Artykuł metodologiczny

Multimodalna metabolomika przestrzenna z obrazowaniem spektrometrii mas pod mikroskopem średniej podczerwieni

DOI:

10.3791/68709

⸱

25 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Shanghai Xuhui Central Hospital, Zhongshan-Xuhui Hospital, 3Children's Hospital of Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy multimodalny przepływ pracy metabolomiki przestrzennej, który integruje obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) i obrazowanie w średniej podczerwieni (MIR) na tym samym wycinku tkanki w celu przestrzennie rozdzielczej analizy metabolicznej i biochemicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomika przestrzenna to szybko rozwijająca się dziedzina do mapowania rozkładu metabolitów w tkankach, organach, a nawet pojedynczych komórkach. Takie podejście dostarcza kontekstowych informacji metabolicznych, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia biochemicznej heterogeniczności systemów biologicznych. Obrazowanie w średniej podczerwieni (MIR) i obrazowanie za pomocą spektrometrii mas (MSI) okazały się potężnymi metodami metabolomiki przestrzennej, z których każde oferuje unikalne i uzupełniające się korzyści. W tym badaniu przedstawiono przebieg pracy do wykonywania obrazowania MIR i jonizacji MSI Z DESORPCJĄ LASEROWĄ WSPOMAGANĄ MATRYCĄ (MALDI-MSI) na tym samym przekroju tkanki, obejmujący procedury eksperymentalne, korejestrację obrazowania, integrację danych i analizę bioinformatyczną. Obrazowanie MIR jest stosowane jako metoda wstępna, pozwalająca na nieniszczącą analizę biochemiczną tkanek. Następnie w tkance deponowana jest matryca dla MALDI-MSI, kierując się informacjami przestrzennymi uzyskanymi z obrazowania MIR. Obrazy są integrowane po wspólnej rejestracji, co umożliwia multimodalną analizę metabolomiki przestrzennej przy użyciu zaawansowanych narzędzi bioinformatycznych, takich jak Seurat. Integracja obrazowania MIR i MSI stanowi przełomowy postęp w metabolomice przestrzennej, oferując bezprecedensowe możliwości badania przestrzennej i chemicznej złożoności procesów metabolicznych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. To multimodalne podejście ma znaczny potencjał w zakresie napędzania innowacji w zakresie odkrywania biomarkerów, diagnostyki chorób i opracowywania terapii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomika przestrzenna polega na mapowaniu metabolitów w ich natywnym kontekście tkankowym poprzez integrację obrazowania spektrometrii mas (MSI) lub innych technik rozdzielczości przestrzennej z analizą metaboliczną, oferując wgląd w metabolizm w rozdzielczości subtkankowej, komórkowej lub subkomórkowej1,2,3,4,5,6,7,8. Wśród tych metod obrazowania, mikroskopia w średniej podczerwieni (MIR) zyskuje coraz większe zainteresowanie ze względu na jej zdolność do chemicznego mapowania biomolekuł w oparciu o kontrast wibracyjny molekularny4,7,9,10,11,12. Nieniszcząca, wolna od etykiet, szybka i ekonomiczna natura4,7,9,10,11,12 sprawia, że obrazowanie MIR szczególnie dobrze nadaje się do integracji z MSI, tworząc obiecujące multimodalne podejście do kompleksowej analizy przestrzennej.

