszkodzić rdzeń twardy i/lub rdzeń kręgowy. - Przechodząc z jednej strony na drugą, kontynuuj odcinanie fragmentów kości z błonki T12, aż będzie wystarczająco dużo miejsca, aby przedłużyć cięcie do linii środkowej procesu, odsłaniając rdzeń kręgowy, z otworem o średnicy około 5 mm (Rysunek 2H).
UWAGA: Usunięcie kości z kręgosłupa może prowadzić do krwawienia, które może zmniejszyć widoczność podczas zabiegu. Używaj patyczków kosmetycznych lub rozwalkowanych chusteczek wolnych od kłaczków (Rysunek Uzupełniający 1B), aby kontrolować ten problem podczas wykonywania laminektomii. - Przepracuj rongeury pod blaszką po obu stronach, a następnie oczyścij równomierny kanał do części czaszkowej T12 (Rysunek 2I).
UWAGA: Rdzeń kręgowy stanie się widoczny, gdy fragmenty płytki laminarnej zostaną usunięte dla każdego segmentu kręgowego. - Powtórz kroki 5.1 do 5.3, aby usunąć zarówno T11, jak i T10.
- Kontynuuj laminektomię, utrzymując równomierne cięcia po obu stronach, przesuwając się wzdłuż rostralu do T9 (rysunek 2J).
UWAGA: W przypadku zabiegów stłuczenia SCI (patrz sekcja Reprezentatywne Wyniki) lamina powyżej pożądanego segmentu/segmentów rdzenia kręgowego musi być odpowiednio oczyszczona, aby umożliwić zastosowanie urządzenia do stłuczenia (patrz rozszerzony obszar na środku Rysunku 2K). Do podawania leku laminektomia może być na tyle szeroka, by zobrazować zastosowanie pożądanego związku. - Delikatnie przepłucz woreczek tekalny solą fizjologiczną i przygotuj pożądane miejsce do durotomii po zakończeniu laminektomii i usunięciu odpowiedniego obszaru T10-T12 (Rysunek 2K).
UWAGA: Procedura ta jest specyficzna dla dostępu do segmentów kręgosłupa (T10-T12), jednak metody te mogą być stosowane do laminektomii na różnych odcinkach kręgosłupa.
6. Durotomia do stosowania zabiegu
- Wykonaj durotomię (nacięcie opona twardego) za pomocą mikroskopu do sekcji podtwardówkowej rdzenia kręgowego (Rysunek 3A).
UWAGA: Dostosuj powiększenie luskoty w zależności od preferencji chirurga dotyczącej widoczności mięśnia twardego. - Zgiąć igłę 27-G pod kątem 90 stopni, z fazą skierowaną do góry (Rysunek 3B).
UWAGA: Używaj pary przewozów igieł lub hemostatyków, aby chwycić igłę podczas zginania. - Delikatnie przekłuj oponę twardą końcówką igły w pożądanym punkcie wejścia rdzenia kręgowego (Rysunek 3B).
UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego ani jego naczyń pośrodkowej. - Po przebiciu kości twardej delikatnie unieś igłę grzbietowo, aby zrobić okrągły otwór w kości twardej nie większej niż 2 mm, po obu stronach naczyń środkowolinijowych. Udana durotomia jest zaobserwowana niewielką ilością wycieku płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z każdego otworu.
UWAGA: Zachowaj co najmniej kilka mm odległości od końca laminektomii, aby ułatwić dostęp do przestrzeni podtwardówkowej. Jeśli trzeba, ostrożnie włóż końcówkę igły z powrotem do początkowego otworu, aby zwiększyć jej rozmiar. - Upewnij się, że pozycja wybrana do nacięcia durotomicznego oraz pozycja bezpośrednio przed nią jest wolna od rozgałęzionych naczyń krwionośnych od naczynia środkowego.
UWAGA: Nie uszkadzaj naczyń środkowej linii krwionośnej, ponieważ spowoduje to nadmierne krwawienie i uniemożliwi ukończenie zabiegu. - Korzystając z otworów w kości twardówkowej, wykonaj pożądane leczenie lub wszczep urządzenie w przestrzeń podtwardówkową. W tym protokole do podawania zabiegu stosuje się cewniki downętrzne, które prowadzą urządzenie stymulujące do pozycji lub wstrzykują hydrożel (rysunek 3C).
