Method Article

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

DOI:

10.3791/68708

⸱

November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nowotworowe krążące (CTC) stanowią obiecujący biomarker do śledzenia przerzutów, postępu i nawrotów nowotworów. Techniki biopsji płynnej skoncentrowane na wykrywaniu CTC wykazały znaczny potencjał ze względu na swoją nieinwazyjną naturę oraz zdolność do monitorowania dynamiki guza w czasie rzeczywistym. Jednak konwencjonalne analizy masowe CTC nie rejestrują wewnętrznej heterogeniczności wśród populacji CTC, co zaciera kluczowe informacje o biologii nowotworów. Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) umożliwia wysokorozdzielczą charakterystykę heterogeniczności CTC, dając nowe możliwości precyzyjnych badań onkologicznych i mechanistycznych postępu guza. Pomimo tych zalet, obecne metody sekwencjonowania pojedynczego CTC często cierpią na nieefektywności, takie jak niskie wskaźniki odzyskiwania, pracochłonne procesy oraz ryzyko zanieczyszczenia związane z wieloma ręcznymi etapami manipulacji. Aby rozwiązać te ograniczenia, przedstawiamy zintegrowany protokół mikrofluidyczny, który łączy wzbogacanie CTC, oczyszczanie oraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek w jednolity przepływ pracy. Metoda wykorzystuje dynamicznie kontrolowane przechwytywanie magnetyczne w chipie o strukturze jodełki, gdzie mieszanie wirów i skumulowane wiązanie kulek immunomagnetycznych umożliwia solidną, wysokoprzepustową izolację CTC przy minimalnym uszkodzeniu komórek. Późniejsze oczyszczanie za pomocą mikrofluidowego chipu pokrytego przeciwciałami leukocytarnymi skutecznie usuwa komórki niebędące celem, dodatkowo wzmacniając czystość CTC poprzez selekcję negatywną. Wreszcie, wysokoprecyzyjny układ sekwencjonowania pojedynczych komórek, zaprojektowany w oparciu o zasady różnicowego oporu przepływu, umożliwia efektywne przechwytywanie i łączenie pojedynczych komórek z unikalnie kodowanymi mikrokulkami. Ta nowatorska platforma przezwycięża ograniczenia metod opartych na dystrybucji Poissona, poprawiając wykorzystanie CTC przy jednoczesnym minimalizowaniu zużycia mikrokulek i kosztów sekwencjonowania. Nasz zintegrowany protokół znacząco zwiększa efektywność przechwytywania CTC, czystość oraz przepustowość sekwencjonowania pojedynczych komórek, co czyni go doskonale przystosowanym do zastosowań klinicznych i badań nad rakiem na dużą skalę. Dzięki umożliwieniu dokładniejszej i skalowalniej analizy heterogeniczności CTC, metoda ta ma potencjał do udoskonalenia wczesnej diagnozy nowotworów, monitorowania leczenia oraz mechanistycznych badań przerzutów, ostatecznie rozwijając dziedzinę precyzyjnej onkologii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty nowotworowe to złożony i wieloetapowy proces, który zaczyna się od rozprzestrzeniania, a następnie podlega uśpieniu i kolonizacji przez komórki nowotworowe wewnątrz pierwotnego guza. Komórki te stopniowo przenikają przez błonę podstawną do głębszych tkanek, a następnie wchodzą do naczyń krwionośnych lub limfatycznych. Po wejściu do krążenia komórki te stają się krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC), które mogą podróżować do odległych narządów1. Pojawienie się CTC jest kluczowym krokiem w kaskadzie przerzutowej, ponieważ stanowią one zalążki odległych przerzutów1. W ostatnich latach technologia biopsji płynnej opartej na CTC zyskała znaczną uwagę ze względu na swoje zalety, w tym nieinwazyjny i wygodny charakter zabiegu oraz możliwość dynamicznego monitorowania w czasie rzeczywistym. Technologia ta umożliwia precyzyjną, w czasie rzeczywistym i kompleksową ocenę biologii nowotworów, oferując unikalne korzyści w monitorowaniu skuteczności leczenia, przewidywaniu nawrotów oraz kierowaniu terapią 2,3,4. Ponadto badania wykazały, że CTC występują we krwi obwodowej nawet podczas niskiego obciążenia guza, takich jak wczesny nowotwor, wczesne przerzuty czy nawrót 5,6. W konsekwencji biopsja płynna CTC przezwycięża ograniczenia tradycyjnych biopsji tkanek, które ograniczają się do guzów litych wykrywalnychobrazowo 7. Zapewnia nowatorską perspektywę i wsparcie technologiczne dla wczesnej diagnozy nowotworów, monitorowania nawrotów i przerzutów, wskazówek dotyczących leczenia, a także wyjaśnia mechanizmy inicjacji, postępu i przerzutów nowotworu. Na przykład liczba CTC we krwi obwodowej wykazano jako niezależny wskaźnik zarówno przeżycia bez progresji, jak i ogólnego przeżycia u pacjentów onkologicznych, przy czym wyższa liczba CTC wskazuje na gorsze rokowanie8. Dynamiczne zmiany w liczbie CTC są również ściśle powiązane z postępem choroby i obciążeniem guzów po leczeniu 9,10.

Najnowsze badania podkreślają technologie oparte na mikrofluidyce jako narzędzia transformacyjne do izolacji CTC. Technologie te można ogólnie podzielić na podejścia oparte na fizyce i biologiczne, z których każde oferuje unikalne zalety, jednocześnie stawiając czoła określonym wyzwaniom. Metody fizyczne opierają się na różnicach rozmiaru i deformowalności, aby oddzielić CTC, umożliwiając sortowanie bez etykiet o wysokiej przepustowości. Jednak ta niespecyficzna strategia separacji może zagrozić zarówno efektywności przechwytu, jak i czystości ze względu na wrodzoną heterogeniczność CTC. Na przykład Lu i in. przedstawili układ mikrofluidyczny, który integrował konstrukcję separacji ogniskowej i redukcji prędkości z matrycami pułapek, przewyższając większość konwencjonalnych technik fizycznych pod względem wzbogacenia i oczyszczania CTC11. Niemniej jednak chip osiągnął jedynie 3-4 logarytmiczne zużycie białych krwinek (WBC), co pozostaje niewystarczające do zastosowań klinicznych. Z kolei strategie izolacji CTC oparte na afinności immunologicznej zazwyczaj oferują wyższy wskaźnik regeneracji i czystość komórek docelowych. Jednak interakcja wiązania między cząsteczkami chwytania a CTC często ogranicza przepustowość takich podejść12,13. W związku z tym metoda izolacji, która równoważy wysoką efektywność wzbogacenia i przepustowość, jest niezbędna do skutecznego przetwarzania próbek klinicznych z rzadkimi populacjami CTC.