Jonizacja laserowa wspomagana matrycą MSI (MALDI-MSI) jest jedną z najczęściej stosowanych technik w metabolomice przestrzennej (Rysunek 1A)13. Umożliwia wykrywanie szerokiego zakresu metabolitów, w tym lipidów, aminokwasów, cukrów, nukleotydów i metabolitów wtórnych, z wysoką czułością1. Postępy w selekcji matryc (np. kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy [DHB], 9-aminoakrydyna [9AA] lub dichlorowodorek N- (1-naftylo)etylenodiaminy [NEDC]) i techniki jonizacji (np. metody post-jonizacji) jeszcze bardziej rozszerzyły zakres wykrywania, szczególnie w przypadku gatunków o niskiej liczebności i słabo jonizowalnych14. Nowoczesne systemy MALDI-MSI obsługują prędkości obrazowania zwykle w zakresie od 5 do 50 pikseli na sekundę, w zależności od rozdzielczości przestrzennej i typu użytego analizatora masy (np. time-of-flight [TOF], Orbitrap lub rezonans cyklotronowy jonów z transformacją Fouriera [FT-IRC]). Warto zauważyć, że szybkie instrumenty MALDI-TOF osiągnęły szybkość przekraczającą 100 pikseli na sekundę, umożliwiając obrazowanie dużego obszaru w ciągu kilku godzin15. Rozdzielczość przestrzenna MALDI-MSI zazwyczaj mieści się w zakresie od 5 do 50 μm, co wystarcza do rozróżnienia struktur komórkowych, a nawet subkomórkowych16,17. Jednak wyższa rozdzielczość przestrzenna zwykle odbywa się kosztem dłuższego czasu akwizycji, zmniejszonego stosunku sygnału do szumu i większych wymagań obliczeniowych podczas przetwarzania danych.

W przeciwieństwie do MSI, obrazowanie MIR jest podejściem optycznym o szerokim polu widzenia4, co czyni je z natury nieniszczącym i o wysokiej przepustowości. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie kwantowych laserów kaskadowych o dużej mocy (QCL) umożliwiają nową strukturę znaną jako obrazowanie w podczerwieni o dyskretnej częstotliwości (DFIR), która znacznie zwiększa prędkość obrazowania aż do szybkości wideo (Rysunek 1B)12,18. Dodatkowo, źródła QCL sprawiły, że niechłodzone detektory mikrobolometryczne są opłacalne do obrazowania MIR, umożliwiając korzystanie z detektorów z większą matrycą płaszczyzny ogniskowej (FPA)12. W rezultacie, jednoczęstotliwościowy obraz MIR na obszarze 1cm2 może być uzyskany z rozdzielczością komórkową (~5 μm) w ciągu zaledwie kilku sekund. Obrazowanie MIR może działać zarówno w trybie bezetykietowym, jak i opisanym. W poprzednich badaniach4,19,20, wprowadzono małe sondy wibracyjne aktywne w podczerwieni do monitorowania kinetyki różnych aktywności metabolicznych in situ. Sondy te umożliwiają śledzenie szlaków metabolicznych w czasie rzeczywistym poprzez raportowanie globalnych przemian chemicznych za pomocą unikalnych pasm spektralnych MIR4. W ten sposób obrazowanie MIR zapewnia zarówno statyczne profilowanie biochemiczne, jak i dynamiczne monitorowanie metaboliczne z wysoką rozdzielczością przestrzenną i dużą szybkością akwizycji.

W tym manuskrypcie wprowadzamy kompleksowy przepływ pracy do przeprowadzania metabolomiki przestrzennej MALDI-MSI pod kontrolą MIR, demonstrując możliwość nabycia obu modalności z tego samego próbki (Rysunek 2, Rysunek 3). Integrując obrazowanie MIR z MSI, ustanawiamy podejście multimodalne, które wykorzystuje uzupełniające się mocne strony każdej techniki. Obrazowanie MIR oferuje szybkie, bezznacznikowe mapowanie biochemiczne całego szkiełka w rozdzielczości komórkowej, służąc jako cenny przewodnik przy wyborze regionu zainteresowania (ROI) w późniejszym pozyskiwaniu MSI. Strategia ta umożliwia bardziej ukierunkowany i wydajny przepływ pracy MSI, skracając czas i koszty pozyskiwania, jednocześnie zwiększając interpretowalność i znaczenie biologiczne przestrzennych danych metabolomicznych. Z kolei MSI zapewnia bardzo szczegółowe adnotacje molekularne obrazów hiperspektralnych MIR, umożliwiając głębsze zrozumienie biochemii tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, to zintegrowane podejście ma ogromny potencjał w zakresie postępów w odkrywaniu biomarkerów, diagnostyce chorób i opracowywaniu terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został przeprowadzony zgodnie z protokołem eksperymentalnym na zwierzętach (DSF-2024-004) zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Fudan.