UWAGA: Utrzymuj wyraźne pole widzenia, nieustannie usuwając krew i/lub płyn mózgowo-rdzeniowy po durotomii. - Upewnij się, że końcówki cewników są widoczne pod oponą twardą przed przejściem do rdzenia kręgowego. Skuteczne zastosowanie oznacza płynne przesuwanie cewników przez małe naczynia krwionośne kręgosłupa pod błoną twardówkową.
- Po podaniu pożądanego zabiegu (rysunek 3D,E) umieść kawałek sterylnej chirurgicznej pianki żelowej w przestrzeni utworzonej po laminektomii, aby wspomóc haemostazę, gojenie ran i utrzymanie struktury kręgosłupa.
- Po nałożeniu pianki żelowej użyj szwu 4-0 z poligsanonem, aby zamknąć warstwę mięśni i skóry powyżej kręgosłupa.
7. Opieka pooperacyjna
- Codziennie kontroluj zwierzęta i podawaj niezbędne leki pooperacyjne (buprenorfinę w razie potrzeby; enrofloksacyna i meloksykam do 5 dni). Podaj 1-3 mL soli fizjologicznej podskórnie w razie potrzeby (jeśli <10% masy ciała zostanie spożyte przez 24 godziny w okresie pooperacyjnym).
- W zależności od zabiegu monitoruj funkcjonowanie pęcherza, ruchów, skalę grymasu oraz wszelkie inne oznaki dobrostanu zwierząt.
- Usuń szwy skórne około 10-14 dni po operacji.
Wyniki
Proponowany protokół został zastosowany w dwóch różnych warunkach eksperymentalnych. Przedstawione dane są reprezentatywne dla grup nieuszkodzonych, ponieważ celem było wykazanie, że manipulacje podtwardówkowe opisane w procedurze (w przypadku braku modelu urazu) nie uszkadzają funkcji. U szczurów Sprague-Dawley w wieku 6-8 tygodni wszczepiono urządzenie bioelektroniczne (rysunek 1A) lub dostarczono hydrożel (rysunek 1B). Funkcje motoryczne tych zwierząt porównano z osobami kontrolnymi, które przeszły fikcyjną operację bez zabiegu podtwardówkowego, stosując skalę funkcji ruchowych BBB. Przedstawionych jest tu kilka grup zwierząt, co pokazuje skuteczność każdej procedury oraz jej bezpieczeństwo. Po każdym zabiegu wszystkie zwierzęta utrzymywały prawidłową funkcję motoryczną bez różnic w wyniku BBB między grupami 7 dni po zabiegu, co świadczy o bezpiecznym zastosowaniu opisanego protokołu. Ponadto przedstawiono grupę zwierząt (rysunek 4C) wykazujących upośledzoną funkcję ruchową kończyn tylnych do porównania z grupami procedur podtwardówkowych, aby dodatkowo wykazać, że w grupach eksperymentalnych nie zaobserwowano żadnych skutków niepożądanych. Grupa ta otrzymała zabieg stłuczenia rdzenia rdzeniowego z urządzeniem uderzeniowym o sile 175 kdyn, jak opisano w wcześniejszej literaturze12,13.
Implant bioelektroniczny
Do implantacji urządzenia protokół obejmuje utworzenie dwóch miejsc po durotomii – jednego do wejścia cewnika, drugiego do wyjścia – aby ułatwić ruch cewników prowadzących pod oponą twardą oraz kontrolowane umieszczenie urządzenia. Urządzenie bioelektroniczne składało się z dwóch rozgałęzionych ramion połączonych z interfejsem PCB, który był otoczony biokompatybilną obudową. Ramiona są tymczasowo połączone z małymi cewnikami wewnątrztekalnymi za pomocą jedwabnego szwu 7-0, co ułatwia ustawienie implantu. Cewniki są powoli przeciągane przez otwory po rostralnej durotomii, przesuwane pod oponą twardą i przez otwory wyjściowe po durotomii ogonowe do miejsca leczenia. Następnie przymocowane ramiona implantów były przeciągane i umieszczane na każdym półprzekroju rdzenia kręgowego. Koniec implantu jest przyszyty do mięśnia połączonego z wyrostkiem T13. Obudowa jest przyszyta do mięśnia trapezowego/najszerszego (rostral) od ramki laminektomii. Następnie otoczenie jest zamykane u podstawy jednostki obudowej, aby umożliwić dostęp z zewnątrz.
