Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu do podłużnego pobierania płynu śródmiąższowego w zwierzęcym modelu glejaka

DOI:

10.3791/68748

⸱

23 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo komunikacja międzykomórkowa leżąca u podstaw wielu chorób ośrodkowego układu nerwowego, takich jak glejak (GBM), jest notorycznie trudna do zmierzenia i scharakteryzowania. Opisujemy tutaj procedury mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu (cOFM), które można zastosować do pobierania próbek składników płynu międzymiąższowego w podłużnym modelu zwierzęcym GBM.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN) objawiają się poprzez złożoną, dynamiczną sieć komunikacji międzykomórkowej. Glejak (GBM), najczęstszy i najbardziej agresywny pierwotny guz mózgu, jest symbolem tej złożoności, ze swoim szybkim postępem i fatalną prognozą mierzoną w miesiącach, a nie latach. Biologia GBM opiera się na złożonych wymianach cząsteczek sygnałowych między komórkami neoplastycznymi a stromalnymi, co stanowią podstawę agresywnego postępu choroby. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu (cOFM) w modelach myszy GBM, umożliwiający monitorowanie w czasie rzeczywistym podłużnego dynamiki mikrośrodowiska guza w płynie śródmiąższowym (ISF). Nasze podejście opisuje implantację trwałych kaniuli prowadzących na głowę, ich zastosowanie do wszczepienia glejaka śródmózgowego bezpośrednio przez przewodnik oraz zbieranie próbek cOFM o wysokiej wierności do analiz metabolomicznych i proteomicznych LC-MS. Co istotne, cOFM przezwycięża ograniczenia wielkości cząsteczki tradycyjnej mikrodializy. Poza GBM, metodologia cOFM obiecuje przełomowe wglądy w spektrum zaburzeń OUN, w tym neurodegeneracyjne, padaczkowe i neuropsychiatryczne, dzięki zdolności do dostarczania biomarkerów etiologicznych i reaktywnych na leczenie w ich modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest notorycznie trudne ze względu na złożone, wielokomórkowe sygnalizowanie międzykomórkowe pośredniczone przez płyn śródmiąższowy (ISF)1,2,3,4. Ta złożoność jest szczególnie widoczna w guzach mózgu, takich jak glejak (GBM), gdzie sygnały międzykomórkowe są przekazywane zarówno między komórkami nowotworowymi, jak i stromalnymi 5,6,7,8,9. W wielu przypadkach nienaturalna wymiana różnorodnych biocząsteczek, w tym metabolitów i białkowych przekaźników, przyczynia się do ukształtowania pierwotnej etiologii patologii OUN. To wyzwanie badawcze jest szczególnie spotęgowane, zwłaszcza w GBM, przez fakt, że skład molekularny ISF jest czasowo dynamiczny i ewoluuje w trakcie postępu choroby oraz w odpowiedzi na leczenie interwencyjne10,11.

Tradycyjne przedkliniczne metody badań GBM obejmują badania in vitro oraz modele zwierzęce z pojedynczym punktem końcowym. Charakter tych podejść ogranicza ich szerszą użyteczność kliniczną ze względu na niezdolność do uchwycenia zarówno cech mikrośrodowiska guza, jak i podłużnych zmian czasowych. Postępy wprowadzone na początku lat 80. przezwyciężyły te ograniczenia kontekstowe dzięki rozwojowi mikrodializy intracerebralnej (cMD)12,13,14,15. Od momentu powstania 45 lat temu, cMD ugruntował swoją pozycję jako standardowa metoda podłużnego pobierania próbek płynu śródmiąższowego (ISF)w żywym mózgu. Osiąga się to poprzez swobodną dyfuzję i konwekcję wysokostężeniowych substancji rozpuszczonych ISF przez błonę półprzepuszczalną do stale płynącego, niskostężeniowego perfuzjatu, zazwyczaj sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)17. Te półprzepuszczalne membrany składają się z różnych biokompatybilnych polimerów o typowych granicach wielkości porów o masie molekularnej w zakresie od 20 kDa do 3 MDa18. Ten minimalnie inwazyjny zabieg umożliwia podłużne zbieranie in situ różnorodnych analitów, od małych cząsteczek, takich jak metabolity czy neuroprzekaźniki, po duże białka, takie jak przeciwciała. Jednak porowatość strukturalna membran cMD w połączeniu z adsorpcyjnym charakterem polimerów składowych może znacząco wpływać na względny odzysk analitów o określonych cechach biochemicznych lub wymiarowych, takich jak lipidy lub przeciwciała, odpowiednio19,20.

Postępy w celu przezwyciężenia tego ograniczenia błon cMD rozpoczęły się na początku lat 2010. wraz z opracowaniem mózgowej mikroperfuzji otwartego przepływu (cOFM)21. Działając na podobnych ogólnych zasadach co cMD, cOFM usuwa ograniczenia biochemiczne narzucone przez błony półprzepuszczalne, zamieniając je na sonda z siatką plastikową o niskiej adsorpcji o otworach makroskopowych o rozmiarze około 100 μm20. Wiele raportów wykazało poprawę użyteczności cOFM nad cMD dzięki zbieraniu wykrywalnych składników ISF, w tym hormonów peptydowych, nanociał/przeciwciał, małych lipofilowych terapii oraz liposomów PEGylowanych 19,22,23,24,25 . Wcześniejsze raporty analizujące fizjologiczną reakcję tkanek na implantację sondy prowadzącej cOFM pokazują, że integralność bariery krew-mózg zostaje przywrócona do 15 dni po implantacji, a blizny glejowe nie powstają do 30 dni po implantacji,26 dni. Dzięki zastąpieniu błon mikrodializujących otworami makroskopowymi, badacze wykazali również innowacyjną zdolność sond prowadzących cOFM do ułatwiania wstrzyknięcia ksenprzeszczepionych komórek glejaka do mózgów szczurów niedoborowych odporności, tak aby aurazowe wszczepienie i wzrost guza zachodziły bezpośrednio w okolicach obszaru pobierania próbekcOFM 27.

Rozważania dotyczące stosowania cOFM w badaniach patologii OUN muszą nadal uwzględniać jego ograniczenia metodologiczne. Ze względu na uzależnienie od pasywnej dyfuzji i konwekcji analitów ISF w płynący perfuzat, ograniczenia te dotyczą stężenia analitu i objętości próbki18. Próbkowane składniki ISF zostaną rozcieńczone w zebranym perfuzacie cOFM w porównaniu do poziomów endogennych, co skłoniło wiele badań do porównania względnych proporcji analitów między warunkami eksperymentalnymi28. Typowe przepływy wahają się od 0,1 μL/min do 1,0 μL/min, co odpowiada zaledwie 6 μL/h do 60 μL/h. Uwzględniając czas przejścia w martwej przestrzeni rur, należy również uwzględnić całkowity czas próbki. Jest to szczególnie ważne podczas pobierania cOFM u zwierząt znieczulonych, gdzie kwestie dobrostanu zwierząt muszą być starannie uwzględniane. Bardziej szczegółowy opis tych i innych kwestii jest dostępny w wcześniejszym raporcie metodycznym zespołu rozwojowego cOFM29.