Ponadto znaczna heterogeniczność między CTC stanowi poważne wyzwanie dla analiz dalszych analiz10, 14, 15, ponieważ konwencjonalne analizy masowe CTC często zacierają indywidualne rozróżnienia komórkowe. Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) umożliwia kompleksową charakteryzację heterogeniczności ekspresji genów CTC na poziomie molekularnym, dostarczając wglądu w klasyfikację, stan i funkcję CTC. Technologia ta oferuje nowatorskie podejścia do precyzyjnej onkologii i ułatwia badania nad inicjowaniem, progresją i mechanizmami przerzutów nowotworów16. Na przykład Fan i in. stworzyli atlas transkryptomiczny pojedynczego CTC z różnych miejsc naczyniowych u pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym, ujawniając heterogeniczność przestrzenną między CTC i identyfikując kluczowe mediatory unika układu odpornościowego17. Równocześnie Miyamoto i in. zidentyfikowali mutacje genów receptorów androgenowych oraz warianty splice w CTC pacjentów z rakiem prostaty, wyjaśniając tym samym mechanizmy leżące u podstaw oporności na leki18.

Jednak rozwój sekwencjonowania transkryptomicznego pojedynczego CTC postępuje powoli. Istniejące metody cierpią na niedociągnięcia w automatyzacji i integracji, co skutkuje niską efektywnością odzyskiwania CTC, złożonymi procedurami i niskimi wskaźnikami sukcesu eksperymentów19. Na przykład obecne protokoły wymagają sekwencyjnego procesu wzbogacania CTC, oczyszczania, izolacji pojedynczych komórek oraz amplifikacji kwasów nukleinowych. Te etapy wykonywane są w oddzielnych rurkach wirówek, co wymaga wielokrotnego pipetowania i przelewu. Pracochłonne procedury nie tylko zmniejszają wydajność, ale także zwiększają ryzyko utraty CTC i zanieczyszczenia20. Konwencjonalne podejścia, takie jak pobieranie komórek na bazie kapilarnych, dodatkowo ograniczają przepustowość i efektywność analityczną podczas izolacji pojedynczych komórek21. Ponadto tradycyjne metody są również ograniczone przez rozkład Poissona, który jest zjawiskiem statystycznym opisującym losowe enkapsulowanie komórek. Skutkuje to wysokim odsetkiem pustych kropelek lub wieloma komórkami na kroplę, co ogranicza efektywność przechwytywania. Aby sprostać tym wyzwaniom, naukowcy opracowali zintegrowane układy mikrofluidyczne do analizy transkryptomii CTC w pojedynczych komórkach. Platformy te łączą wiele etapów w jednym procesorze, zmniejszając ryzyko zanieczyszczeń i poprawiając efektywność analityczną. Na przykład Euisik Yoon i in. opracowali metodę Hydro-Seq, która wykorzystuje selekcję rozmiaru opartą na dynamice płynów do izolowania CTC w mikrokomorach i efektywnego sparowania pojedynczych CTC z unikalnie kodowanymi mikrokulkami22. Takie podejście umożliwia wysokoprzepustową, równoległą analizę pojedynczych komórek wielu CTC. Jednak metoda ta opiera się na separacji CTC opartej na rozmiarze, co często skutkuje niską czystością CTC i ograniczoną przepustowością (10 μL/min), czyniąc ją nieodpowiednią do przetwarzania próbek klinicznych o dużych objętościach. Dlatego pilnie potrzebny jest opracowanie zintegrowanego, wysokoprzepustowego, niskowolumilowego i odpornego na zanieczyszczenia systemu analizy CTC z pojedynczą komórką.

Opisujemy tutaj wysokoprzepustowy i wydajny protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczych komórek, składający się z trzech głównych komponentów: sortowania CTC, oczyszczania oraz układu sekwencjonowania pojedynczych komórek (Rysunek 1). Mikrofluidyczny układ sortujący CTC został zaprojektowany na podstawie zasady dynamicznie regulowanych sił magnetycznych przechwytujących (Rysunek 2A). Umożliwia wysokoprzepustowe wzbogacenie CTC poprzez mieszanie wirów w strukturze jodełki, a także kumulacyjne wychwytywanie przez kulki immunomagnetyczne. Nieniszczące uwalnianie CTC jest następnie osiągane poprzez precyzyjną modulację pola magnetycznego. Następnie stosuje się chip oczyszczający, w którym mikrokanały pokryte przeciwciałami leukocytarnymi są wykorzystywane do selekcji negatywnej, co daje wysoko oczyszczone CTC (Rysunek 2B). Na koniec zastosowano wysokowydajną platformę manipulacyjną pojedynczą komórką opartą na różnicowym oporze przepływu, skutecznie przezwyciężając ograniczenia rozkładu Poissona i umożliwiając efektywne parowanie i przechwytywanie mikrosfer pojedynczych komórek/zakodowanych (Rysunek 3A). Znacząco zwiększa wykorzystanie CTC, jednocześnie obniżając zużycie mikrokulek i koszty sekwencjonowania.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat technologii sortowania CTC i sekwencjonowania pojedynczej komórki opartej na mikrofluidice. Ten proces ilustruje proces, w którym komórki nowotworowe odłączają się od zmian nowotworowych, trafiają do krwiobiegu i tworzą CTC. Próbki krwi obwodowej lub leukopaku zawierające CTC są sekwencyjnie przetwarzane przez układy CTC do wychwytywania, oczyszczania i scRNA-seq, co ostatecznie umożliwia sekwencjonowanie transkryptomiczne i bioinformatyczną analizę CTC. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Metoda 1: Izolacja CTC oparta na mikrofluidach

