Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Krio-elektronowa tomografia (cryoET) była stosowana w ostatnich dekadach do rejestrowania zdjęć kompleksów białkowych, wirusów, komórek i organizmów. CryoET, będąca metodą mikroskopii krioelektronowej (cryoEM), to metoda biologii strukturalnej, w której próbka biologiczna jest szybko zamrażana, a następnie obrazowana w różnych orientacjach za pomocą pochylenia ^1,2,3. Obrazy wykonane w każdej orientacji są następnie obliczeniowo wyrównywane do wspólnej osi nachylenia i rekonstruowane w tomogram, aby uzyskać trójwymiarowy widok⁴.

Podczas gdy krystalografia rentgenowska i cryoEM pojedynczych cząstek wymagają oczyszczonych, strukturalnie jednorodnych cząsteczek, cryoET może obrazować cząsteczkę bezpośrednio w jej natywnym kontekście⁴. Dlatego jedną z głównych zalet cryoET jest jego zdolność do wizualizacji próbek pleomorficznych, takich jak wirusy błoniaste, w tym grypa ^5,6,7. Kolejną zaletą cryoET jest zdolność do obrazowania na różnych skalach. Chociaż tomogramy zazwyczaj nie są rozdzielane powyżej 5-10 nm⁸, całkowanie uśredniania subtomogramów, gdzie kopie tej samej cząstki są identyfikowane, wyrównywane i uśredniane, może skutkować niemal atomową rozdzielczością w niektórych cząsteczkach biologicznych, takich jak rybosomy ^9,10. Jednak tylko ograniczone typy cząsteczek mogą osiągnąć tę rozdzielczość; średnie wartości subtomogramu zazwyczaj nie przekraczają rozdzielczości 10-15 Å. Dla porównania, cryoEM pojedynczej cząstki rutynowo osiąga rozdzielczość 3-4 Å po rewolucji rozdzielczości¹¹. Najnowsze osiągnięcia zarówno w zakresie wyższej przepustowości oprogramowania do pozyskiwania i analizy danych cryoET, umożliwiły określenie struktury struktury dodatkowych cząsteczek biologicznych w rozdzielczości subnanometrowej w ich natywnym kontekście 12,13,14,15,16,17,18.

Jednym z powszechnych zastosowań cryoET jest wizualizacja morfologii, organizacji i struktury wirusa. Pomimo niższej rozdzielczości oferowanej przez tę technikę w porównaniu z krylografią pojedynczą, krylografią rentgenowską lub krystalografią rentgenowską, cryoET w połączeniu ze średnią subtomogramową może dostarczyć informacji o zachowaniu białek wirusowych w ich środowisku rodzimym oraz dostarczyć kluczowych informacji o ich organizacji w kontekście wirionu. Częstym celem krioET wirusów są glikoproteiny powierzchniowe, które są powszechnie wykorzystywane do przyczepiania i fuzji komórek gospodarza, ponieważ często są głównymi antygenami i celami terapii lub szczepionek. Dzięki ostatnim postępom w pakietach przetwarzania krioET, coraz bardziej możliwe staje się osiągnięcie średnich rozdzielczości subnanometrów dla tych glikoprotein: 19,20,21,22. Przykładem jest hemaglutynina (HA), główne białko na powierzchni wirionów grypy. To białko nie tylko przewodzi zarówno wiązaniu receptorów, jak i fuzji błonowej, ale także pokrywa wirion w niezwykle gęsty sposób, z setkami do tysięcy HAs na pojedynczym wirionie⁵. Protokół przedstawiony tutaj (Rysunek 1) integruje kilka powszechnie używanych pakietów z własnymi skryptami, aby wyznaczyć etapy od wstępnego przetwarzania do udoskonalania modelu, tworząc subtomogramową średnią HAA grypy.

