Artykuł metodologiczny

Wzmacnianie technologii pęcherzyków zewnątrzkomórkowych receptora antygenu chimerycznego (CAR-EV): przyszłość terapii nowotworów

DOI:

10.3791/68726

⸱

19 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapeutyczne zastosowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) może zrewolucjonizować leczenie nowotworów i dostarczanie leków. Izolowane za pomocą chromatografii jonowymiennej metodą chromatografii jonowymiennej chimerycznego receptora antygenowego (CAR) EV pochodzące z komórek (CAR-EVs) wykazują zwiększoną nośność, co znacznie zwiększa ich skuteczność funkcjonalną. W niniejszym badaniu scharakteryzowano pojazdy CAR-EV, aby wyjaśnić ich aktywność biologiczną i potencjał terapeutyczny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie komórkowe CAR znacznie przyczyniły się do rozwoju spersonalizowanego leczenia kilku nowotworów hematologicznych. Obecnie siedem produktów CAR-cell jest zatwierdzonych przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA), a sześć przez Europejską Agencję Leków (EMA) do leczenia chłoniaka, szpiczaka mnogiego i przewlekłej białaczki limfocytowej. Pozostaje kilka wyzwań i ograniczeń, z których najbardziej znaczącymi są zespół uwalniania cytokin (CRS) i zespół neurotoksyczności związanej z komórkami efektorowymi układu odpornościowego (ICANS). Terapie bezkomórkowe, takie jak CAR-EV, oferują znaczne korzyści w porównaniu z ich komórkowymi odpowiednikami. Obejmują one zwiększoną infiltrację guza i możliwość ponownego podawania, przy jednoczesnym zminimalizowaniu ryzyka CRS, ICANS i innych niepożądanych skutków ubocznych. Dodatkowo, moc CAR-EV może być dostrojona poprzez inżynierię włączania czynników cytotoksycznych i modyfikujących funkcję kwasów rybonukleinowych (RNA). W niniejszym artykule informujemy o rozwoju skalowalnej platformy CAR-EV do produkcji przestrajalnych pojazdów CAR-EV. Platforma ta obejmuje inżynierię i wstępne kondycjonowanie komórek wytwarzających pojazdy elektryczne (np. ogniwa CAR-T i CAR-natural killer (CAR-NK)), izolację i wzbogacanie pojazdów CAR-EV przy użyciu platformy chromatografii jonowymiennej (IEX) klasy Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP), w pełni zautomatyzowaną, wysokoprzepustową analizę subpopulacji pojazdów elektrycznych oraz in vitro ocena funkcjonalnej aktywności cytotoksycznej CAR-EV. Platforma została zwalidowana przy użyciu CAR-NK-EV i CAR-T-EV zarówno dla linii komórek hematologicznych, jak i litych. Platforma CAR-EV stanowi obiecujące podejście do szybkiego opracowania gotowych terapeutycznych pojazdów CAR-EV dostosowanych do konkretnych wskazań chorobowych, które mogą potencjalnie zmniejszyć niepożądane skutki uboczne związane z terapiami opartymi na komórkach CAR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie oparte na komórkach CAR zostały zatwierdzone do leczenia nowotworów hematologicznych, jednak nadal istnieją poważne wyzwania i ograniczenia1. Warto zauważyć, że ryzyko CRS i ICANS pozostaje krytycznym czynnikiem przy ocenie przydatności pacjenta do terapii CAR, podkreślając potrzebę ciągłego postępu w strategiach leczenia2.

Pojazdy elektryczne pochodzące z komórek CAR (CAR-EV) okazały się skuteczniejszą i potencjalnie bezpieczniejszą allogeniczną opcją terapeutyczną. Takie EV oferują kilka korzyści, w tym zmniejszoną immunogenność, mniejsze ryzyko CRS, zwiększoną infiltrację guza, przydatność do wielokrotnego dawkowania, potencjał terapii skojarzonych, a także wydajne procesy produkcji i przechowywania3. Biologicznie pochodne EV mogą być modyfikowane w celu ekspresji cząsteczek ukierunkowanych na raka, które wiążą się z wysokim powinowactwem do określonych receptorów powierzchniowych na komórkach rakowych. Po zmodyfikowaniu, te zaprojektowane pojazdy elektryczne stanowią obiecującą strategię selektywnego dostarczania ładunku terapeutycznego, z potencjałem zminimalizowania skutków niedocelowych. Pochodzące z komórek CAR, te uzbrojone pojazdy elektryczne wykazują ulepszone właściwości funkcjonalne, które umożliwiają bardziej precyzyjne i skuteczne dostarczanie terapeutyczne. Ich nieodłączne cechy dają wiele korzyści, które łącznie przyczyniają się do poprawy skuteczności leczenia.