  1. Produkcja z odcinkiem jodełkowym (HB-chip)
    1. Przygotowanie formy głównej
      1. Przygotuj czysty płytki krzemowe i piecz je w 135 °C przez noc, aby usunąć wilgoć. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej poddaj płytkę preparatowi do filtrowania plazmy tlenowej o mocy 150 W przez 1 minutę, aby aktywować powierzchnię.
      2. Wzoruj pierwszą warstwę układu, aby utworzyć matrycę filarów nośnych (28 kolumn × 7 rzędów, ponumerowanych od #1 do #28 wzdłuż kierunku przepływu) za pomocą fotorezystu SU-8. Ustaw spincoater tak, aby pracował sekwencyjnie z prędkością 500 obr./min przez 10 s, 2350 obr./min przez 55 s, a 500 obr./min przez 10 s. Upewnij się, że wysokość tej warstwy wynosi 50 μm.
      3. Pierwszą warstwę wypiekaj na miękko w 65 °C przez 1 minutę, a następnie w 95 °C przez 20 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Chłodzić do temperatury pokojowej.
      4. Naświetl pierwszą warstwę za pomocą fotomaski z odpowiednim wzorem filaru nośnego. Ustaw dawkę ekspozycji na 130 mJ/cm2.
      5. Wykonaj wypiek po ekspozycji w 65 °C przez 1 minutę, a następnie w 95 °C przez 6 minut.
      6. Po schłodzeniu nałóż wywoływacz SU-8 na powierzchnię płytki, aby usunąć niepołączony fotorezys i uzyskać dolną warstwę. Pozwól mu się zgromadzić przez 30 sekund, potem przepłucz wodą dejonizowaną.
      7. Warstwa spin-coat nałoży drugą warstwę SU-8 na pierwszą, używając tych samych parametrów spinu co w kroku 1.1.1.2. Wzoruj drugą warstwę, aby utworzyć struktury jodełki pod kątem 45° do ściany kanału, z szerokością rowka 100 μm, skokiem 200 μm i sześcioma żłobinami na cykl. Upewnij się, że wysokość tej warstwy wynosi również 50 μm.
        UWAGA: Schemat ilustrujący wszystkie istotne wymiary cech mikrostruktury (w tym układ filarów nośnych i rowki w kształcie jodełki) został przedstawiony na Dodatkowym Rysunku 1.
      8. Pierwszą warstwę wypiekaj na miękko w 65 °C przez 1 minutę, a następnie w 95 °C przez 20 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Chłodzić do temperatury pokojowej.
      9. Naświetl drugą warstwę za pomocą fotomaski z wzorem jodełki. Ustaw dawkę ekspozycji na 130 mJ/cm2.
      10. Wykonaj wypiek po ekspozycji w 65 °C przez 1 minutę, a następnie w 95 °C przez 6 minut.
      11. Po schłodzeniu użyj wywoływacza SU-8, aby usunąć niepowiązane obszary i odsłonić pełną dwuwarstwową mikrostrukturę.
    2. Przygotowanie replik PDMS
      1. Formułuj mieszankę PDMS, łącząc prepolimer i linkator krzyżowy w stosunku wagowym 10:1. Przygotuj 10-15 ml tej mieszanki na pojedynczy chip.
      2. Wlej mieszankę do formy głównej i usuń uwięzione powietrze przez odgazowanie. Utwardzaj PDMS, umieszczając formę w piekarniku w temperaturze 95 °C na 30 minut.
      3. Wyjmij utwardzoną replikę PDMS z formy. Stwórz jedno wlotowe i jedno wylotowe za pomocą dziurkarki PDMS o średnicy 1 mm.
    3. Zespół układu HB
      1. Ustaw filtr plazmy tlenowej na moc 150 W przez 3 minuty. Aktywuj powierzchnie, traktując zarówno replikę PDMS, jak i warstwę PDMS na czystym szkle.
        UWAGA: Ze względu na obfitość wiązań Si-O w łańcuchach polimerowych PDMS, aktywacja plazmowa umożliwia wiązanie kowalencyjne między PDMS a podłożami, takimi jak szkło, krzem, co ułatwia uszczelnianie odłamków.
      2. Wyrównaj poddane strukturom PDMS i mocno je związaj. Potwierdź, że układ filarów nośnych i elementy jodełki są całkowicie zintegrowane ze szklanym podłożem, aby sfinalizować układ HB.
  2. Przygotowanie kulek immunomagnetycznych (IMB)
    1. Inkubuj 25 μL wypłukanych i ponownie zawiesowanych magnetycznych kulek (SA-MB) (SA-MB) (1 μm) (≈4 × 108 kulek na mL) z 1 μg biotinylowanego przeciwciała EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) w temperaturze pokojowej, z rotacją 20 obr./min przez 40 minut, aby przygotować IMB.
    2. Po oddzieleniu magnetycznym na magnetycznym stojaku usuń supernatant i ponownie zawiesij kulki w 25 μL buforu izolacyjnego (1% BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Działanie chipa izolacyjnego
    1. Pipetuj 20 μL zawieszenia kulek magnetycznych w ciągu 1-2 s, zapewniając brak powstawania pęcherzyków powietrza.
    2. Natychmiast umieść chip pionowo na magnesie i pozwól kulkom osiąść przez 5 minut bez zakłóceń.
    3. Pobierz próbkę krwi (z krwi obwodowej lub eksperymentalnej leukopaku) i natychmiast pobieraj 4 mL do strzykawki, upewniając się, że pęcherzyki powietrza zostaną usunięte. Uszczelnij wlot i wylot układu cieczą, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza. Włóż rurki wlotowe i wylotowe próbki do układu.
      UWAGA: Upewnij się, że podstawowe środki ochrony osobistej są stosowane podczas obsługi próbek biologicznych.
    4. Wstrzyknij próbkę pompą strzykawkową o przepływie 1,5 mL/h.
    5. Po załadunku próbki wstrzykni 60 μL D-PBS do układu HB z przepływem 0,2 mL/h, aby zmyć niezwiązane ogniwa.
    6. Usuń magnes i ręcznie wstrzyknij 1,5 mL BSA (5% objętości w D-PBS), aby przemyć chip i uwolnić przechwycone komórki nowotworowe z chipu HB.

2. Metoda 2: Mikrofluidyczna oczyszczanie CTC

  1. Modyfikacja chipu HB
    1. Przygotuj roztwór (3-merkaptopropylowy) trimetoksysilanu (MPTS) w etanolu o ułamku objętościowym (v/v) 10%. Natychmiast wprowadź 20 μL roztworu MPTS do układu HB i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Opłukaj raz bezwodnym etanolem i susz w temperaturze 100 °C przez 1 godzinę.
    3. Przygotuj roztwór esteru N-γ-maleimidobutyryl-oksysukcynimid (GMBS) w etanolu w stężeniu 0,5 mg/mL. Schłodzić chip do 37 °C, wprowadzić roztwór GMBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      UWAGA: Podczas stosowania MPTS i GMBS zawsze noś rękawiczki, fartuch laboratoryjny i maskę. Te odczynniki mają toksyczne i śluzowe właściwości drażniące i należy z nimi obchodzić się ostrożnie w dobrze wentylowanym miejscu.
    4. Płukaj dwa razy ddH2O, a następnie dwa razy D-PBS.
    5. Natychmiast dodaj 15 μg/mL streptawidyny (SA), inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w 4 °C.
    6. Przepłucz dwa razy D-PBS.
    7. Przygotuj bufor przeciwciał CD45: 0,2% (w/v) BSA i 20 μg/mL biotinylowane przeciwciało CD45, rozcieńczone do objętości D-PBS.
    8. Wstrzyknąć 20 μL buforu przeciwciał CD45 do chipa HB w celu negatywnego selekcji białych krwinek. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przepłucz D-PBS.
    9. Dodaj roztwór blokujący zawierający 3% (w/v) BSA i 0,05% (w/v) Tween-20, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przepłucz D-PBS przed załadowaniem próbki.
  2. Ładowanie próbek
    1. Aspiruj próbkę strzykawką, upewniając się, że pęcherzyki powietrza zostaną usunięte. Uszczelnij wlot i wylot układu cieczą, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza. Włóż rurki wlotowe i wylotowe próbki do układu.
    2. Wstrzyknij próbkę pompą strzykawkową i ustaw przepływ na 0,6 mL/h.
    3. Pobierz oczyszczone komórki nowotworowe z gniazdka do liczenia i sekwencjonowania pojedynczych komórek.