W tym manuskrypcie przedstawiamy zaktualizowany protokół stosowania podłużnego pobierania próbek cOFM w badaniach chorób neurologicznych, ze szczególnym uwzględnieniem GBM. Protokół obejmuje etapy wszczepienia kaniuli przewodniczej cOFM, wstrzyknięcia komórek nowotworowych oraz wszczepienia za pomocą przewodnika cOFM, a także dwie konfiguracje pobierania próbek cOFM u zwierząt obudzonych, swobodnie poruszających się. Przedstawiamy reprezentatywne dane pokazujące efekty leczenia na metabolomiczne i proteomiczne składniki ISF mierzone przez cOFM, wpływ konfiguracji próbkowania na stężenia analitów oraz skuteczność implantacji komórek nowotworowych prowadzonej przez cOFM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt w ramach tego protokołu są zatwierdzane przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Northwestern University (identyfikator protokołu: IS00021383) i podlegają wytycznym National Institutes of Health (NIH). Protokół ten został opracowany do stosowania u myszy C57BL/6J, zarówno samców, jak i samic, w minimalnym wieku 8-10 tygodni. Linia komórkowa glejaka mysiego użyta w tym protokole, CT2A, została dostarczona przez laboratorium Seyfrieda na Uniwersytecie Bostońskim i została wyhodowana oraz przygotowana w warunkach sterylnej hodowli tkanek.

1. Planowanie i przygotowanie do operacji

  1. Informacje o zwierzętach: W eksperymentach cOFM używaj myszy mających co najmniej 8-10 tygodni, aby umożliwić pełny wzrost i rozwój. Implanty czaszki o stałej pozycji mogą zostać przemieszczone lub utrudnić prawidłowy wzrost w wciąż rozwijającej się czaszce i/lub mózgu.
  2. Chirurgiczny wybór współrzędnych: Użyj atlasu mózgu zwierząt, aby zlokalizować ortogonalne współrzędne obszaru zainteresowania względem Bregmy. Na przykład implantacje komórek glejaka są zazwyczaj wykonywane w prążkowiu, aby najlepiej odtworzyć natywne mikrośrodowiska GBM i zmaksymalizować skuteczność dalszego rozwoju guza. Współrzędne wszczepienia cOFM stosowane w tym protokole to średnio-boczne (ML) = 2,5 mm, przednie posteriorne (AP) = 0 mm oraz grzbietowo-wentralne (DV) = 3,5 mm.
    UWAGA: Współrzędne stereotaktyczne mogą się różnić w zależności od rodzaju myszy i wieku. Prosimy o użycie współrzędnych atlasu specyficznych dla gatunku i szczepu, aby zapewnić pożądane umieszczenie przewodnika cOFM.
  3. Wybór odpowiednich konfiguracji komponentów cOFM: Zorganizuj składki dla odpowiednich konfiguracji cOFM w określonych całkowitych długościach od 2 mm do 22 mm, z otwartymi długościami powierzchniowymi od 1 mm do 2 mm.
    UWAGA: Zwierzęta mogą usuwać nieprawidłowo wszczepione głowy cOFM podczas wykonywania zachowań pielęgnacyjnych. Aby zminimalizować dźwignię mechaniczną na montaż głowy podczas tej aktywności, zalecamy stosowanie prowadnic nie dłuższych niż 2 do 3 mm dalej niż zamierzona odległość współrzędnych DV.
  4. Planowanie punktów czasowych operacji chirurgicznych i zabiegów pobierania próbek dla celów eksperymentalnych: W zależności od interesującej choroby i cech modelu, starannie zaplanuj czas i kolejność procedur związanych z cOFM, aby optymalnie zbadać biologię leżącą u podstaw.
    1. Jeśli badamy różnice w składzie ISF między zdrowym mikrośrodowiskiem mózgu a guza, wykonaj procedury pobierania próbek cOFM przed i po wszczepieniu guza w tym samym organizmie.
    2. Jeśli badasz wpływ interwencji klinicznych na patologie OUN, wykonuj procedury pobierania próbek cOFM przed i po podaniu w równoległych kohortach zwierzęcych otrzymujących kontrolę lub eksperymentalne.

