Method Article

Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

DOI:

10.3791/68636

⸱

November 7th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology, University of Massachusetts Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono protokół przetwarzania danych wirusów grypy obrazowanych za pomocą tomografii krioelektronowej oraz późniejszego uśredniania glikoproteiny hemaglutyniny subtomogramem. Protokół ten obejmuje proces krok po kroku, od wstępnego przetwarzania obrazu po ostateczne udoskonalanie modelu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia krioelektronowa jest potężnym narzędziem do wizualizacji próbek heterogenicznych, a jednym z głównych zastosowań jest charakteryzacja strukturalna wirusów pleomorficznych. W ostatnich latach subtomogramowe uśrednianie glikoproteiny wirusowych pojawiło się jako metoda bezpośredniej wizualizacji tych kluczowych białek na powierzchni nienaruszonych wirionów. Jednym z ważnych celów jest glikoprotein hemaglutyny (HA) wirusa grypy, który gęsto pokrywa otoczkę wirusa i odpowiada za wiązanie receptorów grypowych oraz fuzję błon. Chociaż średnie subtomogramów dotyczące HA grypy zostały zgłoszone, ich rozdzielczość była ograniczona ze względu na niski stosunek sygnału do szumu charakterystyczny dla krioET oraz ręczny wysiłek wymagany do analizy heterogennych wirusów grypy. Przedstawiono tutaj pipeline analizy cryoET, który integruje kilka pakietów oprogramowania do efektywnej i solidnej analizy danych tomograficznych wirusów grypy. Protokół ten opisuje wyznaczenie strukturalne HA na podstawie wirusów grypy, poprzez etapy od początkowej korekty ruchu aż do ostatecznej budowy modelu. Po tym procesie uzyskano rekonstrukcję HA o rozdzielczości 6,0 Å z dwóch zestawów danych krioET zebranych ze szczepu grypy A/Puerto Rico/8/34 (PR8).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krio-elektronowa tomografia (cryoET) była stosowana w ostatnich dekadach do rejestrowania zdjęć kompleksów białkowych, wirusów, komórek i organizmów. CryoET, będąca metodą mikroskopii krioelektronowej (cryoEM), to metoda biologii strukturalnej, w której próbka biologiczna jest szybko zamrażana, a następnie obrazowana w różnych orientacjach za pomocą pochylenia 1,2,3. Obrazy wykonane w każdej orientacji są następnie obliczeniowo wyrównywane do wspólnej osi nachylenia i rekonstruowane w tomogram, aby uzyskać trójwymiarowy widok4.

Podczas gdy krystalografia rentgenowska i cryoEM pojedynczych cząstek wymagają oczyszczonych, strukturalnie jednorodnych cząsteczek, cryoET może obrazować cząsteczkę bezpośrednio w jej natywnym kontekście4. Dlatego jedną z głównych zalet cryoET jest jego zdolność do wizualizacji próbek pleomorficznych, takich jak wirusy błoniaste, w tym grypa 5,6,7. Kolejną zaletą cryoET jest zdolność do obrazowania na różnych skalach. Chociaż tomogramy zazwyczaj nie są rozdzielane powyżej 5-10 nm8, całkowanie uśredniania subtomogramów, gdzie kopie tej samej cząstki są identyfikowane, wyrównywane i uśredniane, może skutkować niemal atomową rozdzielczością w niektórych cząsteczkach biologicznych, takich jak rybosomy 9,10. Jednak tylko ograniczone typy cząsteczek mogą osiągnąć tę rozdzielczość; średnie wartości subtomogramu zazwyczaj nie przekraczają rozdzielczości 10-15 Å. Dla porównania, cryoEM pojedynczej cząstki rutynowo osiąga rozdzielczość 3-4 Å po rewolucji rozdzielczości11. Najnowsze osiągnięcia zarówno w zakresie wyższej przepustowości oprogramowania do pozyskiwania i analizy danych cryoET, umożliwiły określenie struktury struktury dodatkowych cząsteczek biologicznych w rozdzielczości subnanometrowej w ich natywnym kontekście 12,13,14,15,16,17,18.