UWAGA: To badanie zapewnia przepływ pracy do wykonywania obrazowania MIR i MALDI-MSI na tym samym wycinku tkanki. To zintegrowane podejście obejmuje procedury eksperymentalne, korejestrację obrazów, fuzję danych i dalszą analizę bioinformatyczną (Rysunek 1C). Obrazowanie MIR jest wykorzystywane jako metoda poprzedzająca, umożliwiająca nieniszczące, bezznacznikowe mapowanie biochemiczne tkanki. Kierując się informacjami przestrzennymi z obrazowania MIR, matryca jest następnie stosowana do akwizycji MALDI-MSI. Po precyzyjnej korejestracji zestawy danych są integrowane w celu wielowymiarowej analizy współanalitycznej (Rysunek 4), umożliwiając kompleksową metabolomikę przestrzenną dzięki zaawansowanym narzędziom obliczeniowym.

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie próbki tkanki
    1. Pobieranie tkanek myszy
      1. Myszy hodowlane C57BL/6J (20 tygodni, 40 g) w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF), utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i zapewnione ad libitum dostępu do pożywienia i wody w celu zapewnienia optymalnego zdrowia przed eksperymentem.
      2. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w dawce 50 mg/kg masy ciała, aby zapewnić głębokie znieczulenie. Monitoruj zwierzę i potwierdź brak odruchów pedałowania i rogówki przed przystąpieniem do perfuzji.
      3. Ukrwić około 20–30 ml zimnego PBS zawierającego heparynę (5 j.m./ml) przez lewą komorę pod kontrolowanym ciśnieniem 150 mmHg przez 6 minut, aby wypłukać krew i wykrwawić narząd przed usunięciem.
      4. Wszystkie pobrane tkanki należy natychmiast stłumić ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
        UWAGA: Szybkie zamrażanie jest niezbędne, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu, które mogą zniekształcić morfologię tkanek.
    2. Osadzanie tkanek i kriosekcja
      1. Ustawić mikrotom na -20 °C i odkazić komorę i łopatkę etanolem (EtOH), aby wyeliminować resztki materiału do zatapiania. Pozwól, aby szkiełka CaF2, koperta do szkiełek, uchwyt próbki i próbka tkanki zrównoważyły się w kriostacie.
      2. Przyciąć tkankę do około 5 mm × 5 mm × 3 mm. Zanurzyć ją w 10% żelatynie w standardowym krioformowaniu w temperaturze -20 °C, zapewniając odpowiednią orientację do cięcia. Zanurzoną próbkę należy zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.
      3. Wyjmij tkankę z formy, przytnij nadmiar materiału, aby zoptymalizować cięcie, i przymocuj ją do uchwytu próbki za pomocą ultraczystej wody, aby zapewnić stabilną przyczepność.
      4. Wyciąć sekcje o grubości 10 μm i unieruchomić je na wstępnie pokrytych podłożach CaF2 i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      5. Umieść zamontowane skrawki tkanki w liofilizatorze próżniowym przed obrazowaniem w średniej podczerwieni. Ustawić ciśnienie w komorze na 0,1 mPa, a temperaturę na -100 °C. Suszyć próbki przez 30 minut.
  2. Przygotowanie próbki komórki
    1. Wysiew 1,25 × 105 komórek HeLa na okrągłych podłożach CaF2 o średnicy 13 mm umieszczonych na standardowych płytkach hodowlanych. Stosuj wysokoglukozową pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Inkubować komórki w normalnych warunkach hodowli (37 °C, 5 % CO2 ) przez 24 godziny.
    2. Po 24 godzinach ostrożnie usunąć pożywkę i utrwalić komórki, inkubując je w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozpuszczonym w buforze PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Przepłukać utrwalone komórki trzykrotnie buforem HBSS, a następnie przepłukać je jeszcze trzy razy za pomocą ddH2O.
    4. Całkowicie wysusz podłoża CaF2 na powietrzu w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do obrazowania MIR.

2. Multimodalna akwizycja obrazów

  1. Akwizycja obrazu MIR za pomocą kwantowego lasera kaskadowego (QCL)
    1. Wykonaj mikroskopię obrazową QCL MIR przy użyciu mikroskopu QCL-MIR wyposażonego w detektor mikrobolometru chłodzonego cieczą non-N2 520 × 480 z matrycą płaszczyzny ogniskowej (FPA) i technologię redukcji koherencji przestrzennej.
    2. Wybierz zakres spektralny od 950 cm-1 do 1800 cm-1.
    3. Użyj obiektywu 4× z aperturą numeryczną 0,6 (NA), co daje nominalny rozmiar piksela 4,25 μm.
    4. Zbierz widmo tła na czystym podłożu CaF2 w rozdzielczości spektralnej 4 cm-1.
    5. Wybierz obszar akwizycji na podstawie morfologii tkanki i zbierz dane spektralne w rozdzielczości spektralnej 4 cm-1. Przy tej rozdzielczości spektralnej prędkość akwizycji obrazu wynosi około 0,3 mm2/s.
      UWAGA: Wszystkie pomiary wykonywane są w trybie transmisyjnym przy użyciu slajdów CaF2, z ręczną regulacją ostrości.
  2. Akwizycja obrazów za pomocą spektrometrii mas
    1. Aplikacja Matrix
      1. Użyj skrawków tkanek po MIR dla MALDI-MSI, nałóż znaczniki referencyjne wokół tkanki za pomocą długopisu Tippex i uchwyć obraz optyczny przed MSI za pomocą skanera płaskiego w celu rejestracji obrazu.
      2. Przygotować matrycę NEDC w stężeniu 7 mg/ml w metanolu/acetonitrylu/wodzie dejonizowanej (V/V/V=75:25:5), a następnie przefiltrować przez membranę 0,2 μm w celu usunięcia cząstek stałych.
      3. Załaduj oznaczone szkiełka tkankowe do automatycznego opryskiwacza matrycowego. Dozować matrycę NEDC na próbkę, stosując wstępnie zdefiniowane parametry.
    2. Pomiar MALDI-MSI
      1. Umieść 0,2 μl czerwonej zawiesiny fosforu na szkiełku CaF2, aby służyło jako zewnętrzny wzorzec wzorcowania masy.
      2. Zamocuj prowadnicę pokrytą matrycą w adapterze prowadnicy, zapewniając optymalny kontakt elektryczny z uchwytem. Załaduj płytkę do systemu MALDI-MSI.
      3. Wyrównaj obraz optyczny szkiełka ze współrzędnymi silnika XY stopnia MALDI za pomocą znaczników odniesienia. Zdefiniuj zwrot z inwestycji dla analizy tkanek i uwzględnij obszar "tylko matryca" jako kontrolę ujemną.
      4. Skonfiguruj instrument w trybie jonów ujemnych o rozmiarze piksela 20 × 20μm2, obejmując zakres m/z 50-1000. Przed rozpoczęciem zbierania danych należy przeprowadzić kalibrację masy przy użyciu czerwonej plamki fosforu. Wykonuj akwizycję danych za pomocą komercyjnej platformy do analizy danych.

3. Wstępne przetwarzanie i analiza danych obrazu

UWAGA: Niestandardowe kody MATLAB są przesyłane jako Plik Uzupełniający 1.