3. Metoda 3: Technologia kodowania kreskowego i sekwencjonowania oparta na mikrostudniach

  1. Przygotowanie odczynników i materiałów
    1. Wstępna obróbka chipu
      1. Dodaj 200 μL 1x D-PBS i 0,5% roztworu F-68 do wlotu układu.
      2. Wykonaj sonikację w kąpieli wodnej, trzymając chip. Gdy pęcherzyki są widoczne na całym obszarze mikroporowatym, kontynuuj sonifikację przez 30 sekund, aby usunąć pęcherzyki z podwójnych studni.
    2. Przygotowanie koralików z kodem kreskowym
      1. Dokładnie wymieszaj roztwór z kulek magnetycznych z kodem kreskowym i przelej 200 μL do rurki wirówki. Stosuj separację magnetyczną, aż roztwór się wyjaśni, i odrzuć supernatant.
      2. Należy dwukrotnie myć koraliki z kodem kreskowym 500 μL TE-TW (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20).
      3. Przemyj i ponownie zawiesij kulki z kodem kreskowym w 200 μL 20x TE (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA) i 50 mM roztworu DTT, a następnie umieść w lodzie.
    3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
      1. Przenieś oczyszczone komórki nowotworowe do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL i wiruj w dawce 400 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Przemyj i ponownie zawiesij granulat w 1 mL 1x D-PBS.
      2. Wykonaj liczenie komórek i odpowiednio przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek. Objętość ładowania próbki powinna wynosić 200 μL, co daje łącznie 80 000 komórek (400 komórek/μL).
    4. Przygotuj bufor do lizy komórek, który zawiera 1x cytrynian sodu (SSC), 0,5 M LiCl, 0,6% Triton X-100, 10 mM EDTA, 5 mM DTT oraz 1 inhibitor U/μL RNazy.
  2. Działanie mikrofluidycznego układu scalonego
    1. Przechwytywanie komórek
      1. Wstrzyknij 200 μL zawiesiny komórek nowotworowych do chipa (60000 podwójnych dołków), a następnie potrząsaj z częstotliwością 10 obr./min na shakerze odbarwiającym przez 5 minut, aby komórki mogły się grawitacją osadzić w dołkach wychwytujących.
      2. Delikatnie pipetuj zawiesinę ogniwową w chipie dwukrotnie w górę i w dół. Następnie umieść chip na odbarwiaczce na 10 obr./min na 5 minut, aby ponownie zawiesować nieprzejęte komórki i pozwolić im się ponownie osadzić.
      3. Dodaj 200 μL 1x D-PBS i 0,5% roztworu F-68 przez wlot i zasysaj roztwór z wylotu. Powtórz to dwa razy, co daje łącznie trzy płukania odprysku.
    2. Przechwytywanie koralików z kodem kreskowym
      1. Ponownie zawiesz zawieszenie kulki z kodem kreskowym, a następnie natychmiast wstrzyknij 200 μL zawieszenia do układu przez wlot powietrza. Potrząsaj z prędkością 10 obr./min przez 20 sekund.
      2. Delikatnie pipetuj zawieszenie kołasek dwukrotnie, a potem potrząsaj z 10 obr./min przez 20 sekund. Powtórz ten krok raz.
      3. Wyjmij zawieszenie kulek z kodem kreskowym z wylotu, dodaj 200 μL 20x TE (pH = 7,5) i 50 mM roztworu DTT, a następnie wyjmij płyn z wylotu. Powtórz ten krok dwa razy, co daje łącznie trzy prania.
    3. Liza komórek i przechwytywanie mRNA
      1. Powoli dodawaj 200 μL bufora lizy komórek do układu przez wlot. Bezpośrednio po tym powoli dodaj 200 μL oleju mineralnego, aby uszczelnić podwójne odwierty.
        UWAGA: Uszczelnienie musi nastąpić natychmiast, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
      2. Usuń roztwór wypływający z wylotu chipu do zbiornika odpadów. Umieść chip poziomo i pozostawij go w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Odzyskiwanie koralików z kodem kreskowym
      1. Po lizie powoli dodaj 200 μL 6x SSC przez wlot, usuń ciecz odpadową i zasysaj pozostały roztwór z wylotu chipu.
      2. Powoli dodawaj 200 μL 6x SSC, aby napełnić chip. Trzymaj magnes blisko powierzchni chipu i powoli przesuwaj go od wlotu do gniazda, aby zebrać kulki z kodami kreskowymi z otworów chwytających. Następnie szybko wciągnij roztwór oraz kulki z kodem kreskowym z chipa do rurki wirówki z 6x SSC.
      3. Przepłukaj trzy razy 200 μL 6x SSC, a następnie raz 1x buforem RT (patrz Tabela materiałów).
  3. Transkrypcja odwrotna (RT), leczenie egzonukleazą I oraz PCR
    1. RT
      1. Ponownie zawiesić kulki z kodem kreskowym w 100 μL mieszanki reakcji odwrotnej transkrypcji, zawierającej 1× bufor RT, 1 mM GTP, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 2,5 μM Template Switch oligo (patrz Tabela materiałów), 1 inhibitor RNazy U/μL oraz 10 U/μL transkryptoazy odwróconej. Inkubuj roztwór w 42 °C przez 120 minut.
    2. Leczenie egzonukleazy
      1. Po odwrotnej transkrypcji należy przeprać koraliki raz 200 μL 1x TE-SDS (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% SDS), raz 200 μL 1x TE-TW i raz 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Ponownie zawiesij kulki w 100 μL mieszanki egzonukleazy, zawierającej 1x bufor egzonukleazy I i 1 U/μL Eksonukleazy I, i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
    3. Synteza drugiej nici
      1. Umyj kulki raz z 200 μL 1x TE-SDS. Ponownie zawiesić kulki w 200 μL 0,1 M NaOH i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z rotacją 30 obr./min, aby denaturować produkt hybrydowy mRNA-cDNA. Następnie myje koraliki raz 200 μL 1x TE-TW i raz 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Ponownie zawiesij kulki w 100 μL mieszanki reakcyjnej, zawierającej 1x bufor RT, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 0,5 μM podkładu syntezy drugiej struny (patrz Tabela materiałów) oraz 0,125 U/μL fragmentu Klenowa. Inkubuj roztwór w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
    4. amplifikacja cDNA
      1. Należy przeprać kulki raz 200 μL 1x TE-SDS, raz 200 μL 1x TE-TW oraz raz 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Ponownie zawiesij kulki w 150 μL mieszanki PCR, w tym 1x mieszanki reakcji PCR i 0,8 μM oligo ISPCR (patrz Tabela materiałów). Ustaw program PCR następująco: 95 °C przez 3 minuty; cztery cykle: 98 °C przez 20 s, 65 °C przez 30 s i 72 °C przez 3 minuty; osiem cykli: 98 °C przez 20 s, 67 °C przez 20 s i 72 °C przez 3 minuty; 72 °C przez 5 minut.
      3. Dwukrotnie oczyść produkt PCR za pomocą 0,6x kulek magnetycznych Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) do oczyszczenia DNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluować 20,5 μLH2O. Zmierzyć stężenie oczyszczonego produktu PCR za pomocą fluorescencyjnego testu ilościowego DNA.
      4. Wykonaj drugą amplifikację oczyszczonego produktu PCR przy użyciu mieszanki PCR zawierającej 1x mieszankę reakcji PCR oraz 0,8 μM oligo ISPCR (patrz Tabela materiałów). Ustaw program PCR następująco: 98 °C przez 3 minuty; pięć cykli: 98 °C przez 20 s, 67 °C przez 20 s i 72 °C przez 3 minuty; 72 °C przez 5 minut.
      5. Dwukrotnie oczyść produkt PCR za pomocą 0,6x kulek magnetycznych SPRI do oczyszczenia DNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluować 20,5 μLH2O. Zmierz stężenie oczyszczonego produktu PCR za pomocą fluorescencyjnego testu ilościowego DNA23.
    5. Konstrukcja biblioteki cDNA
      1. Zbuduj bibliotekę ze standardowym zestawem do przygotowania biblioteki DNA (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Wzmocnić bibliotekę za pomocą PCR za pomocą pary primerów N70X / P5 (patrz Tabela Uzupełniająca). Ustaw program PCR następująco: 72 °C przez 3 minuty; 98 °C przez 30 s; dwanaście cykli: 98 °C przez 15 s, 58 °C przez 30 s i 72 °C przez 3 minuty; 72 °C przez 5 minut.
      3. Oczyść bibliotekę 0,6x kulkami magnetycznymi SPRI do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluować 20 μLH2O. Zmierzyć stężenie oczyszczonego produktu PCR za pomocą fluorescencyjnego testu ilościowego DNA.
        UWAGA: Zazwyczaj końcowe stężenie biblioteki DNA ≥ 2 ng/μL i całkowita ilość ≥ 50 ng jest akceptowalne24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montaż i zwolnienie interfejsu rejestrującego CTC można ocenić za pomocą mikroskopii. Równomierny rozkład kulek magnetycznych (MB) na dole układu HB pod wpływem pola magnetycznego wskazuje na pomyślny montaż, natomiast minimalne lub żadne pozostałe MB potwierdzają pomyślne zwolnienie (rysunek 2C). Ten etap jest kluczowy dla określenia wydajności i czystości przechwyconych CTC. Aby zweryfikować efektywność przechwytywania chipa izolacyjnego CTC, przeprowadziliśmy eksperyment spike-in. Niewielka liczba komórek nowotworowych o wysokiej ekspresji EpCAM (PC3 lub LNCaP) została wpompowana do PBS zawierającego dużą populację komórek Jurkat, które wykazują niską ekspresję EpCAM, symulując obecność obfitości komórek krwi w krążeniu. Chip izolacyjny CTC skutecznie wychwytywał komórki nowotworowe zarówno z próbek 1 mL, jak i 10 mL, demonstrując swoją wysoką przepustowość i efektywną zdolność sortowania CTC (rysunek 2D). Aby ocenić specyficzność przechwytywania opartego na IMB, użyliśmy chipu sterującego zmodyfikowanego SA-MB pozbawionym konjugacji przeciwciał EpCAM. Brak istotnego wychwytu komórek nowotworowych potwierdził specyficzność izolacji CTC podleganej IMB (Rysunek 2D).

Oprócz efektywności przechwytywania, czystość jest kolejnym kluczowym parametrem przy ocenie platform izolacji CTC. Porównaliśmy czystość komórek nowotworowych wyizolowanych za pomocą chipu capture lub samego chipa oczyszczającego, a także czystość uzyskaną poprzez sekwencyjną selekcję pozytywną i negatywną (Rysunek 2E). Oba układy znacząco poprawiły czystość komórek nowotworowych w porównaniu z grupą kontrolną, wykazując skuteczność w izolowaniu CTC. Co ważniejsze, połączone użycie selekcji pozytywnej i negatywnej dodatkowo zwiększyło czystość i wydajność komórek nowotworowych w porównaniu z użyciem jednej metody.

Aby dokładniej ocenić wydajność chipów do przechwytywania i sortowania CTC w warunkach klinicznych, pobraliśmy próbki krwi obwodowej (PB) od sześciu zdrowych dawców i przeprowadziliśmy eksperymenty z napięciem impulsów. Ze względu na niezwykle niską zawartość CTC w próbkach klinicznych, do każdej 10 mL próbki PB wszczepiono około 500-1000 komórek LNCaP. Liczba białych krwinek we wszystkich pobranych próbkach PB mieściła się w normie (4-10 × 106 komórek/mL). Wyniki wykazały, że system sortowania CTC zachowywał wysoką efektywność wychwytywania i czystość komórek nowotworowych, nawet podczas przetwarzania próbek klinicznych (rysunek 2F-G oraz Ilustracja uzupełniająca 2).

figure-results-1
Rysunek 2: Platforma do przechwytywania i oczyszczania CTC o strukturze jodełkowej. (A) Przepływ pracy układu izolacyjnego CTC. Po pierwsze, stabilne pole magnetyczne oraz IMB sprzężone z przeciwciałami EpCAM tworzą interfejs przechwytu. Następnie mieszanie wirów wewnątrz układu HB zwiększa efektywność transferu masy między CTC a IMB, ułatwiając zgromadzone przechwyty. Na koniec delikatne uwalnianie CTC osiąga się poprzez usunięcie pola magnetycznego. (B) Przepływ pracy układu oczyszczającego CTC. Chip HB jest modyfikowany za pomocą przeciwciał selekcyjnych ujemnych, a mieszanie wirów dodatkowo ułatwia interakcje leukocytów z przeciwciałami, co ostatecznie prowadzi do wysoko oczyszczonych CTC. Skala, 100 μm. (C) Obrazowanie mikroskopowe pokazuje pomyślne złożenie i uwolnienie chipa przechwytującego. (D) Wykresy słupkowe porównują wydajność przechwytywania CTC platformy izolacyjnej na różnych woluminach próbek, wykorzystując niefunkcjonalizowane SA-MB jako kontrolę. Paski błędu, średnia ± SD, n = 3. (E) Wykresy słupkowe porównują czystość CTC uzyskanych wyłącznie przy użyciu jednego chipu HB z tymi poddawanymi sekwencyjnemu przechwytywaniu i oczyszczaniu. Grupa kontrolna reprezentuje nieleczoną czystość CTC. Paski błędu, średnia ± SD, n=3. (F) Identyfikacja komórek w chipie izolacyjnym CTC. Komórki LNCaP były barwione Hoechstem i Kalceiną AM, natomiast komórki krwi barwiono wyłącznie Hoechstem. Skala, 100 μm. (G) Czystość komórek nowotworowych i efektywność wychwytywania w eksperymentach z wykorzystującymi 1 mL lub 10 mL krwi obwodowej. Paski błędu, średnia ± SD, n = 3. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Izolowane komórki nowotworowe zostały następnie poddane sekwencjonowaniu pojedynczych komórek o wysokiej przepustowości. Nasz protokół zawiera system kodowania kreskowego z pojedynczą komórką, składający się z 60 000 zagnieżdżonych mikrodołków (Rysunek 3A-B). Dolne, kwadratowe mikrodoły służą do przechwytywania pojedynczych komórek, podczas gdy górne mikrootwory są zaprojektowane do załadunku kulek. Każda dolna mikrodołka ma długość i wysokość 25 μm, co jest odpowiednie dla większości typów komórek. Górne sześciokątne studnie mają wyryte średnice okręgu i wysokość 50 μm, aby pomieścić kulki zwykle w zakresie od 30 do 50 μm. System zwiększa efektywność przechwytywania komórek dzięki kumulatywnemu przechwytywaniu, jednocześnie unikając podwójnych komórek dzięki mikrodołkom wykluczającym rozmiar. Aby zoptymalizować protokół ładowania komórek, zbadaliśmy efektywność przechwytywania komórek oraz stosunek zajętości mikrostudni w różnych warunkach wejściowych komórek (Rysunek 3C). Wyniki wykazały, że zwiększenie wejścia komórki nie zmniejsza efektywności przechwytywania; zamiast tego znacząco podnosiło wskaźnik zajętości. W przypadku chipa przechwytującego 60 000 otworów wskaźnik obsadzenia mikrodołków ustabilizował się, gdy wejście komórki osiągnęło 80 000, nie wykazując dalszego wzrostu przy kolejnych wejściach. Aby zminimalizować występowanie dubletów spowodowanych nadmiernym obciążeniem ogniw, wybraliśmy 80 000 ogniw jako optymalny wejście. Jak pokazano na Rysunku 3D, układ kodowania kreskowego z pojedynczą komórką osiągnął 85,6% obsadzeności komórek i 95,7% z kodem kreskowym, co dało wskaźnik parowania na poziomie 81,9%. Dodatkowo, wielokrotne usadzenia przeprowadzano zgodnie z protokołem, co znacząco poprawiło efektywność przechwytywania i szybkość parowania dzięki kumulatywnemu efektowi przechwytywania (Rysunek 3D). Warto zauważyć, że zaobserwowana różnica w stosunku zajmowania między komórkami a kulkami wynika z większej gęstości i masy kulek w porównaniu do komórek, co pozwala im efektywniej osiadać w mikrodołkach pod wpływem grawitacji. Dlatego przy optymalnych warunkach obciążenia idealna jest obecność pary na poziomie około 80%.

figure-results-2
Rysunek 3: Technologia kodowania kreskowego i sekwencjonowania oparta na mikrostudniach o wysokiej przepustowości pojedynczych komórek. (A) Przepływ protokołu sekwencjonowania pojedynczego CTC. (B) Mikrokopia demonstruje mikrofluidyczne struktury odchłaniające kulki z pojedynczą komórką/kodem kreskowym. Procesy wychwytywania komórek, przechwytywania koralików i odzyskiwania kulek są pokazane od lewej do prawej. Wykresy liniowe skali 30 μm. (C) ilustrują efektywność przechwytywania komórek oraz stosunek obsadzenia mikrootworów w pojedynczej komórki (60000 podwójnych studni) w różnych warunkach wejściowych komórek. (D) Wskaźniki obsadzenia komórek i kulek z kodami kreskowymi w optymalnych warunkach wejściowych komórek, wraz z odpowiednim stosunkiem parowania komórek i kulek. Lewy i prawy panel pokazują podejście do przechwytywania z wykorzystaniem wielu prób osiadania i tylko pojedynczego osiadania. Paski błędu, średnia ± SD, n = 3. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Na koniec, aby zweryfikować zintegrowany protokół sortowania CTC i scRNA-seq, wymieszaliśmy komórki PC3, LNCaP i Jurkat w szacowanym stosunku 1:3:4000 i załadowaliśmy je na mikrofluidyczne układy do wychwytywania komórek nowotworowych, oczyszczania i sekwencjonowania pojedynczych komórek. Dzięki wydajnej platformie izolacji komórek nowotworowych uzyskaliśmy wysoce czyste komórki nowotworowe pozytywne na EpCAM (Rysunek 4B). Równocześnie chip scRNA-seq oparty na mikrofluidyce wykazał precyzyjną zdolność profilowania typu komórki, a wyniki zostały zwizualizowane za pomocą analizy t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) (Rysunek 4A). Udało nam się zidentyfikować trzy odrębne populacje komórek, z których każdą można było wyróżnić unikalnymi markerami (rysunek 4C). Ponadto proporcje komórek w końcowym wyjściu były bardzo podobne proporcjom oczyszczonego wejścia, co potwierdza, że proces kodowania kreskowego w pojedynczych komórkach był bezstronny i wolny od zanieczyszczeń (rysunek 4B). Jeden klaster został zidentyfikowany jako komórki Jurkat na podstawie specyficznej ekspresji TRBC1, IGLL1, CD1E i CD3D (rysunek 4D). Analiza wzbogacenia szlaku dodatkowo potwierdziła odporność tej klasyfikacji (rysunek 4E). Ponadto dwie linie komórkowe raka prostaty były wyraźnie rozdzielone na pojedyncze skupiska zgodnie z genami różnicowo ekspresyjnymi (DEG) (Rysunek 4F-G). Klaster PC3 charakteryzował się wysoką ekspresją mikroseminoproteiny (MSMP), znanej również jako mikrobiałko wydzielane przez PC3. Z kolei klaster LNCaP unikalnie wyrażał markery związane z adhezją, proliferacją i pluripotentnością komórek, takie jak NEDD4, CTNNA1 (α-katenina1) oraz RBBP7.

figure-results-3
Rysunek 4: Walidacja sortowania CTC i sekwencjonowania pojedynczych komórek za pomocą eksperymentu spike-in. (A) Wykres t-SNE pokazujący profilowanie typów komórek przechwyconych i oczyszczonych. (B) Wykres słupkowy przedstawiający proporcje trzech typów komórek na trzech etapach: początkowe wejście, post-oczyszczenie oraz końcowe sekwencjonowanie. (C) Wykres skalny ilustrujący ekspresję unikalnych genów markerowych w różnych klastrach komórek. (D) Poziomy ekspresji TRBC1, IGLL1, CD1E i CD3D we wszystkich komórkach. (E) Analiza wzbogacenia szlaków GO i KEGG genów o różnicowej ekspresji (DEG) w klastrze Jurkat. (F) Wzorce ekspresji NEDD4 i MSMP we wszystkich komórkach. (G) wykres wulkanów pokazujący DEG między klastrami PC3 i LNCaP. Czerwone kropki reprezentują geny zwykłe w PC3; niebieskie kropki oznaczają te zwykłe w LNCaP. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Master mixOdczynnikOstateczne rozcieńczenieTyp bufora
0,5% F-68F-680.50%Woda uzdatniana DEPC
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH=8,0)10 mMWoda uzdatniana DEPC
EDTA1 mM
Tween-200.01%
20× TE (pH=7,5)Tris-HCl (pH=7,5)200 mMWoda uzdatniana DEPC
EDTA20 mM
TE-SDSTris-HCl (pH=8,0)10 mMWoda uzdatniana DEPC
EDTA1 mM
SDS0.50%

Tabela 1: Skład mieszanki odczynników do przygotowania sekwencjonowania pojedynczych CTC. Pokazano części odczynników potrzebnych do scRNA-seq, które można przygotować przed operacją układu, aby zapewnić szybki i płynny proces.

