Artykuł metodologiczny

Standaryzowany model na myszach z trzyosobowym przepływem pracy do badania ostrego odrzutu komórkowego i przekaźnikowego w ksenotransplantacji

DOI:

10.3791/68756

⸱

20 marca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Beijing Jishuitan Hospital Affiliated to Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory of Organ Xenotransplantation, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Cardiac Surgery, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 6Department of Cardiac Surgery, Fuwai Yunnan Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Affiliated Cardiovascular Hospital of Kunming Medical University, 7Shenzhen Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, 8Sanya Institute of China Agricultural University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie ustanawia dwa standaryzowane modele ksenotransplantacji u myszy, aby specyficznie naśladować ostre odrzucenie komórkowe i ostre odrzucenie pośredniczone przeciwciałami. Modele te służą jako niezawodna platforma do badania mechanizmów immunologicznego odrzucania ksenotransplantatów, oceny strategii immunosupresyjnych i rozwijania przedklinicznych badań nad ksenotransplantacją.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mimo ostatnich postępów w dziedzinie ksenotransplantacji, ostra odrzucenie wciąż pozostaje główną przeszkodą dla jej klinicznego zastosowania. Ostra odrzucenie komórkowe (ACR) i ostre odrzucenie pośredniczone przeciwciałami (AMR) są głównymi reakcjami immunologicznymi prowadzącymi do wczesnego niepowodzenia przeszczepu u osób przyjmujących ksenograft. Chociaż duże modele zwierząt, takie jak nietoperze nieludzkie i genetycznie zmodyfikowane świnie, dostarczyły cenny wgląd, ich zastosowanie jest ograniczone wysokimi kosztami, ograniczeniami etycznymi i znaczną zmiennością eksperymentalną. Modele na małych zwierzętach oferują praktyczną, możliwą do powtórzenia alternatywę dla mechanistycznych badań nad odrzuceniem immunologicznym. W niniejszym badaniu opracowano dwa standaryzowane modele mysiej ksenotransplantacji, aby specyficznie naśladować ACR i AMR. Aby zapewnić reproduktywalność i zminimalizować zmienność związaną z operatorem, zaimplementowano zstrukturyzowany protokół chirurgiczny dla trzech osób z przepływowym przebiegiem pracy, umożliwiający konsekwentne generowanie modeli z wysoką wydajnością i jakością. Powstałe modele nie tylko replikują kluczowe cechy immunopatologiczne klinicznego odrzucenia ksenograftu, ale również oferują solidną platformę do badania mechanizmów immunologicznych i oceny ukierunkowanych strategii immunosupresyjnych. Modele te pomogą przyspieszyć przedkliniczny rozwój terapii ksenotransplantacyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ksenokserotransplantacja stała się jedną z najbardziej obiecujących strategii w celu rozwiązania problemu niedoboru narządów od dawców do przeszczepienia. W ostatnich latach szybkie postępy w technologiach edycji genetycznej, strategiach regulacji odporności i inżynierii biomedycznej doprowadziły do znaczącego postęp w tej dziedzinie1. W ciągu ostatnich trzech lat wiele zespołów badawczych na całym świecie przeprowadziło badania kliniczne dotyczące ksenotransplantacji u ludzi, w tym dwa przypadki przeszczepienia genetycznie zmodyfikowanych serc świń na University of Maryland, badanie przeszczepienia nerki świni w Massachusetts General Hospital oraz badanie przeszczepienia tymo-nerki na New York University2,3,4,5. Mimo tych bezprecedensowych osiągnięć, odrzucanie immunologiczne pozostaje głównym wyzwaniem ograniczającym kliniczne zastosowanie ksenotransplantacji. Nawet przy wysoce zoptymalizowanych genetycznie zmodyfikowanych narządach od dawców i połączonych reżimach immunosupresyjnych, odrzucanie nadal jest główną przeszkodą. Obecne badania wskazują, że ostre odrzucanie jest krytyczną przeszkodą w ksenotransplantacji, klasyfikowaną głównie na ostre odrzucanie komórkowe (ACR) i ostre odrzucanie pośredniczone przeciwciałami (AMR). ACR jest głównie pośredniczone przez limfocyty T, charakteryzuje się rozległym infiltracją limfocytów T do przeszczepu, prowadząc do uszkodzenia tkanek i upośledzenia funkcji. Jego podstawowe mechanizmy obejmują prezentację antygenu ksenoksennego, aktywację limfocytów T i uwalnianie cytokin zapalnych6,7. W przeciwieństwie do tego, AMR jest napędzany przeciwciałami przeciwko konkretnemu dawcy, uformowanymi wcześniej lub nowo wytworzonymi. Te przeciwciała wiążą się z komórkami śródbłonka w obrębie przeszczepu, wyzwalając aktywację dopełniacza i mocną odpowiedź immunologiczną, prowadząc ostatecznie do uszkodzenia mikrokrążenia, zakrzepicy i niewydolności przeszczepu8,9,10. Dlatego głębsze zrozumienie tych mechanizmów odrzucania i opracowanie bardziej precyzyjnych strategii immunoregulujących są niezbędne dla rozwoju ksenotransplantacji od badań przedklinicznych do długoterminowego zastosowania klinicznego.

Aby sprostać wyzwaniu ostrego odrzucania w ksenotransplantacji, konieczne jest powrót do badań podstawowych i przedklinicznych w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów immunologicznych. Duże modele zwierzęce, szczególnie naczelne nieludzkie (NHPs) i genetycznie zmodyfikowane świnie, były szeroko stosowane w badaniach ksenotransplantacji ze względu na ich bliskie podobieństwo anatomiczne i fizjologiczne do ludzi. Modele te dostarczają krytycznych informacji na temat mechanizmów immunologicznego odrzucania i strategii immunomodulujących. Jednak ich zastosowanie jest znacznie ograniczone przez wysokie koszty, kwestie etyczne i złożoność długotrwałej opieki pooperacyjnej. Ponadto znaczna zmienność reakcji immunologicznych wśród poszczególnych NHPs wpływa na powtarzalność wyników eksperymentów11,12,13. Podczas gdy duże modele zwierzęce pozostają niezastąpione dla translacji klinicznej, ich ograniczenia w zakresie wykonalności eksperymentów i spójności podkreślają pilną potrzebę bardziej opłacalnych, skalowalnych i mechaniscicznie odpowiednich modeli na małych zwierzętach.

Mając na uwadze te wyzwania, modele na małych zwierzętach zyskały coraz większe znaczenie w badaniach ksenotransplantacji ze względu na niski koszt, krótkie cykle eksperymentalne i łatwość dużej skali zastosowania. Modele te nie tylko zapewniają podstawową platformę do badania mechanizmów immunologicznego odrzucania, ale także służą jako kluczowy most między badaniami in vitro a eksperymentami na dużych zwierzętach, ułatwiając bardziej precyzyjne zbadanie strategii immunoregulujących. W niniejszym badaniu ustanowiono dwa standaryzowane modele ksenotransplantacji na myszach, które specyficznie naśladują ACR i AMR. Aby zapewnić powtarzalność i spójność, zastosowano standaryzowany protokół chirurgiczny dla trzech osób oraz usprawniony, liniowy proces do tworzenia modeli. Ten standaryzowany proces minimalizuje zmienność zależną od operatora, co prowadzi do wysoce jednolitych modeli przeszczepienia serca. Te udoskonalenia zapewniają niezawodną platformę do badań mechaniscicznych i oceny nowych strategii immunosupresyjnych. Ten protokół jest szczególnie odpowiedni dla badaczy prowadzących badania na małych zwierzętach nad mechanizmami immunologicznymi ksenotransplantacji i oceną strategii immunosupresyjnych. Oferuje zalety, takie jak niski koszt, wysoką powtarzalność i standaryzowany proces, zapewniając niezawodną bazę eksperymentalną dla późniejszych badań na dużych zwierzętach i badań przedklinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół może być wykonywany przez jednego operatora lub trzyosobową ekipę, przy czym każdy członek jest odpowiedzialny odpowiednio za pozyskanie serca dawcy, przygotowanie biorcy oraz wykonanie anastomoz serca dawcy. Cała procedura jest zakończona w ciągu 10 minut, co umożliwia szybkie, wysokowydajne i standaryzowane generowanie modelu.

Doświadczenia na zwierzętach w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Zastosowania (IACUC) Szpitala Fuwai, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (Numer zgody 0108-1-70-ZX(X)-41). Wszystkie procedury zostały wykonane z zachowaniem surowych wymagań dotyczących opieki nad zwierzętami oraz wytycznych etycznych w celu zapewnienia przestrzegania odpowiednich standardów. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Przygotowanie mankietów
    1. Do wykonania mankietów na potrzeby chirurgii przeszczepowej użyj poliimidowych rurek. Dla mankietu tętniczego wybierz poliimidowe rurki o średnicy wewnętrznej 0,3–0,5 mm i pokrój je na segmenty 2 mm pod mikroskopem stereoskopowym (10×–20× powiększenie).
    2. Częściowo przetnij przekrój zaciskaczy każdego segmentu wzdłuż obwodu na pół, aby utworzyć wystającą część przypominającą uchwyt. Dla mankietu żylnego wybierz poliimidowe rurki o średnicy wewnętrznej 0,4–0,7 mm i pokrój je na segmenty 3 mm. Podobnie, częściowo przetnij przekrój zaciskaczy wzdłuż obwodu na pół, aby stworzyć wystającą część przypominającą uchwyt.
      UWAGA: Zanurz mankiety w 75% alkoholu etylowym na 30 min, następnie dokładnie spłucz je izotonowym roztworem soli.
  2. Przygotowanie myszy: Do eksperymentu użyj noworodków szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 10–12 dni jako dawców oraz myszy C57BL/6 lub Balb/c w wieku 7–8 tygodni jako biorców. Aby zapewnić właściwą opiekę i zminimalizować stres, transportuj noworodków-dawców razem z matką. Umieść wszystkie zwierzęta w środowisku swobodnym od specyficznych patogenów (SPF).