Leczenie hydrożelem
Do dostawy hydrożelu potrzebny jest jedynie punkt wejścia. Hydrogel był podawany za pomocą podobnych cewników wewnątrztekowych umieszczonych w tym samym miejscu co urządzenie stymulujące. Cewniki były ładowane 10 μL poloksameremhydrożelu 12 i wprowadzane do przestrzeni podtwardówkowej w taki sam sposób jak podczas implantacji urządzenia. Po umieszczeniu cewniki były powoli cofane, podczas gdy hydrożel był nieprzerwanie uwalniany pod oponówką twardą (Rysunek1B) na każdy półpępowin. Po każdym zabiegu zwierzęta były monitorowane przez 7 dni, aby zapewnić odpowiednią regenerację.
Do oceny funkcji motorycznych16 zastosowano skalę Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) z 21 punktami. Zwierzęta w obu grupach były oceniane przed zabiegiem (stan wyjściowy) oraz w ciągu 1, 3 i 7 dni po operacji. Zachowanie na otwartym polu oceniano bezpośrednio oraz za pomocą zaślepionych nagrań wideo. Wyniki funkcji ruchowych zarówno dla lewej, jak i prawej kończyny tylnej w każdej grupie porównano z nieoperowanymi zwierzętami kontrolnymi oraz osobną grupą z ICI, aby określić zakres ewentualnych skutków niepożądanych operacji. Zwierzęta z grupy z implantami lub hydrożelemi nie wykazały deficytu funkcji ruchowej po żadnym z tych zabiegów, w porównaniu z kontrolami bez operacji lub uszkodzonymi zwierzętami rdzenia rdzeniowego. Warto zauważyć, że analiza histologiczna potwierdzająca brak uszkodzenia rdzenia kręgowego została już opublikowana w naszych wcześniejszych badaniach. Badanie wykazało, że stosowanie tej metody do wszczepienia urządzenia nie powoduje dodatkowego urazu rdzenia kręgowego nawet do 7 dni po zabiegu11. Po implantacji urządzenia zaobserwowano minimalne zmiany aktywności astrocytów (GFAP) oraz mikroglej/makrofagów (Iba1) w porównaniu z osobami kontrolnymi. Badana była także powierzchnia i zaokrąglenie przekrojów rdzenia wieńcowego bezpośrednio pod implantem, nie wykazując zmian morfologicznych.
Rysunek 1: Strategie leczenia podtwardówkowego. (A) Przykład urządzenia implantowego oraz (B) cewnik/strzykawka użyta do wstrzyknięcia hydrożelu. (C) Reprezentatywne modele zarówno implantu, jak i wszczepienia hydrożelu do rdzenia kręgowego szczura. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 2: Obrazy laminektomii, przedstawiające pole chirurgiczne. (A) Orientacja zwierzęcia do zdjęć chirurgicznych na Rysunkach 2 i 3. (B) Punkty orientacyjne ścięgien mięśniowych dla lokalizacji procesu T13, które mają pomóc rozpoczęciu sekcji mięśnia. (C) cięcia prostopadłe w celu identyfikacji każdego wyrostka do usunięcia za pomocą laminektomii. (D) Kanały mięśniowe przecięte równolegle do wyrostków kręgosłupa, aby umożliwić dostęp do płytek kostnych w celu usunięcia. (E) Bulldog serrefine klipsy używane do powstrzymywania mięśni/skóry po obu stronach kręgosłupa, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń chirurgiczną. (F) Usunięcie białych ścięgien łączących każdy proces przed rozpoczęciem laminektomii. (G) Pole chirurgiczne na początku laminektomii, gdy rongeury są wsuwane pod płytkę T12, aby rozpocząć cięcie kości. (H) Pierwsza połowa procesu T12 została usunięta, aby odsłonić rdzeń kręgowy i zapewnić chirurgowi odpowiednią przestrzeń do ruchu rostralnego i rozpoczęcia usuwania pozostałych wyrostków (T11/T10). (I) Usunięcie części czaszkowej T12 wraz z całkowitym usunięciem segmentu. (J) Laminektomia w połowie