Jednym z powszechnych zastosowań cryoET jest wizualizacja morfologii, organizacji i struktury wirusa. Pomimo niższej rozdzielczości oferowanej przez tę technikę w porównaniu z krylografią pojedynczą, krylografią rentgenowską lub krystalografią rentgenowską, cryoET w połączeniu ze średnią subtomogramową może dostarczyć informacji o zachowaniu białek wirusowych w ich środowisku rodzimym oraz dostarczyć kluczowych informacji o ich organizacji w kontekście wirionu. Częstym celem krioET wirusów są glikoproteiny powierzchniowe, które są powszechnie wykorzystywane do przyczepiania i fuzji komórek gospodarza, ponieważ często są głównymi antygenami i celami terapii lub szczepionek. Dzięki ostatnim postępom w pakietach przetwarzania krioET, coraz bardziej możliwe staje się osiągnięcie średnich rozdzielczości subnanometrów dla tych glikoprotein: 19,20,21,22. Przykładem jest hemaglutynina (HA), główne białko na powierzchni wirionów grypy. To białko nie tylko przewodzi zarówno wiązaniu receptorów, jak i fuzji błonowej, ale także pokrywa wirion w niezwykle gęsty sposób, z setkami do tysięcy HAs na pojedynczym wirionie5. Protokół przedstawiony tutaj (Rysunek 1) integruje kilka powszechnie używanych pakietów z własnymi skryptami, aby wyznaczyć etapy od wstępnego przetwarzania do udoskonalania modelu, tworząc subtomogramową średnią HAA grypy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przykładowe zbiory danych użyte dla tego protokołu są dostępne pod adresem EMPIAR-12864, który obejmuje dwa zestawy serii pochylenia używane dla tego protokołu. Serie tilt są zbierane z ręcznie zanurzanych siatek oczyszczonego wirusa grypy A o fizycznym rozmiarze piksela 2,09 Å/piksel, aby zapewnić wystarczająco duże pole widzenia, aby każda seria tilt zawierała kilka wirionów, a także aby uzyskać rekonstrukcje o najwyższej rozdzielczości. W przypadku własnych zbiorów danych użytkowników zaleca się rozpoczynanie pracy od surowych filmów tilt. Zbiory danych były przetwarzane i wizualizowane za pomocą wysokowydajnych stacji roboczych. Tabela materiałów zawiera informacje o sprzęcie i oprogramowaniu używanym w tym protokole. Wszystkie pakiety oprogramowania używane w tym protokole są open source i dostępne do pobrania; Linki do instalacji i instrukcje są wymienione w Tabeli Materiałów. Zalecana stacja robocza do przetwarzania zestawów danych cryoET powinna być wyposażona w co najmniej 8-rdzeniowy procesor, dedykowaną kartę GPU z 6 GB VRAM, 64 GB RAM oraz 2 TB lokalnej pamięci.