  1. Wstępne przetwarzanie i analiza danych QCL-MIR
    1. Wstępne przetwarzanie danych
      1. Eksport danych hiperspektralnych w odpowiednim formacie w celu dalszej analizy.
      2. Wykonaj wstępne przetwarzanie danych za pomocą CytoSpec i MATLAB, wykonując następujące kroki 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. Zaimportuj dane spektralne MIR do CytoSpec v2.00.07 w celu wstępnego przetworzenia.
      4. Oceń jakość spektralną za pomocą wbudowanego modułu testów jakości w CytoSpec. Należy wybrać kryterium 2 (grubość próbki), aby ocenić konsystencję próbki. Ustaw zakres całkowania spektralnego na 950-1800 cm-1. Zdefiniuj progi absorbancji w zakresie od 50 do 1000 jednostek, aby wykluczyć widma z obszarów, które są nadmiernie cienkie lub grube.
      5. Redukcja szumów za pomocą filtrowania opartego na PCA w CytoSpec. Zachowaj pierwsze 10 głównych komponentów (PC), aby wyeliminować szumy o wysokiej częstotliwości, zachowując jednocześnie kluczową wariancję biochemiczną.
      6. Eksportuj wstępnie przetworzone dane spektralne z CytoSpec w formacie .mat do dalszej analizy w MATLAB.
      7. Wykonaj korekcję linii bazowej w MATLAB przy użyciu algorytmu korekcji gumki w całym zakresie spektralnym 950-1800 cm-1, aby wyeliminować dryft linii bazowej i poprawić dokładność spektralną.
      8. Zastosuj normalizację spektralną przy użyciu skalowania min-max w tym samym zakresie spektralnym, aby ustandaryzować intensywności we wszystkich widmach i zapewnić porównywalność w całym zestawie danych.
    2. analiza danych
      1. Zidentyfikuj cechy związane z białkiem na 1,550 cm-1 i 1,650 cm-1, odpowiadające odpowiednio prążkom amidu II i amidu I. Zidentyfikuj cechy związane z lipidami na wysokości 1,740 cm-1, reprezentujące wibracje rozciągające ester C = O.
      2. Oblicz stosunek intensywności pasma Amidu I (1650 cm-1) do rozciągnięcia estru C=O (1740 cm-1) i wygeneruj mapy proporcji, aby zobrazować przestrzenny rozkład lipidów do białek.
      3. Nienadzorowana analiza skupień: Wykonaj hierarchiczną analizę skupień (HCA) na danych hiperspektralnych przy użyciu odległości euklidesowej i powiązania Warda w celu sklasyfikowania regionów na podstawie podobieństwa spektralnego. Generuj mapy klastrów, aby zidentyfikować biochemicznie odrębne regiony i ujawnić różnice strukturalne lub patologiczne.
  2. Wstępne przetwarzanie i analiza danych MSI
    1. Zaimportuj surowe dane MSI do komercyjnej platformy analizy danych.
    2. Wykonuj pobieranie szczytowe ze względną intensywnością > 0,01%.
    3. Wyklucz piki pochodzące z macierzy z eksperymentalnej listy pików, porównując je z widmem uzyskanym z regionu kontrolnego tylko z matrycy. Usuń wszystkie piki, które pojawiają się w widmie kontrolnym i mają stosunek sygnału do szumu (SNR) mniejszy niż 3.
    4. Znormalizuj zestaw danych do średniej kwadratowej (RMS), aby uwzględnić zmienność intensywności sygnału jonów w pikselach i próbkach.
    5. Uściślij identyfikację metabolitów, filtrując cechy na podstawie ich rozmieszczenia w tkankach, dopasuj do wpisów w bazie danych ludzkiego metabolomu (HMDB) i zgodność z teoretycznymi wartościami m/z.
    6. Należy wybrać odpowiednie metabolity w oparciu o cele eksperymentalne i kontekst tkankowy.
    7. Wyeksportuj intensywności wybranych elementów dla wszystkich pikseli jako plik CSV.
    8. Zastosuj techniki redukcji wymiarowości (np. PCA, t-SNE lub UMAP) w celu zmniejszenia złożoności danych i identyfikacji klastrów pikseli o podobnych sygnaturach metabolicznych za pomocą narzędzi bioinformatycznych, takich jak Seurat i Banksy, ułatwiając wizualizację przestrzennej heterogeniczności metabolicznej.

4. Współrejestracja i wspólna analiza obrazów multimodalnych

  1. Wybierz obraz MIR uzyskany na wysokości 1650 cm-1 jako odniesienie przestrzenne do wspólnej rejestracji. Ta specyficzna liczba falowa podkreśla pasmo białka amidu I, oferując silny kontrast tkankowy.
  2. Znormalizuj wartości intensywności zarówno obrazów MIR, jak i MSI, aby zwiększyć porównywalność wizualną. Zastosuj techniki poprawy kontrastu, takie jak wyrównanie histogramu za pomocą funkcji histeq w MATLAB, aby redystrybuować intensywność obrazu i poprawić widoczność cech strukturalnych krytycznych dla wyboru punktów orientacyjnych.
  3. Załaduj zarówno obrazy MIR, jak i MSI do programu MATLAB za pomocą funkcji cpselect z przybornika do przetwarzania obrazu. Ta funkcja otwiera interaktywny interfejs do wyboru punktów orientacyjnych.
  4. Ręcznie dodaj adnotacje do pięciu do dziesięciu anatomicznie istotnych i dobrze rozmieszczonych punktów kontrolnych zarówno na obrazach MIR, jak i MSI za pomocą funkcji cpselect. Te punkty orientacyjne powinny odpowiadać wyraźnym cechom morfologicznym, takim jak granice tkanek.
    UWAGA: Rozmieść punkty kontrolne równomiernie w polu obrazu, aby zminimalizować miejscowe zniekształcenia.
  5. Wyeksportuj i zapisz współrzędne punktów kontrolnych z adnotacjami z obu obrazów. Przechowuj je jako dwie pasujące tablice do obliczeń transformacji (np. movingPoints i fixedPoints).
  6. Oblicz macierz transformacji afinicznej za pomocą funkcji MATLAB fitgeotrans w trybie afinicznym. Ta transformacja uwzględnia skalowanie, obracanie, translację i ścinanie.
  7. Zastosuj obliczoną transformację do obrazu MSI za pomocą funkcji imwarp w programie MATLAB. Ten krok generuje przestrzennie zarejestrowany obraz MSI, który jest geometrycznie wyrównany do układu odniesienia MIR.
  8. Sprawdź wzrokowo wyrównanie za pomocą funkcji imshowpair w trybie mieszania, aby nałożyć obrazy MSI i MIR i potwierdzić poprawność rejestracji cech strukturalnych.
  9. Przekonwertuj zarówno zarejestrowany obraz MSI, jak i referencyjny obraz MIR na maski binarne za pomocą funkcji imbinaryzacji w programie MATLAB.
  10. Oblicz współczynnik podobieństwa kości (DSC), aby określić ilościowo przestrzenne nakładanie się dwóch masek binarnych. DSC definiuje się jako: DSC = 2 × (obszar nakładania się)/(Całkowity obszar obu masek). Wartość DSC zbliżająca się do 1,0 wskazuje na wysokie nakładanie się przestrzenne i dokładność rejestracji.
    UWAGA: W razie potrzeby doprecyzuj rejestrację, dostosowując liczbę lub rozmieszczenie punktów kontrolnych i powtarzając proces transformacji. Rozważ niesztywne metody rejestracji, jeśli utrzymują się lokalne niewspółosiowości.
  11. Zapisz zarejestrowany obraz, parametry transformacji i współrzędne punktu orientacyjnego na potrzeby dalszej analizy obrazu multimodalnego, takiej jak korelacja przestrzenna cech biochemicznych i strukturalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby potwierdzić wyżej opisaną strategię multimodalnej metabolomiki przestrzennej, zaimplementowaliśmy ją w mysim modelu raka. Komórki nowotworowe zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP), umożliwiając precyzyjną lokalizację regionu guza poprzez obrazowanie fluorescencyjne. Rysunek 2A pokazuje bezznacznikowe wyniki obrazowania QCL-MIR z pokryciem spektralnym 950-1800 cm-1, znanym jako "obszar odcisku palca". Reprezentatywne pasma MIR są oznaczone...