Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego i analizy wzrostu drobnoustrojów pod wpływem gwałtownych oscylacji tlenu. Wydajność urządzenia została potwierdzona za pomocą wykrywania tlenu w kanałach płynów i hodowli mikroorganizmów.

Streszczenie

Analiza pojedynczych komórek mikrobiologicznych przy użyciu mikrofluidyki w połączeniu z mikroskopią poklatkową daje nadzieję na zbadanie zachowania wzrostu drobnoustrojów w ograniczonych środowiskach z rozdzielczością czasoprzestrzenną, oferując wgląd, którego nie można uzyskać za pomocą konwencjonalnych platform hodowlanych i analitycznych. Tlen odgrywa kluczową rolę w określaniu wzrostu drobnoustrojów. Jednak kontrola czasowa w zakresie sekund nie została zaimplementowana w analizie mikrobiologicznej z wykorzystaniem mikrofluidyki. Niedawno opracowaliśmy dwuwarstwowy chip mikroprzepływowy PDMS, umożliwiający czasową kontrolę tlenu w zakresie kilkudziesięciu sekund. Chip składa się z górnej warstwy do gazowania i dolnej warstwy do uprawy i perfuzji płynów. Obie warstwy są oddzielone cienką pośrednią membraną PDMS, co umożliwia szybką wymianę gazową między dwiema warstwami. W tym artykule metodologicznym wyjaśniamy procedurę wytwarzania, charakterystyki i hodowli mikrobiologicznej przy użyciu chipa. Jako reprezentatywne wyniki demonstrujemy zdolność do szybkiej przełączania tlenu w ciągu kilkudziesięciu sekund, hodowlę mikrobiologiczną i analizę wzrostu z rozdzielczością czasową w stałych i oscylujących warunkach tlenowych. Protokół ten ma na celu pomóc naukowcom zainteresowanym wdrożeniem czasowej kontroli tlenu w ich konfiguracji mikroprzepływowej.

Wprowadzenie

Tlen jest ściśle związany ze wzrostem i fizjologią drobnoustrojów wśród różnych czynników środowiskowych, szczególnie wpływając na procesy komórkowe, takie jak reakcja na stres oksydacyjny, homeostaza żelaza i infekcje chorobotwórcze ^1,2,3. Tradycyjnie hodowla mikrobiologiczna była prowadzona w warunkach otoczenia lub przy minimalnej kontroli przy określonych poziomach tlenu. Z drugiej strony, w realistycznych scenariuszach środowisko tlenu często nie jest w wielu przypadkach stałe, ale raczej zmienia się w czasie. Na przykład mikroorganizmy mogą być narażone na zmieniające się poziomy tlenu w ciągu kilku sekund do minut w systemach wodnych, gdy poruszają się w środowisku z powodu ruchu płynów i ruchliwości drobnoustrojów ^4,5,6. Podobnie, bioreaktory przemysłowe również tworzą niejednorodne środowisko tlenowe z powodu nieodpowiedniego mieszania, co wpływa na rozwój drobnoustrojów i ostateczną wydajność ^7,8. Badanie reakcji mikrobiologicznych na takie dynamiczne warunki ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesów ekologicznych i poprawy zastosowań biotechnologicznych.

Fakultatywne beztlenowce, takie jak Escherichia coli (E. coli), mogą przełączać się między szlakami tlenowymi i beztlenowymi w zależności od dostępności tlenu ^9,10. Chociaż poprzednie badania badały tę metaboliczną zdolność adaptacyjną, większość badań koncentruje się na pojedynczych zmianach tlenu przy użyciu konwencjonalnych systemów uprawy, które nie są w stanie odtworzyć szybkich zmian, z którymi często borykają się drobnoustroje 9,11,12,13,14. W rezultacie wiedza na temat tego, w jaki sposób drobnoustroje reagują fizjologicznie na często zmieniający się poziom tlenu, jest ograniczona.