UWAGA: Przykładowe zbiory danych użyte dla tego protokołu są dostępne pod adresem EMPIAR-12864, który obejmuje dwa zestawy serii pochylenia używane dla tego protokołu. Serie tilt są zbierane z ręcznie zanurzanych siatek oczyszczonego wirusa grypy A o fizycznym rozmiarze piksela 2,09 Å/piksel, aby zapewnić wystarczająco duże pole widzenia, aby każda seria tilt zawierała kilka wirionów, a także aby uzyskać rekonstrukcje o najwyższej rozdzielczości. W przypadku własnych zbiorów danych użytkowników zaleca się rozpoczynanie pracy od surowych filmów tilt. Zbiory danych były przetwarzane i wizualizowane za pomocą wysokowydajnych stacji roboczych. Tabela materiałów zawiera informacje o sprzęcie i oprogramowaniu używanym w tym protokole. Wszystkie pakiety oprogramowania używane w tym protokole są open source i dostępne do pobrania; Linki do instalacji i instrukcje są wymienione w Tabeli Materiałów. Zalecana stacja robocza do przetwarzania zestawów danych cryoET powinna być wyposażona w co najmniej 8-rdzeniowy procesor, dedykowaną kartę GPU z 6 GB VRAM, 64 GB RAM oraz 2 TB lokalnej pamięci.

1. Wstępne przetwarzanie danych filmów pochylenia i rekonstrukcja tomogramów krioelektronowych w Warp ²³ i IMOD ²⁴

1. W terminalu aktywuj środowisko conda, które ma zainstalowany Warp, używając następującego polecenia:
   conda activate warp_environment
2. Stwórz plik ustawień serii klatek do przetwarzania serii klatek. Jest to plik konfiguracyjny zawierający metadane dotyczące mikroskopu, lokalizacji danych do przetwarzania oraz miejsca przechowywania plików wyjściowych.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   UWAGA: Dane te zostały zebrane w trybie superrozdzielczości.
3. Przeprowadz estymację i korekcję ruchu za pomocą funkcji transferu kontrastu (CTF).
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   UWAGA: m_grid parametr powinien odpowiadać liczbie podklatek w filmie tilt – nasze zbiory danych składały się z 5 podklatek na film tilt.
4. Importuj metadane serii tilt, aby WarpTools mógł zidentyfikować, które filmy należą do której serii tilt.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. Po założeniu folderu tomostar utwórz plik ustawień serii tilt do przetwarzania serii tilt
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Zapisuj stosy pochylające i wykonuj automatyczne wyrównanie serii pochyleń opartych na fiducialnym systemie, korzystając z programu batchruntomo IMOD z użyciem graficznego interfejsu Etomo²⁴.
   1. Wykonaj następujące polecenie w terminalu:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      UWAGA: Tiltseries zostały wyeksportowane z 4x fizycznym rozmiarem pikseli, aby skrócić czas wyrównania i zasoby obliczeniowe.
   2. Wybierz przykładowy zbiór danych, aby najpierw ustawić parametry wyrównania przed zastosowaniem ich jako szablonu dla batchruntomo.
   3. Importuj parametry wyrównania z IMOD, jeśli używasz batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      UWAGA: W tym zbiorze danych korzystanie z GUI Etomo dawało lepsze wyniki niż wrappery w WarpTools.
   4. Alternatywnie, wykonaj automatyczne wyrównanie serii bez fiducialnych nachyleń za pomocą wrappera AreTomo²⁵ w WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      UWAGA: Otoczka AreTomo została przetestowana z AreTomo1.3.4.
7. Wykonaj następujące polecenie w terminalu, aby oszacować parametry CTF dla serii tilt:
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. Rekonstruuj tomogramy za pomocą WarpTools.
   1. Ustaw zmienną środowiskową:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      UWAGA: Ten etap zapewnia, że tomogramy będą kompatybilne z kolejnymi etapami przetwarzania i wizualizacji obrazów w innych programach używanych w tym protokole.
   2. Aby zrekonstruować tomogramy, wykonaj w terminalu: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Powtórz kroki 1.2 - 1.8.2 dla wszystkich zbiorów danych.