1. Wstępne przetwarzanie danych filmów pochylenia i rekonstrukcja tomogramów krioelektronowych w Warp 23 i IMOD 24

  1. W terminalu aktywuj środowisko conda, które ma zainstalowany Warp, używając następującego polecenia:
    conda activate warp_environment
  2. Stwórz plik ustawień serii klatek do przetwarzania serii klatek. Jest to plik konfiguracyjny zawierający metadane dotyczące mikroskopu, lokalizacji danych do przetwarzania oraz miejsca przechowywania plików wyjściowych.
    WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
    UWAGA: Dane te zostały zebrane w trybie superrozdzielczości.
  3. Przeprowadz estymację i korekcję ruchu za pomocą funkcji transferu kontrastu (CTF).
    WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
    UWAGA: m_grid parametr powinien odpowiadać liczbie podklatek w filmie tilt – nasze zbiory danych składały się z 5 podklatek na film tilt.
  4. Importuj metadane serii tilt, aby WarpTools mógł zidentyfikować, które filmy należą do której serii tilt.
    WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
  5. Po założeniu folderu tomostar utwórz plik ustawień serii tilt do przetwarzania serii tilt
    WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
  6. Zapisuj stosy pochylające i wykonuj automatyczne wyrównanie serii pochyleń opartych na fiducialnym systemie, korzystając z programu batchruntomo IMOD z użyciem graficznego interfejsu Etomo24.
    1. Wykonaj następujące polecenie w terminalu:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      UWAGA: Tiltseries zostały wyeksportowane z 4x fizycznym rozmiarem pikseli, aby skrócić czas wyrównania i zasoby obliczeniowe.
    2. Wybierz przykładowy zbiór danych, aby najpierw ustawić parametry wyrównania przed zastosowaniem ich jako szablonu dla batchruntomo.
    3. Importuj parametry wyrównania z IMOD, jeśli używasz batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      UWAGA: W tym zbiorze danych korzystanie z GUI Etomo dawało lepsze wyniki niż wrappery w WarpTools.
    4. Alternatywnie, wykonaj automatyczne wyrównanie serii bez fiducialnych nachyleń za pomocą wrappera AreTomo25 w WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      UWAGA: Otoczka AreTomo została przetestowana z AreTomo1.3.4.
  7. Wykonaj następujące polecenie w terminalu, aby oszacować parametry CTF dla serii tilt:
    WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
  8. Rekonstruuj tomogramy za pomocą WarpTools.
    1. Ustaw zmienną środowiskową:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      UWAGA: Ten etap zapewnia, że tomogramy będą kompatybilne z kolejnymi etapami przetwarzania i wizualizacji obrazów w innych programach używanych w tym protokole.
    2. Aby zrekonstruować tomogramy, wykonaj w terminalu: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
  9. Powtórz kroki 1.2 - 1.8.2 dla wszystkich zbiorów danych.