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy multimodalną strategię metabolomiki przestrzennej, która integruje obrazowanie MSI i MIR, aby umożliwić wysokoprzepustowe, molekularnie specyficzne profilowanie metaboliczne na tych samych próbkach. Obrazowanie MIR umożliwia bezznacznikowe, nieniszczące mapowanie chemiczne w oparciu o drgania molekularne, dostarczając szczegółowych informacji o strukturach i grupach funkcyjnych. W przeciwieństwie do tego, MSI zapewnia wysoką czułość i swoistość w zakresie identyfikacji i kwantyfikacji metaboli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Yilong Zou z Uniwersytetu Westlake za wsparcie w zakresie obrazowania MALDI2-MSI oraz biuru Bruker Scientific Technology Co., Ltd. w Szanghaju za pomoc w obrazowaniu MIR opartym na QCL. Dziękujemy również dr Shuguo Sun, Huazhong University of Science and Technology za uprzejme dostarczenie myszy KrasLSL-G12D/+ Tp53fl/fl Rb1fl/fl ZsgreenLSL. Badanie to jest wspierane przez granty z Niezakaźnych Chorób Przewlekłych - Narodowego Programu Nauki i Technologii (2023ZD0500400 dla LS, GW i LY), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 22377016 do L. S.) oraz Funduszu Uniwersytetu Fudan i Badań Podstawowych Cao'ejiang (nr 24FCA08 dla L. S.). Dziękujemy również Głównej Placówce Kolegium Medycznego w Szanghaju, Uniwersytetu Fudan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% Paraformaldehyd, roztwór do utrwalania tkanekSangon Biotech 
Albumina surowicy bydlęcejSigma Aldrich126615
myszy C57BL/6JNifdcCharles River219
CaF2CrystranCAFP25-1
Mikrotom kriostatuDakewe BiotechCT520
CytospecPeter LaschWersja 2.10.01Oprogramowanie do analizy danych MIR, w tym korekcji linii bazowej, normalizacji, generowania obrazów i analizy hiperspektralnej.
Bufor DPBSFisher Scientific 14-190-250
Surowica bydlęcapłodu Gibco10270106
LiofilizatoryLABCONCOFreeZone
Żelatyna Sigma-AldrichG1890Typ A, z
buforu HBSSSangon Biotech 
DMEM o wysokiej zawartości glukozyThermoFisher Scientific 
Oprogramowanie MatlabMathWorksMatlab R2024ado analizy danych MIR, w tym korekcji linii bazowej, normalizacji, generowania obrazu i analizy hiperspektralnej.
System obrazowania spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą desorpcją laserową (MALDI-MSI)Bruker Daltonics GmbH timsTOF fleX MALDI-2
MetanolSinopharm Odczynnik chemiczny10014108
mMassInstytut Entomologii, Centrum Biologii Czeskiej Akademii Nauk, Republika CzeskaWersja 5.5.0Oprogramowanie do analizy danych MSI. Zaimportuj surowe dane MSI do SCILS Lab w celu wstępnego przetworzenia.  Wykonaj pobieranie szczytów w mMass ze względną intensywnością > 0,01%.
Matryca dichlorowodorku N-(1-naftylo)etylenodiaminy (NEDC) Sigma Aldrich222488
Penicylina-streptomycynaThermoFisher Scientific 
Kwantowy laser kaskadowy  Mikroskopia w średniej podczerwieni (QCL-MIR)  Bruker Optics GmbHLUMOS II ILIM
Fosfor czerwonySigma-Aldrich8.0727
SCiLS LabBruker DaltonicsSCiLS Lab 2024bOprogramowanie do analizy danych MSI. Zaimportuj surowe dane MSI do SCILS Lab w celu wstępnego przetworzenia.  Wykonaj pobieranie szczytów w mMass ze względną intensywnością > 0,01%.
OpryskiwaczHTX TechnologiesTM
Trypsyna, 0,25% EDTAThermoFisher Scientific 
E672002 ze skóry świń A0032101056401115140122C25200072