2. Wstępne przetwarzanie tomogramów i wybieranie cząstek

1. W terminalu aktywuj środowisko conda z zainstalowanym IsoNet²⁶ .
   conda activate isonet_env
2. Przygotuj się do przetwarzania tomogramów, najpierw tworząc podfolder i przenosząc do niego wszystkie tomogramy.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Wygeneruj plik gwiazdki w folderze projektu.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. Za pomocą edytora tekstu otwórz wygenerowany plik gwiazdy i wpisz przybliżoną wartość defokusu dla obrazów o nachyleniu 0 stopni w czwartej kolumnie (_rlnDefocus) dla każdego tomogramu, którą można znaleźć w pliku processed_items.json w folderze warp_tiltseries.
   UWAGA: Wartość defokusu powinna być w angstromach dla IsoNet. Warp zapisuje wartości defokusu w μm, co wymaga współczynnika mnożenia 10 000.
5. Uruchom komendę dekonwoluacji CTF w terminalu.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. Po dekonwolwacji inicjuj interfejs EMAN2^{GUI 27} , aby rozpocząć wstępne przetwarzanie tomogramów do pobierania cząstek.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. W sekcji Tomografia kliknij lewym przyciskiem na strzałkę obok Surowe dane i wybierz Import Tomograms z menu rozwijanego.
8. Kliknij lewym przyciskiem na strzałkę obok Segmentacji i wybierz tomogramy wstępne.
   UWAGA: Domyślne parametry prawdopodobnie są odpowiednie dla wielu zbiorów danych. Dla tych tomogramów zastosowano filtr dolnoprzepustowy o częstotliwości 4 Å i obrazy nachylenia zostały znormalizowane. Po wstępnym przetwarzaniu katalog informacji zostanie automatycznie wygenerowany przez EMAN2 z pustymi plikami .json (o podobnych nazwach bazowych jak pliki wstępnie przetworzone). Angpix musi zostać dodany do plików json przed wyborem cząstek.
9. Wytrenuj sieć neuronową splotową (CNN) do rozpoznawania glikoproteiny HA.
   1. Zmień katalog roboczy na lokalizację tomogramów przeznaczonych do treningu CNN i wyboru cząstek:
      cd path/to/tomograms
   2. Użyj terminala, aby otworzyć okno szkoleniowe CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Potwierdź, że cztery okna są otwarte: jedno zawiera informacje o parametrach CNN i tomogramach w katalogu, a pozostałe trzy okna zawierają obrazy dobrych odniesień (Dodatnie), złych odniesień (Negatywne) oraz cząstek wybranych przez CNN (Cząstki).
   4. Kliknij lewym przyciskiem przycisk Nowy w interfejsie CNN, aby zainicjować nowy CNN. Ustaw domyślną szybkość uczenia się na 0,0001, a rozmiar pudełka na 8.
   5. W kolumnie FileName kliknij lewym przyciskiem na reprezentatywny tomogram, aby otworzyć go w nowym oknie.
      UWAGA: Otwarcie może być tylko jedno tomogram naraz.
      1. Aby przejść przez oś z tomogramu, umieść kursor nad otwartym tomogramem i naciśnij kółko przewijania myszy, aby otworzyć nowe okno. Suwak oznaczony N# zmieni oś z.
   6. Na otwartym tomogramie wybierz 10-20 cech odpowiadających HA za pomocą lewego przycisku myszy w panelu Pozytywnych.
      UWAGA: Wybierz zarówno widok z góry, jak i z boku HA, które pojawiają się jako cylindry lub trójkąty nad membraną, jako dobre odniesienia do bardziej odpornej sieci.
      1. Obrazy pozytywnych odniesień pojawią się w oknie Pozytywne . Aby usunąć referencję, przytrzymaj Shift i kliknij lewym przyciskiem na obraz referencyjny.
   7. Przełącz się na panel negatywny i wybierz 10-20 odniesień odpowiadających cechom takim jak puste łaty błony, gęstość vRNP, markery fiducial i zanieczyszczenia.
      UWAGA: Odniesienia pojawią się w oknie Negatywne .
   8. Rozpocznij szkolenie CNN, klikając lewym przyciskiem przycisk Pociąg w głównym oknie.
      UWAGA: Liczba iteracji (Niter) w głównym oknie zmienia liczbę iteracji szkolenia, które przechodzi CNN. Polecam ustawić parametr na 50.
   9. Po wytrenowaniu CNN na wybranych odniesieniach, kliknij lewym przyciskiem Apply, aby użyć CNN do wyboru cząstek w otwartym tomogramie.
      UWAGA: Obrazy wybranych cząstek można zobaczyć w oknie Cząstek. Wybrane cząstki będą również wyświetlane na tomogramie niebieskimi kółkami.
   10. Kontynuuj wybieranie pozytywnych i negatywnych odniesień na podstawie zastosowanej sieci, okresowo zapisując postęp za pomocą przycisku Zapisz.
   11. Gdy będzie zadowolony, wybierz Apply All , aby CNN wybrało cząstki we wszystkich tomogramach w katalogu i oceniło wyniki na kilku tomogramach; Przeprowadzaj dodatkowe szkolenia w razie potrzeby.
10. Zapisz współrzędne do pliku tekstowego dla każdego tomogramu.
    1. Otwórz interfejs EMAN2 za pomocą e2projectmanager.py tego polecenia.
    2. Kliknij strzałkę obok Średnia Subtomogramu i kliknij Ręczny Boks.
    3. Wpisz nazwę tomogramu i kliknij Launch.
    4. Zapisz współrzędne do pliku tekstowego, wybierając Plik > Pole zapisu Koordynaty > tomogram_ha.txt.
    5. Przejdź do podfolderu neuralnets i podfolderu info, aby zrobić kopię nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf i boxes3dref.hdf.
11. Aby mieć pewność, że analiza jest przeprowadzana tylko na w pełni złożonych wirionach, gdzie widoczna jest obecność warstwy białka matrycy (M1) oraz kompleksu wirusowej rybonukleoproteiny (vRNP), należy wytrenować drugą sieć neuronową splotową do rozpoznawania białka M1.
    1. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.9, zmieniając rozmiar pudełka treningowego z 8 na 14.

3. Kuracja cząstek

1. Pobierz notatniki z https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
2. Otwórz notes CNN_Particle_Cleaning.ipynb i załaduj wymagane moduły.
   UWAGA: Skrypt wykorzystuje Open3D²⁸ jako pakiet do wizualizacji współrzędnych cząstek jako trójwymiarowych chmur punktów.
3. Ładuj pliki tekstowe odpowiadające współrzędnym HA i M1 oraz wyświetlaj je jako chmury punktów 3D za pomocą pakietu Open3D.
4. Filtruj odstające współrzędne HA za pomocą statystycznego usuwania odstających zgodnie z Open3D.
   UWAGA: Sugerowane wartości początkowe dla HA to nb_neighbors = 50 (liczba sąsiednich współrzędnych wokół współrzędnej) oraz std_ratio = 0,5.
5. Oblicz odległość między chmurami punktów HA i M1. Wszystkie współrzędne HA oddalone o więcej niż 20 pikseli od chmury punktów M1 zostaną wtedy zidentyfikowane jako odstępne. Wszystkie współrzędne cząstek niezidentyfikowane jako odstawione będą zapisywane w pliku wyjściowym .txt.
   UWAGA: 20 pikseli odpowiada przybliżonej odległości 16 nm przy rozmiarze piksela 8,35 Å/piksel. Środek filtra HA względem warstwy M1 w naszych tomogramach wynosi około 15 nm.
6. Połącz wszystkie cząstki i zapisz je jako pliki gwiazdowe używając pts2starfile.ipynb.

4. Iteracyjne uśrednianie i klasyfikacja subtomogramów

1. Za pomocą WarpTools wyodrębnij cząstki z współczynnikiem binningu 4 i przeprowadź początkowe rundy subtomogramu uśredniające w RELION4²⁹.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   UWAGA: Proponowany rozmiar pudełka to 48 x 48 x 48 pikseli, odpowiadający ~360 ųpudełku, które byłoby wystarczająco duże, by pomieścić tablicę o powierzchni 7-8 HA.
   1. Przekonwertowanie gwiezdnego pliku warp na plik zgodny z RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Generuj początkową referencję za pomocą relion_refine_mpi na podzbiorze cząstek.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Użyj relion_refine_mpi do przeprowadzenia 3D autofine'ów na subtomogramach.
      1. Przykładowe polecenie: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         UWAGA: Początkowe globalne i lokalne pobieranie próbek zostało ustawione na 7,5 i 1,8 stopnia, co odpowiada rzędowi healpix 4 i lokalnemu healpixowi 2. Początkowe udoskonalenia wykorzystują głównie silną gęstość błony, białka M1 oraz matrycy HA. Zakres przesunięcia translacji może być większy, aby uwzględnić wszelkie przesunięcia, które mogą wystąpić podczas wyrównywania tablicy.
   4. Powtarzaj dorafinowanie po zbieżności pierwszego etapu rafinacji, zmieniając translację na 8 i krok na 2.
2. Wykorzystanie klasyfikacji 2D do usuwania cząstek śmieciowych za pomocą relion_refine.
   1. Przykładowe polecenie: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      UWAGA: Zamiast klasyfikacji 3D zastosowano klasyfikację 2D, ponieważ jest ona bardziej wydajna obliczeniowo. Subtomogramy mogą być bezpośrednio używane jako wejście do zadania klasyfikacji 2D bez dodatkowego przetwarzania obrazu.
   2. Połącz klasy zawierające rozpoznawalną tablicę HA zawierającą cylindryczne HA, membrany i gęstość M1 za pomocą relion_star_handler.
   3. Po pierwsze, stwórz pliki gwiazdkowe zawierające dobre klasy.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. Następnie użyj następującego polecenia relion_star_handler, aby połączyć poszczególne pliki gwiazd.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Ponowne wyekstrahowanie w bin2 i odłączenie cząstek do iteracyjnego lokalnego dopracowywania.
   1. Dla udoskonalenia bin2 wyodrębnij cząstki o mniejszym rozmiarze pudełka 80 i przeprowadź lokalne wyszukiwanie z healpixem i lokalnym healpixem ustawionym na 4 (1,8 stopnia lokalne próbkowanie kątowe).
   2. Na tym etapie łącz zestawy cząstek z różnych zbiorów danych za pomocą relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. Po pierwszej rundzie udoskonalania należy utworzyć cylindryczną maskę z użyciem e2filtertool.py w środowisku EMAN2, obejmującą centralny HA oraz membranę i gęstość M1.
      UWAGA: Parametry używane dla maski cylindrycznej: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; wszystkie pozostałe parametry są nieoznaczone.
   4. Przeprowadź jeszcze jedną rundę dopracowywania z nałożoną maską.
   5. Przeprowadzić kolejną rundę klasyfikacji 2D, aby wyeliminować odstawcze niezgodne z centralnym HA oraz dodatkowe zanieczyszczenia.
   6. Powtórz proces z cząstkami niebindowanymi o rozmiarze pudełka 120 i tworzy miękką maskę pokrywającą centralne HA, wyrównuje odniesienie do symetrii C3 i stosuje symetrię na tym etapie dopracowywania.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      UWAGA: Ostateczna rozdzielczość osiągnięta za pomocą RELION wyniosła 6,1 Å.
4. Ostateczne udoskonalenie w MTools⁹
   1. Stwórz populację rafinacji (po aktywacji środowiska Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Dodaj źródła danych dla każdego zbioru danych.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Powtórz poprzedni krok z dodatkowymi zbiorami danych.
   3. Stwórz gatunek rafinacyjny.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Wielocząstkowe udoskonalanie.
      1. Pierwsza cząstka precyzyjnie pozuje za pomocą polecenia: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Następnie doprecyzuj zarówno pozy cząstek, jak i aberrację sferyczną za pomocą polecenia: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         UWAGA: Tutaj zakończono doprecyzowanie, ponieważ kolejne iteracje nie poprawiły rozdzielczości. Różne kombinacje parametrów, które nie zostały dokładnie przetestowane, mogą jednak nadal zwiększać wyniki.