2. Chirurgia z umiejscowieniem przewodnika cOFM

  1. Złóż narzędzia chirurgiczne do chirurgii założenia przewodniczki cOFM ( Tabela materiałów) i sterylizuj autoklawem, jeśli jest wskazane.
  2. Przygotowanie do pracy chirurgicznej:
    1. Dezynfekcja szafki na zabezpieczenia biologiczne: Wykonuj zabiegi chirurgiczne w odpowiednio zdezynfekowanej szafce zabezpieczeń biologicznych. Aktywuj przepływ powietrza w szafce bio-safety i wyczyść powierzchnie wewnętrzne za pomocą zatwierdzonego środka dezynfekującego i metody przetarcia. Wyłóż dolną powierzchnię szafki sterylnymi zasłonami.
    2. Przygotuj instrumenty stereotaktyczne: Wyczyść ramę stereotaktyczną środkiem dezynfekującym i umieść ją w szafce zabezpieczeń biologicznych. Podobnie wyczyść i zdezynfekować wiertarkę i uchwyt na prowadnicę zamontowaną na stereotaktyce oraz umieścić ją w szafie zabezpieczenia biologicznego.
    3. Poduszka grzewcza na etapie chirurgicznym: Stosuj termofor na stereotaktycznym etapie chirurgii, aby zapewnić dodatkowe ciepło podczas znieczulenia zwierzęcia. Oczyść i zdezynfekuj powierzchnię poduszki grzewczej oraz umieść ją na stereotaktycznej ramie, gdzie zwierzę będzie umieszczone. Włącz termofor na niską temperaturę i nałóż na niego 1-2 sterylne zasłony.
    4. Rozstaw dodatkowe instrumenty chirurgiczne i sprzęt: Aseptycznie umieść dodatkowy sterylizowany sprzęt do szafy bio-bezpieczeństwa.
    5. Konfiguracja klatki odzyskującej: Umieść czystą klatkę regeneracyjną na poduszce grzewczej ustawionej na najniższą możliwą temperaturę. Każde zwierzę musi być umieszczone w indywidualnej klatce do odzyskiwania, dopóki nie zostanie całkowicie wyzdrowione, więc całkowita liczba klatek do regeneracji będzie zależała od wyników operacji i czasu rekonwalescencji.
  3. Przedchirurgiczne przygotowania zwierząt (podsumowane na Rysunku 1A):
    1. Znieczulenie: Podawaj instytucjonalnie zatwierdzone związki i dawki znieczulające w celu uzyskania odpowiedniej głębokości znieczulenia, stosując test odruchu uszczypania łapy oraz głębokość/szybkość oddechu, aby zapewnić odpowiednią znieczulenie. Na przykład podanie do otrzewnej koktajlu ketaminy i ksylazyny (100 mg/kg - 10 mg/kg, w soli fizjologicznej) jest wystarczające, aby uzyskać odpowiednią głębokość znieczulenia u myszy C57BL/6J.
    2. Analgezja: Podawanie zatwierdzonych przez instytucjonalnie związków przeciwbólowych wspomagających leczenie bólu około- i pooperacyjnego. Na przykład podskórne zastrzyki meloksykamu (20 mg/kg, w soli fizjologicznej) oraz buprenorfiny SR (1 mg/kg) są odpowiednie do leczenia bólu okołooperacyjnego.
    3. Usuwanie owłosienia (golenie, krem depilacyjny): Usuń włosy z miejsca operacji na czubku czaszki za pomocą golarki elektrycznej i/lub kremu depilacyjnego. Jeśli używasz kremu depilacyjnego, upewnij się, że nie pozostaje na skórze zbyt długo, aby uniknąć podrażnień.
    4. Maść okulistyczna (Oftalmiczna): Użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie nałożyć maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszaniu rogówki podczas operacji.
    5. Umieszczenie zwierzęcia w stereotaktycznej ramie: Prawidłowo umieść zwierzę w stereotaktycznej ramie, wkładając siekacze do bloku gryzienia, mocno, ale delikatnie wkładając drążki do uszu do przewodów słuchowych oraz mocując zacisk nosowy na kości nosowej zwierzęcia ( rysunek 1B). Jeśli jest odpowiednio ustawiona, czaszka zwierzęcia powinna być mocno zamocowana bez żadnego ruchu.
    6. Preparaty aseptyczne do zabiegu chirurgicznego: Przetrzyj skórę wokół miejsca operacyjnego trzema naprzemiennymi wymazami alkoholu (etylowego lub izopropylowego) oraz jodu povidonu, aby aseptycznie zdezynfekować miejsce do nacięcia.
  4. Nacięcie i przygotowanie powierzchni czaszki:
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy wykonać jak najbardziej aseptycznie. W tym celu główny chirurg zwierzęcy powinien nosić sterylne rękawice chirurgiczne zamiast standardowych rękawic laboratoryjnych przed przystąpieniem do nacięcia.
    1. Lokalizacja i długość nacięcia: Użyj sterylnego skalpela, aby wykonać strzałkowe nacięcie środkowe wzdłuż powierzchni czaszki, zaczynając między oczami, rozciągając się na 8-10 mm do kaudalnego ( rysunek 1C).
    2. Wycofanie skóry: Używaj sterylnych kleszczy, aplikatorów z bawełnianymi końcówkami i/lub ostrza skalpela, aby cofnąć skórę z nacięcia środkowego. Upewnij się, że zarówno Bregma, jak i Lambda są widoczne, a jeśli nie, przedłuż nacięcie.
    3. Nacięcie okostne: Użyj sterylnego skalpela, aby wykonać nacięcie w okostnej i bocznie cofnąć tkankę kleszczami.
    4. Opasek z nadtlenku wodoru: Oczyść powierzchnię czaszki rozcieńczonym nadtlenkiem wodoru o stężeniu 1%-3% nałożonym sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką ( rysunek 1D). Pomaga to również w identyfikacji Bregmy i Lambdy poprzez szywy głowy strzałkowe, koronalne i lambdoidalne.
    5. Samotrawiący klej dentystyczny: Użyj strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mL do 1,0 mL, aby równomiernie nałożyć 20-40 μL samotrawiącego kleju dentystycznego na powierzchnię czaszki ( rysunek 1D). Użyj lampy do utwardzania zębów, aby wspomóc trawienie. Po utwardzeniu użyj sterylnych aplikatorów z bawełnianymi końcówkami i soli fizjologicznej, aby zetrzeć nadmiar kleju.
      UWAGA: Samotrawiące kleje dentystyczne, takie jak Bond Force, mogą stanowić potencjalnie niebezpieczne substancje: zagrożenie łatwopalne (GHS02: H225), zagrożenie dla zdrowia (GHS07 i GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H3336) oraz zagrożenie środowiskowe (GHS09: H412). Prosimy o przestrzeganie lokalnych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących właściwej utylizacji odpadów niebezpiecznych.
  5. Lokalizowanie i wiercenie otworów na zadziarny:
    1. Włóż sterylne wiertło 0,7 mm do mikrowiertarki i zamontuj je w ramie stereotaktycznej z odpowiednim uchwytem.
    2. Zlokalizuj Bregmę na skrzyżowaniu szwów strzałkowych i koronalnych i użyj mikromanipulatorów stereotaktycznych, aby ustawić wiertło w tym miejscu.
    3. Przestaw wiertło do współrzędnej prowadnicy cOFM (ML = 2,5, AP = 0,0), uruchom wiertarkę do 15 000 obr./min i ostrożnie wywierć otwór na zadzior, regulując pokrętło mikromanipulatora DV (Rysunek 1E). Często obserwuj grubość czaszki podczas wiercenia, aby zapobiec uszkodzeniom mózgu pod spodem. Podczas wiercenia używaj soli fizjologicznej, aby usunąć resztki kości i zmniejszyć temperaturę między wiertłem a czaszką.
    4. Powtarzaj procedurę wiercenia dla każdej współrzędnej śruby kotwicznej (Rysunek 1E). Zalecane miejsca śrub kotwiczących to ML = 2,5, AP = -2,5 oraz ML = -2,5, AP = -2,5.
    5. Po wywierceniu otworów na zadzior, odłącz mikrowiertarkę i uchwyt wiertła od ramy stereotaktycznej.
    6. Użyj igły 30 G, aby delikatnie przebić oponowanie pod otworem na prowadnicę cOFM.
  6. Zamontuj śruby kotwiące za pomocą sterylnych kleszczy i odpowiednio dobranego sterylnego śrubokręta (rysunek 1F). W zależności od gwintu śruby, kotwica jest wystarczająca, gdy śruba jest włożona na głębokość jednej lub dwóch długości gwintu. Uważaj, żeby nie wkręcić śrub kotwiących zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia kory.
  7. Zamontuj prowadnicę cOFM i atrapę cOFM w uchwytie prowadnicy i mocuj ją do ramy stereotaktycznej. Umieść końcówkę prowadnicy cOFM nad otworem na żarno (ML = 2,5 mm, AP = 0,0 mm) na wysokości DV równej Bregmie i powoli opuszczaj prowadnicę cOFM przez otwór do odpowiedniej wcześniej głębokości z prędkością 1 mm/min ( rysunek 1F). Na przykład głębokość umieszczenia przewodnika cOFM przy planowanym wszczepieniu komórek nowotworowych wynosi DV = -3,5 mm.
  8. Nałóż środek cementujący na powierzchnię czaszki, upewniając się, że pokrywa obszary pod i wokół prowadnicy i śruby kotwiczącej cOFM cienką, jednolitą warstwą. Użyj światła do utwardzania zębów, aby utwardzić każdą warstwę środka cementującego przed nałożeniem kolejnych warstw ( rysunek 1G). Kontynuuj stosowanie środka cementowego, aż powierzchnia czaszki między komponentami zostanie całkowicie pokryta, śruby kotwiące całkowicie zakryte, a obszar pod prowadnicą cOFM aż do i wokół rowka zostanie pokryty. Uważaj, aby nie nakładać środka cementującego na klin blokujący lub w jego pobliżu.
    UWAGA: Środki cementujące, takie jak Tetric EvoFlow, mogą być substancjami potencjalnie niebezpiecznymi: zagrożeniem dla zdrowia (GHS07: H317, H319, H335, H360). Prosimy o przestrzeganie lokalnych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących właściwej utylizacji odpadów niebezpiecznych.
  9. Odłącz uchwyt prowadnicy od prowadnicy cOFM i powoli podnieś uchwyt za pomocą pokrętła DV mikromanipulatora. Usuń mikromanipulator z ramy stereotaktycznej.
  10. Odłącz zwierzę od stereotaktycznej ramy, najpierw poluzując i zdejmując drążki nauszne, poluzując i cofając zacisk nosa, a następnie podnosząc siekacze zwierzęcia z bloku gryzienia.
  11. Skóra szwu zamyka się nad środkiem cementującym, zapewniając, że prowadnica cOFM pozostaje odsłonięta. Zaleca się stosowanie wchłaniających szwów 4-0, takich jak kwas poliglikolowy (PGA) lub poliglaktyna (Vicryl) (rysunek 1H).
  12. Nałóż potrójną maść antybiotykową na skórę przylegającą do pierwotnego nacięcia.
  13. Odzyskiwanie i wsparcie zwierząt:
    1. Przenieś zwierzę do izolowanej klatki do odzyskiwania (jedno zwierzę w klatce) i zapewnij dodatkowe ciepło z poduszki grzewczej ustawionej na niskie ciśnienie.
    2. Opcjonalnie: Podaj zwierzęciu środek przeciwznieczulający, aby przyspieszyć powrót do zdrowia. Na przykład podskórne zastrzyki z atipamezolu (1 mg/kg, w soli fizjologicznej) przyspieszają czas rekonwalescencji po znieczuleniu z około 1 godziny do około 20 minut.
    3. Zapewniać ciągłą obserwację i wsparcie, aż zwierzę odzyska świadomość i leży na mostku. Nie zostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie wyzdrowieją całkowicie po operacji i znieczuleniu.
    4. Gdy zwierzę całkowicie wyzdrowieje, może zostać zwrócone do wspólnych klatek z innymi zwierzętami.
    5. Dzień po operacji zapewnij dodatkowe wsparcie przeciwbólowe, podając instytucjonalnie zatwierdzony środek przeciwbólowy, taki jak meloksykam (patrz krok 2.3.2).
  14. Należy pozwolić na 14-dniowy czas rekonwalescencji po operacji wszczepienia cOFM, aby umożliwić całkowite wygojenie bariery krew-mózg przed przeprowadzeniem kolejnych zabiegów na zwierzętach.