zakończona w T11 z użyciem szerszych cięć do zastosowania przykładowego stłuczenia SCI. (K) Kompletna laminektomia po usunięciu segmentów T10-T12, całkowicie odsłaniająca grzbietową powierzchnię rdzenia kręgowego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 3: Kroki wykonania durotomii i stosowania leczenia celowanego. (A) Schemat lokalizacji otworów w kości twardej rdzenia kręgowego. (B) Pole chirurgiczne pokazujące, że igła 27 G przebija dęporządek twardy, tworząc durotomię; odbywa się to po obu stronach centralnego naczynia krwionośnego, jak widać w (A). (C) Początkowe wprowadzenie cewnika używanego do leczenia. (D) Urządzenie do stymulacji elektrycznej umieszczone na rdzeniu kręgowym. (E) Cewniki wypełnione hydrożelem do wstrzykiwania na powierzchnię rdzenia kręgowego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 4: Stan pooperacyjny i funkcje motoryczne. (A) Reprezentatywne obrazy zwierząt po wszczepieniu urządzenia i dostawie hydrogelu. (B) Reprezentatywne wyniki BBB zwierząt z urazem stłuczenia kręgosłupa w porównaniu ze zwierzętami, które przeszły zabieg podtwardówkowy (implant lub hydrożel) lub kontrolne zwierzęta bez manipulacji. Wielkość próbek kontrolnych (nieoperowanych), SCI i Implant wynosiła n = 5, a wielkość próbki grupy hydrożelowej to n = 3. Paski błędu reprezentują błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek uzupełniający 1: Narzędzia chirurgiczne. Zdjęcie używanych narzędzi chirurgicznych. (1) skalpel #10 blade. (2) Vannas mikro nożyczki. (3) Kleszcze Graefe. (4) Klipsy Serrefine bulldog. (5) Rongeurs. (6) Igła 27 G do durotomii. (7) Cienkie kleszcze. (8) 1 ml strzykawki do podawania soli fizjologicznej w razie potrzeby. (9) Nożyczki do sekcji. (10) Hemostaty do szycia. (11) Ostre patyczki watowe. (12) Wysterylizowane waciki. (13) Rolowane chusteczki bez kłaczków. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.
Rysunek uzupełniający 2: Przestrzeń podtwardówkowa vs. znieczulenie zewnątrzoponowe. Schematyczne przedstawienie kręgosłupa i rdzenia kręgowego, pokazujące znieczulenie zewnątrzoponowe vs. Przestrzeń podtwardówkowa. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metodologia zawiera krok po kroku instrukcje dotyczące dostępu do przestrzeni podtwardówkowej kręgosłupa i demonstruje jej bezpieczeństwo oraz wykonalność poprzez dwa przykłady leczenia w okolicy piersiowej rdzenia kręgowego11,12. Wiele grup badawczych opracowało metody leczenia urazów rdzenia kręgowego (SCI) za pomocą interwencji elektrycznych lub chemicznych. Obecne strategie, w tym urządzenia wszczepiane do optogenetyki17 lub stymulacji elektrycznej18, a także terapie farmaceutyczne wykorzystujące hydrożele19,20, wykazały różny stopień skuteczności w ułatwianiu powrotu do zdrowia i rehabilitacji. Jednak precyzyjne celowanie pozostaje kluczowym wyzwaniem, ponieważ większość obecnych metod leczenia jest wykonywana poza przestrzenią podtwardówkową. Opisana tutaj technika oferuje obiecujące podejście do bezpośrednich interwencji do rdzenia kręgowego, w tym możliwość długoterminowego dostępu do przestrzeni podtwardówkowej (Rysunek Uzupełniający 2), wspierającą trwałe i ukierunkowane podawanie środków terapeutycznych w leczeniu SCI i schorzeń neurodegeneracyjnych. Ma to istotne implikacje dla obejścia bariery krwio-rdzeń kręgowy, co stanowi poważne wyzwanie w opracowywaniu skutecznych terapii chorób rdzenia kręgowego.
Laminektomia
Chociaż procedury laminektomii u gryzoni są powszechnie stosowane 17,21,22, istnieje kilka kluczowych aspektów protokołu, które należy uwzględnić. Anatomiczne punkty orientacyjne użyte w powyższym protokole (krok 4.3; Rysunek 2A) umożliwiają dostęp do dolnej części klatki piersiowej rdzenia kręgowego i są specyficzne dla pracy naszej grupy. Jeśli zabieg ma być stosowany w innym obszarze kręgosłupa, można policzyć segmenty rostralne lub ogonowe do początkowych kręgów, aby określić lokalizację. Kolejnym istotnym czynnikiem jest zakres usuwania błonki. Aby zminimalizować ryzyko niepożądanego uszkodzenia rdzenia kręgowego podczas zabiegu, należy usunąć co najmniej dwa ciągłe poziomy. Dzięki temu zapewnia się wystarczająca przestrzeń na durotomię i zapewnia prawidłową wizualizację. Ta ostrożność zmniejsza ryzyko uszkodzenia małych naczyń krwionośnych podczas zakładania cewnika. Należy również unikać nadmiernego usuwania kości ze ściany bocznej kręgosłupa, aby zapobiec niepotrzebnemu krwawieniu lub niestabilności kręgosłupa po operacji. Dzięki zachowaniu równowagi między odpowiednim dostępem a minimalnym zakłóceniem, procedura zapewnia bezpieczniejsze i precyzyjniejsze prowadzenie leczenia.
Durotomia i założenie cewnika
Wykonanie durotomii wymaga precyzji, aby uniknąć penetracji rdzenia kręgowego. Nieprawidłowe założenie może prowadzić do siniaków lub rozcięcia rdzenia kręgowego lub naczyń podtwardówkowych. Otwory powstałe w twardości twardej powinny być wystarczająco duże, aby pomieścić pożądaną strategię leczenia, w tym przypadku średnicę cewników wewnątrztekalnych, bez naruszania integralności błony. Podczas wykonywania durotomii płyn mózgowo-rdzeniowy może wyciekać podczas przebicia mięśnia twardego; jednak ilość jest minimalna. Chociaż duże pęknięcia w oponie twardej mogą powodować komplikacje, wcześniejsza literatura sugeruje, że drobne nakłucia, takie jak te stosowane w opisanym protokole (krok 6.4), mogą same się leczyć poprzez depozycję kolagenu/unaczynienie23, co skutkuje niewymierzalnymi skutkami niepożądanymi po zabiegu. Podczas zakładania cewników muszą być one umieszczone jak najbardziej równolegle do rdzenia kręgowego, aby zminimalizować ryzyko urazu spowodowanego bezpośrednią siłą. Ostrożne obchodzenie się jest niezbędne, aby zapobiec zginaniu lub zaciskaniu, zapewniając płynne włożenie i prawidłowe ustawienie.
Opieka pooperacyjna
Opieka pooperacyjna po zabiegu jest ważnym czynnikiem, ponieważ gryzonie zazwyczaj są trzymane grupowo w standardowych warunkach. Agresywne zachowania lub interakcje społeczne po tym zabiegu mogą wpływać na wyniki eksperymentów, w zależności od rodzaju zastosowanego leczenia. Protokół ten skutkuje powstaniem 6-8 cm szwów skórnych wzdłuż grzbietu zwierzęcia. Zaleca się trzymanie zwierząt mieszkających w jednym domu przez 7-10 dni po operacji, aby umożliwić gojenie ran i zapobiec ewentualnemu usuwaniu szwów przez towarzysza w klatce. W przypadku podawania leku, po zagojeniu się nacięcia, można je przenieść do poprzednich grup bez jawnie agresywnego zachowania czy komplikacji związanych z zabiegiem. W przypadku urządzeń wszczepialnych zwierzęta powinny być trzymane wyłącznie w grupach po 2. Stwierdziliśmy, że trzymanie zwierząt w grupach po 3 osoby lub więcej może prowadzić do powikłań związanych z agresją i efektami leczenia.