Jak wspomniano, tradycyjnym konfiguracjom laboratoryjnym brakuje precyzji i szybkości potrzebnej do naśladowania gwałtownych wahań tlenu i nie obsługują ciągłego monitorowania w wysokiej rozdzielczości. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy niedawno specjalistyczną platformę mikroprzepływową z dwuwarstwowym chipem z polidimetylosiloksanu (PDMS), umożliwiającą szybką kontrolę tlenu i obrazowanie pojedynczych komórek¹⁵. W tym miejscu udostępniamy protokoły wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego, który wytwarza szybkie oscylacje tlenu i umożliwia analizę wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów w kontrolowanych warunkach tlenowych. Chip składa się z dwóch warstw – górnej warstwy do perfuzji gazowej i dolnej warstwy do płynnej perfuzji i hodowli mikrobiologicznej. Pośrednia cienka membrana pomiędzy dwiema warstwami pozwala na szybką wymianę gazową. W ramach demonstracji w opracowanym chipie wyhodowano E. coli MG1655. Przeanalizowano wzrost w stałych i oscylacyjnych warunkach tlenowych.

Protokół

1. Przygotowanie formy

1. Przygotuj formę na wierzchnią warstwę za pomocą druku 3D. Wykonaj formę górnej warstwy z gładką powierzchnią, aby zapewnić gładką powierzchnię powstałej górnej warstwy PDMS. Zalecamy korzystanie z druku 3D stereolitografii (SLA).
   1. Zaprojektuj formę za pomocą oprogramowania CAD 3D (Rysunek 1A). Upewnij się, że konstrukcja zawiera kanały gazowe, które zachodzą na dolne kanały płynu. Wykonaj ten proces projektowania równolegle z projektowaniem dolnej warstwy (krok 1.2.1).
   2. Wydrukuj formę za pomocą druku 3D SLA. Usuń pozostałą żywicę z wydrukowanej formy i umyj ją w kąpieli z alkoholem izopropylowym (IPA) przez 30 minut (Rysunek 1B).
   3. Utwardzanie końcowe należy wykonać, wystawiając formę na działanie światła o długości fali 405 nm o odpowiednim czasie trwania i temperaturze w zależności od rodzaju i geometrii żywicy.
   4. Pozwól pleśni zanurzyć się w IPA w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut, aby usunąć nieutwardzoną żywicę pozostałą w formie, która w przeciwnym razie mogłaby utrudnić utwardzanie PDMS.
2. Przygotuj formę do wafli krzemowych na dolną warstwę.
   1. Zaprojektuj układ mikroprzepływowy za pomocą edytora układu CAD (Rysunek 1C). Upewnij się, że konstrukcja obejmuje wloty, kanały płynów i wyloty.
   2. Stwórz formę do wafli krzemowych za pomocą dwuwarstwowej fotolitografii, jak opisano w poprzednim artykule (Rysunek 1D)¹⁶.
      UWAGA: Kanały na dolnej warstwie są wielkości μm i wymagają precyzyjnego wykonania, podczas gdy kanały na górnej warstwie są wielkości mm. Ponieważ druk 3D SLA oferuje krótszy czas produkcji, a tym samym szybsze prototypowanie, druk SLA został wykorzystany do wytworzenia dość dużych struktur formy wierzchniej. Dolna warstwa została wykonana metodą fotolitografii, aby zapewnić precyzyjne wykonanie. W przypadku, gdy kanały w górnej warstwie również znajdują się w zakresie μm i wymagają precyzji, rozważ również wykonanie formy przy użyciu fotolitografii.