2. Wstępne przetwarzanie tomogramów i wybieranie cząstek

  1. W terminalu aktywuj środowisko conda z zainstalowanym IsoNet26 .
    conda activate isonet_env
  2. Przygotuj się do przetwarzania tomogramów, najpierw tworząc podfolder i przenosząc do niego wszystkie tomogramy.
    mkdir tomo_folder
    mv tomograms*.mrc tomo_folder/
  3. Wygeneruj plik gwiazdki w folderze projektu.
    isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
  4. Za pomocą edytora tekstu otwórz wygenerowany plik gwiazdy i wpisz przybliżoną wartość defokusu dla obrazów o nachyleniu 0 stopni w czwartej kolumnie (_rlnDefocus) dla każdego tomogramu, którą można znaleźć w pliku processed_items.json w folderze warp_tiltseries.
    UWAGA: Wartość defokusu powinna być w angstromach dla IsoNet. Warp zapisuje wartości defokusu w μm, co wymaga współczynnika mnożenia 10 000.
  5. Uruchom komendę dekonwoluacji CTF w terminalu.
    isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
  6. Po dekonwolwacji inicjuj interfejs EMAN2GUI 27 , aby rozpocząć wstępne przetwarzanie tomogramów do pobierania cząstek.
    conda activate eman_env
    e2projectmanager.py
  7. W sekcji Tomografia kliknij lewym przyciskiem na strzałkę obok Surowe dane i wybierz Import Tomograms z menu rozwijanego.
  8. Kliknij lewym przyciskiem na strzałkę obok Segmentacji i wybierz tomogramy wstępne.
    UWAGA: Domyślne parametry prawdopodobnie są odpowiednie dla wielu zbiorów danych. Dla tych tomogramów zastosowano filtr dolnoprzepustowy o częstotliwości 4 Å i obrazy nachylenia zostały znormalizowane. Po wstępnym przetwarzaniu katalog informacji zostanie automatycznie wygenerowany przez EMAN2 z pustymi plikami .json (o podobnych nazwach bazowych jak pliki wstępnie przetworzone). Angpix musi zostać dodany do plików json przed wyborem cząstek.
  9. Wytrenuj sieć neuronową splotową (CNN) do rozpoznawania glikoproteiny HA.
    1. Zmień katalog roboczy na lokalizację tomogramów przeznaczonych do treningu CNN i wyboru cząstek:
      cd path/to/tomograms
    2. Użyj terminala, aby otworzyć okno szkoleniowe CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
    3. Potwierdź, że cztery okna są otwarte: jedno zawiera informacje o parametrach CNN i tomogramach w katalogu, a pozostałe trzy okna zawierają obrazy dobrych odniesień (Dodatnie), złych odniesień (Negatywne) oraz cząstek wybranych przez CNN (Cząstki).
    4. Kliknij lewym przyciskiem przycisk Nowy w interfejsie CNN, aby zainicjować nowy CNN. Ustaw domyślną szybkość uczenia się na 0,0001, a rozmiar pudełka na 8.
    5. W kolumnie FileName kliknij lewym przyciskiem na reprezentatywny tomogram, aby otworzyć go w nowym oknie.