Zastosowania zabiegowe
Chociaż opisany tutaj zabieg koncentruje się na rdzeniu kręgowym i dwóch konkretnych strategiach leczenia, jest on adaptowalny dla innych obszarów kręgosłupa oraz dodatkowych zastosowań terapeutycznych. Podobne zabiegi laminektomii zostały pomyślnie przeprowadzone na różnych poziomach kręgosłupa w modelach gryzoni. Jednak niewielka przestrzeń podtwardówkowa u gryzoni stanowi wyzwanie, pozostawiając minimalne pole do błędów podczas podawania zabiegu. Chociaż etapy laminektomii i durotomii mogą być łatwo wykonane przez osoby z doświadczeniem w operacjach gryzoni, precyzyjne umieszczenie urządzenia lub leku pod oponą twardą bez powodowania urazu może wymagać dodatkowego czasu szkolenia. Oprócz szkolenia chirurgicznego istnieje kilka czynników, które mogą pomóc w zastosowaniu leczenia. Utrzymanie wyraźnego pola widzenia podczas stosowania zabiegu jest kluczowe. Upewnij się, że podczas stosowania cewników wewnątrztekalnych, jak opisano w tym badaniu, nie ma na nich postrzępionych ani szorstkich miejsc przed włożeniem ich pod oponę twardą. Jak wspomniano wyżej, lokalizacja durotomii jest niezwykle ważna. Im dalej znajduje się miejsce wejścia cewnika od pozostałej szlaszki rostralnej, tym łatwiej cewniki są ustawione i pozostają równoległe do rdzenia kręgowego podczas zakładania. Należy również uwzględnić termin stosowania strategii leczenia w związku z urazem. Przyszłe prace będą obejmować wdrożenie tych procedur u zwierząt w różnych momentach po urazie, aby umożliwić późniejszą ocenę terapii mających na celu leczenie przewlekłych urazów. Protokół ten stanowi istotny postęp w leczeniu chorób neurologicznych rdzenia kręgowego i zapewnia wszechstronne oraz precyzyjne podejście do bezpośredniego leczenia tkanek rdzenia kręgowego.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Prace te są finansowane przez CatWalk Spinal Cord Injury Trust oraz stypendium badawcze HRC Sir Charles Hercus Research Fellowship (BH). Prace te były również wspierane przez Zastępcę Sekretarza Obrony ds. Zdrowia, zatwierdzonego przez Departament Obrony, na kwotę 534 258 USD, poprzez Program Badań nad Urazami Rdzenia Kręgowego w ramach Nagrody nr HT9425-23-1-0492. Schematy na Rysunkach 2A i 3A zostały wygenerowane przy użyciu Biorender.com. Urządzenia bioelektroniczne użyte w tej publikacji zostały zaprojektowane i dostarczone przez dr Marię Asplund oraz Lukasa Mattera z Chalmers University of Technology.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 mL i 3 mL strzykawki | Amtech | ||
| 1ml strzykawek tuberkulinowych | BD | 302100 | |
| 2 x kleszcze Graefe | FST | 11051-10 | |
| Igły 25G do podawania leków | Nipro | SH811 | |
| Igły 27G do nacięcia oponowego | Nipro | SH816 | |
| 6 x zaciski Tissue bulldog | FST | 18051-28 | |
| 70 % etanolu | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Rękawice lateksowe Biogel Surgeons | Molnlycke | 822775-01 | |
| Bupivicaine 2 mg/kg | Aspen, Nowa Zelandia | 2023-02 | |
| Buprenorfina 0,05 mg/kg | Ceva (Vetergesic) | 9000320 | |
| Nalewka chlorheksu i ehtanolu | Perrigo | K076A | |
| Chlorheks scrub | Schulke | LBL11258 | |
| Zakrzywione rongeury | FST | 16021-14 | |
| Kleszcze Dumont #4 | FST | 11294-00 | |
| Żelowa piana, sterylna, wchłaniająca gąbka żelatynowa | ŻELOWA PIANA | 09-0342-04-015 | |
| Strzykawka Hamiltona | Hamilton | 80314 | |
| Poduszka grzewcza (37 oC) | Kent Scientific | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Impaktor Infinite Horizon i oprogramowanie | Precyzyjne systemy i instrumentacja (PSI) | IH-0400 | |
| Izofluran | Medsource | nieznane | |
| Metacam 2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| Szwy niewchłaniające (Ethilon 4-0, P-3) | Ethicon | 1603G | |
| O2 tank | |||
| Mikroskop chirurgiczny Omax | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Prasuj i zamykaj folię spożywczą do drapowania | Cieszę się. | Nie ma | |
| Rękojeść skalpela | Narzędzia Nauki Wysokiej (FST) | 10004-13 | |
| Ostrza skalpela rozmiaru 10 | Amtech Medical | SH070 | |
| Zestaw Indukcyjny Somnoflow | Kent Scientific | SF-01 | System znieczulenia o niskim przepływie |
| Sterylne podkładki chłonne i wata | Szwajcarzy | Nie ma | |
| Sterylne patyczki wacikowe (standardowe + spiczaste) | help@hand | Nie ma | |
| Sól fizjologiczna sterylna 0,9% | Wykonane i poddane autoklawowi w laboratorium | Nie ma | |
| Sterylne fragmenty zwiniętego Kim Wipe'a | Nauka Kimtech | 34155 | |
| Sonda temperaturowa | Kent Scientific | SF-01 | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15903-08 | |
| Smar na bazie wody | |||
| Wagi | Dowolny | Nie ma |
Bibliografia
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nat Rev Dis Primers. 3, 17018(2017).