2. Dwuwarstwowa produkcja chipów mikroprzepływowych PDMS

1. Przygotuj roztwór do wstępnego utwardzania PDMS, dokładnie mieszając bazę i utwardzacz w stosunku 10:1. Odgazować mieszaninę w eksykatorze przez 1 godzinę.
2. Oczyść górną warstwę formy za pomocą IPA i wysusz sprężonym powietrzem.
3. Wlej PDMS do formy wierzchniej warstwy, a następnie utwardzaj termicznie w temperaturze 80 °C przez 20 minut (1.^etap utwardzania, rysunek 1E). 1.^etap utwardzania umożliwia obieranie, cięcie i wykrawanie PDMS, gdy nie jest on w pełni utwardzony.
4. Sprawdź lepkość PDMS ręcznie lub pęsetą po 20 minutach podgrzewania. Jeśli PDMS jest nadal lepki, dostosuj czas nagrzewania.
5. Oderwij PDMS z formy wierzchniej warstwy i pokrój go na pojedyncze kawałki (tutaj 20 mm x 18 mm). Otwory do dziurkaczy (średnica = 0,75 mm) na wloty gazu (rysunek 1F). Oczyść dolną powierzchnię górnej warstwy, spłukując IPA, susząc sprężonym powietrzem i przyklejając taśmę klejącą.
6. Oczyść dolną warstwę formy za pomocą IPA i wysusz ją sprężonym powietrzem. Zamocuj dolną warstwę formy na powlekarce wirowej i wlej PDMS na środek formy. Wlej PDMS blisko płytki, aby zredukować pęcherzyki powietrza. Jeśli po nalaniu PDMS zostaną znalezione jakiekolwiek pęcherzyki powietrza, przenieś je na zewnętrzną stronę za pomocą czystej pęsety lub igieł.
7. Wiruj PDMS na dolnej warstwie formy z prędkością 1000 obr./min przez 60 s, a następnie utwardzaj termicznie w temperaturze 80 °C przez 10 minut (1.^etap utwardzania, rysunek 1G). Sprawdź lepkość PDMS ręcznie lub pęsetą po 10 minutach i w razie potrzeby dostosuj czas nagrzewania.
8. Umieść górną warstwę PDMS na dolnej warstwie PDMS na formie i mocno dociśnij od góry, aby zapewnić mocowanie powierzchni górnej i dolnej warstwy (Rysunek 1H).
9. Całkowicie utwardzić termicznie PDMS w temperaturze 80 °C przez co najmniej 1 godzinę (2.^etap utwardzania). Drugi^etap utwardzania umożliwia końcowe utwardzenie PDMS, w którym górna i dolna warstwa są nieodwracalnie połączone ze sobą (rysunek 1H).
10. Delikatnie pokrój dolną warstwę PDMS na kawałki. Ostrożnie oderwij cały chip PDMS od formy (Rysunek 1H).
    UWAGA: Jeśli wióry PDMS są trudne do oderwania od formy, rozważ dalszą obróbkę powierzchni formy dolnej warstwy, taką jak silanizacja i chemiczne powlekanie powierzchni, aby ułatwić procedurę obierania. Jeśli górna i dolna warstwa odklejają się podczas odklejania, rozważ skrócenie czasu na 1^etap utwardzania.
11. Przebij otwory (średnica = 0,5 mm) na wloty i wyloty płynu na obu końcach kanałów płynu (rysunek 1H). Ostrożnie oczyść dolną powierzchnię wióra, spłukując go alkoholem izopropylowym, susząc sprężonym powietrzem i przyklejając taśmę klejącą.
12. Połącz chip ze szkłem nakrywkowym o grubości 0,175 mm po aktywacji powierzchni przez utlenianie plazmowe (25 s, rysunek 1H).
13. Po umieszczeniu chipa na szklanym podłożu należy przepłukać górną warstwę sprężonym powietrzem, aby upewnić się, że dolna warstwa membrany PDMS jest prawidłowo przymocowana do szkła.
14. Podgrzewaj klejony wiór w temperaturze 80 °C przez 10 s do 1 minuty, aby zwiększyć stabilność wiązania.
    UWAGA: Na wspomniany wcześniej etap utwardzania PDMS i wymagany czas utwardzania mogą mieć wpływ różne parametry, takie jak grubość formy, wyposażenie i warunki otoczenia. Dlatego należy odpowiednio dostosować czas utwardzania w przypadku, gdy sugerowany protokół nie pasuje do zastosowania.

3. Konfiguracja eksperymentalna

UWAGA: Jako standardową konfigurację eksperymentalną stosuje się mikroskop odwrócony wyposażony w kamerę z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (CMOS), kamerę do mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) (dziedzina częstotliwości) oraz inkubator temperatury. Do kamery FLIM podłączone jest modulowane źródło lasera wzbudzenia (445 nm, 100 mW). Do kontroli gazów służą trzy regulatory przepływu masowego (azotu, tlenu i dwutlenku węgla). Pompy strzykawkowe są używane do średniej perfuzji.

1. Przygotuj rurki do perfuzji gazu (wlot) i płynu (wlot i wylot). Włączyć inkubator, aby osiągnąć żądaną temperaturę przed eksperymentem (tutaj 37 °C).
2. Wybierz żądaną soczewkę obiektywu (tutaj 20x do wykrywania tlenu i 100x do obserwacji mikrobiologicznej) i w razie potrzeby dodaj olejek immersyjny. Zamocuj dwuwarstwowy chip na uchwycie na wióry za pomocą klejów.

