Inteligentny strukturalny kolorowy plaster hydrożelowy integrujący diagnostykę i leczenie w leczeniu przewlekłego zapalenia kości i szpiku

Podsumowanie

W badaniu przedstawiono inteligentny strukturalny kolorowy plaster hydrożelowy (CPG) do diagnozowania i leczenia przewlekłego zapalenia kości i szpiku (COM). Plaster zawiera reagujący na temperaturę hydrożel GelMA, rusztowanie CSMA-PBA wrażliwe na pH oraz kwas salicylowy do kontrolowanego uwalniania leków, monitorowania infekcji i wspomagania regeneracji tkanek.

Streszczenie

Przewlekłe zapalenie kości i szpiku (COM) jest uporczywym zakażeniem kości, które jest trudne do leczenia konwencjonalnymi antybiotykami ze względu na takie problemy, jak oporność na leki i niepożądane skutki uboczne. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy nowatorski, inteligentny, strukturalny plaster z hydrożelem (CPG) zarówno do diagnostyki, jak i leczenia COM. Plaster łączy w sobie metyloakrylowany chitozan modyfikowany kwasem fenyloboronowym (CSMA-PBA) jako rusztowanie, reagujący na temperaturę hydrożel GelMA jako wypełniacz i kwas salicylowy (SA) do dostarczania leków. Charakteryzacja wykazała doskonałe właściwości mechaniczne i siłę adhezji. Eksperymenty z uwalnianiem leków potwierdziły, że CPG skutecznie reaguje na zmiany pH, umożliwiając kontrolowane uwalnianie leku. CPG służy również jako narzędzie diagnostyczne, wykrywając zmiany pH i temperatury w miejscu infekcji, pomagając w rekonwalescencji pooperacyjnej. Testy przeciwdrobnoustrojowe wykazały znaczne zahamowanie wzrostu bakterii, a eksperymenty in vitro wykazały zdolność CPG do promowania ekspresji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego przy jednoczesnym zmniejszaniu markerów stanu zapalnego. Badanie podkreśla wielofunkcyjne możliwości plastra hydrożelowego, w tym działanie przeciwbakteryjne, przeciwzapalne i pronaczyniowe, co czyni go obiecującą opcją terapeutyczną w przewlekłym zapaleniu kości i szpiku.

Wprowadzenie

Przewlekłe zapalenie kości i szpiku stało się poważnym problemem dla pacjentów ze względu na trudny i długotrwały proces leczenia, wysokie ryzyko niepowodzenia leczenia i nawrotu¹. Obecne strategie leczenia zapalenia kości i szpiku obejmują chirurgiczne oczyszczanie tkanki martwiczej i antybiotyki pozajelitowe. Jednak konieczność stosowania wysokich dawek antybiotyków w celu zapewnienia poziomu terapeutycznego w miejscu działania pozostaje nieskuteczna w leczeniu choroby. Ponadto stosowanie dużych dawek antybiotyków wiąże się z niekorzystnymi powikłaniami, takimi jak nefrotoksyczność, ototoksyczność, oporność na antybiotyki i skutki uboczne ze strony przewodu pokarmowego. Miejscowe podawanie antybiotyków może być bardziej odpowiednią strategią przezwyciężenia tych wad. Podczas gdy miejscowe podawanie antybiotyków może leczyć infekcje kości przy minimalnych skutkach ubocznych, indukowanie regeneracji kości ma kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia². Dlatego jednoczesne podawanie antybiotyków i czynników wzrostu kości wydaje się być obiecującą strategią leczenia. W ciągu ostatnich kilku dekad niebiodegradowalny polimetakrylan metylu (PMMA) był podstawą miejscowej antybiotykoterapii w zapaleniu kości i szpiku. Jednak zastosowanie PMMA jako miejscowego systemu dostarczania antybiotyków napotyka ograniczenia, takie jak konieczność przeprowadzenia drugiej operacji usunięcia kulek, tworzenie biofilmu bakteryjnego, który sprzyja kolonizacji powierzchni, długotrwałe uwalnianie antybiotyków na poziomie subterapeutycznym prowadzące do oporności na antybiotyki, ogólnoustrojowa toksyczność resztkowych monomerów i brak właściwości indukcyjnych kości³. W związku z tym opracowanie biodegradowalnych lokalnych systemów dostarczania z wykorzystaniem biokompatybilnych polimerów może przezwyciężyć te wady. Literatura sugeruje, że nanocząstki fibroiny jedwabiu (SFNP) włączone do rusztowania jedwabnego w celu miejscowego dostarczania wankomycyny mogą być stosowane w leczeniu ciężkiego zapalenia kości i szpiku. Jednak brak jakichkolwiek indukcyjnych cząsteczek bioaktywnych w materiale nanokompozytowym spowodował, że przygotowane konstrukty nie indukowały istotnie regeneracji kości. W związku z tym projektowanie nanokompozytowych materiałów rusztowań odpowiednich do leczenia przewlekłego zapalenia kości i szpiku było trudnym zagadnieniem. Naturalne hydrożele na bazie polimerów cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich strukturalne podobieństwo do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i ich zdolność do kontrolowania uwalniania leków⁴.

Jedną z wyróżniających się cech hydrożeli jest ich reakcja na różne czynniki, takie jak temperatura i pH. Przewlekłe infekcje mogą zwiększać pH z powodu obciążenia mikrobiologicznego, rozregulowania równowagi regeneracyjno-degradacyjnej i nasilonych reakcji metabolicznych rozpadu. Dodatkowo chirurgiczne wycięcie oczyszczonego materiału, takiego jak tkanka martwicza i ropa, może przyspieszyć przejście pH do wyższych wartości⁵. Dlatego stosowanie wrażliwych na pH hydrożeli zdolnych do wykrywania pH przewlekłej infekcji ma kluczowe znaczenie dla rokowania w przewlekłym zapaleniu kości i szpiku.

W tym badaniu proponujemy zintegrowane podejście do diagnozy i leczenia przy użyciu inteligentnego strukturalnego kolorowego plastra hydrożelowego, posiadającego cechy niezbędne do leczenia przewlekłego zapalenia kości i szpiku, jak pokazano na rycinie 1. Hydrożele supramolekularne pochodzące z montażu supramolekularnych sieci polimerowych są atrakcyjnymi materiałami podobnymi do naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ze względu na swoje doskonałe właściwości, w tym odpowiednią wytrzymałość mechaniczną, właściwości samoregenerujące, przeciwbakteryjne i przeciwzapalne, hydrożele supramolekularne znalazły wiele zastosowań w dziedzinie biomedycyny⁶. W przeciwieństwie do tego, kolor strukturalny, jako rodzaj koloru wytwarzanego przez unikalne interakcje światła z wewnętrznymi okresowymi nanostrukturami, przyciągnął dużą uwagę w takich dziedzinach, jak wyświetlacze optyczne, etykiety zapobiegające podrabianiu i urządzenia elektroniczne do noszenia. Zwłaszcza, gdy strukturalne materiały barwiące są zbudowane z reagujących polimerów, ich kolor może być regulowany przez różne bodźce poprzez rozszerzanie lub kurczenie się tych polimerów, co sugeruje potencjał tych materiałów jako czujników. W związku z tym można sobie wyobrazić, że połączenie hydrożeli supramolekularnych z kolorami strukturalnymi zapewni unikalną strategię konstruowania nowych plastrów hydrożelowych do leczenia przewlekłego zapalenia kości i szpiku ^7,8,9.