      UWAGA: Otwarcie może być tylko jedno tomogram naraz.
      1. Aby przejść przez oś z tomogramu, umieść kursor nad otwartym tomogramem i naciśnij kółko przewijania myszy, aby otworzyć nowe okno. Suwak oznaczony N# zmieni oś z.
    6. Na otwartym tomogramie wybierz 10-20 cech odpowiadających HA za pomocą lewego przycisku myszy w panelu Pozytywnych.
      UWAGA: Wybierz zarówno widok z góry, jak i z boku HA, które pojawiają się jako cylindry lub trójkąty nad membraną, jako dobre odniesienia do bardziej odpornej sieci.
      1. Obrazy pozytywnych odniesień pojawią się w oknie Pozytywne . Aby usunąć referencję, przytrzymaj klawisz Shift i kliknij lewym przyciskiem na obraz referencyjny.
    7. Przełącz się na panel negatywny i wybierz 10-20 odniesień odpowiadających cechom takim jak puste łaty błony, gęstość vRNP, markery fiducial i zanieczyszczenia.
      UWAGA: Odniesienia pojawią się w oknie Negatywne .
    8. Rozpocznij szkolenie CNN, klikając lewym przyciskiem przycisk Pociąg w głównym oknie.
      UWAGA: Liczba iteracji (Niter) w głównym oknie zmienia liczbę iteracji szkolenia, które przechodzi CNN. Polecam ustawić parametr na 50.
    9. Po wytrenowaniu CNN na wybranych odniesieniach, kliknij lewym przyciskiem Apply, aby użyć CNN do wyboru cząstek w otwartym tomogramie.
      UWAGA: Obrazy wybranych cząstek można zobaczyć w oknie Cząstek. Wybrane cząstki będą również wyświetlane na tomogramie niebieskimi kółkami.
    10. Kontynuuj wybieranie pozytywnych i negatywnych odniesień na podstawie zastosowanej sieci, okresowo zapisując postęp za pomocą przycisku Zapisz.
    11. Gdy będzie zadowolony, wybierz Apply All , aby CNN wybrało cząstki we wszystkich tomogramach w katalogu i oceniło wyniki na kilku tomogramach; Przeprowadzaj dodatkowe szkolenia w razie potrzeby.
  10. Zapisz współrzędne do pliku tekstowego dla każdego tomogramu.
    1. Otwórz interfejs EMAN2 za pomocą e2projectmanager.py tego polecenia.
    2. Kliknij strzałkę obok Średnia Subtomogramu i kliknij Ręczny Boks.
    3. Wpisz nazwę tomogramu i kliknij Launch.
    4. Zapisz współrzędne do pliku tekstowego, wybierając Plik > Pole zapisu Koordynaty > tomogram_ha.txt.
    5. Przejdź do podfolderu neuralnets i podfolderu info, aby zrobić kopię nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf i boxes3dref.hdf.
  11. Aby mieć pewność, że analiza jest przeprowadzana tylko na w pełni złożonych wirionach, gdzie widoczna jest obecność warstwy białka matrycy (M1) oraz kompleksu wirusowej rybonukleoproteiny (vRNP), należy wytrenować drugą sieć neuronową splotową do rozpoznawania białka M1.
    1. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.9, zmieniając rozmiar pudełka treningowego z 8 na 14.