4. Wbudowana kontrola i wykrywanie tlenu

1. Przygotować wrażliwy na tlen roztwór barwnika o odpowiednim stężeniu (tutaj 3 mM tris(2,2'-bipirydylo)dichlororuten(II)sześciowodny, RTDP).
2. Skalibruj kamerę FLIM za pomocą szkiełka referencyjnego o znanym czasie życia (tutaj 3.75 ns). Zmierz intensywność sygnału za pomocą kamery FLIM i dostosuj czas ekspozycji lub przysłonę mikroskopu, aby uzyskać intensywność sygnału 0,68 - 0,72 dla lepszej kalibracji.
3. Zamocuj uchwyt na wióry na stoliku mikroskopu. Podłącz odpowiednie rurki do wlotu i wylotu płynu. Rozpocznij perfuzję wrażliwego na tlen roztworu barwnika ze stałym natężeniem przepływu za pomocą pompy strzykawkowej (tutaj 100 nL/min).
4. Podłączyć wlot gazu i regulatory przepływu masowego za pomocą odpowiednich przewodów. Rozpocznij płukanie gazem o kontrolowanym stężeniu tlenu (tutaj 0% lub 21% tlenu, całkowite masowe natężenie przepływu 600 ml/min).
5. Zmierz czas życia fazy przy braku tlenu (τ₀) i przy innym znanym stężeniu tlenu (tutaj przy 21%). Obliczyć stałą hartowania (K_q) za pomocą równania Sterna-Volmera w następujący sposób, które opisuje wygaszanie fluorescencji w obecności tlenu. Alternatywnie można zastosować intensywność fluorescencji (I); Jednak na pomiar oparty na intensywności mogą mieć wpływ zmiany intensywności źródła światła, wybielanie zdjęć i tak dalej.
   
   UWAGA: Zaleca się odczekanie kilku minut po rozpoczęciu płukania gazem, aby zapewnić dokładną kalibrację, szczególnie w przypadku ukierunkowania na poziom wyczerpania tlenu tak niski, jak 0%. Aby zwiększyć precyzję, rozważ uzupełnienie procesu o dodatkowe metody zubożania tlenu, takie jak użycie pochłaniaczy tlenu lub dodatkowej szczelnej komory.
6. Zmierz czas życia fazy i oblicz odpowiednie stężenie tlenu za pomocą równania Sterna-Volmera. Aby stworzyć oscylacyjne warunki tlenowe, użyj dowolnego systemu sterowania przyrządem, aby zautomatyzować regulację natężenia przepływu azotu i tlenu.

5. Przygotowanie kultur bakteryjnych

1. . Rozpocznij hodowlę wstępną od zaszczepienia pożądanego organizmu (tutaj E. coli MG1655, pojedynczy gotowy do użycia koralik z fiolki kriogenicznej w kolbie) w żądanym podłożu (w tym przypadku pożywka LB zawierająca 10 g/l peptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl) i inkubować przez noc (tutaj, 37 °C przy 150 obr./min).
2. Zmierz wynikową gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nm (OD₆₀₀).
3. Zainicjuj następną kulturę w pożywce LB poprzez zaszczepienie prekultury (tutaj początkowy OD₆₀₀ = 0,3 lub 0,0001). Inkubuj kulturę, aż osiągnie fazę wzrostu wykładniczego.
   UWAGA: Jeśli pożywka do hodowli na chipie różni się od pierwszej pożywki preculture, pożądane jest przeprowadzenie drugiej pożywki wstępnej z pożywką do hodowli na chipie, aby umożliwić organizmom zapoznanie się z nową pożywką¹⁶.
4. Przygotuj roztwór do wysiewu, rozcieńczając kulturę do odpowiedniej gęstości optycznej. Przenieś roztwór do wysiewu do strzykawki o pojemności 1 ml w celu wykonania następnego kroku. W przypadku E. coli gęstość optyczna (OD₆₀₀) roztworu wysiewającego wynosiła około 0,5.

6. Hodowla drobnoustrojów na chipie i obrazowanie poklatkowe w kontrolowanych warunkach tlenu

1. Zamocuj uchwyt na wióry na stoliku mikroskopu. Pozwól uchwytowi chipa i chipowi PDMS rozgrzać się w inkubatorze (tutaj 37 °C) przez kilka godzin, ponieważ zmniejszy to ryzyko rozmycia podczas obrazowania poklatkowego z powodu przemieszczenia związanego z temperaturą.
2. Przed rozpoczęciem uprawy należy rozpocząć gazowanie z pożądanym początkowym stężeniem tlenu, dostosowując objętościowy procent masowego przepływu tlenu i azotu, utrzymując całkowite natężenie przepływu i stałe natężenie przepływu dwutlenku węgla.
3. Podłącz wlot gazu do chipa i kontrolery przepływu masowego.
4. Zasiewać organizm w chipie, łącząc strzykawkę z roztworem wysiewającym do wylotu płynu i ręcznie popychając strzykawkę. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki zostały skutecznie uwięzione w komorach hodowlanych.
5. Po inokulacji komórek wyjąć strzykawkę i podłączyć kolejną strzykawkę ze świeżą pożywką do wlotu płynu. Ręcznie popchnąć strzykawkę, aby przepłukać wszelkie pozostałe komórki w kanale doprowadzającym pożywkę.
6. Rozpocząć perfuzję pożywki ze stałym natężeniem przepływu (tutaj 100 nL/min) za pomocą pompy strzykawkowej. Upewnij się, że natężenie przepływu jest wystarczające, ponieważ niewystarczające natężenie może doprowadzić do wyschnięcia komory. Wystarczające natężenie przepływu może się różnić w zależności od kilku czynników, w tym geometrii kanału płynu i natężenia przepływu gazu w kanale górnej warstwy.
7. Rozpocznij akwizycję obrazu poklatkowego. W przypadku uprawy w warunkach oscylacji tlenu należy uruchomić automatyczne sterowanie regulatorami przepływu masy w tym samym czasie, gdy rozpoczyna się akwizycja obrazu. W przypadku wystąpienia jakiegokolwiek opóźnienia w rozpoczęciu kontroli gazu i akwizycji obrazu, należy uwzględnić opóźnienie w późniejszej analizie danych obrazu.

7. Analiza danych obrazowych

1. Zapisz obraz poklatkowy jako jeden stos obrazów na pozycję.
2. Wstępnie przetwórz obraz, aby obrócić, wyrównać i przyciąć uprawianą kolonię za pomocą programów do analizy obrazu. Przykłady wstępnie przetworzonych plików . Obrazy TIF są dostępne tutaj:^{https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747 15}
3. Podziel komórki na segmenty i wyodrębnij odpowiednie wartości, takie jak numer komórki, długość, obszar, intensywność fluorescencji i tak dalej. Dokładniej analizuj zachowania związane ze wzrostem. Przykładowe skrypty w języku Python są dostępne tutaj: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Wyniki

Produkcja dwuwarstwowych chipów PDMS
Wyprodukowany dwuwarstwowy układ scalony jest pokazany na rysunku 2A, z kolorowymi kanałami gazowymi (czerwonymi) i kanałami płynów (niebieskimi) do wizualizacji. Chip ma trzy identyczne kanały płynu i nakładające się kanały gazowe, aby umożliwić równoległe eksperymenty. Kanał płynowy ma obszar uprawy z szeregiem komór uprawowych (rysunek 2A(i)). Komórki są uwięzione w komorach hodowlanych i pozwalają im rosnąć w formacie jednowarstwowym, co umożliwia obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości z dużą szybkością akwizycji obrazu. Przekrój poprzeczny chipa ilustruje górną warstwę o grubości 3 mm i dolną warstwę o grubości 65 μm, umożliwiając szybką dyfuzję gazu z kanału gazowego do kanału płynu przez pośrednią membranę PDMS (rysunek 2A (ii-ii')).

Wbudowana kontrola tlenu
Zdolność opracowanego chipa do wymiany gazowej została przetestowana przy użyciu FLIM i wrażliwego na tlen barwnika¹⁵. Jak pokazano na rysunku 2B, stężenie tlenu w kanale płynu wykazywało odpowiedni spadek lub wzrost w ciągu kilkudziesięciu sekund, gdy stężenie tlenu zmieniało się między 21% a 0%. Wyniki pomiarów tlenu pokazują, że szybkie oscylacje tlenu w ciągu kilkudziesięciu sekund można odtworzyć w opracowanym dwuwarstwowym chipie mikroprzepływowym.

