W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny kardioprotekcyjnego działania sygnalizacji NRG1 / ErbB4 w szczurzym modelu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego poprzez ocenę stresu oksydacyjnego i apoptotycznych szlaków sygnałowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny kardioprotekcyjnego działania sygnalizacji NRG1 / ErbB4 w szczurzym modelu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego poprzez ocenę stresu oksydacyjnego i apoptotycznych szlaków sygnałowych.
Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego (MIRI) stanowi istotną przeszkodę w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych. Patofizjologia MIRI jest złożona i obejmuje stres oksydacyjny, przeciążenie wapniem, stan zapalny i apoptozę. Szlak sygnałowy NRG1/ErbB4 jest zaangażowany w modulowanie reakcji na stres oksydacyjny w sercu, potencjalnie zmniejszając uszkodzenia komórek spowodowane przez wolne rodniki. Badanie to miało na celu wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, za pomocą których szlak NRG1/ErbB4 zapewnia ochronę w szczurzym modelu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego (MIRI). Ustalono szczurzy model MIRI, obejmujący 30 dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley losowo przydzielonych do pięciu grup: kontrola, operacja pozorowana, MIRI, rekombinowany NRG1 i AG1478. Stężenia NRG1 w tkankach serca mierzono metodą ELISA, podczas gdy poziomy p-ErbB4 i całkowitego białka ErbB4 oceniano za pomocą Western blot. Poziom apoptozy kardiomiocytów i reaktywnych form tlenu (ROS) oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. W grupie MIRI poziomy NRG1 były znacznie zmniejszone w porównaniu z kontrolną i pozorowaną grupą operacyjną (p < 0,05). Leczenie rekombinowanym NRG1 doprowadziło do znacznego wzrostu poziomu NRG1 w tkance serca, wraz ze zwiększonym stosunkiem ekspresji p-ErbB4 / ErbB4 (p < 0,05). Grupa AG1478 wykazywała niższe poziomy NRG1 i zmniejszony stosunek p-ErbB4 / ErbB4 w porównaniu z grupą rekombinowaną NRG1 (p < 0,05). Jeśli chodzi o poziomy apoptozy i ROS, grupa MIRI wykazała znacznie wyższe wskaźniki niż grupy kontrolne i pozorowane (p < 0,05). Rekombinowane leczenie NRG1 istotnie zmniejszyło apoptozę komórek mięśnia sercowego i poziomy ROS (p < 0,05), podczas gdy AG1478 również osłabił te efekty, ale w mniejszym stopniu. Szlak sygnałowy NRG1 / ErbB4 odgrywa kluczową rolę ochronną w MIRI u szczurów. Suplementacja egzogennym NRG1 skutecznie podnosi poziom NRG1 w sercu, aktywuje szlak sygnałowy ErbB4, zmniejsza apoptozę komórek mięśnia sercowego i obniża poziom ROS, łagodząc w ten sposób uszkodzenia wywołane przez MIRI.
Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego (MIRI) stanowi krytyczne wyzwanie w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych1. Chociaż przywrócenie przepływu krwi do niedokrwionego mięśnia sercowego jest niezbędne w leczeniu zawału mięśnia sercowego, sama reperfuzja może pogłębić uszkodzenie tkanki serca, ograniczając w ten sposób efekt terapeutyczny. Mechanizmy leżące u podstaw MIRI są złożone i obejmują różne procesy patofizjologiczne, wśród których są stres oksydacyjny, przeciążenie wapniem, reakcje zapalne i apoptoza 2,3,4.
Czynnik wzrostu nerwów 1 (NRG1) i jego receptor Receptor Erb-B2 kinaza tyrozynowa 4 (ERBB4) odgrywają kluczową rolę w fizjologii i patologii serca. NRG1, ligand zewnątrzkomórkowy, oddziałuje z receptorem ErbB4, aktywując kaskadę szlaków sygnałowych, które są kluczowe dla rozwoju serca, utrzymania integralności strukturalnej i reagowania na urazy serca5. Pojawiające się dowody podkreślają rolę, jaką odgrywa szlak sygnałowy NRG1/ErbB4 w chorobach serca. W warunkach niedokrwienia mięśnia sercowego i reperfuzji ekspresja i funkcja NRG1 mogą być zmienione6. Wcześniejsze badania sugerowały, że NRG1 wspomaga przeżycie komórek mięśnia sercowego i hamuje nadmierną apoptozę poprzez aktywację ErbB4. Dodatkowo szlak sygnałowy NRG1 / ErbB4 może regulować reakcję na stres oksydacyjny w sercu i łagodzić uszkodzenia komórek spowodowane przez wolne rodniki. Dlatego wyjaśnienie funkcji szlaku sygnałowego NRG1 / ErbB4 w MIRI ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologicznych podstaw tego uszkodzenia i opracowania nowych strategii terapeutycznych 7,8.