Ilustracja uzupełniająca 1: Projekt układu HB. (A) Schematyczny diagram dwuwarstwowej struktury mikrofluidycznej. Góra: Wierzchnia warstwa z strukturą jodełki. Powiększona wstawka przedstawia szczegółową geometrię jodełki, która jest zorientowana pod kątem 45° względem ściany kanału, o szerokości rowka 100 μm i rozchyleniu 200 μm. Dolna warstwa: Dolna warstwa składająca się z układu filarów nośnych (28 kolumn × 7 rzędów), ponumerowanych od #1 do #28 wzdłuż kierunku przepływu. (B) Widok z boku na odcinek z jodełki. Rowki w kształcie jodełki mają szerokość 100 μm. Wysokość zarówno struktur jodełkich, jak i filarów nośnych wynosi 50 μm. (C) Widok z góry na odłam jodełki. Każdy filar nośny ma wymiary 500 μm szerokości i 1150 μm długości, z przerwą 550 μm między sąsiednimi filarami. (D) Fotografia wykonanego układu HB. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 2: Reprezentatywny obraz pokazujący fluorescencyjnie barwione komórki nowotworowe oraz krwi obecne w płynie odpadowym zebranym z wylotu chipa izolacyjnego CTC. Komórki LNCaP były barwione Hoechstem i Kalceiną AM, natomiast komórki krwi barwiono wyłącznie Hoechstem. Skala 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca: Sekwencje oligonukleotydów stosowane w transkrypcji odwrotnej i przygotowaniu bibliotecznym Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTC stanowią cenne biomarkery w diagnozie nowotworów, wytycznych leczenia oraz badaniach dotyczących inicjacji, postępu i przerzutów guza25. Jednak istniejące metody izolacji CTC nie osiągają ani wysokiej wydajności, ani wysokiej przepustowości26. Dodatkowo, niska wydajność uwalniania CTC często skutkuje niską czystością i wysokim uszkodzeniem komórek, co ogranicza ich kompatybilność z analizami dalszymi27. Zaproponowaliśmy tutaj zintegrowany protokół do sortowania CTC o wysokiej przepustowości oraz sekwencjonowania pojedynczych CTC, składający się z trzech głównych procedur: przechwytywania CTC, oczyszczania oraz scRNA-seq.

Ta platforma oparta na mikrofluidyce oferuje elastyczność i skalowalność. Liczba równoległych kanałów w układach HB, a także studni przechwytujących w chipie kodowania kreskowego, może być dostosowywane do różnych wymagań próbkowych, co pozwala na wysokie wymagania przepustowości. W chipie przechwytującym CTC IMB można optymalizować zgodnie z konkretnym typem nowotworu. Na przykład w próbkach pacjentów z rakiem prostaty IMB można funkcjonalizować za pomocą koktajlu przeciwciał EpCAM i PSMA, aby zwiększyć efektywność wychwytywania. Co więcej, poleganie wyłącznie na wychwytywaniu opartym na EpCAM może prowadzić do utraty mezenchymalnych CTC, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Aby rozwiązać ten problem, można włączyć dodatkowe przeciwciała przeciwko białku szoku cieplnego 70 (HSP-70) lub wimentynie powierzchniowej komórki (CSV), które wychwytują CTC na różnych etapach EMT.

Ponieważ układy HB do wychwytywania i oczyszczania CTC opierają się na mikrofluidyce, ostrożne obchodzenie się z nimi jest niezbędne podczas eksperymentów. Przed wprowadzeniem odczynników do wlotu chipu należy usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, a zarówno wlot, jak i wylot mogą zostać uszczelnione, aby wyeliminować uwięzione powietrze. Dodatkowo odczynniki powinny być wprowadzane szybko (w ciągu 1-2 sekund), ponieważ uwięzione pęcherzyki powietrza mogą utrudniać przepływ IMB i komórek, co znacząco obniża efektywność wychwytywania i czystość. Ponadto, jak wspomniano wcześniej, jednolity rozkład IMB jest kluczowy dla skutecznego przejęcia CTC. Po załadowaniu IMB układ musi być umieszczony pionowo na magnesie i zamocowany na co najmniej pięć minut, aby zapobiec zakłóceniu rozkładu IMB w polu magnetycznym. Warto zauważyć, że przepływ obciążenia komórki określony w protokole powinien być optymalizowany w zależności od różnych typów próbek. Na przykład próbki leukopaku wykazują podwyższone stężenie i lepkość leukocytów. Jeśli przepływ jest zbyt wysoki, może to utrudniać efektywne interakcje między CTC a IMB, zapobiegając akumulacji magnetycznej i tym samym zmniejszając czystość CTC. Aby ocenić skuteczność naszej platformy izolacji i oczyszczania CTC w przetwarzaniu próbek krwi klinicznej, pobraliśmy PB od kilku zdrowych dawców i wprowadziliśmy do próbek niewielką liczbę komórek LNCaP (około 50-100 komórek na mL). Co istotne, mimo że platforma wykazała wysoką efektywność wychwytywania i czystość komórek nowotworowych w próbkach PB, jej wydajność była nieco niższa niż w próbkach komórek opartych na PBS (Rysunek 2D, Rysunek 2E i Rysunek 2G). Przypuszczamy, że ta rozbieżność wynika z wyższej lepkości krwi oraz obfitości czerwonych krwinek i płytek krwi w porównaniu do PBS. Dlatego przy obsłudze próbek krwi klinicznej można rozważyć kroki przedlecznicze, takie jak liza krwinek czerwonych czy ekstrakcja PBMC, aby poprawić wydajność.

Podobnie jak układy HB, mikrofluidyczny układ kodowania kreskowego z pojedynczą komórką wymaga ostrożnego obchodzenia, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Biorąc pod uwagę różnorodność użytych odczynników, niektóre odczynniki można przygotować przed rozpoczęciem operacji chipowych (Tabela 1). Podczas ładowania komórek i kulek konieczna jest ścisła kontrola prędkości wstrzykiwania, aby zapewnić równomierny rozkład, ponieważ komórki mają niższą gęstość, a kulki z kodami kreskowymi są gęstsze. Zazwyczaj zawieszenie ogniwa powinno być dodawane powoli przez 3~5 s, a następnie szybkie dodawanie zawieszenia kulek w ciągu 1~2 s. Po załadowaniu komórek i kulek wykonaj dwie rundy aspiracji i dozowania, a następnie umieść chip na shakerze, aby zakończyć proces kumulacyjnego wychwytu. Ten krok jest kluczowy dla poprawy wskaźnika obłożenia i liczby par. Podczas lizy komórek stosuje się metodę uszczelniania olejem do izolacji powierzchni mikrootworów, zapobiegając krzyżowemu zanieczyszczeniu między odwiertami. Warto zauważyć, że olej mineralny powinien być dodawany natychmiast po lizie, bez opóźnień. Po lizie odzyskiwanie kulek z kodem kreskowym odbywa się poprzez powolne przesuwanie magnesu od wlotu do wylotu, aby zapewnić wysoką szybkość odzyskiwania kulek. W razie potrzeby ten krok można powtórzyć wielokrotnie. Na koniec odzyskane kulki magnetyczne w rurze wirówki poddawane są RT, syntezie drugiego włókna, wzmacnianiu PCR i konstrukcji bibliotecznej, a następnie następuje sekwencjonowanie nowej generacji (NGS).

Ta zintegrowana platforma mikrofluidyczna niesie ze sobą znaczący potencjał do zastosowań klinicznych. Poprzez zwiększenie efektywności i przepustowości izolacji CTC, zwiększa wykrywalność CTC na niskich etapach obciążenia guza, umożliwiając ustanowienie modelu klasyfikacji łączącego liczbę CTC z etapem guza. Ten postęp oferuje nowatorskie podejście do diagnozowania nowotworów, monitorowania leczenia, oceny rokowania oraz przewidywania nawrotów. Dodatkowo, analiza transkryptomii pojedynczych komórek CTC umożliwia identyfikację kluczowych cech molekularnych, w tym kluczowych szlaków genowych, sieci interakcji oraz genów biomarkerów. Analiza ta dostarcza wglądu w kluczowe czynniki wpływające na wczesne przerzuty nowotworowe i ujawnia molekularne mechanizmy powstawania zmian przerzutowych, oferując potencjalne cele terapeutyczne dla pacjentów z nawrotem lub przerzutami nowotworowymi. Co więcej, ta platforma jest bardzo skalowalna. Może być dostosowany do specyficznych wymagań analitycznych i rozszerzany o wsparcie analiz multi-omicznych, w tym transkryptomiki i genomiki.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Merkaptopropyl) trimetyksysilan  Sigma Aldrich175617-100GRozwiązanie MPTS
20& razy; Bufor SSCSangon BiotechB548109-0200
5& razy; Bufor RTSangon BiotechB610020-0500
Biotynowo biotynylowane przeciwciało monoklonalne CD45eBioscience13-0459-82Przechowywanie w odległości 2 stopni; C do 8 stopni; C 
Biotinylowane przeciwciało monoklonalne EpCAMeBioscience13-9326-82Przechowywanie w odległości 2 stopni; C do 8 stopni; C 
Albumina surowicy bydła (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Przechowywanie w odległości 2 stopni; C do 8 stopni; C 
Układ kartriżowy DECODERDynamiczne Biosystemy2203106Przechowywanie w odległości 2 stopni; C do 8 stopni; C 
Zestawy odczynników do wkładów DECODERDynamiczne Biosystemy2203206Przechowywanie w odległości 2 stopni; C do 8 stopni; C 
Woda uzdatniana DEPCSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Zawiera: NaCl 136,89 mM; KCl 2,67 mM; Na2HPO4 8,10 mM; KH2PO4 1,47 mM. pH=7,2-7,4 
DTTThermo ScientificR0861Przechowywanie w odległości 2 stopni; C do 8 stopni; C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MB, 1 μ m
EDTASangon BiotechB540625-05000,5 M, pH=8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012& razy; Mieszanka reakcji PCR
Opadnięcie chlorku litu Soln.InvitrogenAM94800,2 & mikro; m filtrowany
N-γ-maleimidobutyryl-oksysukcynimidowe esterThermo Scientific22309Rozwiązanie GMBS
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Qubit 1& razy; Zestaw do testów dsDNA HSThermo ScientificQ33231
Rozwiązanie SDSSangon BiotechB648118-010010% SDS
StreptawidynaSigma Aldrich189730Przechowywanie w odległości 2 stopni; C do 8 stopni; C 
Fotorezysta SU-8MikrochemiaSU-8 3050
Zestaw silikonowy SYLGARD 184Dow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7,5)LEAGENENR00721 mol/L, pH=7,5, wolne od RNaz
Tris-HCl (pH 8,0)LEAGENENR00731 mol/L, pH=8,0, wolna od Rnazy
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Trueprep DNA Library Prep Kit V2 dla Illumina  VazymeTD502Zestaw do przygotowania biblioteki DNA
Tween-20Sangon BiotechA600560-0500
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411Kulki magnetyczne z odwracalną imobilizacją w fazie stałej (SPRI) do oczyszczania DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).">Gerstberger, S., Jiang, Q., Ganesh, K. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).
  2. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).">Heller, G., et al. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).
  3. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).">Heitzer, E., Speicher, M. R. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).
  4. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).">Bidard, F. C., et al. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).
  5. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).">Chang, K., et al. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).
  6. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).">Grisanti, S., et al. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).
  7. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).">Underwood, J. J., et al. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).
  8. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).">Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).
  9. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).">De Bono, J. S., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  10. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).">Tsao, S. C., et al. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).
  11. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).">Lu, C., et al. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).
  12. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).">Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).
  13. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).">Xu, Y., Chen, B., He, M., Cui, Z., Hu, B. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).
  14. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).">Reza, K. K., et al. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).
  15. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).">Mohamadi, R. M., et al. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).
  16. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).">Levitin, H. M., Yuan, J., Sims, P. A. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).
  17. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).">Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  18. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).">Miyamoto, D. T., et al. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  19. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).">Kojima, M., et al. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).
  20. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).">Chauhan, A., et al. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).
  21. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).">Yu, H., Yang, C., Tai, Q., Gao, M., Zhang, X. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).
  22. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).">Cheng, Y. H., et al. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).
  23. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).">Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  24. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).">Ikeda, H., et al. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).
  25. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).">Yang, Y. P., Giret, T. M., Cote, R. J. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).
  26. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).">Deng, Z., Wu, S., Wang, Y., Shi, D. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).
  27. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).">Wu, L., et al. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating Tumor CellsMicrofluidic CTC IsolationSingle Cell SequencingLiquid BiopsyImmunomagnetic BeadsTumor Cell PurificationBarcoded MicrobeadsNegative SelectionHerringbone ChipPrecision Oncology

Related Articles