- Lee, B. B., Cripps, R. A., Fitzharris, M., Wing, P. C. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: Update 2011, global incidence rate. Spinal Cord. 52 (2), 110-116 (2014).
- Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi-Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 282(2019).
- Chari, A., Hentall, I. D., Papadopoulos, M. C., Pereira, E. A. Surgical neurostimulation for spinal cord injury. Brain Sci. 7 (2), 18(2017).
- Krucoff, M. O., et al. Spinal cord stimulation and rehabilitation in an individual with chronic complete L1 paraplegia due to a conus medullaris injury: Motor and functional outcomes at 18 months. Spinal Cord Ser Cases. 6 (1), 96(2020).
- Chalif, J. I., et al. Epidural spinal cord stimulation for spinal cord injury in humans: A systematic review. J Clin Med. 13 (4), 1090(2024).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nat Med. 29 (3), 689-699 (2023).
- Calvert, J. S., Grahn, P. J., Zhao, K. D., Lee, K. H. Emergence of epidural electrical stimulation to facilitate sensorimotor network functionality after spinal cord injury. Neuromodulation. 22 (3), 244-252 (2019).
- Capogrosso, M., et al. Advantages of soft subdural implants for the delivery of electrochemical neuromodulation therapies to the spinal cord. J Neural Eng. 15 (2), 026024(2018).
- Kwiecien, J. M., et al. Neuroprotective effect of subdural infusion of serp-1 in spinal cord trauma. Biomedicines. 8 (10), 372(2020).
- Harland, B., et al. A subdural bioelectronic implant to record electrical activity from the spinal cord in freely moving rats. Adv Sci (Weinh). 9 (20), e2105913(2022).
- Meissner, S., et al. Safe subdural administration and retention of a neurotrophin-3-delivering hydrogel in a rat model of spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), 25424(2024).
- Harland, B., et al. Daily electric field treatment improves functional outcomes after thoracic contusion spinal cord injury in rats. bioRxiv. , (2024).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. 78, e50111(2013).
- Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection. J Vis Exp. (205), e66463(2024).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Shalileh, S., Moallemi, A., Tsuyuki, B., Simard, A. A. P., Shahriari, D. Implantation of optoelectronic devices in the rodent spinal cord. J Vis Exp. (209), e66992(2024).
- Hachmann, J. T., et al. Epidural spinal cord stimulation as an intervention for motor recovery after motor complete spinal cord injury. J Neurophysiol. 126 (6), 1843-1859 (2021).
- Ye, J., et al. Rationally designed, self-assembling, multifunctional hydrogel depot repairs severe spinal cord injury. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100242(2021).
- Wu, W., et al. Supramolecular hydrogel microspheres of platelet-derived growth factor mimetic peptide promote recovery from spinal cord injury. ACS Nano. 17 (4), 3818-3837 (2023).
- Pietruczyk, E. A., Stephen, T. K. L., Alford, S., Lutz, S. E. Laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse. J Vis Exp. (152), e58330(2019).
- Zhou, X. H., et al. Design and evaluation of a novel laminectomy auxiliary device based on rats. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 28 (3), 621-628 (2020).
- Ahmadi, S. A., et al. The effect of L-arginine on dural healing after experimentally induced dural defect in a rat model. World Neurosurg. 97, 98-103 (2017).
Przedruki i uprawnienia