3. Wszczepienie komórek nowotworowych wewnątrzczaszkowych według przewodnika cOFM

  1. Hodowla i przygotowanie komórek:
    1. Hodować i rozbudowywać komórki zgodnie z protokołami specyficznymi dla typu komórek. Na przykład syngeniczne komórki glejaka myszy, takie jak CT2A, można hodować w naczyniach o średnicy 10 cm lub w kolbach T-75 zawierających DMEM z 10% surowicy płodowej bydła (FBS) i 1% suplementów penicyliny/streptomycyny.
    2. Przygotuj hodowlane komórki do implantacji zgodnie z protokołami specyficznymi dla typu komórek.
      1. Na przykład w syngeneicznych komórkach glejaka CT2A usuwa się medium wzrostowe, krótko myje PBS i inkubuje komórki przez 5 minut w 0,05% trypsynie (z 0,53 mM EDTA) w temperaturze 37 °C.
      2. Zneutralizuj trypsynę o tej samej objętości 1% DMEM zawierającego FBS, przenieś komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 ml i wiruj w 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C do pelletów.
      3. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1 mL PBS (czyli soli fizjologicznej). Określ całkowitą liczbę komórek na mL za pomocą ręcznego lub zautomatyzowanego hemocytometru. Ponownie wiruj zawiesinę komórkową w dawce 300 x g przez 5 minut w 4 °C, usuń supernatant i ponownie zawiesij w odpowiedniej objętości PBS (lub soli fizjologicznej), aby uzyskać 50 000 komórek na μL. Umieść zawiesinę komórkową na lodzie do momentu wszczepienia (krok 3.5.2).
  2. Zorganizuj narzędzia chirurgiczne do implantacji komórek nowotworowych wewnątrzczaszkowych (Tabela materiałów) i sterylizuj za pomocą autoklawu, jeśli jest to wskazane.
  3. Przygotowanie do miejsca pracy chirurgicznego
    1. Dezynfekacja szafy na bezpieczeństwo biologiczne: patrz krok 2.2.1.
    2. Przygotuj instrumenty stereotaktyczne: Oczyść ramę stereotaktyczną środkami dezynfekującymi i umieść ją w szafce zabezpieczeń biologicznych. Podobnie wyczyść i zdezynfekować uchwyt na strzykawkę montowany stereotaktycznie oraz przymocować go do ramy stereotaktycznej.
    3. Wykonaj kroki 2.2.3.-2.2.5. na pozostałe etapy przygotowawcze.
  4. Przygotowania zwierząt przed operacją:
    1. Wykonaj kroki 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4 oraz 2.3.5. do przygotowania zwierząt.
  5. Wszczepienie komórek nowotworowych:
    1. Strzykawka i wkład infuzjny (podsumowane na Rysunku 2)
      1. Namocz złącza rur z kołnierzem w 70% etanolu przez co najmniej 5 minut.
      2. Włóż końcówkę sterylnej gazoszczelnej szklanej strzykawki o pojemności 10 μL lub 25 μL do jednego końca złącza rury z kołnierzem.
      3. Włóż wlot wkładu infuzyjnego cOFM na drugim końcu złącza rury.
      4. Zamocuj wkład do strzykawki do stereotaktycznego uchwytu na strzykawkę.
    2. Załaduj wkład do strzykawki odpowiednią objętością zawiesiny komórkowej. Na przykład załadujemy 3 μL zawiesiny komórkowej przy 50 000 komórek na μL, co daje łączny zastrzyk 150 000 komórek na zwierzę.
    3. Zastąpienie wkładu dummy wkładem infuzyjnym:
      1. Użyj kleszczy, aby usunąć klin blokujący z prowadnicy cOFM i zespołu atrapa, a następnie delikatnie wyjmij atrapę cOFM z prowadnicy.
      2. Użyj pokręteł regulacji ML i AP na mikromanipulatorze, aby manewrować zespołem wkładki do strzykawki nad prowadnicą cOFM. Użyj pokrętła DV, aby ostrożnie opuścić wkład infuzji do prowadnicy cOFM i zabezpieczyć go na miejscu, mocno ponownie wkładając klin blokujący za pomocą kleszczy.
    4. Wstrzyknąć 3 μL zawiesiny komórkowej ze strzykawki z częstotliwością 1 μL/min. Dokładnie obserwuj obszar wokół przewodnicy cOFM i wkładu infuzyjnego, aby upewnić się, że żadna zawiesina komórkowa nie wydostaje się z zespołu. Po wstrzyknięciu całej objętości należy odczekać kolejną minutę, aż ciśnienie wewnątrzczaszkowe się wyrówna.
    5. Zamień wkład infuzacyjny na zastępczy.
      1. Użyj kleszczy, aby usunąć klin blokujący z prowadnicy cOFM i zespołu wkładki infuzyjnej, a następnie delikatnie wyreguluj pokrętło DV mikromanipulatora, aby wyjąć wkład infuzji cOFM z prowadnicy.
      2. Włóż manekinę cOFM do prowadnicy i zabezpiecz ją na miejscu, ponownie wkładając klin blokujący za pomocą kleszczy.
  6. Odłącz zwierzę od stereotaktycznej ramy, najpierw poluzując i zdejmując drążki nauszne, poluzując i cofając zacisk nosa, a następnie podnosząc siekacze zwierzęcia z bloku gryzienia.
  7. Odzyskiwanie i wsparcie zwierząt:
    1. Przenieś zwierzę do izolowanej klatki do odzyskiwania (jedno zwierzę w klatce) i zapewnij dodatkowe ciepło z poduszki grzewczej ustawionej na niskie ciśnienie.
    2. Opcjonalnie: Podaj zwierzęciu środek przeciwznieczulający (np. atipamezol), aby przysłużyć czas rekonwalescencji, patrz krok 2.13.2.
    3. Zapewniać ciągłą obserwację i wsparcie, aż zwierzę odzyska świadomość i leży na mostku. Nie zostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie wyzdrowieją całkowicie po operacji i znieczuleniu.
    4. Gdy zwierzę całkowicie wyzdrowieje, może zostać ponownie umieszczone w klatkach wspólnych w towarzystwie innych zwierząt.
    5. Dzień po operacji zapewnij dodatkowe wsparcie przeciwbólowe, podając instytucjonalnie zatwierdzony środek przeciwbólowy, taki jak meloksykam (patrz krok 2.3.2).
      UWAGA: Jeśli używasz linii komórkowych z lucyferazą, obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) można wykonać 1-2 tygodnie po implantacji komórek, aby potwierdzić skuteczność przeszczepienia guza. Chociaż cechy fizyczne, takie jak futro zwierzęcia czy obecność na głowie, mogą utrudniać wykryte luminescencje, nadal można je wykorzystać do przybliżonych przybliżeń obecności lub braku guza. Alternatywnie, MRI można wykonać, jeśli śruby kotwiące użyte w umieszczeniu prowadnicy cOFM są nieferromagnetyczne i kompatybilne z MRI.

4. pobieranie płynu śródmiąższowego mózgu cOFM

UWAGA: Ze względu na uzależnienie od pasywnej dyfuzji analitów, próbki cOFM zawierają rozcieńczone stężenia analitu w porównaniu do endogennego środowiska ISF. Z tego powodu wcześniej zaproponowano kilka metod kalibracji pomiarów próbek, aby lepiej odzwierciedlały stężenia in situ 18. Ta sekcja opisuje dwie różne metody próbki. Krok 4.1. opisuje zalecany przez producenta tryb konfiguracji (od tego momentu określany jako frakcjonowany), który oferuje większą czułość czasową, ale kosztem stężenia analitu. Krok 4.2. opisuje alternatywny tryb konfiguracji, który opracowaliśmy (od tego miejsca określany jako recyrkulowany), który pozwala osiągnąć większe stężenie analitu kosztem zmniejszonej rozdzielczości czasowej.

  1. Frakcjonowane próbkowanie cOFM (podsumowane na Rysunku 3A):
    1. Mocz złącza rur z kołnierzem w 70% etanolu przez co najmniej 5 minut, aby ułatwić mocowanie na wkładkach do rur i próbek.
    2. Napełnij worek perfuzatu odpowiednią ilością perfuzatu aCSF. Na przykład 680 μL jest minimalnie wystarczające zarówno dla 20-minutowego płukania linii przy 10 μL/min, jak i 8-godzinnego próbkowania z prędkością 1 μL/min. Jednak zaleca się minimalną objętość 2 mL, aby zapobiec zapadaniu się i nieprawidłowościom worka perfuzowego.
    3. Napełnij zarówno linie rur push, jak i pull odpowiednią objętością aCSF za pomocą gazoszczelnych szklanych strzykawek. Na przykład rurki uniwersalne Push-Pull Low-Bind mają średnicę wewnętrzną 0,25 mm, a pojedyncze rury 100 cm. Daje to około 1 μL na 2 cm, a więc około 55 μL w rurze pchającej i 100 μL w rurze ciągnięciowej.
    4. Prawidłowo zamontuj perystaltyczną część rury w głowicy pompy mikroperfuzyjnej, jak pokazano na Rysunku 3A.
      UWAGA: Zobacz instrukcję obsługi BASi, jeśli są potrzebne, aby uzyskać dodatkowe instrukcje.
    5. Podłącz worek perfuzatu do sekcji rurki pchającej za pomocą złącza Luer lock (Rysunek 3A, komponent i).
    6. Podłącz wkładkę próbkową do linii rurowych za pomocą złączek rurowych z kołnierzem. Wlot wlotu próbkowania (dłuższa długość wału) powinien być przymocowany do końca rury pchającej, naprzeciwko linii rurki z perfuzatem (Rysunek 3A, lewy górny róg). Wylot wkładki próbkowej (krótszy wał) powinien być podłączony do wejścia rurki ciągniącej, równolegle do rurki z perfuzatem (rysunek 3A, w prawym górnym rogu). Umieść podłączoną wkładkę do próbki w sterylnej rurce mikrowirówki zawierającej 750 μL aCSF w przygotowaniu do przepłukania systemu.
    7. Połącz igłę kolektora frakcji z złączem rury z kołnierzem do linii wyjściowej rury ciągniętej (na przeciwległym końcu od wyjścia wkładki próbkowej).
    8. Przepłukaj system rur przez 20 minut przy 10 μL/min, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki gazu wewnątrz systemu.
    9. Konfiguracja kolektora ułamków:
      1. Etykietowanie i ważenie probówek do pobierania ułamków wagowych, adnotując każdą wagę do późniejszego porównania i weryfikacji objętości pobranej próbki. Umieść rurki w odpowiednich szczelinach karuzeli kolektora frakcji.
      2. Włącz kolektor ułamków i skonfiguruj ustawienia na pożądane wartości. Przykładowe ustawienia to # próbek, czas próbkowania (m), opóźnienie (godziny), chłodzenie chłodzenia oraz tryb _cannula.
        UWAGA: Odrzucenie objętości płynu martwej przestrzeni w rurce wyciągającej, która nigdy nie miała kontaktu z ortotopowym ISF, jest przybliżone przez i) długość i objętość rury (około 2 cm/μL dla OFM-PP2-100-LB), ii) przepływ oraz iii) opóźnienie (godziny). Parametry te powinny być starannie rozważone przy tworzeniu systemu zbierania, aby zapewnić prawidłowe zbieranie ułamków.
  2. Recyrkulowane próbkowanie cOFM (podsumowane na Rysunku 3B):
    1. Mocz złącza rur z kołnierzem w 70% etanolu, aby ułatwić mocowanie na rurkach i wkładkach pobierania próbek.
    2. Napełnij linię rurki wyciągającej odpowiednią objętością aCSF za pomocą gazoszczelnych szklanych strzykawek.
    3. Prawidłowo zamontuj perystaltyczną część rury w głowicy pompy mikroperfuzyjnej.
    4. Podłącz wkładkę próbkową do linii rurowych za pomocą złączek rurowych z kołnierzem. Wlot wkładki próbkowej (dłuższa długość wału) powinien być przymocowany do końca wyjściowego rury ciągniącej. Wylot wkładki próbkowej (krótszy wał) powinien być przymocowany do wejścia rurki ciągnącej. Umieść podłączoną wkładkę do próbki w sterylnej rurce mikrowirówki zawierającej 750 μL aCSF w przygotowaniu do przepłukania systemu.
    5. Przepłukaj system rur przez 20 minut przy 10 μL/min, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki gazu wewnątrz systemu.
  3. Konfiguracja systemu klatki obrotowej:
    UWAGA: Obrotowe systemy klatki zwierzęce, takie jak system Raturn, ułatwiają pobieranie cOFM zwierząt w stanie przebudzenia, zapobiegając nadmiernemu skręcaniu i plątaniu rur push-pull. Może to również pomóc w automatyzacji pobierania cOFM, eliminując konieczność ręcznego rozplątywania rurek podczas sesji zbierania cOFM na jawie.
    1. Równomiernie rozłóż czystą ściółkę na obrotowej podłodze i wyposażaj klatkę w łatwo dostępne źródła jedzenia i wody.
    2. Włącz kontroler obrotu klatki i sprawdź jego aktywność, obracając zawieszoną linę. Klatka powinna obracać się przeciwnie do kierunku obrotu nadawanego linie. Ustaw kontroler obrotu w trybie czuwania, dopóki zwierzę nie zostanie przymocowane do liny.
  4. Łączenie zwierzęcia z systemem cOFM:
    UWAGA: Połączenie i odłączenie zwierząt do systemu cOFM jest najłatwiejsze podczas tymczasowej znieczulenia izofluranowego. Jeśli jest wykonany prawidłowo, proces ten trwa nie więcej niż 5 minut na każde zwierzę; Jednak stosowanie maści okulistycznej jest zdecydowanie zalecane.
    1. Znieczulenie zwierząt: Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej izofluranu. Rozpocznij znieczulenie z przepływem tlenu 2 L/min i ustawieniem izofluranu na 3%. Obserwuj zwierzę, aż osiągnie odpowiedni poziom znieczulenia (nieruchomy, z tempem oddechu około 1 oddechu/s). Przenieś zwierzę z komory indukcyjnej do maski znieczulonej ustawionej na przepływ tlenu 2 L/min i 3% izofluranu.
    2. Otulanie zwierząt: Umieść zwierzę w odpowiednio dopasowanej kurtce, przeciągając przednie kończyny całkowicie przez otwory na ramiona i mocując kurtkę na grzbiecie zwierzęcia (pokazano na rysunku 3C).
    3. Zastąpienie wkładki atrapowej wkładką próbkową: Użyj kleszczy, aby usunąć klin blokujący z prowadnicy i zespołu atrapowego i ostrożnie wyjmij atrapę z prowadnicy. Delikatnie zamontuj próbkę, włóż ją do prowadnicy, a następnie włóż klin blokujący.
    4. Wyjmij zwierzę z narkozy i umieść je w obracającym się systemie klatki. Przymocuj linę klatki do kurtki zwierzęcej i aktywuj system obrotowej klatki.
  5. Wykonywanie próbkowania cOFM:
    1. Ustaw pompy mikroperfuzyjne na 5 μL/min i wykonaj 2-minutowe przepłukanie, aby usunąć wszelkie mikropęcherzyki powstałe podczas instalacji wkładu do próbkowania cOFM.
    2. Zmień ustawienia pompy mikroperfuzyjnej na poprawnie pożądany przepływ dla trybu pompy (np. 1 μL/min).
    3. Aktywuj tryb pompy. W przypadku frakcjonowanego pobierania próbek cOFM aktywuj kolektor frakcji.
    4. Na początkowych etapach pobierania próbek cOFM należy dokładnie obserwować rurki push-pull, aby upewnić się, że nie występują pęcherzyki gazu, ponieważ mogą one utrudnić prawidłowe działanie maszyny i pobieranie próbek, potencjalnie zagrażając zwierzęciu. Jeśli zauważone zostaną pęcherzyki gazu, zatrzymaj elementy systemu, odłącz zwierzę od systemu cOFM i usuń pęcherzyki gazu przez przepłukanie aCSF przez rurkę.
    5. W trakcie trwania procesu pobierania próbek cOFM należy regularnie obserwować rurki cOFM oraz zachowania zwierząt. Jeśli zachowanie zwierząt wskazuje na nagłe zmiany zdrowotne, natychmiast zatrzymaj komponenty systemu i zająj się problemem zdrowia zwierząt. W razie potrzeby skonsultuj się z personelem weterynaryjnym instytucji.
  6. Odłączenie zwierzęcia od systemu cOFM:
    1. Dezaktywuj system obrotowej klatki i odłącz linę klatki od kurtki zwierzęcia.
    2. Przenieś zwierzę do komory indukcyjnej do znieczulenia izofluranowego, z przymocowaną wkładką do pobierania próbek i rurką cOFM. Rozpocznij znieczulenie z przepływem tlenu 2 L/min i ustawieniem izofluranu na 3%. Obserwuj zwierzę, aż osiągnie odpowiedni poziom znieczulenia (nieruchomy, z tempem oddechu około 1 oddechu/s). Przenieś zwierzę z komory indukcyjnej do maski znieczulliwej ustawionej na przepływ tlenu 2 L/min i 3% izofluranu.
    3. Zamień wkładkę próbkową na wkładkę atrapową: Użyj kleszczy, aby usunąć klin blokujący z prowadnicy i wkładki próbkowej, a następnie ostrożnie wyjmij wkładkę próbkową z prowadnicy. Delikatnie włóż wkładkę atrapową z powrotem do prowadnicy, a następnie włóż klin blokujący.
    4. Zdejmowanie płaszcza: Odłącz zapięcia z tylnej strony kurtki zwierzęcej i delikatnie zdejmij kurtkę ze zwierzęcia.
    5. Odzyskiwanie i obserwacja zwierząt: Wyjmij zwierzę z znieczulenia izofluranowego i umieszczaj w czystej klatce do odzyskiwania, zapewniając ciągłą obserwację aż do pełnego odzyskania przytomności i pozycji mostkowej. Przeniesione do klatki domowej, gdy zwierzę zostanie całkowicie wyleczone.
  7. Zbieranie i przechowywanie próbek:
    1. Frakcjonowane próbki:
      1. Wyjmij probówki do zbierania frakcji z kolektora frakcji i umieść je w lodzie do krótkoterminowego transportu.
      2. Zważ każdą probówkę i porównaj z wagą przed pobraniem, aby zweryfikować objętość próbki.
      3. Przeprowadzić dalsze analizy próbek cOFM lub umieścić je w zamrażarce o temperaturze -80 °C do długoterminowego przechowywania.
    2. Próbki recyrkulacyjne:
      1. Pozostawiając rurkę wyciągającą podłączoną do wylotu wkładki cOFM (krótszy wał), odłącz ją od reszty układu i umieść rurkę oraz wkładkę do próbki w nowej, czystej mikrowirówce.
      2. Przymocuj sterylną igłę 18G do sterylnej strzykawki o pojemności 1 mL do 5 mL i napełnij powietrzem.
      3. Ostrożnie włóż igłę do złącza z kołnierzem na wejściu rurki pociągowej.
      4. Aby upewnić się, że wkładka próbkowania cOFM pozostaje w rurce mikrowirówki, naciśnij tłok strzykawki, aby wyrzucić recyrkulowaną objętość próbki cOFM z rurki wyciągającej powietrzem. Upewnij się, że cała próbka cOFM została wyrzucona z rurki wyciągającej i umieszczona w rurce mikrowirówki, odłączając strzykawkę i napełniając powietrzem, jeśli to konieczne.
      5. Umieść recyrkulowaną próbkę cOFM na lodzie do krótkoterminowego transportu.
      6. Przejdź do analiz końcowych lub umieść je w zamrażarce o temperaturze -80 °C do długoterminowego przechowywania.
  8. Przechowywanie materiałów cOFM przy powtarzaniu próbki cOFM w tym samym zwierzęciu:
    UWAGA: Producent nie zaleca ponownego użycia jednorazowych materiałów cOFM, takich jak wkładki do próbek i rurki wlotowe/wylotowe.