Hodowla mikroorganizmów w stałych warunkach tlenowych
Chip został po raz pierwszy wykorzystany do scharakteryzowania fakultatywnego wzrostu beztlenowców E. coli w stałych warunkach gazowych przy różnych stężeniach tlenu. Dwutlenek węgla był zawsze dodawany do gazu zasilającego, ponieważ zaobserwowaliśmy ograniczony wzrost E. coli pod wpływem wyczerpania dwutlenku węgla we wstępnych eksperymentach (dane nie pokazane). Ryciny 3A i 3B przedstawiają reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym E. coli odpowiednio w warunkach tlenowych (21% dopływu tlenu) i beztlenowych (0% dopływu tlenu). Po 3 godzinach uprawy E. coli uprawiane w warunkach tlenowych dały większe kolonie w porównaniu z warunkami beztlenowymi. Analiza ilościowa pokazuje również różne tempo wzrostu wielkości kolonii (kolonii A) w zależności od dostępności tlenu, jak pokazano na krzywych wzrostu na rysunku 3C. Należy pamiętać, że kolonia jest znormalizowana przez początkową powierzchnię, aby umożliwić porównanie różnych kolonii i warunków. Wykładniczą szybkość wzrostu μ można wyznaczyć na podstawie krzywej wzrostu w następujący sposób i podsumować na rysunku 3D.

Wyniki potwierdzają zdolność urządzenia do kontrolowania tlenu w docelowych stężeniach i skutecznej analizy odpowiedniego wzrostu drobnoustrojów na podstawie uzyskanych zdjęć poklatkowych.

Hodowla drobnoustrojów w warunkach oscylacji tlenu
Wreszcie, E. coli hodowano w warunkach oscylacji tlenu, przełączając się między tlenowymi i beztlenowymi fazami gazowania z interwałem przełączania T'. Zbadano różne T' w zakresie od 60 minut do 1 minuty, aby przetestować zdolność do czasowo-rozdzielczej analizy wzrostu w korelacji z oscylującymi warunkami tlenu. Rysunek 4 przedstawia ilościowy wzrost E. coli w warunkach oscylacji tlenu przy T' = 60, 30, 10, 5, 2 i 1 min. Oprócz krzywej wzrostu opartej na _kolonii A, chwilowe tempo wzrostu μ_Δt jest również określane w celu uzyskania wglądu z rozdzielczością czasową w następujący sposób.

Tempo wzrostu w stałych warunkach tlenowych i beztlenowych jest również pokazane liniami przerywanymi (μ_21%, μ_0%) na rysunku 4 jako odniesienia wzrostu. Wzrost E. coli wykazywał wyraźną dynamikę w odpowiedzi na oscylujące warunki gazowe. Na przykład po przejściu fazy gazowania z warunków tlenowych na beztlenowe (T' = 60 min), wzrost wykazywał (i) fazę odpowiedzi: nagły spadek tempa wzrostu, po której następowała (ii) faza odzyskiwania: stopniowy wzrost tempa wzrostu oraz (iii) faza stabilizacji: stabilizacja wzrostu około μ_0%. Dynamika wzrostu E. coli została tymczasowo pomyślnie rozwiązana w różnych T' już po 1 minucie, gdzie E. coli wykazywała monotonne tempo wzrostu w górę i w dół z powodu ograniczonego czasu na przystosowanie wzrostu do zmieniających się warunków gazowych. Co więcej, zachowanie wzrostu może być analizowane nie tylko na poziomie kolonii, ale także na poziomie pojedynczej komórki. Rysunek 5 ilustruje rozwój obszaru pojedynczej komórki pod wpływem oscylacji tlenu w różnych odstępach przełączania T'. Wzrost pojedynczych komórek można wywnioskować, śledząc sąsiednie wykresy, bez śledzenia analizy. Zachowanie wzrostu na poziomie pojedynczej komórki przypomina to, co zaobserwowano na poziomie kolonii na rysunku 4; szybszy przyrost powierzchni podczas fazy gazowania tlenowego i wyraźna zmiana prędkości wzrostu w momencie przełączania gazu. Uzyskane wyniki wskazują na zdolność do hodowli mikroorganizmów w oscylujących warunkach gazowych oraz do analizowania wzrostu drobnoustrojów w korelacji z dostępnością tlenu w sposób rozdzielczy w czasie.

Rysunek 1: Procedura wytwarzania dwuwarstwowych wiórów. Procedura rozpoczyna się od (A, C) projektowania form, (B, D) produkcji formy, (E-G) formowania PDMS i (H) montażu chipów. Liczba ta została zmodyfikowana z¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wyprodukowany dwuwarstwowy chip i jego zdolność do kontroli tlenu. (A) Przedstawiono reprezentatywny obraz wyprodukowanego chipa, z kolorowymi kanałami gazu (czerwony) i kanałami płynu (niebieskimi) do wizualizacji. Obraz SEM jest pokazany w (i), przedstawiając szereg komór uprawowych połączonych kanałami płynów po obu stronach (podziałka 100 μm). Przekrój poprzeczny wióra pokazano w (ii-ii'), przedstawiając górną warstwę o grubości 3 mm i dolną warstwę o grubości 65 μm. (B) Zmierzone stężenie tlenu w kanale płynu po przełączeniu między warunkami tlenowymi (21% tlenu) i beztlenowymi (0% tlenu). Liczba ta została zmodyfikowana z¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Hodowla E. coli w stałych warunkach tlenowych. (A) Komórki są hodowane tlenowo (21% dopływ tlenu) przez 3 godziny, a obrazy poklatkowe są pozyskiwane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. (B) Komórki są hodowane beztlenowo (0% dopływu tlenu), a obrazy poklatkowe są pozyskiwane przez 3 godziny. (C) Wzrost komórek w różnych stałych warunkach tlenu jest wykreślany na podstawie kolonii A. (D) Wykładnicza stopa wzrostu jest obliczana i sumowana. Wszystkie podziałki = 5 μm. Dane są wyrażone jako średnia ± S.D. n = 35 kolonii (0%), 27 (0,1%), 21 (0,5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). Liczba ta została zmodyfikowana z¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Hodowla E. coli w warunkach oscylacji tlenu. Badany jest wzrost komórek w różnych oscylujących warunkach tlenowych (T', interwał przełączania między warunkami tlenowymi i beztlenowymi). Wzrost komórek na podstawie kolonii A jest wykreślany w czasie (na górze), a _{μ Δt} jest wykreślany w czasie, aby umożliwić interpretację danych z rozdzielczością czasową (na dole). Dane są wyrażone jako średnia ± S.D. n = 5 kolonii (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min). Liczba ta została zmodyfikowana z¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Obszar pojedynczej komórki (pojedyncza komórka ) E. coli hodowanej w warunkach oscylacji tlenu. Dane pochodzą z reprezentatywnej kolonii z każdego interwału przełączania T'. Liczba ta została zmodyfikowana z¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opracowano protokół wytwarzania i obsługi dwuwarstwowego systemu mikroprzepływowego w celu obserwacji wzrostu drobnoustrojów w szybko oscylujących warunkach tlenowych z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. W połączeniu z obrazowaniem poklatkowym platforma ta umożliwia hodowlę na chipie i monitorowanie mikroorganizmów w czasie rzeczywistym w kontrolowanych warunkach tlenu, umożliwiając analizę wzrostu drobnoustrojów w korelacji z dostępnością tlenu.

W tym protokole górna i dolna warstwa są przygotowywane osobno, a następnie montowane w jeden chip. Ta modułowa koncepcja pozwala na różne projekty chipów po prostu zastępując konfiguracje dwuwarstwowe. Dla form górnej i dolnej warstwy zastosowano różne metody wytwarzania - druk 3D SLA dla górnej i fotolitografia dla dolnej - w oparciu o ich odpowiednie wymagania dotyczące rozmiaru i dokładności. Takie podejście poprawia ogólną wydajność procesu produkcyjnego. Montaż dwóch warstw odbywa się poprzez dwuetapowy proces utwardzania PDMS. Konieczne jest zoptymalizowanie czasu nagrzewania dla pierwszego etapu utwardzania zgodnie z projektem, ponieważ grubość formy i lokalne warunki ogrzewania mogą mieć wpływ na wyniki utwardzania PDMS.