Dwie główne przeszkody w skutecznym wykorzystaniu pojazdów elektrycznych w klinice to skala i skuteczność. Przedstawione w niniejszym dokumencie metodologie wykazują wrodzoną skalowalność i można je łatwo dostosować do szerokiego spektrum paradygmatów eksperymentalnych. Zwiększenie skali produkcji pojazdów elektrycznych do produkcji klasy klinicznej jest obszarem aktywnego rozwoju, ale wymaga dalszej optymalizacji w celu wygenerowania wystarczających ilości materiału klasy klinicznej4. Co ważne, ostatnie badania wykazały obiecujące podejścia do poprawy skuteczności EV, takie jak wstępne kondycjonowanie komórek rodzicielskich za pomocą interleukinów (np. IL-7, IL-15, IL-21) i generowanie EV w warunkach niedotlenienia (1-2% O2) 5,6,7.

Celem pracy było zbadanie potencjału terapeutycznego receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) ukierunkowanych na CAR EV in vitro, z wykorzystaniem komórek raka piersi MCF-7 i komórek białaczki szpikowej K562. EV wyizolowano i wzbogacono z pożywek kondycjonowanych komórkami CAR (CM) za pomocą IEX, scharakteryzowano za pomocą śledzenia nanocząstek i analizy Western blot oraz poddano testom funkcjonalnym. Pojazdy elektryczne CAR zawierające endogenny ładunek cytotoksyczny skutecznie indukowały śmierć komórek in vitro. Uzyskane dane wskazują na wykonalność skalowalnej, ukierunkowanej produkcji pojazdów elektrycznych do zastosowań terapeutycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ze wszystkimi żywymi komórkami w szafce z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL-2) należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (np. rękawic, fartuchów laboratoryjnych). Materiały stanowiące zagrożenie biologiczne, takie jak granulki komórkowe zawierające żywe komórki, muszą zostać odkażone przy użyciu końcowego 10% roztworu podchlorynu sodu (wybielacza).

1. Hodowla komórkowa i pobieranie CM

  1. Hodowla komórek CAR
    UWAGA: Chociaż komórki CAR transdukowane lentiwirusem użyte w tym badaniu zostały zlecone na zewnątrz, protokół nadal ma zastosowanie do komórek CAR-T / NK generowanych we własnym zakresie za pomocą standardowych technik inżynierii komórkowej.
    1. Utrzymać komórki CAR NK/T w hodowli wolnej od ksenotypów (pożywka wzrostowa uzupełniona 100 IU / ml IL-2) o gęstości 0,5-1 x 106 / ml, w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C (5% CO2, 21% O2). Monitoruj co 2-3 dni i ogranicz liczbę komórek do 3 razy w tygodniu ze względu na ograniczenia przepustowości.
    2. Potwierdź ekspresję CAR za pomocą mikroskopii, upewniając się, że komórki są fluorescencyjne (jeśli są odpowiednio oznakowane). Komórki w zdrowych kępkach wskazują na solidną hodowlę komórek CAR.
  2. Kolekcja CM
    1. Gdy hodowle komórkowe osiągną 80% konfluencji, oceń żywotność komórek i określ gęstość żywych komórek za pomocą automatycznej analizy zliczania komórek Trypan blue.
    2. Odwirować komórki w temperaturze 300 × g (temperatura pokojowa) przez 5 minut, aby powstał osad.
    3. Ostrożnie zebrać sklarowany sklarant i odwirować w temperaturze 3 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Przechowywać oczyszczony CM w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowy do wzbogacenia EV.

2. Izolacja i wzbogacenie EV

UWAGA: Poniższe metody przedstawiają dwa podejścia do wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV): metodę IEX, opracowaną do izolacji EV do funkcjonalnej analizy in vitro , oraz metodę wysokoprzepustowego wychwytywania panegzosomów, zoptymalizowaną pod kątem dalszych badań charakterystyki.

  1. Wzbogacenie funkcjonalnych pojazdów elektrycznych CAR za pośrednictwem IEX
    UWAGA: Wszystkie specyfikacje objętościowe są wyrażone w objętości kolumny (CV), co odzwierciedla proporcjonalną zależność między objętościami odczynnika a objętością złoża żywicy w kolumnie chromatograficznej.
    1. Doprowadź kolumnę IEX (szczegółowe informacje na temat używanej kolumny znajduje się w Tabeli materiałów ) do temperatury pokojowej (RT), pozostawiając ją na 15 minut przed użyciem. Dodać 10 CV buforu regeneracyjnego, a następnie przeprowadzić równowagę przy użyciu 10 CV izotonicznego buforu równowagi (przy pH 7,4) (szczegóły dotyczące znajdują się w Tabeli Materiałów ).
      UWAGA: Nie pozwól, aby kolumna pracowała na sucho przez dłuższy czas. Zawsze utrzymuj kolumnę w pozycji pionowej.
    2. Rozmrozić CM i przepuścić przez filtr polieterosulfonowy (PES) 0,22 μm.
    3. Dodać próbkę do kolumny równowagi (do 31,2 CV), a następnie 10 CV izotonicznego buforu do przemywania (o pH 7,4). Dodać 2,5 CV hipertonicznego buforu elucyjnego (patrz tabela materiałów) i zebrać przepływ, ponieważ jest to próbka eluatu EV.
    4. Przeprowadzić wymianę buforową na eluacie EV przy użyciu dostępnych na rynku ultrafiltracyjnych filtrów odśrodkowych (odcięcie 30 kDa) i roztworu izotonicznego jako rozcieńczalnika, zapewniając minimalny współczynnik rozcieńczenia 100x. Objętość docelowa po wymianie bufora może być określona przez użytkownika zgodnie z jego parametrami eksperymentalnymi.
    5. Przeprowadź końcowy etap filtracji przy użyciu filtra 0,22 μm w celu sterylizacji wzbogaconych EV do testów funkcjonalnych in vitro .
    6. Określ rozkład wielkości, stężenie i wydajność CAR-EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)8,9.
  2. Wysokoprzepustowa izolacja pan-egzosomu EV (za pomocą automatycznego systemu oczyszczania, przeprowadzana w temperaturze pokojowej (RT)), do charakteryzowania ograniczonej lub dużej liczby próbek10,11.
    1. Przygotuj trzy 96 płytek z 96 głębokimi dołkami po 1 ml 1x PBS na studzienkę.
    2. Utworzyć płytkę "elucyjną", dodając 35 μl 1% buforu dodecylosiarczanu sodu (SDS) do każdej studzienki.
    3. Przygotować "wiążącą" płytkę zawierającą 1 ml próbki CM i 30 μl kulek wychwytujących EXO-NET pan-egzosomy na studzienkę.
    4. Skonfiguruj następujące ustawienia w systemie automatycznej izolacji:
      1. Krok 1: Podnieś wskazówkę: Upewnij się, że protokół izolacji zaczyna się od włączenia przez instrument grzebienia z końcówką o głębokości 96 dołków, aby umożliwić manipulację kulkami magnetycznymi podczas całego procesu izolacji.
      2. Krok 2: Upewnij się, że próbka CM i kulki magnetyczne są mieszane w ciągłych warunkach niskiej prędkości przez 30 minut, aby umożliwić skuteczne wychwytywanie EV na cząstkach magnetycznych. Po wymieszaniu dołącza się 5 cykli po 30 s każdy, aby zapewnić wychwycenie kulek magnetycznych.
      3. Krok 3: Upewnij się, że każdy z trzech etapów mycia wykorzystuje delikatną 30-sekundową mieszankę o niskiej prędkości w celu usunięcia niespecyficznie związanych zanieczyszczeń, zachowując jednocześnie integralność związanych pojazdów elektrycznych. Podobnie jak poprzednio, krok kończy się 5 cyklami po 30 s każdy, aby uchwycić kulki magnetyczne.
      4. Krok 4: Elucja białka EV (liza): Upewnij się, że związane EV są poddawane lizie w celu odzyskania białka w procesie dwufazowym. Wstępne mieszanie przez 30 s (mieszanie od dołu) przeprowadza się przed inkubacją przez 7 minut i 30 s w stanie pauzy, z końcówką umieszczoną powyżej studzienki. Po upływie tego czasu następuje drugie 30 s mieszania i pauza na kolejne 7 minut i 30 s. Na koniec włączanych jest 5 cykli po 30 s każdy.
      5. Krok 5: W tym momencie upewnij się, że zawartość białka znajduje się w buforze, podczas gdy kulki są przymocowane do końcówki. Po etapie elucji zużyty grzebień z końcówką jest wyrzucany, kończąc protokół.
        UWAGA: Kulki Exo-Net Pan-Exosome Capture zawierają 0,05% (w/w) roztworu konserwującego. Chociaż nie jest klasyfikowany jako niebezpieczny zgodnie z przepisami Administracji Bezpieczeństwa i Zdrowia w Pracy (OSHA), podczas obchodzenia się z nim należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), zwłaszcza w kontekście płynów biologicznych.

3. Charakterystyka EV za pomocą western blotting

UWAGA: Pojazdy CAR-EV charakteryzowały się Western blot (Granzyme B i Calnexin) w porównaniu z komórkami jako kontrolą.

  1. Przygotować lizaty komórkowe, dodając 10 μl 1x buforu testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (z inhibitorami proteazy) na 1 × 106 komórek. Inkubować na lodzie przez 30 minut, a następnie odwirować w temperaturze 14 000 × g (4°C) przez 15 minut w celu usunięcia resztek komórek. Pojazdy elektryczne mogą być poddawane lizie przy użyciu tego samego bufora lub 1% SDS.
  2. Określić ilościowo ilość białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) (lub odpowiedniego nanospektrofotometru).
  3. Zmontuj 4-12% żel poliakryloamidowy SDS w aparacie do elektroforezy zgodnie z protokołem producenta. Przygotować lizaty białkowe przy użyciu buforu Laemmli.
    UWAGA: Systemy żelowe mogą się różnić w zależności od marki
  4. Załadować 5 μg próbki do każdej studzienki i rozpylać żele pod napięciem 200 V przez 20 minut.
  5. Wykonaj transfer Western za pomocą membran z polifluorku winylidenu (PVDF), blokując bloty 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% Tween 20 (1x TBST) następnie.
  6. Inkubować bloty w pierwszorzędowym przeciwciałie monoklonalnym (Granzyme B i Calnexin, rozcieńczenie 1:500 w roztworze 5% BSA w 1x TBST), w stagnacji (bez wstrząsania) i przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Następnego dnia przemyj bloty 3x przez 5 minut każdy 10-15 ml 1x TBST przed inkubacją w przeciwciałie drugorzędowym (zależne od gatunku, rozcieńczenie 1 na 1,000 w roztworze 5% BSA w 1x TBST przez 1 godzinę w RT). Wykrywanie pasm za pomocą ulepszonej chemiluminescencji (ECL) na podstawie obrazów zarejestrowanych za pomocą kamery cyfrowej z ładowanym urządzeniem sprzężonym (CCD).

4. Test funkcjonalny (za pośrednictwem MTS)

UWAGA: Cytotoksyczność oceniano za pomocą testu MTS in vitro [(3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium], w którym komórki redukują związek tetrazolu do rozpuszczalnego barwnego produktu formazanu, mierzalnego przy absorbancji 490 nm. Rak piersi MCF-7 i komórki raka krwi K-562 były leczone do 3 dni w trzech niezależnych eksperymentach ze wzrostem stężeń (0-500 000 cząstek / komórkę) CAR-EV.

  1. Wysiewaj 5 000 komórek biorczych na dołek (50 μl/dołek) na 96-dołkowej płytce za pomocą wielokanałowej pipety. Zarezerwuj jedną kolumnę na ślepą pożywkę (do odejmowania tła odczynnika MTS). Unikaj studzienek brzegowych, napełniając je 200 μl sterylnej wody.
    UWAGA: Przylegające komórki należy posiać dzień wcześniej, aby zapewnić przyczepienie komórkowe do powierzchni płytki przed zabiegiem.
  2. Dodawaj pojazdy elektryczne w coraz większych ilościach (np. 2,5 x 105 i 4,5 x 105 lub 0,5, 0,75 i 1 milion pojazdów elektrycznych na ogniwo). Obejmują kontrole: "Brak EV", 1x PBS "bufor EV" i dodatnią kontrolę zabijania komórek (np. specyficzny dla celu inhibitor małocząsteczkowy lub 0,1% TX-100).
  3. Inkubować komórki w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C (5% CO2, 21% O2) przez 2-3 dni.
  4. W wyznaczonym punkcie czasowym leczenia zbadaj komórki za pomocą mikroskopii. Dodać odczynnik MTS (20 μl na każde 100 μl kultury na studzienkę). Inkubować przez 1-4 godziny, mierząc absorbancję za pomocą czytnika płytkowego przy 490 nm, co godzinę.
  5. Odejmij odczyt absorbancji ślepej pożywki w celu analizy danych. Obliczaj statystyki za pomocą testu t-Studenta dla porównań dwóch grup lub jednoczynnikowej ANOVA z wielokrotnymi porównaniami dla trzech lub więcej grup.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typowy przebieg hodowli komórek CAR T/NK, po którym następuje izolacja, charakterystyka i wykorzystanie EV w teście funkcjonalnym, przedstawiono na rysunku 1. CM z hodowli komórek CAR T / NK jest zbierany przed wzbogaceniem EV i dalszą charakterystyką (w tym analizą śledzenia nanocząstek) oraz aktywnością funkcjonalną ocenianą za pomocą wielodołkowego testu MTS na płytce (Figura 1).

Komórki CAR znakowane GFP można wizualizować za pomocą mikroskopii, aby potwierdzić ekspresję konstruktu CAR w hodowli. Mikroskopia powinna być wykonywana rutynowo przed i w trakcie pobierania CM, aby zapewnić wystarczającą wydajność transdukcji. Ważne jest, aby nakładać na siebie kanały jasnego pola i GFP, aby uchwycić potencjalną autofluorescencję podczas oceny wydajności. Warto zauważyć, że limfocyty T mają tendencję do naturalnego zlepiania się (podobnie obserwowane w komórkach NK; dane nie pokazane), a fluorescencję można wyraźnie zaobserwować, gdy komórki wykazują zbity fenotyp (Figura 2).

Po wzbogaceniu EV, EV można scharakteryzować za pomocą NTA i zachodniego immunoblottingu. Wykorzystując NTA, analiza wydajności cząstek może potwierdzić zwiększone stężenie w izolowanych EV w porównaniu z CM (rysunek 3A). Dane Western blot dodatkowo potwierdzają ekspresję markera cytolitycznego granzymu B w komórkach CAR i EV oraz brak kalneksyny w tych ostatnich, co potwierdza brak materiału komórkowego w preparatach. HEK293T komórki są włączone jako kontrola ujemna CAR (ryc. 3B).

Analizę funkcjonalności EV przeprowadzono za pomocą testu MTS w celu określenia żywotności komórek/zdolności do proliferacji. Wpływ CAR-EV ukierunkowanych na EGFR i HER2 na żywotność i wzrost komórek raka piersi MCF-7 i raka krwi K562 określa się przez pomiar kolorymetrycznego odczynnika MTS przy absorbancji 490 nm (po usunięciu sygnału tła). W tym przykładzie EGFR ukierunkowany na pojazdy elektryczne zmniejszył żywotność ogniw MCF-7 i K562 odpowiednio o 70% i 40%. HER-2 celujący w CAR-EV zmniejszył MCF-7 o ~10% (zgodnie z testem t-Studenta). Biorąc pod uwagę układ eksperymentalny, zastosowanie testu nieparametrycznego (np. U. Manna-Whitneya) może dostarczyć bardziej wiarygodnych informacji w kolejnych badaniach (Rysunek 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Generacja CAR-EV, wzbogacenie, charakterystyka EV i odczyt funkcjonalny .Schemat ideowy przedstawiający typowy przebieg procesu wytwarzania, produkcji i charakterystyki wzbogaconych próbek pojazdów elektrycznych przed analizą funkcjonalności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywna analiza mikroskopowa poprzez potwierdzenie ekspresji GFP w komórkach CAR-T ukierunkowanych na HER2. Obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, przy użyciu obiektywu 20x. Biały pasek skali reprezentuje długość 50 μm. Limfocyty T mają naturalną tendencję do wzrostu w kępkach przed oderwaniem na pojedyncze komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka ogniw CAR i EV. (A) Nano-śledząca analiza cząstek CAR-T CM i wzbogaconych EV. Stężenie cząstek EV było 1,6-2,1 razy większe niż CM, podczas gdy stężenie białka zmniejszyło się o >80%. Statystycznie istotne różnice przetestowano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA i wielokrotnego testu porównawczego Tukeya; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) Analiza Western blot transdukowanych limfocytów T i wzbogaconych CAR-EV potwierdziła obecność cytolitycznego granzymu B zarówno w komórkach CAR, jak i EV, podczas gdy brak odnotowano w HEK293T komórkach innych niż CAR. Calnexin nie został wykryty w CAR-EV, co wskazuje na niskie zanieczyszczenie cząstkami retikulum endoplazmatycznego. Obciążenie białkiem na linię = 5 μg. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Wpływ CAR-EV na żywotność komórek docelowych (komórki raka piersi MCF-7 i linia komórkowa przewlekłej białaczki szpikowej K562). Komórki docelowe traktowano pojedynczą dawką 4,5 x 105 i 2,5 x 105 EV / komórkę (odpowiednio EGFR lub HER2 CAR) lub kontrolną (bufor EV) przez okres do 3 dni. (A) ogniwa CAR-EVs ukierunkowane na EGFR. B) Samochody elektryczne ukierunkowane na HER2. W obu liniach komórkowych zaobserwowano zmniejszenie odczytu absorbancji (wskazującego na skuteczność leczenia). Dane reprezentują średnią absorbancję ± SD (n = 3), analizowaną za pomocą dwustronnego, niesparowanego testu t-Studenta, z wartościami p wskazującymi na istotność statystyczną; ** p≤ 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie udowodnionej skuteczności terapii CAR z obiecującymi zaletami terapii opartej na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV) może poprawić skuteczność leczenia raka, jak wykazano w badaniach ukierunkowanych na raka piersi i płuc12,13. Podejście terapeutyczne opracowane w ramach projektu CAR-EV jest odpowiedzią na obecne ograniczenia terapii CAR, takie jak wyzwania związane z dostarczaniem i związana z nimi toksyczność, przy jednoczesnym wykorzystaniu biokompatybilności i możliwości celowania pojazdów elektrycznych. Integracja tych metod może ułatwić opracowanie nowych strategii terapeutycznych w leczeniu raka, rozszerzając możliwości zastosowania EV w warunkach klinicznych. Ponadto, inżynieria i wzbogacenie funkcjonalnych pojazdów elektrycznych zapewnia bezpieczniejszą (poprzez enkapsulację ładunku cytolitycznego) i bardziej precyzyjną metodę (tj. dodanie domen docelowych) dostarczania ładunku terapeutycznego, zwłaszcza do trudnych miejsc, takich jak rdzeń guza, szpik kostny i obszary chronione przez bariery, takie jak bariera krew-mózg lub bariera krew-jądro 14,15,16. Pomimo dobrze ugruntowanej metody wzbogacania EV za pomocą ultrawirowania, nadal istnieje kilka ograniczeń. Do istotnych ograniczeń należą: skalowalność, współizolacja zanieczyszczeń i ograniczona wydajność poprodukcyjna17. Istnieje wyraźna potrzeba usprawnienia procesów generowania terapeutycznych pojazdów elektrycznych na dużą skalę.

To badanie potwierdzające słuszność koncepcji pokazuje, że IEX jest skalowalną i skuteczną metodą produkcji, izolacji i wzbogacania funkcjonalnych pojazdów CAR-EV, wykorzystującą jako dane wejściowe oczyszczoną CM z komórek wykazujących ekspresję CAR. IEX umożliwia przetwarzanie o wysokiej przepustowości i wspiera zarówno badania, jak i produkcję na skalę cGMP, umożliwiając kontrolę jakości w całym przepływie pracy - od generowania pojazdów elektrycznych do testowania końcowego produktu leczniczego18,19. Chociaż charakterystyka EV jest niezbędna do potwierdzenia funkcji, wydajność może się znacznie różnić ze względu na różnice w objętości próbki, stężeniu wejściowym i właściwościach specyficznych dla EV, takich jak ładunek powierzchniowy i właściwości wiązania. Dane wewnętrzne przy użyciu ogniw MCF-7 pokazują średnią wydajność wstępnego oczyszczania wynoszącą ~2,85 × 108 cząstek/ml, przy stężeniach po oczyszczeniu zwykle od 3 × 1011 do 1 × 1012 cząstek/ml. Poziomy te można regulować, modyfikując objętość ponownego zawieszania podczas wymiany buforu, aby dopasować je do dalszych potrzeb. Biorąc pod uwagę tę zmienność, zdecydowanie zachęca się użytkowników do optymalizacji protokołu za pomocą CM odpowiedniego dla ich konfiguracji eksperymentalnej, aby zapewnić powtarzalne i solidne plony.

Dla pomyślnej produkcji pojazdów CAR-EV kluczowe znaczenie ma kilka etapów w ramach protokołu, ze szczególnym naciskiem na fazy ładowania próbki i elucji. Etapy te mają bezpośredni wpływ na skuteczność wychwytywania EV przez kolumnę, a co za tym idzie, na ogólny uzysk. Etap wymiany bufora ma kluczowe znaczenie, ponieważ niepełne usunięcie nadmiaru substancji rozpuszczonych może zagrozić stabilności pojazdu elektrycznego, prowadząc z czasem do degradacji. EV można następnie scharakteryzować za pomocą metod takich jak NTA lub profilowanie proteomiczne. Jeśli CAR-EV są przeznaczone do testów funkcjonalnych, takich jak badania wychwytu komórkowego lub interwencje terapeutyczne, sterylność ma ogromne znaczenie. Końcowy etap sterylizacji "końcowej" (0,22 μm) jest niezbędny, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu, które może zakłócić wyniki eksperymentów lub stanowić zagrożenie dla bezpieczeństwa biologicznego. Biorąc pod uwagę te czynniki, zdecydowanie zaleca się użytkownikom zachowanie szczególnej ostrożności podczas tych etapów, aby zachować powtarzalność i integralność funkcjonalną końcowego preparatu EV.

Może być konieczne wprowadzenie kilku modyfikacji protokołu, aby rozwiązać typowe problemy napotykane podczas produkcji CAR-EV. Niska wydajność jest najczęściej spowodowana nieoptymalnym obciążeniem CM, przekraczającym lub niewystarczającym w stosunku do zdolności wiązania kolumny. Aby określić optymalną objętość wejściową, zaleca się przeprowadzenie badania miareczkowania CM, stopniowo zwiększając obciążenie w celu określenia punktu maksymalnego odzysku EV. Zatkanie filtra, zwykle obserwowane na końcowym etapie filtracji sterylnej, często wynika z nadmiernego stężenia próbki i lepkości, co może sprzyjać agregacji EV. W takich przypadkach zaleca się rozcieńczenie końcowego preparatu EV. Jeżeli rozcieńczenie nie jest możliwe, przed wymianą buforu można przeprowadzić sterylną filtrację; Takie podejście wymaga jednak, aby wszystkie kolejne etapy były przeprowadzane w ściśle aseptycznych warunkach w celu utrzymania sterylności.

Rozwój EV jako terapii przeciwnowotworowych wymaga powtarzalnych procesów produkcyjnych i solidnej walidacji ich skuteczności przeciwko docelowym liniom komórek nowotworowych. Częstym ograniczeniem IEX we wzbogacaniu EV jest współizolacja cząstek innych niż EV – wyzwanie możliwe do zidentyfikowania poprzez dalszą analizę markerów specyficznych dla EV i możliwe do zredukowania poprzez dalszą optymalizację CM. Charakterystyka uwalniania kontrolnego EV powinna obejmować: NTA w celu określenia liczby i wielkości cząstek oraz stężenia EV po wzbogaceniu; analiza genetyczna i transkrypcyjna ekspresji konstruktu CAR; oznaczanie ekspresji komórkowej i białkowej EV CAR, kanonicznych biomarkerów EV i markerów cytolitycznych (np. granzymu B i perforyny); oraz efekty on- i off-target. Włączenie dodatkowych technik, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), zapewni walidację morfologiczną w celu uzupełnienia charakterystyki opartej na wielkości, wspierając bardziej wszechstronną analizę. Aby utrzymać kontrolę jakości, produkty EV powinny być poddawane testom zanieczyszczenia mykoplazmą i endotoksynami w celu sprawdzenia sterylności i przydatności do produkcji klinicznej. Stosowanie odpowiednich preparatów do długotrwałego przechowywania funkcjonalnych pojazdów CAR-EV może dać możliwość zwiększenia ich stabilności, w tym utrzymania jakości, ilości i skuteczności terapeutycznej. Konsekwentna ocena wydajności funkcjonalnej jest niezbędna do zapewnienia integralności produktu. Warto zauważyć, że test MTS zastosowany w tym badaniu oferuje pośrednią ocenę cytotoksyczności poprzez pomiar aktywności metabolicznej. Przyszłe badania skorzystałyby na zintegrowaniu standaryzowanych testów cytotoksyczności, takich jak uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH), barwienie aneksyną V/PI lub profilowanie aktywacji kaspazy, w celu dokładniejszego określenia efektów cytotoksycznych. Co więcej, włączenie komparatorów komórek CAR (niewłączonych do obecnego badania ze względu na ograniczenia w pozyskiwaniu) samodzielnie lub w połączeniu z CAR-EV, a także włączenie równoległego leczenia kontrolnych linii komórkowych nienowotworowych, mogłoby pogłębić wartość interpretacyjną wyników.

Badanie to podkreśla potencjalne zastosowanie pojazdów elektrycznych EGFR/HER2 CAR jako realnej strategii terapeutycznej w przypadku określonych nowotworów. Zwiększenie skuteczności CAR EV można osiągnąć poprzez wielokrotne dawkowanie lub wstępną aktywację macierzystych limfocytów T w celu zwiększenia cytotoksyczności. Co więcej, postępy w nowych podejściach, takich jak ładunki siRNA, oraz poprawa zdolności wiązania EGFR/HER2 stwarzają możliwości udoskonalenia projektu tych platform terapeutycznych20,21. Obiecujące zastosowanie podwójnych chimerycznych receptorów antygenowych (dual-CAR) w terapii komórkowej stwarza dodatkową szansę na postęp. Rozszerzenie zastosowania podwójnych CAR poprzez wykorzystanie ich odpowiedników EV w terapiach może być kluczowym krokiem w poszerzaniu ich zakresu terapeutycznego i ulepszaniu metod leczenia22,23. Monitorowanie w czasie rzeczywistym cytotoksyczności komórek rakowych sterowanych przez CAR EV (np. aktywacja kaspazy 3/7, odczyt impedancji) dostarcza cennych informacji na temat określenia optymalnych schematów dawkowania, ułatwiając usprawnione tłumaczenie na przyszłe zastosowania in vivo.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L i Rice G są pracownikami INOVIQ Ltd.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Sienie Barton, Hibie Rashid, Sarze Nikseresht, Shayalini Wignarajah i Abelowi Sujeevowi za ich wkład w laboratorium. Autorzy dziękują wszystkim wewnętrznym i zewnętrznym współpracownikom, a to badanie jest wspierane i finansowane przez INOVIQ Ltd.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Gibco (firma Gibco)10010049Wzbogacanie pojazdów elektrycznych
1% dodecylosiarczan sodu (SDS)SigmaL3771-100GRozpuść 1 g proszku SDS w 10 ml ultraczystej wody
1x tris buforowana sól fizjologiczna z Tween-20 (TBST)Chemikalia Thermo ScientificJ77500. Zobacz materiał K2Rozcieńczyć ultraczystą wodą, aby uzyskać 1x roztwór (alternatywnie, przygotować 0,1% roztwór polisorbatu-20/Tween-20 w 1x tris buforowanej soli fizjologicznej)
96-dołkowa, przezroczysta, płaska płytka polistyrenowa poddana działaniu TC, sterylnaCorning3595Test funkcjonalny In vitro
Bolt Bis-Tris Plus Mini żele białkowe, 4-12%, 1,0 mm, format WedgeWellInvitrogenCharakterystyka ogniwa/EV
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647-100GCharakterystyka ogniwa/EV
Przeciwciało CalnexinSygnalizacja komórkowa2433SCharakterystyka ogniwa/EV
Komórki CAR-NK/TProMab BiotechnologiesRóżni sięZewnątrzkomórkowa domena wiążąca ligand CAR zależy od preferowanego celu na komórkach biorcy
CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek (MTS)Preparat PromegaKlasa G3580Test funkcjonalny In vitro
cOmpete, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyRoche11836170001Liza komórek
Odczynnik do wykrywania e-blot ECL Western blotAmershamRPN2232Charakterystyka ogniwa/EV
Bufor elucyjnyINOVIQ powiedział:Wzbogacanie/izolacja EV
Bufor równowagiINOVIQ powiedział:Wzbogacanie/izolacja EV
Kolumna EGZO-ACE IEXINOVIQ powiedział:Wzbogacanie/izolacja EV do dalszego testu funkcjonalnego
Identyfikator patentu AU2024901931
Koraliki wychwytujące pan-egzosomy EXO-NETINOVIQ powiedział:Izolacja EV do dalszej charakterystyki
Patent ID WO/2014/011673
Przeciwciało Granzyme BSygnalizacja komórkowa4275Charakterystyka ogniwa/EV
Ludzki samolot IL-2 IS, klasa premiumMiltenyi Biotec130-097-744Hodowla komórek T/NK bez ksenotypów
Stosy transferowe iBlot 2, PVDFInvitrogenCharakterystyka ogniwa/EV
ImmunoCult-XF (cGMP)Technologie komórek macierzystych100-0956Hodowla komórek T/NK bez ksenotypów
Zobacz materiał K-562Kontroler ATCC (Kontroler TZobacz materiał CCL-243Test funkcjonalny In vitro
MCF-7 (Moduł MCF-7)Kontroler ATCC (Kontroler TZobacz materiał HTB-22Test funkcjonalny In vitro
Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22 i mikro; mMerck MilliporeSLGPR33RSFiltracja końcowa
Bufor regeneracyjnyINOVIQ powiedział:Wzbogacanie/izolacja EV
Bufor RIPA (10X)Technologia sygnalizacji komórkowej9806Liza komórek
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco (firma Gibco)15250061Ocena żywotności i gęstości komórek
Bufor do płukaniaINOVIQ powiedział:Wzbogacanie/izolacja EV
Sprzęt
Automatyczny licznik komórekInvitrogenHrabina II FLOcena żywotności i gęstości komórek
Laboratoryjny automatyczny przyrząd do ekstrakcjiInvitrogenSystem wierzchołkowy KingFisherZautomatyzowany system oczyszczania o wysokiej przepustowości
Szczegółowe informacje na temat protokołu można znaleźć pod linkiem: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
Mikroskop fluorescencyjnyZeissObserwator aksjo 7Hodowla komórkowa
Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)Particle Metrix GmbHZetaview PMX-130Analiza cząstek
Czytnik płytekBMG LabtechSPECTROstar NanoTest funkcjonalny In vitro
Wirówka stołowa z chłodzeniemBeckman CoulterAvanti J-15RHodowla komórkowa i Przetwarzanie wzbogacania EV
Mini zbiornik żelu SDS-PAGEInvitrogenNr kat. A25977Charakterystyka ogniwa/EV
System transferu Western blotInvitrogeniBlot 2 (Plik iBlot 2)Charakterystyka ogniwa/EV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date. Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).
  2. Jain, M. D., Smith, M., Shah, N. N. How I treat refractory CRS and ICANS following CAR T-cell therapy. Blood. 141 (20), 2430-2442 (2023).
  3. Tang, X. J., et al. Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes: A cell-free modality for targeted cancer therapy. Oncotarget. 6 (42), 44179-44190 (2015).
  4. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. JEV. 12 (12), e12387(2023).
  5. Jiang, Y., et al. Hypoxia enhances the production and antitumor effect of exosomes derived from natural killer cells. Ann Transl Med. 9 (6), 473-473 (2021).
  6. Decot, V., et al. Natural-killer cell amplification for adoptive leukemia relapse immunotherapy:comparison of three cytokines IL-2, IL-15, or IL-7 and impact on NKG2D, KIR2DL1, and KIR2DL2 expression. Exp Hematol. 38 (5), 351-362 (2010).
  7. Kim, I. Y., et al. Functional enhancement of exosomes derived from NK cells by IL-15 and IL-21 synergy against hepatocellular carcinoma cells: The cytotoxicity and apoptosis in vitro study. Heliyon. 9 (6), e16962-e16962 (2023).
  8. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. J Vis Exp. (95), e50974(2015).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis-an accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. JEV. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Khanabdali, R., et al. High throughput surface epitope immunoaffinity isolation of extracellular vesicles and downstream analysis. Biol Methods Protoc. 9 (1), bpae032(2024).
  11. Salomon, C., et al. Early detection of ovarian cancer: An accurate high-throughput extracellular vesicle test. J Clin Oncol. 43 (16_suppl), 5582-5582 (2025).
  12. Fu, W., et al. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity. Nat Commun. 10 (1), 1-12 (2019).
  13. Zheng, W., et al. Inhalable CAR-T cell-derived exosomes as paclitaxel carriers for treating lung cancer. J Transl Med. 21 (1), 383(2023).
  14. Tian, J., et al. Engineered exosome for drug delivery: Recent development and clinical applications. Int J Nanomed. 18, 7923-7940 (2023).
  15. Chen, Z., et al. Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review. J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).
  16. Basyoni, A. E., Atta, A., Salem, M. M., Mohamed, T. M. Harnessing exosomes for targeted drug delivery systems to combat brain cancer. Cancer Cell Int. 25 (1), 150(2025).
  17. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  18. Zhang, W., et al. Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography. Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).
  19. Fernandes, R. P., et al. Targeted isolation of extracellular vesicles from cell culture supernatant using immuno-affinity chromatography. Sep Purif Technol. 358 (Part A), 130312-130312 (2024).
  20. Jiang, J., et al. Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases. JNB. 22 (1), 159(2024).
  21. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728-100728 (2024).
  22. Shi, M., et al. Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial. Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).
  23. Roddie, G., Amrolia, P. J. Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zewn trzkom rkowe p cherzyki CARizolacja egzosom wchromatografia wymiany jonowejledzenie nanocz stekizolacja zgodna z GMPdostarczanie terapeutyk w RNAwysokoprzepustowa analiza p cherzyk w zewn trzkom rkowychp cherzyki CAR EGFRp cherzyki CAR HER2

Powiązane artykuły