W tym celu opracowaliśmy zintegrowane podejście do diagnostyki i leczenia przy użyciu inteligentnego strukturalnego plastra hydrożelowego (CPG) składającego się z mieszanego modyfikowanego metyloakrylowanego chitozanu z kwasem fenyloboronowym (CSMA-PBA) jako rusztowaniem z kamienia przeciwbiałkowego, reagującego na temperaturę hydrożelu GelMA jako wypełniacza i obciążonego kwasem salicylowym (SA)¹⁰. Ze względu na odwracalność wiązań wodorowych i oddziaływań niekowalencyjnych w sieci, uzyskany plaster hydrożelowy nie tylko wykazywał doskonałe właściwości mechaniczne, ale także posiadał zdolności samoregenerujące. Ponadto, ze względu na obecność CSMA, ten hydrożelowy plaster wykazywał również silną bioaktywność przeciwbakteryjną. Dodatkowo, wykorzystując reaktywność termiczną polimeru GelMA, plaster hydrożelowy może uwalniać substancje czynne po umieszczeniu w miejscu zapalenia o stosunkowo wyższej temperaturze. Jednocześnie, ze względu na obecność wiązań estrowych boronianowych w CSMA-PBA, hydrożel reagował na zmiany pH¹¹ w środowisku. Opierając się na tych zaletach, wykazaliśmy, że proponowana strukturalna kolorowa supramolekularna łatka hydrożelowa może leczyć przewlekłe zapalenie kości i szpiku poprzez obniżenie ekspresji czynników zapalnych, aktywność przeciwbakteryjną i promowanie angiogenezy. Warto zauważyć, że korzystając z unikalnych właściwości optycznych rusztowania z kamienia przeciwbiałkowego, plaster hydrożelowy może nawet wykazywać zdolność zmiany koloru w odpowiedzi na bodźce temperaturowe, wykazując znaczny potencjał w monitorowaniu i leczeniu przewlekłego zapalenia kości i szpiku oraz ukierunkowaniu leczenia klinicznego.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Lekarskiej i wykonane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja NIH nr 80-23, poprawiona w 1978 r.). W eksperymentach wykorzystano samce szczurów rasy Sprague-Dawley (8 tygodni)

Przygotowanie matryc kryształów krzemionkowych (SCC)
SCC zostały przygotowane zgodnie z wcześniejszym opisem 12,13,14. Oczyszczone i poddane obróbce plazmowej szkiełka podstawowe zanurzono w 5% roztworze monodyspersyjnych nanocząstek krzemionki (o średnicy 12 nm) zdyspergowanych w wodzie dejonizowanej. Roztwór mieszano w sposób ciągły w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 1 godzinę, aby zapewnić równomierne rozproszenie nanocząstek krzemionki. Szkiełka wyjęto z roztworu i suszono na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Proces suszenia miał kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego przylegania nanocząstek do powierzchni szkiełek podstawowych. Po wysuszeniu na powietrzu szkiełka umieszczono w wentylowanym piecu w temperaturze 60 °C na 2 dni w celu odparowania pozostałego rozpuszczalnika i ułatwienia tworzenia kryształów koloidalnych. Podczas tego parowania szkiełka zostały ustawione pod kątem 45°, aby ułatwić tworzenie uporządkowanych koloidalnych układów krystalicznych. Uporządkowane koloidalne układy krystaliczne charakteryzowały się samoorganizacją i wykazywały różne barwy strukturalne w zależności od rozstawu międzycząsteczkowego. Matryce te zostały następnie wykorzystane jako szablony do późniejszej produkcji łatek hydrożelowych.

Przygotowanie zintegrowanej diagnostyki i leczenia inteligentnych strukturalnych kolorowych plastrów hydrożelowych (CPG)
Kamienne rusztowania przeciwbiałkowe zostały odtworzone z pustych przestrzeni matryc kryształów koloidalnych krzemionki (SCC). Oczyszczone szkiełka podstawowe zanurzono najpierw w 5% roztworze monodyspersyjnych nanocząstek krzemionki (o średnicy 12 nm) w wodzie dejonizowanej, a następnie roztwór mieszano w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 1 godzinę, aby zapewnić równomierne rozproszenie nanocząstek na powierzchni. Proces mieszania miał kluczowe znaczenie dla zapobieżenia tworzeniu się agregatów i zapewnienia jednorodnego rozmieszczenia nanocząstek. Po zanurzeniu szkiełka suszono na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie suszono w piecu w temperaturze 60 °C przez 2 dni, aby ułatwić odparowanie rozpuszczalnika i ułatwić samoorganizację nanocząstek krzemionki w dobrze uporządkowane koloidalne układy kryształów. Podczas parowania szkiełka zostały ustawione pod kątem 45°, aby ułatwić wyrównanie nanocząstek, sprzyjając tworzeniu układu okresowego z kontrolowanymi odległościami między cząstkami. Ten uporządkowany układ wykazywał kolor strukturalny, charakterystyczną cechę kryształów koloidalnych, i służył jako matryca dla późniejszej struktury hydrożelowej.

Przygotowane SCC następnie nasączono roztworem żelu wstępnego CPG, który składał się z GelMA w stężeniu 10% w/v rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Próbki pozostawiono na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby zapewnić dokładną infiltrację GelMA do pustych przestrzeni między nanocząstkami krzemionki, zapewniając równomierne rozprowadzenie w strukturze matrycy. Ten etap miał kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że matryca hydrożelowa została równomiernie wkomponowana w matrycę i że ostateczna struktura hydrożelu odtworzyła uporządkowany układ nanocząstek SCC. Po namoczeniu roztwór żelu wstępnego polimeryzowano w świetle UV (365 nm) o intensywności 3 mW/^cm2 przez 5 minut. Ta ekspozycja na promieniowanie UV zainicjowała sieciowanie GelMA, zestalając matrycę hydrożelową. Czas i intensywność ekspozycji zostały starannie zoptymalizowane, aby uzyskać wystarczające usieciowanie bez prześwietlania hydrożelu, co mogłoby prowadzić do nadmiernego żelowania lub utraty struktury matrycy.

Charakterystyka CPG
Morfologię przekroju poprzecznego hydrożelu obserwowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) z napięciem przyspieszenia 5 kV po pokryciu próbek (1 mm x 1 mm) złotem¹⁵. Pozwoliło nam to na wizualizację nanoporowatej struktury i potwierdzenie jednorodności sieci hydrożelowej. Zachowanie pęcznienia oceniano przez zanurzenie próbek 10 mg hydrożelu w 10 ml PBS w różnych odstępach czasu (0, 30, 60, 120 i 180 min). Procentowe pęcznienie obliczono, mierząc wzrost objętości hydrożelu w czasie, co dostarczyło informacji na temat zdolności hydrożelu do wchłaniania wody w różnych warunkach. Analizę reologiczną przeprowadzono przy użyciu reometru z 1% odkształceniem, stosując częstotliwości kątowe w zakresie od 1 rad/s do 100 rad/s w celu pomiaru modułu przechowywania (G') i modułu strat (G''). Ten krok był niezbędny do zrozumienia właściwości mechanicznych hydrożelu, w tym jego lepkosprężystego zachowania pod wpływem naprężeń. Właściwości adhezji przy ścinaniu oceniano za pomocą uniwersalnej maszyny do prób rozciągania (Instron) zgodnie z ASTM F2255-05 (2015) przy prędkości 10 mm/min i obciążeniu wstępnym 0,01 N, aby ocenić zdolność hydrożelu do przylegania do tkanek biologicznych. Uwalnianie leku oceniano za pomocą spektrofotometru UV, monitorując absorbancję przy λ = 280 nm po zanurzeniu hydrożelu w 5 ml PBS (pH 7,4). Uwalnianie określono ilościowo za pomocą standardowej krzywej stężeń kwasu salicylowego, aby potwierdzić zdolność hydrożelu CPG do kontrolowanego uwalniania. Na koniec hydrożele zanurzono w roztworach buforowych o pH 4,5 i 7,2 na 30 minut, aby ocenić reakcję pH, obserwując zmiany objętości i wyglądu w różnych warunkach pH¹⁶.