5. Udoskonalanie modelu

1. Korzystając z ChimeraX³⁰, wgrano ostateczną mapę i model atomowy HA.
2. Mapuj i łącz wszystkie segmenty odpowiadające ektodomenie HA oraz użyj narzędzia Fit to Segments do dokowania w modelu HA.
   1. Zapisz przekształcone współrzędne modelu.
3. Otwórz interfejs Phenix³¹ i użyj narzędzia Real Space Refinement .
   1. Gdy pojawi się poproszenie o dodanie plików, dodaj przekształcony model HA i mapę, a następnie wypełnij rozdzielczość ostatecznej rekonstrukcji.
   2. Przeprowadzić pięć rund globalnej minimalizacji, lokalnego dopasowania rotamerów, dopracowywania zajętości oraz grupowego dopracowywania ADP.
4. Wizualizuj ostateczną rekonstrukcję i modeluj za pomocą ChimeraX.

Aby wykazać wykorzystanie tego protokołu przetwarzania (Rysunek 1), wcześniej opisany workflow zastosowano do dwóch zbiorów danych po 25 tomogramów połączonych, uzyskanych ze szczepu wirusa grypy A H1N1 (A/Portoryko/8/1934). Parametry zbierania danych przedstawiono w Tabeli 1. Rysunek 2 ilustruje reprezentatywny tomogram oraz powiększone widoki pleomorficznych wirusów grypy. Tomogram ten uchwycił różnorodne morfologie, ponieważ wiriony mają kształt od kulistych do owalnych/wydłużonych. Podczas gdy większość cząstek grypy zawiera dobrze zorganizowane zespoły M1 i vRNP, niektóre wiriony wydają się być bardziej nieuporządkowane i pozbawione kluczowych elementów strukturalnych.

Z tego zbioru danych użyto początkowego zestawu 40 995 subtomogramów do rekonstrukcji bin4 (8,35 Å/piksel) po wybraniu i kuracji cząstek. Oba zestawy danych były początkowo przetwarzane niezależnie w RELION4 z symetrią C1 i szeroką maską sferyczną obejmującą całą matrycę HA. Przeprowadzono trzy cykle dopracowywania tych subtomogramów, po których nastąpiła klasyfikacja 2D. Po klasyfikacji odrzucano słabo rozróżnione subtomogramy i cząstki śmieci; pozostałe subtomogramy zostały wyodrębnione w bin2 (4,17 Å/piksel) i oba zbiory danych zostały połączone. Subtomogramy Bin2 najpierw były wyrównywane razem w cyklu uśredniania subtomogramów, następnie zastosowano cylindryczną maskę wokół centralnego HA w celu ustawienia ostrości. Na tym etapie symetria trimeryczna może być wyraźnie widoczna dla rekonstrukcji HA. Dodatkowe rundy udoskonalania przeprowadzono w bin2 oraz przy prędkości 2,8 Å/pix. Przeprowadzono ostatnią rundę klasyfikacji 2D z małą maską zakrywającą tylko centralny trimer HA z wyrównanymi subtomogramami. Główna klasa, składająca się z ~94% pozostałych subtomogramów, została wyodrębniona do cząstek nieposegregowanych i poddana trójwymiarowej dopracowaniu z zastosowaniem symetrii C3. Na koniec te subtomogramy zostały wyeksportowane do M, gdzie przeprowadzono pozy cząstek i cykle dopracowywania aberracji sferycznej (Rysunek uzupełniający 1).