Badanie to spekuluje, że szlak sygnałowy NRG1 / ErbB4 odgrywa ochronną rolę w MIRI. Dlatego w tym badaniu skonstruowano szczurzy model niedokrwienia-reperfuzji mięśnia sercowego w celu systematycznego badania mechanizmu szlaku sygnałowego NRG1 / ErbB4 w MIRI. Regulując stężenie NRG1 i obserwując zmiany w statusie aktywacji ErbB4, tempie apoptozy komórek mięśnia sercowego i poziomie stresu oksydacyjnego. Niniejsze badanie ma na celu ujawnienie mechanizmu molekularnego, za pomocą którego szlak sygnałowy NRG1 / ErbB4 wywiera działanie ochronne w MIRI. Nowatorstwo tego badania polega na ujawnieniu znaczenia szlaku sygnałowego NRG1/ErbB4 w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym mięśnia sercowego, a także na dostarczeniu nowej perspektywy dla strategii leczenia chorób serca opartych na tym szlaku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zwierzęta doświadczalne
Trzydzieści dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 8 tygodni i o wadze 180-200 g uzyskano od komercyjnego sprzedawcy. Szczury te były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów przez 1 tydzień przed eksperymentami. Eksperymenty uzyskały zgodę Komisji Etycznej Pierwszego Szpitala w Nanping (nr NPSY202208010).
Modele zwierzęce uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego
Szczury znieczulono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 3% pentobarbitalu sodu w dawce 50 mg/kg. Po potwierdzeniu braku odruchów zwierzęta umieszczono w pozycji leżącej, a okolice szyi i klatki piersiowej ogolono i zdezynfekowano 75% etanolem. Wykonano nacięcie szyjki macicy w linii środkowej (~2 cm) w celu odsłonięcia tchawicy, a następnie intubację doustną za pomocą cewnika 16 G w celu utrzymania drożności dróg oddechowych podczas operacji. Następnie starannie wypreparowano lewy mięsień piersiowy większy, aby odsłonić trzecią i czwartą przestrzeń międzyżebrową. Wykonano torakotomię, wykonując nacięcie między tymi przestrzeniami, a osierdzie otwarto w celu pełnego odsłonięcia serca. Aby wywołać niedokrwienie, lewą przednią zstępującą tętnicę wieńcową (LAD) podwiązano za pomocą 8-0 szew nylonowy. Rurka polietylenowa (PE-10) została wprowadzona między LAD a ligaturę, aby umożliwić odwracalną okluzję. Niedokrwienie utrzymywało się przez 45 minut, potwierdzone wizualnie blednięciem mięśnia sercowego i zmianami w EKG. Reperfuzję rozpoczynano od zwolnienia ligatury, co pozwoliło na wznowienie przepływu krwi przez 3 godziny. Podwiązanie usunięto 45 minut później.
Grupowanie eksperymentalne
Szczury zostały losowo przydzielone do pięciu grup (n = 6 każda). (1) Grupa kontrolna: szczury otrzymywały standardową opiekę bez żadnej interwencji chirurgicznej lub leczenia. (2) Pozorowana grupa operacyjna: szczury przeszły torakotomię i nawlekanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) bez podwiązania, służąc jako kontrola chirurgiczna. (3) Grupa MIRI: szczury przeszły indukcję uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego i podawano im normalną sól fizjologiczną dożołądkowo jako kontrolę nośnika. (4) Grupa rekombinowanego NRG1: szczury otrzymały dożylne wstrzyknięcie rekombinowanego ludzkiego NRG1 (rh-NRG1) w dawce 5 mg / kg, 30 minut przed torakotomią, a następnie procedurę MIRI. (5) Grupa AG1478: szczurom podawano dożylnie rh-NRG1 (5 mg/kg) w połączeniu z AG1478 (20 mg/kg), inhibitorem kinazy receptora ErbB, 30 minut przed torakotomią, a następnie poddano je procedurze MIRI.
Test immunoenzymatyczny (ELISA)
Zwierzęta poddano eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (150 mg/kg). Tkanki serca pobrano natychmiast po reperfuzji i homogenizowano na lodzie w odpowiedniej objętości lodowatego PBS. Homogenaty następnie odwirowywano przy 1200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia supernatantu. Stężenie NRG1 w supernatancie określono ilościowo przy użyciu dostępnego na rynku zestawu NRG1 ELISA, dokładnie przestrzegając instrukcji producenta. Krótko mówiąc, próbki i wzorce dodano do studzienek płytkowych ELISA, inkubowano w temperaturze pokojowej przez zalecany czas, a następnie przemyto i dodano przeciwciała wykrywające. Absorbancję mierzono przy określonej długości fali za pomocą czytnika mikropłytek, a poziomy NRG1 obliczono na podstawie krzywej wzorcowej. Objętość próbki wynosiła 100 μl, rozcieńczenie przeciwciała 1:100, a długość fali do pomiaru absorbancji ustalono na 450 nm.
Analiza Western blot
Tkanki serca wycięto znieczulonym szczurom i przepłukano w lodowatym PBS w celu usunięcia resztek krwi. Dla każdego serca zważono około 0,5 g tkanki lewej komory i umieszczono ją w 500 μl świeżo przygotowanego buforu do lizy RIPA. Tkanka była następnie homogenizowana na lodzie za pomocą mechanicznego młynka do tkanek, aż do pełnej lizy, a następnie inkubacja na lodzie przez 30 minut, aby zapewnić pełną ekstrakcję białka. Lizaty odwirowywano w stężeniu 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń. Stężenia białek oznaczono za pomocą zestawu do oznaczania BCA. Równe ilości białka ogółem (np. 30 μg na linię) załadowano i oddzielono za pomocą SDS-PAGE. Białka następnie przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą mokrego systemu transferowego pod napięciem 100 V przez 90 minut. Błony zatkano 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie błony inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko fosforylowanemu ErbB4 (p-ErbB4) i całkowitemu ErbB4, z których każde rozcieńczono w stosunku 1:1000. Po umyciu błony inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pasma białkowe zwizualizowano za pomocą substratu o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i wychwycono za pomocą systemu obrazowania żelowego. Intensywności pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ, a stosunek p-ErbB4 do całkowitego ErbB4 obliczono w celu oceny poziomów fosforylacji.
Cytometria przepływowa
Apoptozę miocytów serca oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Tkanki serca zostały drobno rozdrobnione i enzymatycznie trawione przy użyciu mieszaniny kolagenazy typu II (1 mg/ml) i proteazy (np. trypsyny, 0,25%) w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem przez 20-30 min. Trawienie enzymatyczne zakończono przez dodanie równej objętości płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Zawiesinę komórek przefiltrowano przez nylonową siatkę o grubości 70 μm i odwirowano w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek. Osad komórkowy zawieszono ponownie w buforze wiążącym, a następnie inkubowano z aneksyną V-FITC i jodkiem propidyny (PI) zgodnie z protokołem producenta. Po inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, próbki natychmiast analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Wczesne komórki apoptotyczne zostały zidentyfikowane jako aneksyna V-dodatnie i PI-ujemne, podczas gdy późne komórki apoptotyczne lub martwicze były dodatnie dla obu markerów. Wskaźniki apoptozy określono ilościowo i porównano między grupami eksperymentalnymi. Strategia bramkowania przyjmuje ustawienie bramki krzyżowej/prostokątnej. Podczas przeprowadzania detekcji na maszynie bramka krzyżowa została ustawiona jako linia przerywana, a wszystkie parametry zostały zastosowane w celu zapewnienia spójności przesiewania danych. Natężenie przepływu dostosowano w zależności od stężenia ogniw (utrzymywanego na poziomie 1000 komórek/s), a ładowanie próbki przy niskiej prędkości pozwala uniknąć zatkania dyszy.
Wykrywanie poziomów reaktywnych form tlenu (ROS)
Kardiomiocyty wyizolowano z tkanek serca, a następnie odwirowano w stężeniu 300 × g przez 5 minut i dwukrotnie przemywano solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Komórki następnie inkubowano z 10 μM barwnikiem dioctanu 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFDA) w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po barwieniu komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanego barwnika. Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS mierzono natychmiast za pomocą cytometrii przepływowej, wykrywając intensywność fluorescencji emitowanej po utlenieniu DCFDA. Średnia intensywność fluorescencji (MFI) każdej próbki została określona ilościowo za pomocą oprogramowania FlowJo w celu porównania poziomów ROS w grupach eksperymentalnych. Strategia bramkowania jest opisana powyżej (sekcja cytometrii przepływowej).
Analiza statystyczna
Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania SPSS, przedstawionego jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Jednoczynnikowa analiza wariancji z testem post hoc Tukeya została przeprowadzona w celu porównania wielu grup, a test t Studenta został użyty do porównań parami. Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
NRG1 wykazuje działanie ochronne przeciwko apoptozie kardiomiocytów indukowanej przez MIRI
Analiza cytometryczna wykazała znaczny wzrost wskaźników apoptozy w grupie MIRI w porównaniu z grupą kontrolną i grupą sham (P < 0.05). Zarówno w grupie z rekombinowanym NRG1, jak i w grupie AG1478 odnotowano istotnie niższe wskaźniki apoptozy w porównaniu z grupą MIRI (P < 0.05). Z kolei grupa z rekombinowanym NRG1 wykazała niższy wskaźnik apoptozy w porównaniu z grupą AG1478 (P < 0.05) (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
MIRI nadal stanowi istotną przeszkodę w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych, biorąc pod uwagę, że przywrócenie perfuzji do niedokrwionej tkanki serca może paradoksalnie nasilić uszkodzenie mięśnia sercowego. Występowanie MIRI jest wieloczynnikowe i obejmuje stres oksydacyjny, przeciążenie wapniem, reakcje zapalne i dysfunkcję mitochondriów 9,10.
NRG1, ligand zewnątrzkomórkowy, aktywuje dalsze szlaki sygnałowe poprzez wiązanie się z re...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Praca ta była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Fujian (numer grantu.2024J011604,2023J011877) oraz Młodzieżowy Projekt Badawczy Komisji Paleniskowej Prowincji Fujian (numer grantu.2019-9-25).
WKŁAD AUTORA:
Maozhi Huang kierował koncepcją i projektem projektu badawczego, zaplanował i szczegółowo opracował protokół eksperymentalny, uczestniczył w kluczowych eksperymentach i napisał pierwszy szkic manuskryptu. Jianping Zheng wniósł równy wkład w ogólne badania, w tym w projektowanie, zbieranie danych i sporządzanie manuskryptów. Xianlu Cheng brał udział w projekcie badawczym, zbierał próbki i analizował dane. Chaoqun: Pomagałeś w pisaniu i porządkowaniu rękopisu. Ziguo Chen sprawdził dane i pomógł ulepszyć sekcję metod i materiałów. Ling Jiang zapewniał akademicką kontrolę i wskazówki w całym procesie badawczym. Shanghua Xu kierował ogólnym kierunkiem projektu, koordynował zasoby oraz recenzował i poprawiał ostateczną wersję manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AG1478 powiedział: | Technologia BioLab | WD102925 | Lek interwencyjny AG1478 |
| Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC/PI | Meilune powiedział: | MA0220 powiedział: | Cytometria przepływowa, apoptoza |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Meilunbio powiedział: | MA0082-2 powiedział: | Kwant białka WB |
| System obrazowania chemiluminescencyjnego | Bio-Rad (Stany Zjednoczone) | ChemiDoc Dotyk | Obrazowanie Western blot |
| Chlorowodorek cyjamemazyny | Zdrowie zwierząt Huamu | 20220601 | Środek znieczulający do modelowania zwierząt |
| Zestaw do wykrywania ECL | Meilunbio powiedział: | MA0186-1 powiedział: | Chemiluminescencja WB |
| ERbB4 powiedział: | Technologia białkowa | 19943-1-AP | Przeciwciało pierwszorzędowe WB |
| Cytometr przepływowy | BD | FACSCalibur powiedział: | Wykrywanie apoptozy metodą cytometrii przepływowej |
| GAPDH | Technologia białkowa | 60004-1-IG | Przeciwciało kontrolujące obciążenie WB |
| IgG anty-mysie IgG (H+L) kozy sprzężone z HRP | Technologia białkowa | SA00001-1 | Immunohistochemia |
| IgG przeciw królikowi IgG (H+L) kozie sprzężone z HRP | Technologia białkowa | SA00001-2 | Immunohistochemia |
| Czytnik mikropłytek | Thermo | Zobacz materiał K3 | Wykrywanie testu ELISA |
| PAGE Zestaw do przygotowania żelu 15% | Meilunbio powiedział: | MA0384 powiedział: | Elektroforeza WB |
| p-ERbB4 powiedział: | Powinowactwo | AF3445 powiedział: | Przeciwciało pierwszorzędowe WB |
| Wstępnie wybarwiony marker białkowy | Meilunbio powiedział: | MA0342 powiedział: | Elektroforeza WB |
| Zestaw ELISA Neuregulin-1 dla szczurów (NRG-1) | Meimian (Język meimski) | Zobacz materiał MM-61434R2 | Wykrywanie testu ELISA |
| Zestaw do oznaczania reaktywnych form tlenu (ROS) | Meilune powiedział: | MA0219 powiedział: | Test WB |
| rhNRG1 powiedział: | Technologia BioLab | WD091127 | Lek interwencyjny NRG1 |
| Bufor do lizy RIPA | Meilunbio powiedział: | MA0151 | Ekstrakcja białka dla Western blot |
| Bufor ładowania SDS-PAGE (5x) | Beyotime | Zobacz materiał P0015L | Elektroforeza WB |
| Dodecylosiarczan sodu | Sigma | 151-21-3 | Elektroforeza WB |
| Su Tai 50 | Virbac (Francja) | 8X22A | Środek znieczulający do modelowania zwierząt |
| Pionowy system elektroforezy białek | Bio-Rad (Stany Zjednoczone) | POWER PAC 200 | Elektroforeza Western blot |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny