Artykuł metodologiczny

Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

878 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68697

⸱

18 lipca 2025

 , 
1IBG-1: Biotechnology, Institute of Bio- and Geosciences, Forschungszentrum Jülich GmbH, 2Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego i analizy wzrostu drobnoustrojów pod wpływem gwałtownych oscylacji tlenu. Wydajność urządzenia została potwierdzona za pomocą wykrywania tlenu w kanałach płynów i hodowli mikroorganizmów.

Streszczenie

Analiza pojedynczych komórek mikrobiologicznych przy użyciu mikrofluidyki w połączeniu z mikroskopią poklatkową daje nadzieję na zbadanie zachowania wzrostu drobnoustrojów w ograniczonych środowiskach z rozdzielczością czasoprzestrzenną, oferując wgląd, którego nie można uzyskać za pomocą konwencjonalnych platform hodowlanych i analitycznych. Tlen odgrywa kluczową rolę w określaniu wzrostu drobnoustrojów. Jednak kontrola czasowa w zakresie sekund nie została zaimplementowana w analizie mikrobiologicznej z wykorzystaniem mikrofluidyki. Niedawno opracowaliśmy dwuwarstwowy chip mikroprzepływowy PDMS, umożliwiający czasową kontrolę tlenu w zakresie kilkudziesięciu sekund. Chip składa się z górnej warstwy do gazowania i dolnej warstwy do uprawy i perfuzji płynów. Obie warstwy są oddzielone cienką pośrednią membraną PDMS, co umożliwia szybką wymianę gazową między dwiema warstwami. W tym artykule metodologicznym wyjaśniamy procedurę wytwarzania, charakterystyki i hodowli mikrobiologicznej przy użyciu chipa. Jako reprezentatywne wyniki demonstrujemy zdolność do szybkiej przełączania tlenu w ciągu kilkudziesięciu sekund, hodowlę mikrobiologiczną i analizę wzrostu z rozdzielczością czasową w stałych i oscylujących warunkach tlenowych. Protokół ten ma na celu pomóc naukowcom zainteresowanym wdrożeniem czasowej kontroli tlenu w ich konfiguracji mikroprzepływowej.

Wprowadzenie

Tlen jest ściśle związany ze wzrostem i fizjologią drobnoustrojów wśród różnych czynników środowiskowych, szczególnie wpływając na procesy komórkowe, takie jak reakcja na stres oksydacyjny, homeostaza żelaza i infekcje chorobotwórcze 1,2,3. Tradycyjnie hodowla mikrobiologiczna była prowadzona w warunkach otoczenia lub przy minimalnej kontroli przy określonych poziomach tlenu. Z drugiej strony, w realistycznych scenariuszach środowisko tlenu często nie jest w wielu przypadkach stałe, ale raczej zmienia się w czasie. Na przykład mikroorganizmy mogą być narażone na zmieniające się poziomy tlenu w ciągu kilku sekund do minut w systemach wodnych, gdy poruszają się w środowisku z powodu ruchu płynów i ruchliwości drobnoustrojów 4,5,6. Podobnie, bioreaktory przemysłowe również tworzą niejednorodne środowisko tlenowe z powodu nieodpowiedniego mieszania, co wpływa na rozwój drobnoustrojów i ostateczną wydajność 7,8. Badanie reakcji mikrobiologicznych na takie dynamiczne warunki ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesów ekologicznych i poprawy zastosowań biotechnologicznych.

Fakultatywne beztlenowce, takie jak Escherichia coli (E. coli), mogą przełączać się między szlakami tlenowymi i beztlenowymi w zależności od dostępności tlenu 9,10. Chociaż poprzednie badania badały tę metaboliczną zdolność adaptacyjną, większość badań koncentruje się na pojedynczych zmianach tlenu przy użyciu konwencjonalnych systemów uprawy, które nie są w stanie odtworzyć szybkich zmian, z którymi często borykają się drobnoustroje 9,11,12,13,14. W rezultacie wiedza na temat tego, w jaki sposób drobnoustroje reagują fizjologicznie na często zmieniający się poziom tlenu, jest ograniczona.

Jak wspomniano, tradycyjnym konfiguracjom laboratoryjnym brakuje precyzji i szybkości potrzebnej do naśladowania gwałtownych wahań tlenu i nie obsługują ciągłego monitorowania w wysokiej rozdzielczości. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy niedawno specjalistyczną platformę mikroprzepływową z dwuwarstwowym chipem z polidimetylosiloksanu (PDMS), umożliwiającą szybką kontrolę tlenu i obrazowanie pojedynczych komórek15. W tym miejscu udostępniamy protokoły wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego, który wytwarza szybkie oscylacje tlenu i umożliwia analizę wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów w kontrolowanych warunkach tlenowych. Chip składa się z dwóch warstw – górnej warstwy do perfuzji gazowej i dolnej warstwy do płynnej perfuzji i hodowli mikrobiologicznej. Pośrednia cienka membrana pomiędzy dwiema warstwami pozwala na szybką wymianę gazową. W ramach demonstracji w opracowanym chipie wyhodowano E. coli MG1655. Przeanalizowano wzrost w stałych i oscylacyjnych warunkach tlenowych.

Protokół

1. Przygotowanie formy

  1. Przygotuj formę dla warstwy górnej za pomocą druku 3D. Wykonaj formę warstwy górnej z gładką powierzchnią, aby zapewnić gładką powierzchnię otrzymanej górnej warstwy PDMS. Zalecamy zastosowanie druku 3D metodą stereolitografii (SLA).
    1. Zaprojektuj formę w oprogramowaniu 3D CAD (Rysunek 1A). Upewnij się, że projekt zawiera kanały gazowe, które nakładają się na dolne kanały płynowe. Przeprowadź ten proces projektowania równolegle z projektowaniem warstwy dolnej (krok 1.2.1).
    2. Wydrukuj formę za pomocą druku 3D SLA. Usuń pozostałą żywicę z wydrukowanej formy i przemyj ją w kąpieli z alkoholu izopropylowego (IPA) przez 30 minut (Rysunek 1B).
    3. Przeprowadź dotwardzanie, naświetlając formę światłem o długości fali 405 nm przez odpowiedni czas i w temperaturze zależnej od rodzaju żywicy i geometrii.
    4. Namocz formę w IPA w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 min, aby usunąć nieutwardzoną żywicę pozostałą w formie, która w przeciwnym razie mogłaby hamować utwardzanie PDMS.
  2. Przygotuj formę z wafla krzemowego dla warstwy dolnej.
    1. Zaprojektuj chip mikrofluidyczny w edytorze układów CAD (Rysunek 1C). Upewnij się, że projekt zawiera wloty, kanały płynowe i wyloty.
    2. Utwórz formę z wafla krzemowego, stosując dwuwarstwową fotolitografię, zgodnie z opisem w poprzedniej pracy (Rysunek 1D)16.
      UWAGA: Kanały w warstwie dolnej mają rozmiary rzędu µm i wymagają precyzyjnego wykonania, natomiast kanały w warstwie górnej mają rozmiary rzędu mm. Ponieważ druk 3D SLA oferuje krótszy czas wykonania, a tym samym szybsze prototypowanie, do wytwarzania stosunkowo dużych struktur formy warstwy górnej zastosowano druk SLA. Warstwę dolną wykonano metodą fotolitografii, aby zapewnić precyzyjne wykonanie. W przypadku, gdy kanały w warstwie górnej również znajdują się w zakresie µm i wymagają precyzji, należy rozważyć wykonanie formy również za pomocą fotolitografii.

2. Wytwarzanie dwuwarstwowego chipu mikroprzepływowego z PDMS

  1. Przygotować roztwór PDMS przed utwardzaniem, dokładnie mieszając bazę i utwardzacz w stosunku 10:1. Odpowietrzyć mieszaninę w desykatorze przez 1 h.
  2. Oczyścić górną warstwę formy za pomocą izopropanolu (IPA) i osuszyć sprężonym powietrzem.
  3. Wlej PDMS do formy warstwy górnej, a następnie przeprowadź utwardzanie termiczne w temperaturze 80 °C przez 20 min (1st etap utwardzania, Rysunek 1E). 1st etap utwardzania umożliwia odklejanie, wycinanie i dziurkowanie PDMS przed jego pełnym utwardzeniem.
  4. Sprawdź lepkość PDMS dłonią lub pęsetą po 20 minutach grzania. Jeśli PDMS jest nadal lepki, dostosuj czas grzania.
  5. Odzielić PDMS z formy górnej warstwy i pociąć go na pojedyncze kawałki (w tym przypadku 20 mm x 18 mm). Wyciąć otwory (średnica = 0,75 mm) dla wlotów gazu (Rycina 1F). Oczyść dolną powierzchnię górnej warstwy, płucząc ją izopropanolem (IPA), susząc sprężonym powietrzem i naklejając taśmę klejącą.
  6. Oczyść formę dolnej warstwy przy użyciu IPA i osusz ją sprężonym powietrzem. Zamocuj formę dolnej warstwy na powlekarce wirówkowej i wlej PDMS do centrum formy. Wlewaj PDMS blisko powierzchni wafla, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza. Jeśli po wlaniu PDMS pojawią się pęcherzyki powietrza, przesuń je na zewnątrz za pomocą czystych pincet lub igieł.
  7. Nanieś PDMS na formę warstwy dolnej metodą spin coatingu przy 1000 obr./min przez 60 s, a następnie poddaj utwardzaniu termicznemu w 80 °C przez 10 min (1st etap utwardzania, Rycina 1G). Po 10 minutach sprawdzić lepkość PDMS ręcznie lub za pomocą pęsety i w razie potrzeby dostosować czas nagrzewania.
  8. Umieść elementy górnej warstwy PDMS na dolnej warstwie PDMS znajdującej się na formie i mocno dociśnij od góry, aby zapewnić przyleganie powierzchni górnej i dolnej warstwy (Rysunek 1H).
  9. Poddaj PDMS całkowitemu utwardzaniu termicznemu w temperaturze 80 °C przez co najmniej 1 h (2nd etap utwardzania). 2nd etap utwardzania umożliwia końcowe utwardzenie PDMS, w wyniku czego warstwa górna i dolna zostają nieodwracalnie ze sobą związane (Rysunek 1H).
  10. Ostrożnie potnij dolną warstwę PDMS na kawałki. Delikatnie oddziel cały chip z PDMS od formy (Rycina 1H).
    UWAGA: Jeśli chipy PDMS trudno jest oddzielić od formy, należy rozważyć dalszą obróbkę powierzchniową formy warstwy dolnej, np. silanizację i chemiczną powłokę powierzchniową, aby ułatwić procedurę oddzielania. Jeśli warstwy górna i dolna rozdzielają się podczas oddzielania, należy rozważyć skrócenie czasu dla 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. etap utwardzania.
  11. Wykonać otwory (średnica = 0,5 mm) dla wlotów i wylotów cieczy na obu końcach kanałów płynowych (Rysunek 1H). Należy starannie oczyścić dolną powierzchnię chipa, płucząc go izopropanolem (IPA), susząc sprężonym powietrzem i przykładając taśmę klejącą.
  12. Przymocuj chip do szkła przykrywkowego o grubości 0,175 mm po aktywacji powierzchni za pomocą utleniania plazmowego (25 s, Rysunek 1H).
  13. Po umieszczeniu chipa na szklanym podłożu, przedmuchaj górną warstwę sprężonym powietrzem, aby upewnić się, że dolna warstwa membrany PDMS jest prawidłowo przytwierdzona do szkła.
  14. Podgrzać złączony chip w temperaturze 80 °C przez 10 s do 1 min w celu zwiększenia stabilności wiązania.
    UWAGA: Wspomniany etap utwardzania PDMS oraz wymagany czas utwardzania mogą zależeć od różnych parametrów, takich jak grubość formy, zastosowany sprzęt i warunki otoczenia. Należy zatem odpowiednio dostosować czas utwardzania w przypadku, gdy sugerowany protokół nie jest odpowiedni dla danej aplikacji.

3. Układ eksperymentalny

UWAGA: Jako standardowy układ doświadczalny wykorzystuje się mikroskop odwrócony wyposażony w kamerę CMOS (complementary metal oxide semiconductor), kamerę do obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) w domenie częstotliwości oraz inkubator temperaturowy. Do kamery FLIM podłączone jest modulowane laserowe źródło wzbudzenia (445 nm, 100 mW). Do kontroli gazów wykorzystuje się trzy kontrolery przepływu masowego (azotu, tlenu i dwutlenku węgla). Do perfuzji pożywki stosuje się pompy strzykawkowe.

  1. Przygotować przewody do perfuzji gazu (wlot) oraz cieczy (wlot i wylot). Włączyć inkubator, aby osiągnął pożądaną temperaturę przed rozpoczęciem eksperymentu (w tym przypadku 37 °C).
  2. Wybrać odpowiedni obiektyw (tutaj 20x do pomiaru poziomu tlenu i 100x do obserwacji drobnoustrojów) i w razie potrzeby dodać olej immersyjny. Przymocować dwuwarstwowy chip do uchwytu na chipy za pomocą kleju.

4. Kontrola i pomiar poziomu tlenu na chipie

  1. Przygotować roztwór barwnika wrażliwego na tlen o odpowiednim stężeniu (w tym przypadku 3 mM tris(2,2'-bipirydylo)dichlororuten(II)heksahydratu, RTDP).
  2. Zkalibrować kamerę FLIM, używając preparatu referencyjnego o znanym czasie życia (tutaj 3,75 ns). Zmierzyć natężenie sygnału kamerą FLIM i dostosować czas ekspozycji lub aperturę mikroskopu, aby uzyskać natężenie sygnału w zakresie 0,68 - 0,72 dla lepszej kalibracji.
  3. Zamocować uchwyt chipa na stole mikroskopu. Podłączyć odpowiednie przewody do wlotu i wylotu cieczy. Rozpocząć perfuzję roztworu barwnika wrażliwego na tlen ze stałym przepływem, korzystając z pompy strzykawkowej (tutaj 100 nL/min).
  4. Połączyć wlot gazu i kontrolery przepływu masowego odpowiednimi przewodami. Rozpocząć przepłukiwanie gazem o kontrolowanym stężeniu tlenu (tutaj 0% lub 21% tlenu, całkowity przepływ masowy 600 mL/min).
  5. Zmierzyć czas życia fazowego w obecności tlenu (τ0) oraz przy innym znanym stężeniu tlenu (tutaj 21%). Obliczyć stałą gaszenia (Kq), korzystając z równania Sterna-Volmera w następujący sposób, co opisuje gaszenie fluorescencji w obecności tlenu. Alternatywnie można zastosować natężenie fluorescencji (I); jednak pomiary oparte na natężeniu mogą być podatne na zmienność natężenia źródła światła, fotobleakowanie i inne czynniki.
    Wzór na stężenie tlenu; równanie gaszenia; analiza symboli dla badań naukowych.
    UWAGA: Zaleca się odczekać kilka minut po rozpoczęciu przepłukiwania gazem, aby zapewnić dokładną kalibrację, szczególnie w przypadku dążenia do poziomów usuwania tlenu tak niskich jak 0%. W celu zwiększenia precyzji można rozważyć uzupełnienie procesu dodatkowymi metodami usuwania tlenu, takimi jak zastosowanie pochłaniaczy tlenu lub dodatkowej szczelnej komory.
  6. Zmierzyć czas życia fazowego i obliczyć odpowiadające mu stężenie tlenu za pomocą równania Sterna-Volmera. W celu stworzenia oscylujących warunków tlenowych należy użyć dowolnego systemu sterowania instrumentami, aby zautomatyzować regulację natężenia przepływu objętościowego azotu i tlenu.

5. Przygotowanie hodowli bakteryjnej

  1. Przygotuj kulturę wstępną poprzez zaszczepienie wybranego organizmu (w tym przypadku E. coli MG1655, jedna gotowa kuleczka z krio probówki na kolbę) w odpowiednim medium (tutaj medium LB zawierające 10 g/L peptonu, 5 g/L ekstraktu z drożdży i 10 g/L NaCl) i inkubuj przez noc (tutaj 37 °C przy 150 rpm).
  2. Zmierz otrzymaną gęstość optyczną za pomocą fotometru przy 600 nm (OD600).
  3. Zaszczep kolejną kulturę w medium LB, wykorzystując kulturę wstępną (tutaj początkowa OD600 = 0,3 lub 0,0001). Inkubuj kulturę aż do osiągnięcia fazy wzrostu wykładniczego.
    UWAGA: Jeśli medium do hodowli na chipie różni się od medium pierwszej kultury wstępnej, zaleca się przeprowadzenie drugiej kultury wstępnej w medium przeznaczonym do hodowli na chipie, aby organizmy mogły zaadaptować się do nowego podłoża16.
  4. Przygotuj roztwór zasiewny poprzez rozcieńczenie kultury do odpowiedniej gęstości optycznej. Przenieś roztwór zasiewny do strzykawki o objętości 1 mL na potrzeby następnego kroku. Dla E. coli gęstość optyczna (OD600) roztworu zasiewnego wynosiła około 0,5.

6. Hodowla mikroorganizmów na chipie i obrazowanie poklatkowe w kontrolowanych warunkach tlenowych

  1. Zamocuj uchwyt chipa na stoliku mikroskopu. Pozostaw uchwyt oraz chip PDMS w inkubatorze (tutaj 37 °C) przez kilka godzin w celu ich ogrzania, co zmniejszy ryzyko rozmycia obrazu podczas obrazowania time-lapse wynikającego z przesunięć związanych ze zmianą temperatury.
  2. Przed rozpoczęciem hodowli uruchom przepływ gazu o pożądanej początkowej koncentracji tlenu, regulując procentową objętość tlenu i masowy przepływ azotu, utrzymując stałą całkowitą prędkość przepływu oraz prędkość przepływu dwutlenku węgla.
  3. Podłącz wlot gazu do chipa oraz regulatory masowego przepływu.
  4. Wsiać organizmy do chipa, podłączając strzykawkę z roztworem zasiewu do wylotu cieczy i ręcznie wysuwając tłok strzykawki. Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zostały skutecznie uwięzione w komorach hodowlanych.
  5. Po inokulacji komórek wyjmij strzykawkę i podłącz do wlotu cieczy inną strzykawkę ze świeżą pożywką. Ręcznie wysuń tłok strzykawki, aby wypłukać pozostałe komórki z kanału doprowadzającego pożywkę.
  6. Rozpocznij perfuzję pożywki ze stałą prędkością przepływu (tutaj 100 nL/min) za pomocą pompy strzykawkowej. Zapewnij odpowiednią prędkość przepływu, ponieważ zbyt niska wartość może doprowadzić do wyschnięcia komory. Wymagana prędkość przepływu może się różnić w zależności od kilku czynników, w tym geometrii kanału cieczowego i prędkości przepływu gazu w kanale górnej warstwy.
  7. Rozpocznij akwizycję obrazów time-lapse. W przypadku hodowli w oscylujących warunkach natlenienia, uruchom automatyczną kontrolę regulatorów masowego przepływu w tym samym czasie, w którym rozpoczyna się akwizycja obrazów. Jeśli wystąpi opóźnienie w uruchomieniu kontroli gazów i akwizycji obrazów, należy uwzględnić to opóźnienie podczas późniejszej analizy danych obrazowych.

7. Analiza danych obrazowych

  1. Zapisz obrazy time-lapse jako jeden stos obrazów dla każdej pozycji.
  2. Przetwórz wstępnie obraz, aby obrócić, wyrównać i wykadrować hodowaną kolonię, korzystając z programów do analizy obrazu. Przykłady wstępnie przetworzonych obrazów w formacie .TIF są dostępne tutaj: https://doi.org/10.5281/zenodo.1398274715
  3. Przeprowadź segmentację komórek i wyodrębnij istotne wartości, takie jak liczba komórek, długość, pole powierzchni, intensywność fluorescencji i tym podobne. Następnie przeanalizuj dynamikę wzrostu. Przykładowe skrypty w języku Python są dostępne tutaj: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-202515

Wyniki

Wytwarzanie dwuwarstwowego chipa PDMS
Wytworzony dwuwarstwowy chip przedstawiono na Rysunku 2A, gdzie w celu wizualizacji zaznaczono kolorami kanały gazowe (czerwone) oraz kanały płynowe (niebieskie). Chip posiada trzy identyczne kanały płynowe i nakładające się na nie kanały gazowe, co umożliwia prowadzenie eksperymentów równoległych. Kanał płynowy posiada obszar hodowlany z szeregiem komór hodowlanych (Rysunek 2A(i)). Komórki są uwięzione wewnątrz komór hodowlanych i mogą rosnąć w formie warstwy jednowarstwowej, co pozwala na obrazowanie time-lapse o wysokiej rozdzielczości i wysokiej częstotliwości akwizycji obrazu. Przekrój poprzeczny chipa ilustruje górną warstwę o grubości 3 mm oraz dolne warstwy o grubości 65 µm, co umożliwia szybką dyfuzję gazu z kanału gazowego do kanału płynowego poprzez pośrednią membranę PDMS (Rysunek 2A (ii-ii')).

Kontrola tlenu w układzie on-chip
Zdolność do wymiany gazowej opracowanego chipa przetestowano z wykorzystaniem FLIM oraz barwnika wrażliwego na tlen15. Jak pokazano na Rysunku 2B, stężenie tlenu w kanale płynnym wykazało odpowiedni spadek lub wzrost w ciągu kilkunastu sekund, gdy stężenie tlenu zmieniano pomiędzy 21% a 0%. Wyniki pomiarów tlenu dowodzą, że szybkie oscylacje tlenu w skali kilkunastu sekund mogą zostać odtworzone w opracowanym dwuwarstwowym chipie mikroprzepływowym.

Kultywacja mikroorganizmów w stałych warunkach natlenienia
Chip został najpierw wykorzystany do charakterystyki wzrostu fakultatywnego beztlenia E. coli w stałych warunkach gazowych przy różnych stężeniach tlenu. Do gazu zasilającego zawsze dodawano dwutlenek węgla, ponieważ w wstępnych eksperymentach zaobserwowano ograniczenie wzrostu E. coli przy deficycie dwutlenku węgla (dane nie zostały przedstawione). Rycina 3A oraz Rycina 3B przedstawiają reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym E. coli odpowiednio w warunkach tlenowych (zasilanie 21% tlenem) i beztlenowych (zasilanie 0% tlenem). Po 3 h kultywacji E. coli hodowane w warunkach tlenowych utworzyły większe kolonie w porównaniu do warunków beztlenowych. Analiza ilościowa wykazuje również różne tempo wzrostu wielkości kolonii (Acolony) w zależności od dostępności tlenu, co przedstawiają krzywe wzrostu na Rycynie 3C. Należy zauważyć, że Acolony została znormalizowana względem powierzchni początkowej, aby umożliwić porównanie różnych kolonii i warunków. Eksponencjalna szybkość wzrostu µ może zostać wyznaczona z krzywej wzrostu w następujący sposób i została podsumowana na Rycynie 3D.

Równanie szybkości wzrostu bakterii μ=(lnA_colony,t-lnA_colony,t0)/(t-t0), wzór analizy logarytmicznej.

Wyniki potwierdzają zdolność urządzenia do kontrolowania poziomu tlenu w założonych stężeniach oraz efektywnego analizowania odpowiadającego temu wzrostu drobnoustrojów na podstawie uzyskanych obrazów time-lapse.

Kultywacja drobnoustrojów w warunkach oscylacyjnego dopływu tlenu
Na koniec E. coli kultywowano w warunkach oscylacyjnego dopływu tlenu, przełączając między tlenową a beztlenową fazą napowietrzania z interwałem przełączania T'. Badano różne wartości T' w zakresie od 60 min do 1 min, aby sprawdzić możliwość analizy wzrostu w czasie w korelacji z oscylacyjnymi warunkami natlenienia. Rysunek 4 przedstawia ilościowy wzrost E. coli w warunkach oscylacyjnego dopływu tlenu dla T' = 60, 30, 10, 5, 2 i 1 min. Oprócz krzywej wzrostu opartej na Acolony, w celu uzyskania rozdzielczych w czasie informacji wyznaczono również chwilową szybkość wzrostu µΔt w następujący sposób.

Równanie szybkości wzrostu drobnoustrojów, μΔt, przedstawiające zmianę kolonii w czasie; wzór matematyczny.