Ostateczna średnia subtomogramu (Rysunek 3A), składająca się z 15 970 cząstek HA, osiągnęła globalną rozdzielczość 6,0 Å oraz lokalny zakres rozdzielczości 5-7 Å (Rysunek 4). Model PR8 HA został elastycznie dopracowywany do gęstości; przy FSC=0,5 i FSC=0,143, rozdzielczość mapa-model wynosiła odpowiednio 8,1 Å i 6,6 Å. Architektura rekonstrukcji HA bardzo przypominała wcześniejsze mapy cryoEM i cryoET. W tej rozdzielczości można rozróżnić alfa-helisy i arkusze beta (Rysunek 3B); ponadto glikany można zacząć identyfikować w czterech miejscach glikozylacji na głowicy i łodydze HA (Rysunek 3C).

Nasze wyniki pokazują przydatność cryoET w rekonstrukcji HA z rodzimych wirusów grypy. Dzięki protokołowi zaobserwowano wyraźną gęstość cylindrycznego glikoproteiny prostopadłą do błony wirusowej, a rozdzielczość poprawiała się z każdym krokiem. Dla własnych danych sugeruje się, aby uśrednianie subtomogramu zaczynało się od zbinetowanego stosu cząstek, a wyniki powinny być ściśle monitorowane przy każdym cyklu dopracowywania. Jeśli gęstość glikoproteiny nie jest widoczna już na początkowych etapach, zaleca się odwzorowanie lokalizacji subtomogramu z powrotem na tomogram, aby zweryfikować dokładne położenie. W przeciwnym razie można dostosować parametry wyrównania lub wdrożyć dodatkowe etapy klasyfikacji, aby osiągnąć optymalne wyniki.

Rysunek 1: Ogólny przebieg uśredniania HA z kryoET wirusa grypy przez subtomogram .Górny panel przedstawia podsumowanie przepływu pracy dla dwóch zbiorów danych użytych do demonstracji protokołu. Drugi panel odpowiada Sekcji 1 protokołu, trzecia Sekcji 2-3, a czwarta Sekcji 4-5. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Reprezentatywny tomogram wirusa grypy PR8. (A) Przecięcie przez zrekonstruowany tomogram. Skala ma 100 nm. (B-D) Przybliżone na widok (B) kulistego, (C) cylindrycznego, (D) bezM1-bez-wirionowego wirionu PR8. Wszystkie paski skalowe w B-D odpowiadają 50 nm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Średnia subtomogramu PR8 HA. (A) Widok górny i boczny rekonstrukcji HA na dwóch poziomach konturowych, elastycznie wyposażony w pojedynczą strukturę krioEM PR8 HA. (B) Widoki przycięte przez rekonstrukcję HA. Kolorowe strzałki odpowiadają kolorowym ramkom. (C) Rekonstrukcja HA wykazana na niższym konturze, aby odsłonić gęstość glikanu. Pokazane są także zbliżenia glikanów w reprezentacji na mapie cryoET. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Estymacja rozdzielczości średniej subtomogramu HA. (A) Lokalna estymacja rozdzielczości średniej subtomogramu HA odwzorowanej na rekonstrukcję. Pasek kolorów przedstawia 5-7 Å na palecie niebiesko-biało-czerwonej. (B) Krzywe FSC półodwzorowań oraz rozdzielczości odwzorowania do modelu. Niebieska krzywa to odsłonięta rekonstrukcja, a czerwona to zamaskowana. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Parametry zbierania danych dla zestawów danych cryoET wirusa grypy PR8.

Rysunek uzupełniający 1: Workflow uśredniania subtomogramów dla HA. Iteracyjne wyrównanie, uśrednianie i klasyfikacja są przeprowadzane dla subtomogramów HA poprzez stopniowe rozwarstwianie się. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.