Reakcja plastrów CPG na temperaturę i pH
Plastry CPG (o średnicy około 2 mm) umieszczono w 5 ml roztworu buforowego o pH 7,2 i utrzymywano w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze przez 30 minut, aby naśladować warunki fizjologiczne. Widma odbicia mierzono za pomocą spektrofotometru UV-Vis na długościach fal od 400 nm do 800 nm. Po wstępnych pomiarach plastry przeniesiono do roztworów buforowych o różnych wartościach pH (np. pH 4,5, 7,2 i 9,0) i utrzymywano w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Reakcja na mikrośrodowisko, w tym wszelkie zmiany koloru, była obserwowana wizualnie, a widma odbicia zostały ponownie zarejestrowane w celu analizy przesunięcia koloru. Ta reakcja na temperaturę i pH dostarcza cennych informacji na temat tego, jak hydrożel reaguje na zmiany w środowisku rany.

Badania przeciwbakteryjne in vitro
Testy antybakteryjne przeprowadzono przy użyciu standardowych procedur. Do oceny aktywności przeciwbakteryjnej plastrów CPG wykorzystano szczepy Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923) i Escherichia coli (E. coli, ATCC 53868). Te standardowe szczepy referencyjne zostały zakupione z American Type Culture Collection (ATCC) i zostały wykorzystane jako szczepy kontroli jakości (QC) w celu walidacji procedur testowania przeciwdrobnoustrojowego. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe wykonano metodą mikrorozcieńczenia bulionu zgodnie z wytycznymi CLSI M100. Zawiesiny bakteryjne przygotowano w bulionie Muellera-Hintona, standardowym podłożu do badań przeciwdrobnoustrojowych. Zmętnienie dostosowano do standardu 0,5 McFarlanda, co odpowiada około 1,5 × 10⁸ CFU/ml. Zawiesiny następnie inokulowano plastrami CPG (o średnicy 2 mm), przygotowanymi z wodą dejonizowaną lub buforem kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) o pH 6,0 (10 mM). Plastry dodawano do zawiesin bakteryjnych w proporcji jeden plaster na 1 ml hodowli. Zawiesiny inkubowano w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Po inkubacji wzrost bakterii oceniano przez posiewanie seryjnych rozcieńczeń kultur na agarze odżywczym, a jednostki tworzące kolonie (CFU) policzono po 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C. Procedura ta dostarczyła ilościowej miary skuteczności przeciwbakteryjnej.

Ocena biokompatybilności
Eksperymenty przeprowadzono w sposób opisany wcześniej. Plastry CPG były przetwarzane przez dializę w PBS (pH 7,4) przez 4 godziny, a następnie sterylizację etanolem (70%) przez 10 minut i dezynfekcję UV (365 nm) przez 30 minut, aby upewnić się, że wszystkie zanieczyszczenia biologiczne zostały usunięte. Komórki L929 (ATCC CCL-1) hodowano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C z 5% CO² w celu utrzymania żywotności komórek. Komórki wysiewano na 24-dołkowych płytkach po 2 × 10⁵ komórek/ml, z łatami CPG (o średnicy 2 mm) lub bez, w trzech powtórzeniach. Komórki podzielono na trzy grupy eksperymentalne: ślepą kontrolę, grupę CPG i grupę CPG (MES). Po 24 godzinach żywotność komórek oceniano za pomocą testu MTT, powszechnie akceptowanej metody oceny aktywności metabolicznej komórek. W przypadku testu MTT do każdego dołka dodano 20 μl MTT (5 mg/ml), a następnie inkubowano w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Po inkubacji pożywkę usunięto i dodano 150 μl DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu utworzonych przez żywe komórki. Absorbancję zmierzono przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek w celu ilościowego określenia liczby żywotnych komórek. Takie podejście zapewniło wiarygodną ocenę cytotoksyczności i biokompatybilności plastrów hydrożelowych.

Działanie przeciwzapalne
Aktywność przeciwutleniającą CPG oceniano za pomocą zestawu testowego ROS. Komórki L929 (ATCC CCL-1) hodowano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 24 godziny, aby umożliwić przyłączenie komórek i początkową proliferację. Aby wywołać stres oksydacyjny, komórki traktowano nadtlenkiem wodoru (H2O2) w ilości 3 μg/ml przez 12 godzin. Po indukcji stresu oksydacyjnego do komórek dodano ekstrakt hydrożelowy (przygotowany przez rozpuszczenie 1 mg hydrożelu CPG w 1 ml pożywki DMEM). Komórki inkubowano przez kolejne 12 godzin, aby umożliwić potencjalne działanie przeciwutleniające hydrożelu CPG. Następnie komórki barwiono 10 μM roztworem DCFH-DA (rozcieńczonym w pożywce DMEM) i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 20 minut. DCFH-DA to sonda fluorescencyjna służąca do wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach. Po barwieniu komórki przemyto PBS, a obrazy fluorescencyjne uchwycono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisyjnej 530 nm. Intensywność zielonej fluorescencji była odwrotnie skorelowana z aktywnością przeciwutleniającą hydrożelu, zapewniając wizualną ocenę zdolności hydrożelu do łagodzenia stresu oksydacyjnego w komórkach.

Model zwierzęcy szczura z zapaleniem kości i szpiku
Ustalono model przewlekłego zapalenia kości i szpiku: samce szczurów Sprague-Dawley (w wieku 8 tygodni) znieczulono izofluranem (2-3% tlenu), aby upewnić się, że pozostaną nieruchome i wolne od bólu podczas operacji. Wykonano 2-centymetrowe nacięcie po bocznej stronie lewej kości udowej, a sterylną igłą 27-G wstrzyknięto 1 10⁷ CFU S. aureus bezpośrednio w obszar beleczkowy kości udowej. Wstrzyknięcie wykonano do jamy szpiku kostnego kości udowej w celu wywołania infekcji w przestrzeni szpikowej, pierwotnym miejscu zapalenia kości i szpiku. Bakterie były dostarczane powoli, aby zapewnić prawidłowe odkładanie się w szpiku kostnym. Po 10 dniach szczury zostały poddane eutanazji za pomocą inhalacji CO_{2 ,} a zakażone kości udowe zostały starannie wycięte. Ziarninę wycięto z miejsca zakażenia i natychmiast zanurzono w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny w celu zachowania integralności tkanki. Po utrwaleniu tkanka kostna była odwapniana za pomocą środka odwapniającego (np. EDTA) przez 48-72 godziny, w zależności od wielkości kości, aby umożliwić prawidłowe wycięcie do analizy histologicznej i immunohistochemicznej. Odwapnione próbki kości zostały następnie przetworzone do badania histologicznego, immunohistochemii (IHC) i barwienia immunofluorescencyjnego. W przypadku ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ziarninę przechowywano w temperaturze -80 °C w celu późniejszej ekstrakcji RNA, co umożliwiło analizę profili ekspresji genów związanych ze stanem zapalnym, regeneracją kości i odpowiedziami immunologicznymi

Ocena leczenia zapalenia kości i szpiku in vivo
Tkankę ziarninową zatopiono w parafinie i pocięto na 5 μm za pomocą mikrotomu. Skrawki barwiono trichromem Massona (15 min hematoksyliną, 1 godzinę błękitem anilinowym) w celu oceny odkładania się kolagenu i przebudowy tkanek. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) (5 min hematoksyliną, 2 minuty eozyną) stosowano do obserwacji ogólnej morfologii tkanek i stanu zapalnego. Immunohistochemię (IHC) z anty-CD31 (1:100) i anty-EGF (1:200) prowadzono przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie drugorzędową inkubację przeciwciał w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut przy użyciu anty-mysiej IgG lub anty-króliczej IgG (rozcieńczonej 1:200), w zależności od zastosowanego przeciwciała pierwszorzędowego, w celu oceny angiogenezy i ekspresji czynnika wzrostu. Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono za pomocą anty-VEGF (1:100) i anty-bFGF (1:200) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie wtórną inkubację przeciwciał przez 30 minut w temperaturze RT. Skrawki obserwowano pod kątem ekspresji CD31, EGF, VEGF i bFGF za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Do ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) analizowano ekspresję mRNA cytokin prozapalnych (TNF-α, IL-1β i IL-6) po ekstrakcji RNA z RNAiso Plus i syntezie cDNA przy użyciu zestawu odczynników PrimeScript RT. PCR przeprowadzono przy użyciu SYBR Green PCR Master Mix w celu ilościowej oceny odpowiedzi zapalnej na poziomie molekularnym.

Środki kontroli jakości
Aby zapewnić wiarygodność i powtarzalność wyników eksperymentów, wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie ze znormalizowanymi protokołami. Każdy eksperyment obejmował odpowiednie grupy kontrolne, takie jak ślepe próby kontrolne (szczury zakażone S. aureus , ale nie otrzymujące leczenia), grupy kontrolne (szczury, które przeszły zabiegi chirurgiczne bez infekcji bakteryjnej i bez leczenia) oraz porównawcze grupy leczenia (szczury otrzymujące różne metody leczenia zapalenia kości i szpiku, takie jak antybiotyki lub lek eksperymentalny), w celu zminimalizowania zmienności. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach, aby zapewnić spójność i zmniejszyć błąd systematyczny. Każda grupa składała się z 6 szczurów, aby zapewnić istotność statystyczną. Przyrządy, w tym spektrofotometr UV-Vis, reometr i tester rozciągania, były rutynowo kalibrowane przed użyciem zgodnie ze specyfikacjami producenta. Hodowle bakterii i komórek przygotowano w kontrolowanych warunkach środowiskowych w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a procedury barwienia stosowano przy użyciu spójnych protokołów w celu zapewnienia odtwarzalności. Akwizycja danych została przeprowadzona przy użyciu ujednoliconych ustawień mikroskopu, aby zminimalizować zmienność między próbkami i zapewnić dokładny pomiar.

Analiza statystyczna
Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu GraphPad Prism (wersja 8.0). Dane są prezentowane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). W celu porównania między wieloma grupami zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post-hoc Tukeya w celu oceny różnic we właściwościach mechanicznych, zachowaniu termoreaktywnym, aktywności przeciwbakteryjnej i żywotności komórek. Test t Studenta został wykorzystany do porównań parami, gdy porównywano tylko dwie grupy, np. w przypadku porównania pików odbicia plastrów CPG przy różnych wartościach pH lub zmianach temperatury. p < 0,05 uznano za istotne statystycznie dla wszystkich analiz. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach, aby zapewnić spójność i powtarzalność wyników.

Wyniki

Wytwarzanie i charakterystyka plastrów CPG (rysunek 1)
W typowym eksperymencie monodyspersyjne nanocząstki krzemionki samoorganizowały się poprzez odparowanie rozpuszczalnika, tworząc gęsto upakowane matryce, w wyniku czego uzyskano strukturalne powłoki barwne (SCC)17,18,19, które następnie wykorzystano do stworzenia wielofunkcyjnych strukturalnych kolorowych plam hydrożelowych, jak pokazano na rysunku 1. Proces ten polegał na infiltracji roztworu pre-żelu do szczelin w nanoskali SCC poprzez działanie kapilarne. Następnie zastosowano polimeryzację UV w celu utworzenia hybrydowej warstwy SCC i hydrożelu. Po wytrawieniu SCC uzyskano odwrócone rusztowanie kamienne przeciwbiałkowe o okresowej porowatej strukturze. Na koniec termoczuły hydrożel GelMA wypełniono szczeliny w nanoskali rusztowania z kamienia antybiałkowego, a następnie utwardzono, aby stworzyć niezależne plastry CPG.

Silna sieć sieciująca hydrożelu nadała plastrom CPG doskonałe właściwości mechaniczne. Zaobserwowano, że łaty były wystarczająco wytrzymałe, aby wytrzymać rozciąganie bez powodowania żadnych uszkodzeń i mogły być rozciągnięte do 2,5 razy w stosunku do ich pierwotnej długości. Co ważne, plastry CPG wykazywały żywe kolory strukturalne i ulegały dynamicznym zmianom koloru podczas rozciągania, co jest unikalną cechą wynikającą z okresowego ułożenia nanostruktur wysokiego rzędu w obrębie plastrów. Te nanostruktury tworzą fotoniczne przerwy energetyczne (PBG), w których światło o określonych długościach fal w PBG jest selektywnie odbijane, a nie przekazywane, nadając łatom CPG charakterystyczne kolory strukturalne i piki odbicia.

Szczytową pozycję odbicia łaty CPG można oszacować za pomocą równania²⁰:

λ = 1,633dn_średnia

gdzie d jest odległością między płaszczyznami dyfrakcyjnymi, a n_średnia jest średnim współczynnikiem załamania światła materiału, który oblicza się jako średnią współczynników załamania światła składników, w tym hydrożelu GelMA i innych materiałów użytych w łacie. Równanie to sugeruje, że gdy łata jest rozciągana i d maleje, długość fali odbicia maleje, co prowadzi do niebieskiego przesunięcia koloru strukturalnego łaty. Przetestowano również wytrzymałość plastrów na rozciąganie i stwierdzono, że zdolność odkształcania łat zmniejszyła się z powodu wypełnienia hydrożelu GelMA w nanoskalowych szczelinach rusztowania z kamienia antybiałkowego. Deformacja łat CPG podczas rozciągania zapewnia bardzo czuły sposób wykrywania odkształceń, dzięki czemu nadają się one do zastosowań wymagających monitorowania mechanicznego.

Termoczułe i wrażliwe na pH zachowanie plastrów CPG (rysunek 2)
Plastry CPG wykazały się niezwykłymi właściwościami termoczułymi dzięki hydrożelowi GelMA. Po podniesieniu temperatury otoczenia do 37 °C hydrożel uległ skurczeniu, uwalniając cząsteczki wody i załadowany ładunek. Skurcz ten spowodował zmniejszenie rozmiaru nanoporów w płatach CPG, zmieniając ich PBG, a w konsekwencji przesuwając widmo odbicia. Rysunek 2 ilustruje to zachowanie, pokazując, jak zmienia się kolor strukturalny plam w odpowiedzi na zmiany temperatury i pH.

Aby potwierdzić te obserwacje, plastry CPG umieszczono w symulowanym środowisku rany po przewlekłym zakażeniu w temperaturze 37 °C i pH 7,2. Wraz ze wzrostem pH roztworu zaobserwowano niebieskie przesunięcie piku odbicia plastrów CPG, co wskazuje, że rozmiar nanoporów zmniejszył się. I odwrotnie, gdy pH spadało, plamy wykazywały przesunięcie ku czerwieni, co odpowiadało rozszerzeniu nanoporów. To wrażliwe na pH zachowanie przypisano hydrolizie wiązań estrów boronianowych w CSMA-PBA w warunkach kwaśnych, co spowodowało zerwanie wiązań i przesunięcie koloru strukturalnego ku czerwieni. Jednak gdy pH było zasadowe, nie zaobserwowano znaczącej zmiany koloru, co wskazuje na stabilność plam w podstawowych warunkach. Wyniki te sugerują, że plastry CPG mogą być stosowane do monitorowania zarówno zmian temperatury, jak i pH w środowisku ran, co ma kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia ran.