Wykorzystujemy naturę PDMS, który jest wysoce przepuszczalny dla powietrza, aby osiągnąć szybką zmianę tlenu. Z drugiej strony, na precyzję kontroli tlenu może mieć również wpływ bierna dyfuzja tlenu przez PDMS, szczególnie przy niższych poziomach tlenu. Aby zrekompensować to ograniczenie, do protokołu można dodać dalsze ulepszenia. Na przykład metoda kalibracji czujnika tlenu ma możliwości poprawy. W zademonstrowanym protokole czujnik jest kalibrowany w dwóch punktach odniesienia, 0% i 21% poziomie tlenu, przy użyciu dwuwarstwowego chipa PDMS. W związku z tym precyzja wykrywania tlenu zależy od zdolności do tworzenia dokładnych warunków do kalibracji z niedoborem tlenu. Jak wspomniano w protokole, zaleca się odczekanie kilku minut po rozpoczęciu płukania gazem, aby zapewnić dokładną kalibrację, szczególnie w przypadku użycia, gdy poziom wyczerpania tlenu wynosi zaledwie 0%. Niemniej jednak zadanie to jest trudne ze względu na potencjalne nieszczelności lub zatrzymywanie powietrza w przepuszczającym powietrze chipie PDMS. Dokładność kalibracji można dodatkowo poprawić, stosując chemikalia pochłaniające tlen lub zamykając chip w szczelnie zamkniętej, zubożonej w gaz komorze ^17,18. Suplementy te mogą pozwolić na bardziej solidną i precyzyjną analizę zachowania drobnoustrojów w warunkach ściśle beztlenowych i niskotlenowych.

Zademonstrowane urządzenie może być interesujące dla różnych dziedzin badawczych. Na przykład byłby przydatny do odtworzenia warunków tlenowych w bioreaktorach przemysłowych, w których zakłada się, że dostępność tlenu jest czasowo niejednorodna 7,8,19,20. Zastosowanie dwuwarstwowego chipa pozwala naukowcom scharakteryzować i zrozumieć zachowanie mikroorganizmów w szybko zmieniającym się środowisku tlenowym, co nie było możliwe w konwencjonalnych konfiguracjach uprawy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Clewin 5	WieWeb software, Holandia	N/A	Edytor układu
Kamera CMOS	Nikon, Japonia	DS-Qi2 powiedział:
szkło nakrywkowe	Schott AG, Niemcy	D263 Życiorys	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Odkurzacz plazmowy Femto	Diener Electronics, Niemcy	-	Klejenie plazmą wiórową
Formularz 3B	Formlabs, Stany Zjednoczone	-	Drukarka 3D
Odniesienie do okresu istnienia	Starna Scientific, Wielka Brytania	UMM-SFG
Regulator przepływu masowego	Vö gtlin Instruments GmbH, Szwajcaria	GSC-A9SA-BB22	azot, tlen
Regulator przepływu masowego	Vö gtlin Instruments GmbH, Szwajcaria	GSC-A9SA-BB21	dwutlenek węgla
Żywica model v3	Formlabs, Stany Zjednoczone	RS-F2-DMBE-03	Żywica do druku 3D
Zawartość NaCl	Carl Roth, Niemcy	3957.1	LB średni składnik
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Japonia	-	Mikroskop odwrócony
Aparat fotograficzny pco.flim	PCO AG, Niemcy	-
Laser pco.flim	Omicron-Laserprodukte GmbH, Niemcy	-
Pepton	Carl Roth, Niemcy	8986.1	LB średni składnik
Plan Apo λ	Nikon, Japonia	-	100x olej, 20x
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Dow Chemical Company, Stany Zjednoczone	Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych
Narzędzie do wykrawania, Φ 0,50 mm	World Precision Instruments, Stany Zjednoczone	504528
Narzędzie do wykrawania, Φ 0,75 mm	World Precision Instruments, Stany Zjednoczone	504529
Fiolka kriogeniczna ROTI Store	Carl Roth, Niemcy	-
Solidworks 2016 x64 Edition	Dassault Systems, Francja	N/A	3D
Powlekarka wirowa do podłoża	APT Automation, Niemcy	SPIN150i	Powlekanie wirujące PDMS
Pompa strzykawkowa	CETONI, Niemcy	neMESYS
Inkubator temperatury	Okolab, Włochy	-	Sprzęt do mikroskopów
tris(2,2'-bipirydylo)dichlororuten(II)heksahydrat, (RTDP)	Acros Organics, Belgia	208750010
Rury	Saint-Gobain, Francja	Tygon F-4040-A	Przewody doprowadzające gaz
Rury	Saint-Gobain, Francja	Tygon AAD04103	Przewody do płynów
Ekstrakt drożdżowy	Carl Roth, Niemcy	2363.3	LB średni składnik