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandrov, T. Spatial metabolomics: From a niche field towards a driver of innovation. Nat Metab. 5 (9), 1443-1445 (2023).
  2. Gilmore, I. S., Heiles, S., Pieterse, C. L. Metabolic imaging at the single-cell scale: Recent advances in mass spectrometry imaging. Annu Rev Anal Chem. 12 (1), 201-224 (2019).
  3. Chadha, R. S., Guerrero, J. A., Wei, L., Sanchez, L. M. Seeing is believing: Developing multi-modal metabolic insights at the molecular level. ACS Central Science. 10 (4), 758-774 (2024).
  4. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  5. Steinhauser, M. L., et al. Multi-isotope imaging mass spectrometry quantifies stem cell division and metabolism. Nature. 481 (7382), 516-519 (2012).
  6. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  7. Qian, N., et al. Illuminating life processes by vibrational probes. Nat Methods. 22 (5), 928-944 (2025).
  8. Kim, M. M., Parolia, A., Dunphy, M. P., Venneti, S. Non-invasive metabolic imaging of brain tumours in the era of precision medicine. Nat Rev Clin Oncol. 13 (12), 725-739 (2016).
  9. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9 (8), 1771-1791 (2014).
  10. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23 (4), 469-474 (2005).
  11. Schnell, M., et al. All-digital histopathology by infrared-optical hybrid microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3388-3396 (2020).
  12. Yeh, K., Kenkel, S., Liu, J. N., Bhargava, R. Fast infrared chemical imaging with a quantum cascade laser. Anal Chem. 87 (1), 485-493 (2015).
  13. Ma, S., et al. High spatial resolution mass spectrometry imaging for spatial metabolomics: Advances, challenges, and future perspectives. TrAC Trends Anal Chem. 159, 116902(2023).
  14. Mckinnon, J. C., et al. Enhancing metabolite coverage in MALDI-MSI using laser post-ionisation (MALDI-2). Anal Methods. 15 (34), 4311-4320 (2023).
  15. Bednařík, A., et al. MALDI MS imaging at acquisition rates exceeding 100 pixels per second. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (2), 289-298 (2019).
  16. He, M. J., et al. Comparing DESI-MSI and MALDI-MSI mediated spatial metabolomics and their applications in cancer studies. Front Oncol. 12, 2022(2022).
  17. Wang, G., et al. Analyzing cell-type-specific dynamics of metabolism in kidney repair. Nature Metab. 4 (9), 1109-1118 (2022).
  18. Haase, K., Kröger-Lui, N., Pucci, A., Schönhals, A., Petrich, W. Real-time mid-infrared imaging of living microorganisms. J Biophotonics. 9 (1-2), 61-66 (2016).
  19. Liu, X., et al. Towards mapping mouse metabolic tissue atlas by mid-infrared imaging with heavy water labeling. Adv Sci. 9 (15), e2105437(2022).
  20. Liu, X., Shi, L., Zhao, Z., Shu, J., Min, W. Vibrant: Spectral profiling for single-cell drug responses. Nat Methods. 21 (3), 501-511 (2024).
  21. Gruber, L., et al. Deep MALDI-MS spatial omics guided by quantum cascade laser mid-infrared imaging microscopy. Nat Commun. 16 (1), 4759(2025).
  22. Heijs, B., et al. Histology-guided high-resolution matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 87 (24), 11978-11983 (2015).
  23. Rabe, J. H., et al. Fourier transform infrared microscopy enables guidance of automated mass spectrometry imaging to predefined tissue morphologies. Sci Rep. 8 (1), 313(2018).
  24. Wang, G., et al. Spatial quantitative metabolomics enables identification of remote and sustained ipsilateral cortical metabolic reprogramming after stroke. bioRxiv. , (2024).
  25. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  26. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (d2o) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Analytica Chimica Acta. 1242, 340722(2023).
  27. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Commun. 9 (1), 2995(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spatial MetabolomicsMass Spectrometry ImagingMid Infrared ImagingMALDI MSIImaging Co RegistrationBioinformatics AnalysisTissue Metabolite MappingMulti Modal ImagingMetabolic HeterogeneityBiomarker Discovery
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły