Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie ludzkich organoidów sercowych z embrionalnych komórek macierzystych poprzez krokową indukcję mezodermy i samoorganizację 3D

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68738

⸱

7 października 2025

 , 
1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje krok po kroku metodę generowania funkcjonalnych organoidów ludzkiego serca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Obejmuje etapy rozmrażania, różnicowania i dojrzewania komórek, zapewniając solidną platformę do rozwoju serca i modelowania chorób.

Streszczenie

Organoidy serca pochodzące z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) to wielokomórkowe trójwymiarowe (3D) struktury, które podsumowują kluczowe aspekty wczesnego rozwoju i funkcji ludzkiego serca. Te samoorganizujące się organoidy wykazują spontaniczną kurczliwość, ekspresję markerów kardiomiocytów i strukturę przypominającą tkankę, przypominającą natywny mięsień sercowy. W tym miejscu przedstawiamy solidny i powtarzalny protokół generowania organoidów sercowych z linii hESC H9 poprzez stopniowe różnicowanie linii. Indukcję mezodermy rozpoczyna się przez leczenie sferoidów przez 36-40 godzin aktywiną A (50 ng/ml), białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP4, 10 ng/ml), czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF2, 30 ng/ml), laduviglusibem (CHIR99021, 3 μM) i inhibitorem kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K) (LY294002, 5 μM). Specyfikacja linii serca jest następnie kierowana przez codzienną ekspozycję przez cztery dni na BMP4 (10 ng / ml), FGF2 (10 ng / ml), inhibitor szlaku Wnt (XAV-939, 5 μM) i kwas retinowy (0,5 μM). Różnicowanie i dojrzewanie kardiomiocytów jest dodatkowo wspomagane od 5,5 dnia za pomocą BMP4 (10 ng / ml), FGF2 (10 ng / ml) i insuliny (10 μg / ml). Walidację funkcjonalną uzyskuje się poprzez obrazowanie poklatkowe i analizę immunofluorescencyjną, potwierdzając wytwarzanie kurczliwych kardiomiocytów oznaczonych ekspresją sercowej troponiny T (cTnT). Dodatkowo barwienie immunologiczne 3D ujawnia obecność α-SMA i CDH5, co wskazuje na pojawienie się populacji komórek mięśni gładkich i śródbłonka. Te organoidy sercowe konsekwentnie wykazują rytmiczne skurcze; Nie przeprowadzono jednak bezpośredniej walidacji elektrofizjologicznej sprzężenia elektromechanicznego. Znane ograniczenia obejmują niezdolność do pasażowania organoidów i potencjalną martwicę centralną podczas rozszerzonych hodowli. Podsumowując, model ten stanowi skalowalną i fizjologicznie istotną platformę do badania ludzkiej kardiogenezy, reakcji na leki i wrodzonych chorób serca.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, co podkreśla pilną potrzebę wiarygodnych modeli in vitro, które podsumowują rozwój i funkcję ludzkiego serca 1,2. Tradycyjne dwuwymiarowe (2D) jednowarstwowe hodowle kardiomiocytów, choć cenne, nie są w stanie odtworzyć złożoności przestrzennej, interakcji wielokomórkowych i integracji elektromechanicznej rodzimego ludzkiego serca 3,4. Organoidy sercowe 3D pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych pojawiły się jako potężne platformy, które rozwiązują te ograniczenia, zapewniając samoorganizujące się, wielokomórkowe struktury, które naśladują wczesną morfogenezę serca i dojrzewanie funkcjonalne in vitro5.

hESC, takie jak linia H9, posiadają wewnętrzną zdolność do różnicowania się we wszystkie typy komórek somatycznych, w tym kardiomiocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty serca6. W kontrolowanych warunkach hodowli hESC można przeprowadzić przez kolejne etapy indukcji mezodermy, specyfikacji mezodermy serca i różnicowania kardiomiocytów 5,7. Ten krokowy proces można regulować za pomocą określonych cząsteczek sygnałowych i inhibitorów, w tym inhibitorów Activin A, BMP4, FGF2, PI3K, CHIR99021, inhibitorów Wnt i kwasu retinowego 5,8. Poprzez ścisłe naśladowanie środowiska sygnalizacyjnego in vivo rozwoju embrionalnego serca, sygnały te promują wydajną i powtarzalną kardiogenezę in vitro 5,7.

W przeciwieństwie do wielu układów organoidowych, które wymagają osadzenia w elementach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takich jak Matrigel, organoidy sercowe mogą samoorganizować się w warunkach niskiej adhezji bez wsparcia matrycy 5,9. Agregacja różnicujących się hESC w zawiesinie daje kuliste struktury 3D, które wykazują spontaniczne bicie w ciągu pierwszego tygodnia różnicowania10. Organoidy te zawierają funkcjonalnie istotne populacje komórek serca i wykazują charakterystyczne cechy, takie jak organizacja sarkomeryczna, stany przejściowe wapnia i rytmiczne skurcze 11,12, oferując fizjologicznie istotny model wczesnej ludzkiej tkanki serca.

Zdolność do generowania organoidów sercowych pochodzących z hESC oferuje ekscytujące możliwości w zakresie biologii rozwojowej, modelowania chorób, badań przesiewowych leków i testów kardiotoksyczności13,14. Co więcej, integracja z technologiami edycji genomu i indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (iPSC) specyficznymi dla pacjenta umożliwia spersonalizowane modelowanie chorób i eksplorację terapeutyczną dziedzicznych chorób serca.

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy, krok po kroku protokół generowania organoidów sercowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, podkreślając kluczowe etapy różnicowania, warunki hodowli i techniki walidacji. Platforma ta zapewnia solidny, skalowalny system do podsumowania rozwoju serca człowieka i stworzenia podstaw dla przyszłych badań translacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (H9) zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komisję Etyki Biomedycznej Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego, zatwierdzenie 20241023-031. Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową opisane poniżej powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Zawsze upewnij się, że pożywka i odczynniki mają temperaturę pokojową, zrównoważoną w naturalny sposób przed użyciem. Nie używaj łaźni wodnej do podgrzewania mediów.

1. Rozmrażanie i rutynowe hodowle HESC (H9)

  1. Powlekanie płytek hodowlanych witronektyną
    1. Rozmrozić wywar z witronektyny na lodzie i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μg/ml przy użyciu zimnego podłoża E8.
    2. Dodać 1 ml rozcieńczonego roztworu witronektyny do 6-dołkowej płytki na studzienkę. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-4 godziny przed użyciem.
    3. Przed wysiewem komórek odessać nadmiar witronektyny i nie spłukiwać.
      UWAGA: Inkubacja w inkubatorze hodowli komórkowych poprawia jednorodność powłoki i zwiększa przyczepianie komórek, co jest szczególnie ważne w przypadku wrażliwych komórek macierzystych. Nie dopuścić do wyschnięcia roztworu powłokowego. W protokole tym wykorzystuje się płytki pokryte witronektyną tylko podczas etapów rozmrażania i rozprężania hESC, aby zapewnić zdefiniowany, związany powierzchniowo substytut ECM. Organoidy sercowe są następnie formowane w wyniku samoagregacji w warunkach zawiesiny o niskiej adhezji, bez potrzeby stosowania ECM.
  2. Rozmrażanie kriokonserwowanych HESC (H9)
    1. Co najmniej 30-60 minut wcześniej pozwól, aby wszystkie wymagane podłoża i odczynniki (np. pożywka E8, inhibitor E8 + ROCK, PBS) w naturalny sposób zrównoważyły się do temperatury pokojowej.
    2. Pobrać jeden kriowial ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H9 z magazynu ciekłego azotu przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej. Natychmiast zanurz kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Delikatnie obracać fiolką i uważnie monitorować.
    3. Gdy pozostanie mały kryształek lodu (~90% rozmrożony, ~1-2 min), natychmiast przenieś fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Przed otwarciem zdezynfekuj zewnętrzną część kriowialu 75% etanolem.
    4. Powoli przenieść zawartość kriowialu kroplami do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki E8 o temperaturze pokojowej uzupełnionej 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK). Mieszać delikatnie, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze.
    5. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki E8 + Y-27632.
    6. Umieść komórki na 6-dołkowej płytce pokrytej witronektyną (przygotowanej wcześniej) o pożądanej gęstości wysiewu (zwykle 150 000-200 000 komórek / dołek). Delikatnie kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki, i przenieś do inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
      UWAGA: Stosowanie inhibitora ROCK (Y-27632) ma kluczowe znaczenie w ciągu pierwszych 24 godzin po rozmrożeniu, aby zapobiec anoikis i pomóc w przeżyciu.
  3. Rutynowa konserwacja i przechodzenie
    1. Zmieniaj pożywkę codziennie, używając 2 ml świeżej pożywki E8 na dołek.
    2. Monitoruj codziennie pod mikroskopem z kontrastem fazowym; Komórki pasażowe, gdy osiągną ~70-80% konfluencji, zwykle co 3-4 dni.
      1. Do przejścia: Odessać pożywkę i delikatnie spłukać 1 ml DPBS.
      2. Dodać 0,5 ml odczynnika do dysocjacji komórek macierzystych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut. Delikatnie postukaj w płytkę, aby usunąć kolonie.
      3. Zebrać zawiesinę komórek i ponownie patyczować w stosunku podziału 1:3-1:4 na świeżo pokrytych witronektyną studzienkach w pożywce E8 zawierającej 10 μM Y-27632. Po 24 godzinach należy wymienić pożywkę na E8 bez ROCKi.
        UWAGA: Aby uzyskać optymalną regenerację i późniejszą wydajność różnicowania, HESC powinny być pasażowane jako małe skupiska po 2-10 komórek.
        Zaleca się stosowanie końcówek o szerokim otworze, aby zminimalizować naprężenia ścinające. Do mieszania można użyć końcówki do pipety o pojemności 5 ml lub pipety serologicznej o pojemności 10 ml.

2. Różnicowanie HESC (H9) w linię serca

  1. Indukcja różnicowania mezodermalnego (dzień 0-1,5)
    UWAGA: Unikaj bezpośredniego różnicowania świeżo rozmrożonych HESC (H9) na organoidy sercowe. Bardzo ważne jest, aby komórki były najpierw pasażowane i utrzymywane przez co najmniej jedno pasaż przed zainicjowaniem różnicowania, aby zapewnić optymalną żywotność komórek i zdrowe różnicowanie. Różnicowanie komórek natychmiast po rozmrożeniu może skutkować słabymi wynikami z powodu pogorszenia zdrowia komórek.
    1. Wysiew preindukcyjny: Gdy hPSC osiągną około 70% konfluencji, delikatnie zdysocjuj komórki na małe klastry za pomocą odpowiedniego odczynnika dysocjacyjnego. Zawiesić klastry w 2 ml pożywki E8 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Y-27632).
    2. Agregacja: Umieść 200 μl zawiesiny komórek (zwykle 12 000-15 000 komórek) do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu, a następnie odwiruj płytkę przy 200 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby ułatwić agregację komórek na dnie każdej studzienki.
    3. Inkubacja: Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i hodować ją przez 24 godziny, aby umożliwić tworzenie zwartych i jednorodnych ciał zarodkowych (EB).
    4. Przygotuj podstawową pożywkę hodowlaną (BC-M), łącząc 50% IMDM, 50% mieszanki składników odżywczych F12, 15 μg/ml insuliny-transferyny-selenu (ITS-G), 450 μM monotioglicerolu i 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej frakcji V.
    5. Przygotuj MD-M, uzupełniając BC-M aktywiną A (50 ng / ml), BMP4 (10 ng / ml), CHIR99021 (3 μM), FGF2 (30 ng / ml) i LY294002 (5 μM).
    6. Indukcja mezodermalna: Po 24 godzinach agregacji indukuj EB przez 36 godzin za pomocą MD-M.
      UWAGA: Aby zapewnić skuteczność indukcji i spójność organoidów sercowych, ściśle ograniczyliśmy stosowanie hESC H9 do trzech pasaży po rozmrożeniu. Strategia ta ma kluczowe znaczenie dla utrzymania wysokiej wydajności różnicowania i ogólnej niezawodności eksperymentu.
      Delikatne obchodzenie się z medium podczas wymiany medium ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności formowanych agregatów. Unikaj zakłócania kulistej morfologii EB.
  2. Indukcja różnicowania mezodermalnego serca (dni 1,5-5,5)
    UWAGA: Inhibitor sygnalizacji Wnt (XAV-939) ma kluczowe znaczenie dla tłumienia tylnych sygnałów mezodermalnych i promowania specyfikacji linii serca. Kwas retinowy odgrywa wrażliwą na dawkę rolę w kształtowaniu się przednio-tylnym; nadmierne RZS może prowadzić do specyfikacji jelita przedniego.
    1. Uzupełnij BC-M (skład szczegółowo opisany w kroku 2.1) o BMP4 (10 ng / ml), FGF2 (10 ng / ml), kwas retinowy (0,5 μM) i XAV-939 (5 μM) w celu przygotowania pożywki do różnicowania mezodermalnego serca (CMD-M).
    2. Po 36-40 godzinach indukcji mezodermalnej ostrożnie odessać MD-M i zastąpić CMD-M na 4 dni z codzienną zmianą pożywki.
      UWAGA: Podczas wymiany podłoża należy obchodzić się z kruszywami delikatnie, aby uniknąć zakłóceń mechanicznych lub apoptozy wywołanej naprężeniami.
      W tym okresie sferoidy stają się bardziej zwarte i zorganizowane. Wczesne oznaki zaangażowania linii serca można zaobserwować pod mikroskopią jasnego pola do 5 dnia.
  3. Specyfikacja organoidów sercowych (dni 5,5-7,5)
    1. Uzupełnij BC-M (skład szczegółowo opisany w kroku 2.1) o BMP4 (10 ng/ml), FGF2 (10 ng/ml) i insulinę (10 mg/ml) w celu przygotowania pożywki o specyfikacji organoidów sercowych (COS-M).
    2. W dniu 5.5 delikatnie odessać CMD-M i zastąpić go COS-M na 2 dni z wymianą pożywki każdego dnia.
      UWAGA: BMP4 i FGF2 synergistycznie promują ekspansję progenitorów serca i tłumią losy niesercowe na tym etapie. Insulina wspomaga aktywność metaboliczną i rozwój strukturalny różnicujących się kardiomiocytów.
  4. Dojrzewanie organoidów sercowych
    UWAGA: Należy unikać pełnej dysocjacji lub pipetowania sferoidów podczas przenoszenia. Kardiomiocyty są bardzo wrażliwe na naprężenia ścinające.
    1. Uzupełnij BC-M (skład szczegółowo opisany w kroku 2.1) insuliną (10 mg/ml) w celu przygotowania pożywki do dojrzewania organoidów sercowych (COM-M).
    2. Począwszy od dnia 7.5, przejście na COM-M. Codziennie wykonuj zmiany pożywki, aby utrzymać poziom składników odżywczych i usunąć odpady metaboliczne, jednocześnie minimalizując stres.
    3. Od 8 do 12 dnia szukaj spontanicznego bicia organoidów sercowych, które zwykle staje się widoczne pod mikroskopem świetlnym.
    4. Do dnia 12+ upewnij się, że rytm skurczowy jest regularny i utrzymujący się.
      UWAGA: Częstość uderzeń i morfologię można określić ilościowo za pomocą mikroskopii poklatkowej i narzędzi do analizy obrazu.
      Analizę elektrofizjologiczną (np. obrazowanie wapnia lub MEA) można przeprowadzić od 12 dnia w celu oceny dojrzałości funkcjonalnej.

3. Przygotowanie do kriokonserwacji

  1. Ostrożnie przenieś organoidy sercowe z płytki hodowlanej za pomocą pipety o szerokim otworze, aby uniknąć naprężeń mechanicznych. Umieść je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i pozwól organoidom naturalnie osiąść grawitacyjnie przez 3-5 minut bez wirowania.
  2. Przygotuj pożywkę do kriokonserwacji (Cryo-CM) z następującymi składnikami (stężenia końcowe): 80% CM-M, 10% FBS, 10% DMSO.
  3. Delikatnie zawiesić organoidy sercowe w 500 μl Cryo-CM na kriowial.
  4. Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania na bazie izopropanolu. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 12-24 godziny, aby zapewnić stopniowe chłodzenie w temperaturze ~1 °C/min.
  5. Po zamrożeniu przez noc przenieść fiolki do przechowywania ciekłego azotu w celu długotrwałej konserwacji.
    UWAGA: Kriokonserwowaliśmy organoidy serca w gęstości około 20-30 dojrzałych organoidów na kriowial, zawieszonych w 1 ml pożywki do krioprezerwacji.

4. Odzyskiwanie i rozmrażanie organoidów sercowych

  1. Aby odzyskać organoidy, szybko rozmrozić fiolki w łaźni wodnej, przenieść organoidy sercowe do podłoża CM-M, delikatnie odwirować w celu usunięcia DMSO i ponownie zawiesić organoidy w świeżym CM-M.
    UWAGA: Ubijanie po rozmrożeniu zwykle wznawia się w ciągu 24-48 godzin, w zależności od dojrzałości organoidów i jakości obróbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne różnicowanie hESC H9 w organoidy sercowe rozpoczyna się od silnego ożywienia i utrzymania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po rozmrożeniu hESC wykazują wysoką żywotność i przyczepność po posianiu na płytkach pokrytych witronektyną w pożywce E8 uzupełnionej inhibitorem ROCK. W ciągu 24-48 godzin można zaobserwować zwarte kolonie o określonych krawędziach i wysokim stosunku jądra do cytoplazmy, co wskazuje na odzyskanie typowej niezróżnicowanej morfologii (ryc. 1A). Po rozmro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomyślne wygenerowanie organoidów sercowych z hESC H9 opiera się na precyzyjnej czasowej i przestrzennej regulacji kluczowych szlaków sygnałowych w celu naśladowania wczesnego rozwoju serca. Protokół ten podsumowuje krytyczne etapy indukcji mezodermy, specyfikację linii serca i samoorganizację w struktury kurczliwe 3D w chemicznie zdefiniowanym systemie. Metoda ta zapewnia solidną i powtarzalną platformę do modelowania rozwoju ludzkiego serca, wrodzonych wad serca i badań przesiewowych kardiotoksyczności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Junfeng Ji (Szkoła Podstawowych Nauk Medycznych, Uniwersytet Zhejiang, Chiny) i Tao Luo (Szkoła Podstawowych Nauk Medycznych, Uniwersytet Zhejiang, Chiny) za uprzejme udostępnienie komórek macierzystych (H9). Prace te były wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr U23A20398 dla C.Z.), Sichuan Science and Technology Program (grant nr 2022YFS0578 i 2022YFS0614 dla C.Z.), Research Start-up Foundation of Southwest Medical University (grant nr 00040155 dla C.Z.), Research Start-up Foundation of Southwest Medical University (grant nr 00170071 dla B.W.), Programy Strategicznej Współpracy Naukowej i Technologicznej Ludowego Samorządu Miejskiego Luzhou i Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego (grant nr 2024LZXNYDJ088 dla BW), Projekt Strategicznej Współpracy Naukowo-Technologicznej Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego (grant nr 2024PZXNYD01 dla BW) oraz Fundacji Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego (grant nr 2024ZKZ014 dla BW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,02% substancji EDTABeyotimeZobacz materiał C0198
6 dobrze  talerzCORNING3516
7,5% albuminy surowicy bydlęcejACMEC (Międzynarodowa Sieć HamulcowaAC11954
96-dołkowa bardzo niska płytka mocującaCORNING7007
Alexa Fluor 488 Osioł anty-mysie IgGYeasen powiedział:Numer katalogowy: 34106ES60
Alexa Fluor 555 Koza anty-królikInvitrogenA-21428
CHIR-99021 monochlorowodorekYeasen powiedział:Numer katalogowy 52965ES10
DMSO Solarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał D8370
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)Yeasen powiedział:Numer katalogowy: 60152ES76
FBS (Sieć UsługowaGibco (firma Gibco)10099141C
Białko FGF2, ludzkie, rekombinowaneCelMolTMPY-00749-50 μ g 
Mieszanka odżywcza F-12 szynkiTechnologie życiowe11765054
hPSC-CDM (podłoże Essential 8)Komórka kalafiasowa400105
Ludzkie białko rekombinowane BMP-4Gibco (firma Gibco)PHC9534
IMDM, Suplement GlutaMAXTechnologie życiowe31980030
Insulina-transferyna-selen (ITS -G)Gibco (firma Gibco)41400045
LY294002Selleck powiedział:S1105-50mg tabletki powlekane
MonotioglicerolSigma-AldrichZobacz materiał M6145
Mysz anty-αSMAAbmart powiedział:MN50104
Uchwyt antyblakowy ProLong Diamond z DAPIInvitrogenZobacz materiał P36966 powiedział:
Królik anty-CDH5Abmart powiedział:TA6265 powiedział:
Królik anty-cTNTInvitrogen701620
Rekombinowane ludzkie białko BMP-4Yeasen powiedział:Numer katalogowy 92053ES20
Rekombinowana insulina ludzka Yeasen powiedział:Numer katalogowy: 40112ES25
Rekombinowane białko aktywiny A u człowieka / myszy / szczuraYeasen powiedział:Numer katalogowy: 91702ES10
ReLeSRKomórka macierzysta100-0483
Kwas retinowySigma-AldrichCzynnik R2625
WitronektynaGibco (firma Gibco)Certyfikat A14700
XAV-939Selleck powiedział:Zobacz materiał S1180
Y-27632 2HCl (inhibitor ROCK)Selleck powiedział:Zobacz materiał S1049