Działanie przeciwbakteryjne plastrów CPG (ryc. 3)
Właściwości przeciwbakteryjne plastrów CPG oceniano poprzez ich kohodowlę z S. aureus i E. coli. Rycina 3A,B pokazuje, że plastry CPG znacznie ograniczyły rozwój bakterii, wykazując swoje skuteczne właściwości przeciwbakteryjne. Ta skuteczność przeciwbakteryjna została przypisana oddziaływaniu elektrostatycznemu między dodatnio naładowaną powierzchnią CMCSMA plastrów a ujemnie naładowanymi ścianami komórkowymi^{bakterii 21}. Ta interakcja zakłóciła strukturę błony bakteryjnej, prowadząc do śmierci bakterii. Grupy kationowe CMCSMA mogą wiązać się ze składnikami anionowymi w błonie bakteryjnej, prowadząc do depolaryzacji błony i zwiększonej przepuszczalności²². Ponadto, ze względu na stosunkowo mały rozmiar cząsteczki i elastyczne łańcuchy polimerowe, CMCSMA może skuteczniej przenikać przez dwuwarstwę lipidową, powodując wyciek substancji wewnątrzkomórkowych i zakłócając aktywność metaboliczną. Niewielki rozmiar cząsteczek CMCSMA dodatkowo ułatwił ich przenikanie do błony komórkowej bakterii, gdzie wchodziły w interakcje z niezbędnymi biomolekułami, zaburzając metabolizm bakteryjny i systemy enzymatyczne²³. Dodatkowo, biorąc pod uwagę solidną zdolność S. aureus do tworzenia biofilmu, warto zauważyć, że materiały na bazie chitozanu, takie jak CMCSMA, zakłócają biofilmy bakteryjne poprzez przenikanie do zewnątrzkomórkowej matrycy substancji polimerowej (EPS) i ingerowanie w jej integralność. Dzięki temu środki przeciwbakteryjne mogą uzyskać dostęp do bakterii osadzonych w biofilmach, które są zwykle oporne na konwencjonalne antybiotyki, i zabijać je^24,25. Jak pokazano na rycinie 3A, wizualne porównanie kolonii bakteryjnych wyraźnie wskazuje na znaczne zmniejszenie po leczeniu plastrami CPG, podkreślając ich skuteczne działanie bakteriobójcze i obiecujący potencjał do stosowania w środowiskach ran podatnych na infekcje.

Funkcjonalność biologiczna plastrów CPG (ryc. 4)
Plastry CPG wykazały się znaczącą funkcjonalnością biologiczną oprócz swoich właściwości przeciwbakteryjnych. Ryc. 4C,D pokazują, że plastry skutecznie wychwytywały reaktywne formy tlenu (ROS) w komórkach, na co wskazuje zmniejszony sygnał zielonej fluorescencji w grupie CPG. Wymiatanie ROS jest niezbędne w gojeniu się ran, ponieważ nadmierna produkcja ROS może upośledzać regenerację tkanek. Żywotność ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) hodowanych jednocześnie z plastrami CPG oceniano za pomocą barwienia żywotności, jak pokazano na rysunku 4A. Wyniki wskazały, że większość komórek była żywa, a tylko niewielka część komórek martwych, co sugeruje, że plastry CPG promują żywotność komórek i wspierają proliferację komórek.

Rycina 4B przedstawia wyniki testu MTT, który wykazał, że plastry CPG znacząco promują proliferację komórek. Co więcej, rycina 4F,G wykazała, że plastry CPG zwiększają angiogenezę poprzez promowanie ekspresji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), które mają kluczowe znaczenie dla proliferacji komórek śródbłonka i tworzenia nowych naczyń krwionośnych. Wyniki te podkreślają potencjał plastrów CPG nie tylko w zapobieganiu infekcjom, ale także w usprawnianiu regeneracji tkanek i przyspieszaniu gojenia się ran.

Ocena in vivo plastrów CPG (ryc. 5)
Eksperymenty in vivo przeprowadzone przy użyciu modelu przewlekłego zapalenia kości i szpiku wykazały, że plastry CPG znacznie zmniejszały infekcje i stany zapalne. Rycina 5A przedstawia analizę histologiczną (barwienie H&E), w której grupa kontrolna wykazywała charakterystyczne zapalenie, zniszczenie kości, tkankę martwiczą i wysoką infiltrację komórek obronnych, podczas gdy grupa leczona wykazała znaczne zmniejszenie infekcji, stanu zapalnego i naciekania komórek obronnych. W grupie CPG zaobserwowano zwiększoną migrację osteoblastów, transformację osteoblastów w komórki kostne, tworzenie naczyń krwionośnych, tworzenie nowych kości i zmniejszenie infekcji, co dodatkowo potwierdza skuteczność plastrów CPG w promowaniu regeneracji tkanek.

Dodatkowo rycina 5B pokazuje barwienie angiogenezą, potwierdzając, że plastry CPG sprzyjały tworzeniu nowych naczyń krwionośnych, co ma kluczowe znaczenie dla naprawy tkanek. Odkrycia te sugerują, że plastry CPG odgrywają podwójną rolę zarówno w kontrolowaniu infekcji, jak i promowaniu regeneracji tkanek, co czyni je wysoce odpowiednimi do zastosowań w przewlekłym gojeniu ran i regeneracji kości.

Rysunek 1: Przygotowanie i charakterystyka strukturalnej plamy hydrożelowej (CPG). (A): Reakcja między CSMA i PBA; (B): Zdjęcie CPG, pokazujące zmianę koloru po rozciągnięciu; (C): Charakterystyka SEM CPG; (D): Pęcznienie CPG; (E): Profil degradacji CPG; (F): Kinetyka uwalniania leku z CPG. Podziałka: 100 nm. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD). W grupie eksperymentalnej wykorzystano sześć szczurów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Inteligentne wykrywanie plastra CPG. (A): Zmienność koloru strukturalnego łaty CPG wraz ze zmianami temperatury otoczenia i pH; (B): Analiza spektralna plastra CPG w różnych temperaturach; (C): Analiza spektralna plastra CPG przy różnych poziomach pH. Podziałka: 1 mm. Dane reprezentują średnią ± SD, analizowane przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Działanie przeciwbakteryjne plastra CPG. (A): Reprezentatywne obrazy wspólnej hodowli S. aureus i E. coli z plastrem CPG; (B): Analiza wartości gęstości optycznej (OD). Podziałka: 5 mm. Słupki błędów reprezentują SD. Istotność statystyczna została określona za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya. W każdej grupie wykorzystano sześć powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Biologiczna ocena funkcjonalna plastra CPG. (A): Barwienie żywotności komórek HUVEC hodowanych jednocześnie z plastrem CPG przez 48 godzin, pokazujące żywe komórki (kolor zielony) i martwe (kolor czerwony); (B): Proliferacja komórek mierzona testem MTT; (C): barwienie ROS plastra CPG; (D): Wskaźnik wymiatania DPPH w grupie VEGF; (E): analiza q-PCR czynników zapalnych; (F): Promowanie angiogenezy przez plaster CPG; (G): Wyniki Western blot ekspresji VEGF i bFGF; (H): Analiza statystyczna wartości VEGF i bFGF w skali szarości. Podziałka: 100 μm. Słupki błędów reprezentują SD. Dane zostały przeanalizowane przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya. W każdej grupie wykorzystano sześć szczurów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Eksperymenty in vivo z plastrem CPG. (A): barwienie HE; (B): Barwienie angiogenezą. Podziałka: 100 μm. Dane reprezentują średnią ± SD, analizowaną za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya. Każda grupa składała się z 6 zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wyniki tego badania wskazują na wielofunkcyjność plastrów hydrożelowych CPG, szczególnie pod względem zmian strukturalnego koloru, wrażliwości na temperaturę, reakcji pH i właściwości przeciwdrobnoustrojowych. Te plastry hydrożelowe mogą ulegać widocznym strukturalnym zmianom koloru pod wpływem odkształceń mechanicznych, oferując bardzo czuły mechanizm monitorowania obciążenia. Ta cecha jest zgodna z wcześniejszymi badaniami, które badały kolor strukturalny w materiałach do zastosowań w czujnikach, gdzie takie przesunięcia kolorów są wykorzystywane jako wskaźniki odkształcenia lub ciśnienia^26,27. Nasze badanie rozszerza te wyniki, wykorzystując te zmiany koloru jako nieinwazyjny sposób monitorowania stresu ran, co jest niezbędne do oceny gojenia się ran w czasie rzeczywistym. Możliwość monitorowania takich naprężeń mechanicznych dostarcza kluczowych informacji dla klinicystów, potencjalnie pomagając w identyfikacji wczesnych oznak powikłań, takich jak rozejście się szwów, wspierając w ten sposób bardziej ukierunkowane i terminowe interwencje. Co ważne, odczyt optyczny zapewnia bezpośredni i intuicyjny mechanizm wykrywania bez konieczności stosowania dodatkowego zasilania lub urządzeń do obrazowania, oferując zdecentralizowane rozwiązanie do monitorowania, idealne do opieki pooperacyjnej w miejscu opieki nad pacjentem lub w domu.

Termoresponsywne i wrażliwe na pH zachowania plastrów hydrożelowych CPG zwiększają ich potencjał do użytku klinicznego. W miarę gojenia się ran często występują wahania temperatury i pH, szczególnie w przypadku infekcji lub stanu zapalnego²⁸. Wiadomo, że podwyższona temperatura i zmienione wartości pH w miejscu rany są związane z tymi stanami. W tym badaniu plastry CPG wykazały wrażliwość na takie zmiany, umożliwiając monitorowanie w czasie rzeczywistym miejscowych stanów rany. Cecha ta jest szczególnie przydatna w warunkach klinicznych, gdzie wczesne wykrycie infekcji lub stanu zapalnego ma zasadnicze znaczenie dla optymalizacji strategii terapeutycznych. Monitorowanie zmian temperatury i pH jest szczególnie ważne w leczeniu ran, ponieważ służą one jako wczesne, nieinwazyjne biomarkery stanu rany²⁹. Podwyższona temperatura może sygnalizować początek infekcji przed wystąpieniem objawów klinicznych, podczas gdy zmiany w kierunku zasadowego pH często wskazują na przewlekłość, kolonizację drobnoustrojów i upośledzone gojenie. Natomiast środowisko kwaśne wiąże się z ostrymi ranami i lepszym potencjałem gojenia²⁴. W związku z tym włączenie elementów reagujących na temperaturę i pH do opatrunków na rany pozwala na szybkie interwencje i ciągłą ocenę postępów gojenia, co może zapobiec pogorszeniu się stanu rany lub progresji do infekcji ogólnoustrojowej. Zdolność hydrożelu do dynamicznego dostosowywania się do tych zmian stanowi również nowe narzędzie dla klinicystów do ciągłego monitorowania stanu rany, oferując większą dokładność w śledzeniu procesu gojenia. Co więcej, taka dynamiczna reakcja pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę nad uwalnianiem terapeutycznym, zapewniając, że dostarczanie leku jest zsynchronizowane z patologicznymi sygnałami, co jest głównym celem nowoczesnych inteligentnych biomateriałów.

Ponadto właściwości przeciwdrobnoustrojowe plastrów hydrożelowych CPG mają kluczowe znaczenie dla zmniejszenia obciążenia bakteryjnego w miejscu rany. Chitozan, który został włączony w strukturę hydrożelu, od dawna jest znany ze swoich właściwości przeciwdrobnoustrojowych, ze względu na swój kationowy charakter, który ułatwia interakcje elektrostatyczne z ujemnie naładowanymi ścianami komórkowymi^{bakterii 29}. Jednak mechanizm przeciwbakteryjny materiałów na bazie chitozanu nie ogranicza się do prostego przyciągania ładunku. W kontakcie z błonami bakteryjnymi chitozan może zwiększyć przepuszczalność błony, prowadząc do wycieku zawartości wewnątrzkomórkowej, takiej jak jony potasu, białka i kwasy nukleinowe. Dodatkowo chitozan może chelatować jony metali dwuwartościowych (np. Ca²⁺ i Mg²⁺), zaburzając aktywność enzymów i funkcje metaboliczne. Chitozan o niskiej masie cząsteczkowej może również przenikać przez ścianę komórkową bakterii i wiązać się z DNA, hamując transkrypcję mRNA i syntezę białek. Te wieloaspektowe mechanizmy zostały obszernie udokumentowane. Porowata struktura rusztowania hydrożelowego dodatkowo wzmacnia te efekty poprzez zwiększenie powierzchni i kontaktu z bakteriami, co skutkuje synergiczną skutecznością przeciwbakteryjną. Właściwość ta jest szczególnie istotna w leczeniu przewlekłych infekcji, takich jak zapalenie kości i szpiku, gdzie tworzenie się biofilmu komplikuje proces gojenia^25,30. Wyniki tego badania pokazują, że plastry hydrożelowe CPG były skuteczne w hamowaniu wzrostu bakterii, zmniejszaniu obciążenia bakteryjnego w miejscu rany i potencjalnie tworzeniu bardziej korzystnego środowiska do regeneracji tkanek. Ta aktywność przeciwdrobnoustrojowa, w połączeniu z innymi właściwościami hydrożelu, pozycjonuje plastry jako obiecującego kandydata do leczenia przewlekłych ran, które często są nękane przez zanieczyszczenie bakteryjne i opóźnione gojenie. Dodatkowo, hamując miejscową kolonizację bakteryjną, hydrożel pośrednio zapobiega regulacji w górę cytokin prozapalnych, które często utrzymują się w zakażonych ranach przewlekłych, promując w ten sposób proregeneracyjne mikrośrodowisko.

Chociaż ROS są zwykle związane ze stresem oksydacyjnym i uszkodzeniem tkanek, powszechnie uznaje się, że kontrolowane wytwarzanie ROS odgrywa kluczową rolę w eradykacji bakterii. ROS, takie jak rodniki hydroksylowe i aniony ponadtlenkowe, mogą utleniać białka bakteryjne, lipidy i DNA, ostatecznie prowadząc do pęknięcia błony i śmierci komórki. Dlatego obecność ROS na umiarkowanych poziomach służy jako krytyczny składnik wrodzonych mechanizmów obrony przeciwdrobnoustrojowej. W kontekście przewlekłego zapalenia kości i szpiku, w którym utrzymuje się kolonizacja bakteryjna i tworzenie biofilmu, eliminacja patogenów jest warunkiem wstępnym znaczącej regeneracji tkanek. Hydrożel CPG, tłumiąc nadmierne ROS przy jednoczesnym utrzymaniu skutecznej aktywności przeciwbakteryjnej poprzez przerywanie błony za pośrednictwem CMCSMA i penetrację biofilmu, oferuje zrównoważone podejście. Ta podwójna funkcja zapewnia, że stan zapalny nie jest przedłużany przez utrzymującą się obecność bakterii, co pozwala na przejście od aktywacji immunologicznej do regeneracyjnego mikrośrodowiska. W ten sposób, zamiast bezkrytycznie wymiatać ROS, system ten moduluje mikrośrodowisko oksydacyjne, aby wspierać zarówno usuwanie bakterii, jak i gojenie tkanek.

Oprócz aktywności przeciwdrobnoustrojowej, plastry hydrożelowe CPG wykazywały funkcję biologiczną, która ma kluczowe znaczenie dla naprawy i regeneracji tkanek³¹. Testy in vitro wykazały, że hydrożel wspomaga żywotność i proliferację komórek, a także angiogenezę. Odkrycia te są zgodne z wcześniejszymi badaniami, które podkreśliły znaczenie angiogenezy w gojeniu się ran³². Angiogeneza ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia odpowiedniego zaopatrzenia w tlen i składniki odżywcze zranionej tkanki, ułatwiając jej regenerację. Dodatkowo, proangiogenne działanie hydrożelu jest szczególnie ważne w leczeniu ran przewlekłych, ponieważ rany te często cierpią z powodu słabego unaczynienia, co utrudnia proces gojenia^33,34. Wspomagając tworzenie naczyń krwionośnych, hydrożel CPG nie tylko przyczynia się do regeneracji tkanek, ale także tworzy bardziej sprzyjające środowisko dla długotrwałego przetrwania nowo powstałych tkanek. Co więcej, zdolność hydrożelu do promowania migracji i różnicowania osteoblastów stanowi istotną wartość dodaną w kontekście gojenia kości, szczególnie dla pacjentów z przewlekłymi infekcjami kości lub ubytkami kostnymi³⁵. Wzmocnienie osteogenezy jest obiecującą drogą do poprawy wyników w zapaleniu kości i szpiku i powiązanych chorobach kości, w których gojenie jest często utrudnione. Taka funkcjonalność osteoindukcyjna, zintegrowana z miejscową kontrolą zakażeń, rozwiązuje główne wyzwanie w inżynierii tkanki mięśniowo-szkieletowej: potrzebę konwergentnych rozwiązań, które promują zarówno obronę przeciwdrobnoustrojową, jak i regenerację tkanek na jednej platformie.

Wyniki badań in vivo dodatkowo potwierdzają potencjał terapeutyczny plastrów hydrożelowych CPG, wykazując ich zdolność do wspomagania naprawy tkanek, zmniejszania infekcji i promowania osteogenezy. W modelach ran przewlekłych hydrożele te skutecznie ułatwiały zamykanie ran i regenerację tkanek. W modelach regeneracji kości hydrożel CPG promował migrację i różnicowanie osteoblastów, przyspieszając gojenie się kości. Wyniki te są zgodne z wynikami innych badań, w których analizowano strategie gojenia się ran i regeneracji kości na bazie hydrożelu³⁶. Zdolność plastrów hydrożelowych CPG do jednoczesnego zwalczania infekcji, promowania angiogenezy i wspierania osteogenezy stanowi potężną platformę do kompleksowej pielęgnacji ran, co czyni ją obiecującym kandydatem do zastosowania klinicznego.

Pomimo tych obiecujących wyników, istnieje kilka ograniczeń obecnego badania. Po pierwsze, podczas gdy modele in vitro i in vivo wykazały pozytywne wyniki, badania przedkliniczne przeprowadzono głównie na modelach mysich. Chociaż myszy są szeroko stosowane do badań nad gojeniem się ran, mogą nie w pełni odwzorowywać złożoności gojenia się ran u ludzi. Dlatego konieczna jest dalsza walidacja w większych modelach zwierzęcych, a także w badaniach klinicznych na ludziach, aby potwierdzić bezpieczeństwo i skuteczność tych plastrów hydrożelowych w rzeczywistych warunkach klinicznych. Po drugie, chociaż hydrożele CPG wykazywały dobre właściwości mechaniczne i funkcjonalność biologiczną w krótkim okresie, ich długoterminowa stabilność i degradacja in vivo pozostają niejasne. Hydrożele mogą z czasem ulegać degradacji, a produkty ich degradacji mogą wpływać na proces gojenia, a nawet wywoływać działania niepożądane. Przyszłe badania powinny koncentrować się na optymalizacji szybkości degradacji tych hydrożeli, aby zapewnić, że rozkładają się one w kontrolowany sposób, bez uwalniania szkodliwych produktów ubocznych. Dodatkowo, kontrolowane uwalnianie środków bioaktywnych zawartych w hydrożelu powinno być dalej udoskonalane, aby zapewnić trwałe efekty terapeutyczne w czasie, zwłaszcza w przypadku leczenia ran przewlekłych.

Podczas gdy badanie to koncentruje się na rusztowaniu supramolekularnym na bazie hydrożelu, alternatywne podejścia do rozwiązania tej samej hipotezy terapeutycznej obejmują bioczujniki elektrochemiczne, mikroprzepływowe systemy nawinięte na chip oraz inteligentne bandaże zawierające komponenty elektroniczne do wykrywania środowiska. Jednak w przeciwieństwie do tych technologii, które często wymagają źródeł zasilania i złożonych interfejsów, opracowany tutaj plaster hydrożelowy zapewnia samodzielną, wizualnie interpretowaną platformę bez zewnętrznego oprzyrządowania, co czyni ją szczególnie atrakcyjną w przypadku ustawień o ograniczonych zasobach.

Znaczenie tej pracy polega na jej potencjale translacyjnym. Oprócz zapalenia kości i szpiku, platformę CPG można dostosować do innych stanów związanych ze stanem zapalnym, takich jak owrzodzenia stopy cukrzycowej, infekcje miejsca operowanego i monitorowanie po resekcji guza. Integracja funkcji diagnostycznych i terapeutycznych w jednej matrycy hydrożelowej stwarza wyjątkową okazję do opracowania inteligentnych opatrunków nowej generacji. Ponadto system kolorów strukturalnych oparty na kryształach fotonicznych stwarza możliwości biodetekcji kolorymetrycznej w czasie rzeczywistym, która ma zastosowanie w medycynie spersonalizowanej. Co więcej, modułowość konstrukcji CPG pozwala na adaptację do przyszłej integracji z komórkami macierzystymi, egzosomami lub wektorami dostarczania genów w celu dalszego rozszerzenia jej zdolności regeneracyjnych, dostosowując się do obecnych trajektorii w precyzyjnej medycynie regeneracyjnej.

Patrząc w przyszłość, przyszłe badania powinny koncentrować się na kilku kluczowych obszarach. Po pierwsze, optymalizacja składu i struktury plastrów hydrożelowych CPG będzie miała kluczowe znaczenie dla zwiększenia ich długoterminowej stabilności i wydajności. Modyfikacja gęstości sieciowania i włączenie innych czynników bioaktywnych, takich jak czynniki wzrostu lub cytokiny, może poprawić potencjał terapeutyczny hydrożelu w określonych zastosowaniach klinicznych. Po drugie, rozszerzenie zakresu zastosowań tych hydrożeli poza rany przewlekłe na inne rodzaje regeneracji tkanek, takie jak naprawa nerwów lub chrząstek, może jeszcze bardziej wykazać ich wszechstronność. Potrzebne są badania nad tym, w jaki sposób hydrożele CPG mogą być dostosowane do określonych rodzajów ran, takich jak owrzodzenia cukrzycowe lub odleżyny, aby rozszerzyć ich zastosowanie kliniczne. Po trzecie, zintegrowanie zaawansowanych terapii, takich jak terapia komórkami macierzystymi lub terapia genowa, z plastrami hydrożelowymi może poprawić ich właściwości regeneracyjne, umożliwiając bardziej kompleksowe i skuteczne leczenie. Wreszcie, konieczne będą zakrojone na szeroką skalę, wieloośrodkowe badania kliniczne i badania aplikacyjne w warunkach rzeczywistych, aby ocenić bezpieczeństwo, możliwości produkcyjne, zgodność z przepisami przez użytkowników i gotowość regulacyjną platformy CPG, wspierając w ten sposób jej ostateczne zastosowanie kliniczne.

Podsumowując, plastry hydrożelowe CPG stanowią obiecującą platformę do zaawansowanego leczenia ran i regeneracji tkanek. Ich zdolność do monitorowania naprężeń ran, reagowania na zmiany temperatury i pH, wykazywania właściwości przeciwdrobnoustrojowych i wspomagania regeneracji tkanek oferuje wieloaspektowe podejście do leczenia ran przewlekłych. Chociaż wyniki badań przedklinicznych są zachęcające, konieczna jest dalsza optymalizacja i walidacja kliniczna, aby w pełni wykorzystać potencjał tych plastrów hydrożelowych w warunkach klinicznych. Przyszłe kierunki badań powinny obejmować ulepszenia w składzie materiałów, szersze zastosowania, integrację z zaawansowanymi strategiami terapeutycznymi oraz badania kliniczne w celu ustalenia ich skuteczności i bezpieczeństwa u ludzi.

W tym eksperymencie wykorzystaliśmy kombinację metylowego CSMA-PBA jako odwróconego rusztowania opalowego, reagującego na temperaturę hydrożelu GelMA jako wypełniacza i załadowaliśmy go SA, aby stworzyć zintegrowaną diagnostyczną i terapeutyczną inteligentną strukturalną łatkę hydrożelową CPG. Wyniki eksperymentów wskazują, że ten plaster hydrożelowy wykazuje doskonałe właściwości mechaniczne i siłę klejenia. Może hamować rozwój bakterii, znacznie zwiększać ekspresję czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych i obniżać poziom czynników zapalnych, zapewniając w ten sposób znaczące perspektywy kliniczne w leczeniu COM. Ponadto, co ważne, w oparciu o zdolność CPG do wykrywania zmian temperatury i pH w miejscu zakażenia, pełni rolę monitorującą w powrocie do zdrowia po przewlekłym zapaleniu kości i szpiku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Akrylamid (AM, 99%)	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy A8887	Monomer do polimeryzacji hydrożelowej
Chlorek akryloylu (AC, 99%)	TCI Chemikalia	Nr kat. A0376	Stosowany w reakcjach modyfikacji chemicznej
Alkaliczny tlenek glinu (200-300 mesh)	Aladdin	A112336	Służy do oczyszczania metakrylanu metylu
Przeciwciało anty-bFGF	Santa Cruz	SC-9084 powiedział:	Barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia czynnika wzrostu
Przeciwciało anty-CD31	Księga Abcam	ab28364 powiedział:	Immunohistochemia do wykrywania markerów naczyniowych
Przeciwciało anty-EGF	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy E9644	Barwienie immunohistochemiczne
Przeciwciało anty-VEGF	Santa Cruz	SC-7269 powiedział:	Barwienie immunofluorescencyjne w angiogenezie
Bis-akrylamid (BIS, 97%)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7279	Środek sieciujący w sieci hydrożelowej
Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)	Dojindo powiedział:	CK04 powiedział:	Ocena żywotności komórek
Chitozan, metyloakrylowany (CSMA-PBA)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C3641	Tworzenie rusztowań w łatwach hydrożelowych
Sonda DCFH-DA	Beyotime	S0033 powiedział:	Detekcja reaktywnych form tlenu (ROS)
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Korporacja Chińskiej Narodowej Grupy Farmaceutycznej	DMSO-AR	Rozpuszczalnik do formulacji hydrożelowej
Escherichia coli (E. coli)	Kontroler ATCC (Kontroler T	-	Stosowany w testach antybakteryjnych
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	Zobacz materiał BX53	Immunofluorescencja i obrazowanie komórek
Metakrylan żelatyny (GelMA)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G1894	Składnik hydrożelowy reagujący na temperaturę
Kwas solny (HCl)	Chongqing Tianyun	HCl-AR (czujnik HCl-AR)	Regulacja pH w syntezie
Nadtlenek wodoru (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009 powiedział:	Indukuje stres oksydacyjny w komórkach
Kwas fluorowodorowy (HF, 4%)	Sinopharm powiedział:	H814912	Wytrawianie kryształów krzemionki koloidalnej
Uniwersalna maszyna do prób rozciągania Instron	Instron	3345	Badanie wytrzymałości mechanicznej i adhezyjnej
Ogniwa L929	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-1	Stosowany do oznaczania cytotoksyczności i biokompatybilności
Mikrotom Leica	Księga Leica	Zobacz materiał RM2235	Służy do parafinowego cięcia tkanek
Samce szczurów Sprague-Dawley (8 tygodni)	Biotechnologia Reagana	-	Model przewlekłego zapalenia kości i szpiku in vivo
Massona' s Zestaw bejc trichromowych	Solarbio (Słoneczna Biologia)	Silnik G1340	Barwienie histologiczne na zwłóknienie
Metakrylan metylu (MMA, 99%)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M27805	Monomer do formowania rusztowań
Zestaw testowy MTT	Beyotime	Zobacz materiał M5655	Ocena proliferacji komórek i cytotoksyczności
Paraformaldehyd (4%)	Serwis bio	G1101 powiedział:	Utrwalanie tkanek
Parafina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1003	Podłoże do zatapiania do histologii
Bufor PBS	Gibco (firma Gibco)	10010023	Stosowany w przetwórstwie komórkowym i hydrożelowym
Fenyloalanina (99%)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5482 powiedział:	Stosowany w modyfikacji chemicznej
Kwas fenyloboronowy (PBA)	TCI Chemikalia	Zobacz materiał P0157	Składnik wrażliwy na pH w hydrożelu
Nadsiarczan potasu (KPS)	Pekin Baolingwei	KPS-AR	Inicjator rodników w polimeryzacji
Zestaw odczynników PrimeScript RT	Takara	Przekaźnik RR047A	Służy do syntezy cDNA
Zestaw do oznaczania reaktywnych form tlenu (ROS)	KeyGen Biotechnologia	KGAF019	Ocena aktywności antyoksydacyjnej
System PCR w czasie rzeczywistym	Biosystemy stosowane	Krok OnePlus	Kwantyfikacja ekspresji genów
RNAiso Plus	Takara	9108	Odczynnik do ekstrakcji RNA
Reometr (HR-1)	Instrumenty TA	HR-1	Charakterystyka reologiczna hydrożelu
Kwas salicylowy (SA)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S3254	Cząsteczka leku w hydrożelu
Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)	JEOL (o rany)	JSM-7500F	Analiza morfologiczna struktury hydrożelu
Nanocząstki krzemionki (12 nm)	Sigma-Aldrich	637246	Tworzenie koloidalnych matryc krystalicznych z krzemionki
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Korporacja Chińskiej Narodowej Grupy Farmaceutycznej	NaOH-AR	Ph
Staphylococcus aureus (S. aureus)	Kontroler ATCC (Kontroler T	-	Stosowany w testach antybakteryjnych
SYBR Zielona mieszanka wzorcowa PCR	Biosystemy stosowane	4367659	Odczynnik do wykrywania qPCR
Źródło światła UV (365 nm, 3 mW/cm²)	Herolab (Laboratorium Herolab)	UVT-28	Służy do polimeryzacji UV
Spektrofotometr UV	Shimadzu powiedział:	UV-2600	Pomiar uwalniania leku