Szybkości wzrostu w stałych warunkach tlenowych i beztlenowych są również przedstawione liniami przerywanymi (µ21%, µ0%) na Ryc. 4 jako referencje wzrostu. Wzrost E. coli wykazał odrębną dynamikę w odpowiedzi na oscylujące warunki gazowe. Na przykład, po przełączeniu fazy napowietrzania z warunków tlenowych na beztlenowe (T' = 60 min), wzrost wykazał (i) fazę odpowiedzi: nagły spadek szybkości wzrostu, po którym nastąpiła (ii) faza regeneracji: stopniowy wzrost szybkości wzrostu oraz (iii) faza stabilizacji: stabilizacja wzrostu w okolicy µ0%. Dynamika wzrostu E. coli została pomyślnie rozdzielona czasowo przy różnych wartościach T', w tym tak krótkich jak 1 min, gdzie E. coli wykazała monotonne wahania szybkości wzrostu ze względu na ograniczony czas adaptacji wzrostu do zmieniających się warunków gazowych. Ponadto zachowanie wzrostu można analizować nie tylko na poziomie kolonii, ale także na poziomie pojedynczych komórek. Ryc. 5 ilustruje rozwój powierzchni pojedynczej komórki podczas oscylacji tlenu przy różnych interwałach przełączania T'. Wzrost pojedynczej komórki można wywnioskować, śledząc sąsiednie wykresy, bez konieczności przeprowadzania analizy śledzenia. Zachowanie wzrostu na poziomie pojedynczej komórki przypomina to, co zaobserwowano na poziomie kolonii na Ryc. 4; szybszy przyrost powierzchni podczas tlenowej fazy napowietrzania i wyraźna zmiana prędkości wzrostu w momencie przełączenia gazu. Przedstawione wyniki demonstrują możliwość hodowli mikroorganizmów w oscylujących warunkach gazowych oraz analizy wzrostu mikrobiologicznego w korelacji z dostępnością tlenu w sposób rozdzielony czasowo.

Wytwarzanie chipa mikrofluidycznego: schemat z projektem formy, odlewaniem PDMS i etapami procesu montażu.
Rycina 1: Procedura wytwarzania dwuwarstwowego chipa. Procedura rozpoczyna się od (A, C) projektowania formy, (B, D) wytwarzania formy, (E-G) odlewania PDMS oraz (H) montażu chipa. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikrofluidyczny układ z kanałami gazowo-cieczowymi i komorą hodowlaną; wykres dynamiki poziomu tlenu.
Rysunek 2: Wykonany dwuwarstwowy chip i jego zdolność do kontroli poziomu tlenu. (A) Przedstawiono reprezentacyjny obraz wykonanego chipa, z kolorowymi kanałami gazowymi (czerwone) i cieczowymi (niebieskie) w celu wizualizacji. Obraz SEM pokazano w (i), przedstawiający serię komór hodowlanych połączonych z kanałami cieczowymi po obu stronach (pasek skali 100 µm). Przekrój poprzeczny chipa pokazano w (ii-ii'), przedstawiający górną warstwę o grubości 3 mm oraz dolną warstwę o grubości 65 µm. (B>) Zmierzona koncentracja tlenu w kanale cieczowym po przełączeniu między warunkami tlenowymi (21% tlenu) a beztlenowymi (0% tlenu). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost bakterii przy różnych poziomach O2; mikroskopia poklatkowa, wykresy szybkości wzrostu, model Monoda.
Rysunek 3: Hodowla E. coli w stałych warunkach natlenienia. (A) Komórki hodowane tlenowo (podaż tlenu 21%) przez 3 h; obrazy poklatkowe wykonano za pomocą mikroskopii kontrastowej. (B) Komórki hodowane beztlenowo (podaż tlenu 0%); obrazy poklatkowe wykonano przez 3 h. (C) Wykres wzrostu komórek w różnych stałych warunkach natlenienia na podstawie Acolony. (D) Obliczona i podsumowana wykładnicza szybkość wzrostu. Wszystkie paski skali = 5 µm. Dane przedstawiono jako średnia ± S.D. n = 35 kolonii (0%), 27 (0,1%), 21 (0,5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). Rysunek zmodyfikowano na podstawie 15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dynamika wzrostu drobnoustrojów w warunkach tlenowych i beztlenowych; odpowiedź, stabilizacja, regeneracja.
Rysunek 4: Hodowla E. coli w oscylujących warunkach tlenowych. Zbadano wzrost komórek w różnych oscylujących warunkach tlenowych (T', interwał przełączania między warunkami tlenowymi a beztlenowymi). Wzrost komórek na podstawie Acolony przedstawiono w funkcji czasu (góra), a µΔt  przedstawiono w funkcji czasu, aby umożliwić interpretację danych w rozdzielczości czasowej (dół). Dane wyrażono jako średnia ± S.D. n = 5 kolonii (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost komórek tlenowy a beztlenowy, powierzchnia w funkcji czasu, serie wykresów, analiza faz oddychania.
Rysunek 5: Powierzchnia pojedynczej komórki (A single cell ) E. coli hodowanych w oscylujących warunkach tlenowych. Dane pochodzą z reprezentatywnej kolonii dla każdego przedziału przełączania T'. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie 15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opracowano protokół wytwarzania i obsługi dwuwarstwowego systemu mikroprzepływowego w celu obserwacji wzrostu drobnoustrojów w szybko oscylujących warunkach tlenowych z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. W połączeniu z obrazowaniem poklatkowym platforma ta umożliwia hodowlę na chipie i monitorowanie mikroorganizmów w czasie rzeczywistym w kontrolowanych warunkach tlenu, umożliwiając analizę wzrostu drobnoustrojów w korelacji z dostępnością tlenu.

W tym protokole górna i dolna warstwa są przygotowywane osobno, a następnie montowane w jeden chip. Ta modułowa koncepcja pozwala na różne projekty chipów po prostu zastępując konfiguracje dwuwarstwowe. Dla form górnej i dolnej warstwy zastosowano różne metody wytwarzania - druk 3D SLA dla górnej i fotolitografia dla dolnej - w oparciu o ich odpowiednie wymagania dotyczące rozmiaru i dokładności. Takie podejście poprawia ogólną wydajność procesu produkcyjnego. Montaż dwóch warstw odbywa się poprzez dwuetapowy proces utwardzania PDMS. Konieczne jest zoptymalizowanie czasu nagrzewania dla pierwszego etapu utwardzania zgodnie z projektem, ponieważ grubość formy i lokalne warunki ogrzewania mogą mieć wpływ na wyniki utwardzania PDMS.

Wykorzystujemy naturę PDMS, który jest wysoce przepuszczalny dla powietrza, aby osiągnąć szybką zmianę tlenu. Z drugiej strony, na precyzję kontroli tlenu może mieć również wpływ bierna dyfuzja tlenu przez PDMS, szczególnie przy niższych poziomach tlenu. Aby zrekompensować to ograniczenie, do protokołu można dodać dalsze ulepszenia. Na przykład metoda kalibracji czujnika tlenu ma możliwości poprawy. W zademonstrowanym protokole czujnik jest kalibrowany w dwóch punktach odniesienia, 0% i 21% poziomie tlenu, przy użyciu dwuwarstwowego chipa PDMS. W związku z tym precyzja wykrywania tlenu zależy od zdolności do tworzenia dokładnych warunków do kalibracji z niedoborem tlenu. Jak wspomniano w protokole, zaleca się odczekanie kilku minut po rozpoczęciu płukania gazem, aby zapewnić dokładną kalibrację, szczególnie w przypadku użycia, gdy poziom wyczerpania tlenu wynosi zaledwie 0%. Niemniej jednak zadanie to jest trudne ze względu na potencjalne nieszczelności lub zatrzymywanie powietrza w przepuszczającym powietrze chipie PDMS. Dokładność kalibracji można dodatkowo poprawić, stosując chemikalia pochłaniające tlen lub zamykając chip w szczelnie zamkniętej, zubożonej w gaz komorze 17,18. Suplementy te mogą pozwolić na bardziej solidną i precyzyjną analizę zachowania drobnoustrojów w warunkach ściśle beztlenowych i niskotlenowych.

Zademonstrowane urządzenie może być interesujące dla różnych dziedzin badawczych. Na przykład byłby przydatny do odtworzenia warunków tlenowych w bioreaktorach przemysłowych, w których zakłada się, że dostępność tlenu jest czasowo niejednorodna 7,8,19,20. Zastosowanie dwuwarstwowego chipa pozwala naukowcom scharakteryzować i zrozumieć zachowanie mikroorganizmów w szybko zmieniającym się środowisku tlenowym, co nie było możliwe w konwencjonalnych konfiguracjach uprawy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

KK był wspierany przez Japońską Organizację Usług Studenckich (JASSO) Program Wsparcia Wymiany Studenckiej (G2130401003N) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - SFB1535 - Numer identyfikacyjny projektu 458090666.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Clewin 5WieWeb software, HolandiaN/AEdytor układu
Kamera CMOSNikon, JaponiaDS-Qi2 powiedział:
szkło nakrywkoweSchott AG, NiemcyD263 Życiorys39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Odkurzacz plazmowy FemtoDiener Electronics, Niemcy-Klejenie plazmą wiórową
Formularz 3BFormlabs, Stany Zjednoczone-Drukarka 3D
Odniesienie do okresu istnieniaStarna Scientific, Wielka BrytaniaUMM-SFG
Regulator przepływu masowegoVö gtlin Instruments GmbH, SzwajcariaGSC-A9SA-BB22azot, tlen
Regulator przepływu masowegoVö gtlin Instruments GmbH, SzwajcariaGSC-A9SA-BB21dwutlenek węgla
Żywica model v3Formlabs, Stany ZjednoczoneRS-F2-DMBE-03Żywica do druku 3D
Zawartość NaClCarl Roth, Niemcy3957.1LB średni składnik
Nikon Eclipse Ti-E 2Nikon, Japonia-Mikroskop odwrócony
Aparat fotograficzny pco.flimPCO AG, Niemcy-
Laser pco.flimOmicron-Laserprodukte GmbH, Niemcy-
PeptonCarl Roth, Niemcy8986.1LB średni składnik
Plan Apo λNikon, Japonia-100x olej, 20x
Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow Chemical Company, Stany ZjednoczoneSylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych
Narzędzie do wykrawania, Φ 0,50 mmWorld Precision Instruments, Stany Zjednoczone504528
Narzędzie do wykrawania, Φ 0,75 mmWorld Precision Instruments, Stany Zjednoczone504529
Fiolka kriogeniczna ROTI StoreCarl Roth, Niemcy-
Solidworks 2016 x64 EditionDassault Systems, FrancjaN/A3D
Powlekarka wirowa do podłożaAPT Automation, NiemcySPIN150iPowlekanie wirujące PDMS
Pompa strzykawkowaCETONI, NiemcyneMESYS
Inkubator temperaturyOkolab, Włochy-Sprzęt do mikroskopów
tris(2,2'-bipirydylo)dichlororuten(II)heksahydrat, (RTDP)Acros Organics, Belgia208750010
RurySaint-Gobain, FrancjaTygon F-4040-APrzewody doprowadzające gaz
RurySaint-Gobain, FrancjaTygon AAD04103Przewody do płynów
Ekstrakt drożdżowyCarl Roth, Niemcy2363.3LB średni składnik

Bibliografia

  1. Cabiscol, E., Tamarit, J., Ros, J. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species. Int Microbiol. 3 (1), 3-8 (2000).
  2. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 413-451 (2007).
  3. André, A. C., Debande, L., Marteyn, B. S. The selective advantage of facultative anaerobes relies on their unique ability to cope with changing oxygen levels during infection. Cell Microbiol. 23 (8), e13338(2021).
  4. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  5. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  6. Taylor, J. R., Stocker, R. Trade-offs of chemotactic foraging in turbulent water. Science. 338 (6107), 675-679 (2012).
  7. Enfors, S. O., et al. Physiological responses to mixing in large scale bioreactors. J Biotechnol. 85 (2), 175-185 (2001).
  8. Takors, R. Scale-up of microbial processes: Impacts, tools and open questions. J Biotechnol. 160 (1), 3-9 (2012).
  9. Partridge, J. D., Scott, C., Tang, Y., Poole, R. K., Green, J. Escherichia coli transcriptome dynamics during the transition from anaerobic to aerobic conditions. J Biol Chem. 281 (38), 27806-27815 (2006).
  10. Ren, T., et al. Oxygen sensing regulation mechanism of Thauera bacteria in simultaneous nitrogen and phosphorus removal process. J Cleaner Prod. 434, 140332(2024).
  11. Murashko, O. N., Lin-Chao, S. Escherichia coli responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. Proc Natl Acad Sci. 114 (38), E8025-E8034 (2017).
  12. Yasid, N. A., Rolfe, M. D., Green, J., Williamson, M. P. Homeostasis of metabolites in Escherichia coli on transition from anaerobic to aerobic conditions and the transient secretion of pyruvate. Royal Soc Open Sci. 3 (8), 160187(2016).
  13. von Wulffen, J., RecogNice-Team,, Sawodny, O., Feuer, R. Transition of an Anaerobic Escherichia coli Culture to Aerobiosis: Balancing mRNA and Protein Levels in a Demand-Directed Dynamic Flux Balance Analysis. PloS one. 11 (7), e0158711(2016).
  14. Pedraz, L., Blanco-Cabra, N., Torrents, E. Gradual adaptation of facultative anaerobic pathogens to microaerobic and anaerobic conditions. FASEB J. 34 (2), 2912-2928 (2020).
  15. Kasahara, K., et al. Unveiling microbial single-cell growth dynamics under rapid periodic oxygen oscillations. Lab on a Chip. 25, 2234-2246 (2025).
  16. Gruenberger, A., et al. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560(2013).
  17. Wu, H. M., et al. Widefield frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FD-FLIM) for accurate measurement of oxygen gradients within microfluidic devices. Analyst. 144 (11), 3494-3504 (2019).
  18. Kasahara, K., et al. Enabling oxygen-controlled microfluidic cultures for spatiotemporal microbial single-cell analysis. Front Microbiol. 14, 1198170(2023).
  19. Bisgaard, J., et al. Characterization of mixing performance in bioreactors using flow-following sensor devices. Chem Eng Res Des. 174, 471-485 (2021).
  20. Nauha, E. K., Kálal, Z., Ali, J. M., Alopaeus, V. Compartmental modeling of large stirred tank bioreactors with high gas volume fractions. Chem Eng J. 334, 2319-2334 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Urządzenie mikroprzepływowemikroskopia poklatkowamikroprzepływy PDMSkontrola poziomu tlenuanaliza wzrostu drobnoustrojówwymiana gazowaczasowa kontrola tlenuwytwarzanie chipów mikroprzepływowych
Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.