3. Kuracja cząstek

  1. Pobierz notatniki z https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
  2. Otwórz notes CNN_Particle_Cleaning.ipynb i załaduj wymagane moduły.
    UWAGA: Skrypt wykorzystuje Open3D28 jako pakiet do wizualizacji współrzędnych cząstek jako trójwymiarowych chmur punktów.
  3. Ładuj pliki tekstowe odpowiadające współrzędnym HA i M1 oraz wyświetlaj je jako chmury punktów 3D za pomocą pakietu Open3D.
  4. Filtruj odstające współrzędne HA za pomocą statystycznego usuwania odstających zgodnie z Open3D.
    UWAGA: Sugerowane wartości początkowe dla HA to nb_neighbors = 50 (liczba sąsiednich współrzędnych wokół współrzędnej) oraz std_ratio = 0,5.
  5. Oblicz odległość między chmurami punktów HA i M1. Wszystkie współrzędne HA oddalone o więcej niż 20 pikseli od chmury punktów M1 zostaną wtedy zidentyfikowane jako odstępne. Wszystkie współrzędne cząstek niezidentyfikowane jako odstawione będą zapisywane w pliku wyjściowym .txt.
    UWAGA: 20 pikseli odpowiada przybliżonej odległości 16 nm przy rozmiarze piksela 8,35 Å/piksel. Środek filtra HA względem warstwy M1 w naszych tomogramach wynosi około 15 nm.
  6. Połącz wszystkie cząstki i zapisz je jako pliki gwiazdowe używając pts2starfile.ipynb.

4. Iteracyjne uśrednianie i klasyfikacja subtomogramów

  1. Za pomocą WarpTools wyodrębnij cząstki z współczynnikiem binningu 4 i przeprowadź początkowe rundy subtomogramu uśredniające w RELION429.
    WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
    UWAGA: Proponowany rozmiar pudełka to 48 x 48 x 48 pikseli, odpowiadający ~360 Å3pudełku, które byłoby wystarczająco duże, by pomieścić tablicę o powierzchni 7-8 HA.
    1. Przekonwertowanie gwiezdnego pliku warp na plik zgodny z RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
    2. Generuj początkową referencję za pomocą relion_refine_mpi na podzbiorze cząstek.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
      mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
    3. Użyj relion_refine_mpi do przeprowadzenia 3D autofine'ów na subtomogramach.
      1. Przykładowe polecenie: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
        UWAGA: Początkowe globalne i lokalne pobieranie próbek zostało ustawione na 7,5 i 1,8 stopnia, co odpowiada rzędowi healpix 4 i lokalnemu healpixowi 2. Początkowe udoskonalenia wykorzystują głównie silną gęstość błony, białka M1 oraz matrycy HA. Zakres przesunięcia translacji może być większy, aby uwzględnić wszelkie przesunięcia, które mogą wystąpić podczas wyrównywania tablicy.
    4. Powtarzaj dorafinowanie po zbieżności pierwszego etapu rafinacji, zmieniając translację na 8 i krok na 2.
  2. Wykorzystanie klasyfikacji 2D do usuwania cząstek śmieciowych za pomocą relion_refine.
    1. Przykładowe polecenie: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      UWAGA: Zamiast klasyfikacji 3D zastosowano klasyfikację 2D, ponieważ jest ona bardziej wydajna obliczeniowo. Subtomogramy mogą być bezpośrednio używane jako wejście do zadania klasyfikacji 2D bez dodatkowego przetwarzania obrazu.
    2. Połącz klasy zawierające rozpoznawalną tablicę HA zawierającą cylindryczne HA, membrany i gęstość M1 za pomocą relion_star_handler.
    3. Po pierwsze, stwórz pliki gwiazdkowe zawierające dobre klasy.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
    4. Następnie użyj następującego polecenia relion_star_handler, aby połączyć poszczególne pliki gwiazd.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
  3. Ponowne wyekstrahowanie w bin2 i odłączenie cząstek do iteracyjnego lokalnego dopracowywania.
    1. Dla udoskonalenia bin2 wyodrębnij cząstki o mniejszym rozmiarze pudełka 80 i przeprowadź lokalne wyszukiwanie z healpixem i lokalnym healpixem ustawionym na 4 (1,8 stopnia lokalne próbkowanie kątowe).
    2. Na tym etapie łącz zestawy cząstek z różnych zbiorów danych za pomocą relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
    3. Po pierwszej rundzie udoskonalania należy utworzyć cylindryczną maskę z użyciem e2filtertool.py w środowisku EMAN2, obejmującą centralny HA oraz membranę i gęstość M1.
      UWAGA: Parametry używane dla maski cylindrycznej: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; wszystkie pozostałe parametry są nieoznaczone.
    4. Przeprowadź jeszcze jedną rundę dopracowywania z nałożoną maską.
    5. Przeprowadzić kolejną rundę klasyfikacji 2D, aby wyeliminować odstawcze niezgodne z centralnym HA oraz dodatkowe zanieczyszczenia.
    6. Powtórz proces z cząstkami niebindowanymi o rozmiarze pudełka 120 i tworzy miękką maskę pokrywającą centralne HA, wyrównuje odniesienie do symetrii C3 i stosuje symetrię na tym etapie dopracowywania.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      UWAGA: Ostateczna rozdzielczość osiągnięta za pomocą RELION wyniosła 6,1 Å.
  4. Ostateczne udoskonalenie w MTools9
    1. Stwórz populację rafinacji (po aktywacji środowiska Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
    2. Dodaj źródła danych dla każdego zbioru danych.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Powtórz poprzedni krok z dodatkowymi zbiorami danych.
    3. Stwórz gatunek rafinacyjny.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
    4. Wielocząstkowe udoskonalanie.
      1. Pierwsza cząstka precyzyjnie pozuje za pomocą polecenia: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Następnie doprecyzuj zarówno pozy cząstek, jak i aberrację sferyczną za pomocą polecenia: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
        UWAGA: Tutaj zakończono doprecyzowanie, ponieważ kolejne iteracje nie poprawiły rozdzielczości. Różne kombinacje parametrów, które nie zostały dokładnie przetestowane, mogą jednak nadal zwiększać wyniki.