Bibliografia

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game-changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Ni, B., Ye, L., Zhang, Y., Hu, S., Lei, W. Advances in humanoid organoid-based research on inter-organ communications during cardiac organogenesis and cardiovascular diseases. J Transl Med. 23 (1), 380(2025).
  3. Mohr, E., Thum, T., Bär, C. Accelerating cardiovascular research: Recent advances in translational 2D and 3D heart models. Eur J Heart Fail. 24 (10), 1778-1791 (2022).
  4. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  5. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  6. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: A methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  7. Yang, N., et al. Human cardiac organoid model reveals antibacterial triclocarban promotes myocardial hypertrophy by interfering with endothelial cell metabolism. Sci Bull. 70 (3), 342-346 (2025).
  8. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  9. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  10. Liu, C., Feng, X., Li, G., Gokulnath, P., Xiao, J. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76 (1), 103813(2022).
  11. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nat Commun. 11 (1), 4283(2020).
  12. Yang, J., et al. Generation of human vascularized and chambered cardiac organoids for cardiac disease modelling and drug evaluation. Cell Prolif. 57 (8), e13631(2024).
  13. Kim, H., Kamm, R. D., Vunjak-Novakovic, G., Wu, J. C. Progress in multicellular human cardiac organoids for clinical applications. Cell Stem Cell. 29 (4), 503-514 (2022).
  14. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 39 (6), 737-746 (2021).
  15. Klimanskaya, I., McMahon, J. Approaches for derivation and maintenance of human embryonic stem cells. Handb Stem Cells. , 1st ed, Elsevier Academic Press. (2004).
  16. Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799(2022).
  17. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3D bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie embrionalne komórki macierzystetrójwymiarowa samoorganizacjaróżnicowanie kardiomiocytówspecyfikacja linii komórkowejanaliza immunofluorescencyjnaobrazowanie time-lapsetroponina T sercakomórki mięśni gładkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.