    1. Przepłukać rurkę cOFM push-pull około 500 μL sterylnego aCSF lub soli fizjologicznej z częstotliwością nie większą niż 10 μL/min. Następnie dodaj podobną dawkę 1-2 mL 70% etanolu. Na koniec użyj strzykawki 5 lub 10 mL wyposażonej w igłę 18G i złącze rurki z kołnierzem, aby przepłukać rurkę powietrzem.
    2. Przepłuknij rurki wlotowe i wylotowe wkładki cOFM z 50 μL sterylnego aCSF lub soli fizjologicznej za pomocą gazoszczelnej szklanej strzykawki wyposażonej w złącze rury z kołnierzem. Następnie dodaj 50 μL 70% etanolu. Odłącz wkładkę cOFM od złącza rury i przechowuj ją w fiolce wypełnionej 70% etanolem aż do ponownego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne metody oceny mające na celu określenie sukcesu eksperymentu mogą być stosowane na etapach pośrednich lub końcowych, w zależności od specyficznego charakteru patologii podstawowej i modelu zwierzęcego badającego. Do badań biologii GBM obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) może być stosowane jako pośrednia miara oceny skuteczności przeszczepu komórek nowotworowych za pośrednictwem przewodnika cOFM (Rysunek 4A). Jednak jest to stosowane do prostych, dychotomicznych ocen obecnych lub nieobe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury cOFM opisane w tym protokole mają potencjał rewolucjonizacji badań chorób OUN dzięki zdolności do podłużnego pobierania endogennych składników ISF tkanek patologicznych. Jednak sukces badawczy stosowania tej metody zależy od właściwego wykonania kilku kluczowych kroków. Z nich prawidłowe i bezpieczne umieszczenie kaniuli prowadzącej cOFM jest jednym z najważniejszych elementów. Nieprawidłowe zabiegi chirurgiczne lub strategie mocowania mogą skutkować przesunięciem całego uchwytu głowy i późniejszym wycofaniem z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały wsparte przez grant National Institute of Neurological Disorders and Stroke 1R01NS096376, 1R01NS112856 oraz P50CA221747 SPORE for Translational Approaches to Brain Cancer (A.U.A.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wiertło 0,7 mmNarzędzia Nauki Ścisłej19008-07Wiercenie otworów z żarnem
Strzykawka o pojemności 1 do 5 mLBD#309646Recyrkulacja próbki perfuzacji
Igła 18 GBD#305195Recyrkulacja próbki perfuzacji
Igła 30GBD Ultra-Fine328438Przebijanie twardej
Szwy 4-0 vicrylDynarex9130Zamknięcie operacji chirurgicznych
Chusteczki alkoholoweFisherBrand22-363-750Dezynfekcja skóry w miejscu chirurgicznym
Śruby kotwiąceBASiMD-1310Montaż na głowie cOFM
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400ISF próbkowania
wkładka cOFM dummyBASi (Joanneum)cOFM-D- #Montaż na głowie cOFM
przewodnik cOFMBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #Montaż na głowie cOFM
Posiadacz przewodnika cOFMBASi (Joanneum)OFM-STM-1Montaż na głowie cOFM
Wkład infuzyjny cOFMBASi (Joanneum)cOFM-I- #Iniekcja komórek
klin blokujący cOFMBASi (Joanneum)cOFM-LOCKMontaż na głowie cOFM
Wkładka cOFM do próbkowaniaBASi (Joanneum)cOFM-S-XISF próbkowania
Aplikatory z bawełnianymi końcówkamiFisherBrane22363160Wchłanianie płynów, stosowanie nadtlenku wodoru
Linia komórkowa glejaka myszy CT2ALaboratorium Seyfrieda – Uniwersytet BostońskiNAPrzeszczepione komórki nowotworowe
Środek cementujący zębyIvoClar595953USMontaż na głowie cOFM
Światło do utwardzania zębówHenry Schein5700253Montaż na głowie cOFM
Krem do depilacjiVeet3116875Usuwanie owłosienia w miejscu operacji
Elektryczny golarzWahl Clipper Corp. 8841Usuwanie owłosienia w miejscu operacji
Kleszcze z cienkim końcówkąNarzędzia Nauki Ścisłej5SFNacięcie, umieszczenie śruby kotwicznej
Złącza rur z kołnierzemBASi (Joanneum)MD-1510Iniekcja komórek
Fiolki do kolekcji frakcjiBASi (Joanneum)MF-5281Frakcjonowane przechowywanie próbek
Gazoszczelna szklana strzykawka (25 μ L)Hamilton80465Iniekcja komórek
Nadtlenek wodoru (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32Czyszczenie powierzchni czaszki
Strzykawki insulinowe (0,3 do 1,0 mL) z igłami 31GBD Ultra-Fine328438Znieczulenie i podawanie środków przeciwbólowych
Rurki mikrowirówkoweBasix02-682-002Recyrkulacja próbki perfuzacji
Mikrowiertarka i uchwyt stereotaktycznyAparat Harvarda75-1874Wiercenie otworów z żarnem
Kurtka myszyLomirMJ 02Połączenie zwierząt z systemem klatki obrotowej
Rurki OFM o niskim wiązaniuBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBISF próbkowania
OFM-Pump - Pompa mikroperfuzjiBASi (Joanneum)MPP102-PCISF próbkowania
Maść okulistycznaDechra211-38Okołosugryczne nawilżenie oka
Igła do pobierania próbek metalu pasywowanegoBASi (Joanneum)MW-2310Frakcjonowane przechowywanie próbek
Worek perfuzacyjnyBASi (Joanneum)OFM-BAGISF próbkowania
Fizjologiczny roztwór soli fizjologicznejOIOM Medyczne & nbsp;0990-7983-03Czyszczenie powierzchni czaszki, pomoc w wierceniu dziur z żarnami
Wymazy z povidonu i joduPDI HealthcareSKU B40600Dezynfekcja skóry w miejscu chirurgicznym
Uchwyt sondyStoelting51633
Chłodzony kolektor frakcjiBASi (Joanneum)MD-1201Frakcjonowane przechowywanie próbek
System klatki obrotowejBASi (Joanneum)AMD-R RaturnAutomatyczne obudowy do pobierania cOFM podczas budzenia
Ostrza skalpela i uchwytyFisher Scientific  22079693Nacięcie
ŚrubokrętMontaż na głowie cOFM
Samotrawiący klej dentystyczny & nbsp;TokuyamaGruntowanie powierzchni czaszki do środka cementującego
Silikonowa kapsla do fiolek kolekcjonerskichBASi (Joanneum)MF-5283Frakcjonowane przechowywanie próbek
Rama sterotaktycznaStoelting51725

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shetty, A. K., Zanirati, G. The interstitial system of the brain in health and disease. Aging Dis. 11 (1), 200-211 (2020).
  2. Taoka, T., et al. Interstitial fluidopathy of the central nervous system: An umbrella term for disorders with impaired neurofluid dynamics. Magn Reson Med Sci. 23 (1), 1-13 (2024).
  3. Matsumae, M., et al. Research into the physiology of cerebrospinal fluid reaches a new horizon: Intimate exchange between cerebrospinal fluid and interstitial fluid may contribute to maintenance of homeostasis in the central nervous system. Neurol Med Chir (Tokyo). 56 (7), 416-441 (2016).
  4. Filannino, F. M., Panaro, M. A., Benameur, T., Pizzolorusso, I., Porro, C. Extracellular vesicles in the central nervous system: A novel mechanism of neuronal cell communication. Int J Mol Sci. 25 (3), 1629(2024).
  5. Marcus, H. J., Carpenter, K. L., Price, S. J., Hutchinson, P. J. In vivo assessment of high-grade glioma biochemistry using microdialysis: A study of energy-related molecules, growth factors and cytokines. J Neurooncol. 97 (1), 11-23 (2010).
  6. De Ruiter Swain, J., Michalopoulou, E., Noch, E. K., Lukey, M. J., Van Aelst, L. Metabolic partitioning in the brain and its hijacking by glioblastoma. Genes Dev. 37 (15-16), 681-702 (2023).
  7. Teer, L., Yaddanapudi, K., Chen, J. Biophysical control of the glioblastoma immunosuppressive microenvironment: Opportunities for immunotherapy. Bioengineering (Basel). 11 (1), 93(2024).
  8. De Boeck, A., et al. Glioma-derived il-33 orchestrates an inflammatory brain tumor microenvironment that accelerates glioma progression. Nat Commun. 11 (1), 4997(2020).
  9. Yeo, E. C. F., Brown, M. P., Gargett, T., Ebert, L. M. The role of cytokines and chemokines in shaping the immune microenvironment of glioblastoma: Implications for immunotherapy. Cells. 10 (3), 607(2021).
  10. Riviere-Cazaux, C., et al. Longitudinal glioma monitoring via cerebrospinal fluid cell-free DNA. Clin Cancer Res. 31 (5), 881-889 (2025).
  11. Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
  12. Lehmann, A., Isacsson, H., Hamberger, A. Effects of in vivo administration of kainic acid on the extracellular amino acid pool in the rabbit hippocampus. J Neurochem. 40 (5), 1314-1320 (1983).
  13. Sandberg, M., Lindstrom, S. Amino acids in the dorsal lateral geniculate nucleus of the cat--collection in vivo. J Neurosci Methods. 9 (1), 65-74 (1983).
  14. Tossman, U., et al. Brain amino acids measured by intracerebral dialysis in portacaval shunted rats. J Neurochem. 41 (4), 1046-1051 (1983).
  15. Zetterstrom, T., et al. Purine levels in the intact rat brain. Studies with an implanted perfused hollow fibre. Neurosci Lett. 29 (2), 111-115 (1982).
  16. Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  17. Darvesh, A. S., et al. In vivo brain microdialysis: Advances in neuropsychopharmacology and drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (2), 109-127 (2011).
  18. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. Chapter 7 (Unit7), 1(2009).
  19. Altendorfer-Kroath, T., et al. Comparison of cerebral open flow microperfusion and microdialysis when sampling small lipophilic and small hydrophilic substances. J Neurosci Methods. 311, 394-401 (2019).
  20. Custers, M. L., et al. Applicability of cerebral open flow microperfusion and microdialysis to quantify a brain-penetrating nanobody in mice. Anal Chim Acta. 1178, 338803(2021).
  21. Birngruber, T., et al. Cerebral open flow microperfusion: A new in vivo technique for continuous measurement of substance transport across the intact blood-brain barrier. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (12), 864-871 (2013).
  22. Kleinert, M., et al. Time-resolved hypothalamic open flow micro-perfusion reveals normal leptin transport across the blood-brain barrier in leptin resistant mice. Mol Metab. 13, 77-82 (2018).
  23. Le Prieult, F., Barini, E., Laplanche, L., Schlegel, K., Mezler, M. Collecting antibodies and large molecule biomarkers in mouse interstitial brain fluid: A comparison of microdialysis and cerebral open flow microperfusion. MAbs. 13 (1), 1918819(2021).
  24. Altendorfer-Kroath, T., et al. Quantification of the therapeutic antibody ocrelizumab in mouse brain interstitial fluid using cerebral open flow microperfusion and simultaneous monitoring of the blood-brain barrier integrity. Pharmaceutics. 15 (7), 1880(2023).
  25. Birngruber, T., et al. Enhanced doxorubicin delivery to the brain administered through glutathione pegylated liposomal doxorubicin (2b3-101) as compared with generic caelyx,((r))/doxil((r))--a cerebral open flow microperfusion pilot study. J Pharm Sci. 103 (7), 1945-1948 (2014).
  26. Birngruber, T., et al. Long-term implanted cOFM probe causes minimal tissue reaction in the brain. PLoS One. 9 (3), e90221(2014).
  27. Altendorfer-Kroath, T., et al. Atraumatic access to human glioblastoma in a xenograft animal model by cerebral open flow microperfusion. J Neurosci Methods. 393, 109893(2023).
  28. Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 52(2021).
  29. Hummer, J., Altendorfer-Kroath, T., Birngruber, T. Cerebral open flow microperfusion to monitor drug transport across the blood-brain barrier. Curr Protoc Pharmacol. 85 (1), e60(2019).
  30. Sundheimer, J. K., et al. Experimental insights and recommendations for successfully performing cerebral microdialysis with hydrophobic drug candidates. Clin Transl Sci. 18 (5), e70226(2025).
  31. Altendorfer-Kroath, T., Hummer, J., Birngruber, T. In vivo monitoring of brain pharmacokinetics and pharmacodynamics with cerebral open flow microperfusion. Biopharm Drug Dispos. 44 (1), 84-93 (2023).
  32. Kreß, S., et al. Innovative platform for the advanced online monitoring of three-dimensional cells and tissue cultures. Cells. 11 (3), 412(2022).
  33. Bjorkli, C., et al. In vivo microdialysis in mice captures changes in alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers consistent with developing pathology. J Alzheimers Dis. 84 (4), 1781-1794 (2021).
  34. Gorska, A. M., et al. Evaluation of cerebrospinal fluid (csf) and interstitial fluid (isf) mouse proteomes for the validation and description of alzheimer's disease biomarkers. J Neurosci Methods. 411, 110239(2024).
  35. Pemmari, T., et al. Screening of homing and tissue-penetrating peptides by microdialysis and in vivo phage display. Life Sci Alliance. 8 (5), e202201490(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model mysi glejaka wielopostaciowegopobieranie p ynu r dmi szowegomikro rodowisko guzaszczepienie guza m zgupobieranie pr bek pod u nychanaliza metabolomicznaanaliza proteomicznapompa mikroperfuzyjnaobrazowanie bioluminescencyjne

Powiązane artykuły