5. Udoskonalanie modelu

  1. Korzystając z ChimeraX30, wgrano ostateczną mapę i model atomowy HA.
  2. Mapuj i łącz wszystkie segmenty odpowiadające ektodomenie HA oraz użyj narzędzia Fit to Segments do dokowania w modelu HA.
    1. Zapisz przekształcone współrzędne modelu.
  3. Otwórz interfejs Phenix31 i użyj narzędzia Real Space Refinement .
    1. Gdy pojawi się poproszenie o dodanie plików, dodaj przekształcony model HA i mapę, a następnie wypełnij rozdzielczość ostatecznej rekonstrukcji.
    2. Przeprowadzić pięć rund globalnej minimalizacji, lokalnego dopasowania rotamerów, dopracowywania zajętości oraz grupowego dopracowywania ADP.
  4. Wizualizuj ostateczną rekonstrukcję i modeluj za pomocą ChimeraX.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wykazać wykorzystanie tego protokołu przetwarzania (Rysunek 1), wcześniej opisany workflow zastosowano do dwóch zbiorów danych po 25 tomogramów połączonych, uzyskanych ze szczepu wirusa grypy A H1N1 (A/Portoryko/8/1934). Parametry zbierania danych przedstawiono w Tabeli 1. Rysunek 2 ilustruje reprezentatywny tomogram oraz powiększone widoki pleomorficznych wirusów grypy. Tomogram ten uchwycił różnorodne morfologie, ponieważ wiriony mają kszt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lepsze zrozumienie struktury kluczowych białek wirusowych może przyspieszyć odkrywanie nowych metod leczenia tych wirusów. W ostatniej dekadzie rewolucja rozdzielczości przyspieszyła wyznaczanie wysokorozdzielczych struktur wirusowych za pomocą cryoEM, jednak metoda ta ogranicza się do oczyszczonych białek lub wirusów nieobtoczonych o symetrii dwudziestościennej. Dla porównania, cryoET jest w stanie wizualizować morfologicznie zróżnicowane błoniaste wiriony w 3D, ale jego rozdzielczość jest ograniczona. Przedstawiony tut...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby wyrazić podziękowania za pomocne rozmowy z Schiffer Lab. Chcielibyśmy również podziękować placówce UMass Chan Core CryoEM za pomoc w pozyskiwaniu danych oraz za wsparcie i doradztwo. Prace te były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences R01GM143773 na magisterium i R35GM151996 na C.A.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WXAMDhttps://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4UC San Franciscohttps://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52Baylor College of Medicinehttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27Uniwersytet Kolorado w Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
Skrypty analizy grypySzkoła Medyczna UMass Chanhttps://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3UCLAhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0Genentechhttps://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000NVIDIA https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D Intel Labshttps://www.open3d.org/
PHENIX 1.21-5207Narodowe Laboratorium Lawrence'a Berkeleyphenix-online.org
RELION 4.0Laboratorium Biologii Molekularnej MRChttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
Ubuntu 20.04Ubuntuhttps://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1UC San Franciscohttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
Warp 2.0.0Genentechhttp://warpem.github.io/warp/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
  2. Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465(2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: the resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52, 339-360 (2023).
  4. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Lett. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  5. Huang, Q. J., et al. Quantitative structural analysis of influenza virus by cryo-electron tomography and convolutional neural networks. Structure. 30 (5), 777-786.e3 (2022).
  6. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  7. Mangala Prasad, V., et al. Cryo-ET of Env on intact HIV virions reveals structural variation and positioning on the Gag lattice. Cell. 185 (4), 641-653.e17 (2022).
  8. Förster, F. Subtomogram analysis: the sum of a tomogram's particles reveals molecular structure in situ. J Struct Biol X. 6, 100063(2022).
  9. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  10. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. Chen, S., et al. Cryo-electron tomography reveals the microtubule-bound form of inactive LRRK2. Elife. 13, e97222(2024).
  13. Chen, Z., et al. De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking. Cell. 186 (23), 5041-5053.e19 (2023).
  14. Kelley, R., et al. Towards community-driven visual proteomics with large-scale cryo-electron tomography of Chlamydomonas reinhardtii. bioRxiv. , (2024).
  15. Klumpe, S., et al. In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryo-ET. Cell. 188 (8), 2094-2110.e18 (2025).
  16. Li, S., et al. The structure of basal body inner junctions from Tetrahymena revealed by electron cryo-tomography. EMBO J. 44 (7), e1975-e2001 (2025).
  17. Song, X., et al. The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography. J Struct Biol. 217 (2), 108212(2025).
  18. Waltz, F., et al. In-cell architecture of the mitochondrial respiratory chain. Science. 387 (6740), 1296-1301 (2025).
  19. Huang, Q. J., et al. Virion-associated influenza hemagglutinin clusters upon sialic acid binding visualized by cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  20. Turoňová, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
  21. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  22. Calcraft, T., et al. Integrated cryoEM structure of a spumaretrovirus reveals cross-kingdom evolutionary relationships and the molecular basis for assembly and virus entry. Cell. 187 (16), 4213-4230.e19 (2024).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  25. Zheng, S., et al. AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068(2022).
  26. Liu, Y. T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  27. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  28. Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. Open3D: a modern library for 3D data processing. arXiv. , (2018).
  29. Zivanov, J., et al. A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0. Elife. 11, e83724(2022).
  30. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  32. Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography. PLoS Biol. 19 (8), e3001319(2021).
  33. Watanabe, R., et al. Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography. Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).
  34. Woldeyes, R. A., et al. Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease. bioRxiv. , (2025).
  35. Li, W., et al. HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes. Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).
  36. Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo. PLoS Biol. 19 (8), e3001318(2021).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Tran, E. E., et al. Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate. mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryo Electron TomographySubtomogram AveragingInfluenza HemagglutininViral GlycoproteinsPleomorphic VirusesStructural DeterminationParticle PickingConvolutional Neural Network3D Auto RefinementGlycosylation Sites

Related Articles