2. Pozyskanie serca dawcy

  1. Fiksację i znieczulenie
    1. Znieczulić noworodki szczurów przez wstrzyknięcie dootrzewnowe mieszanki ketaminy i ksylazyny, takich jak ketaminy w dawce 80–100 mg/kg i ksylazyny w dawce 5–10 mg/kg, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucję. Przed zabiegiem zapewnić znieczulenie pooperacyjne poprzez podskórne podanie meloxicam w dawce 5 mg/kg z wykorzystaniem sterylnego roztworu soli fizjologicznej jako pojazdu. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego upewnić się, że nie ma reakcji odruchowych, co świadczy o odpowiednim znieczuleniu.
    2. Po osiągnięciu pełnego znieczulenia, ułóż szczura w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz go pod mikroskopem stereoskopowym. Usuń włosy z obszaru operacyjnego torakoabdominalnego i wykonaj przygotowanie aseptyczne przy użyciu trzech naprzemiennych przecierek z mydłem powidenowo-jodowym lub na bazie chlorheksidyny, po czym zastosuj alkohol. Podczas pozyskiwania serca dawcy używaj sterylnych rękawic, sterylnego sprzętu oraz sterylnego prześcieradła, aby utrzymać warunki aseptyczne.
      UWAGA: Obsługuj tribromoetanol z rękawicami i ochroną oczu w wentylowanym obszarze; unikaj kontaktu ze skórą i wdychania.
  2. Heparynizacja
    1. Wykonaj dezynfekcję obszaru torakoabdominalnego za pomocą bawełnianych kul zmokczonych w powideonie jodowym. Delikatnie przesuń jelita za pomocą bawełnianego wacika, aby eksponować dolną żyłę główną.
    2. Wstrzyknij heparynizowanego soli fizjologicznej (0,2–0,5 ml) do dolnej żyły głównej za pomocą strzykawki insulinowej, po czym lekko uciśnij miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem, aby zapobiec krwawieniu.
      UWAGA: Podczas przygotowywania lub wstrzykiwania heparynizowanego soli fizjologicznej, używaj rękawic i ochrony oczu; wyrzuć strzykawki jako odpady ostre. Przygotuj heparynizowanego soli fizjologicznej, rozpuszczając jedną fiolkę medycznego heparynu sodowej (125 mg) w 100 ml izotonicznego soli fizjologicznej.
  3. Arrest kardio
    1. Wykonaj nacięcie przepony, przetnij ścianę piersiową po obu stronach i odsuń ją, aby w pełni eksponować serce. Usuń grasicę. Przetnij górną żyłę główną, aby zmniejszyć ciśnienie, i przeprowadź perfuzję 1 ml roztworu University of Wisconsin (UW) do aorty, aby wywołać arrest kardio.
    2. Kontynuuj perfuzję, aż serce zmieni kolor z czerwonego na bladobiały. Jednocześnie umieść gazę nasączoną lodowato zimnym soli fizjologicznej na sercu, aby obniżyć jego temperaturę i zapobiec odwodnieniu.
      UWAGA: Przed użyciem wytnij sterylne gazy na kawałki o wymiarach 1 cm × 1 cm i wstępnie je nasącz w lodowato zim

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia standaryzowany trzyosobowy przepływ pracy współpracy w celu stworzenia modelu ksenotransplantacji mysich. W tym systemie trzy operatorzy pracują równolegle, każdy wykonując wielokrotnie wyznaczone zadanie: przygotowanie biorcy, pobieranie serca oddawcy lub anastomoza serca oddawcy. Taki podział pracy pozwala na zakończenie jednego pełnego modelu transplantacyjnego co 10 min. Podczas gdy pojedynczy operator może ukończyć jeden model w około 30 min, trzyosobowy przepływ p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ksenoksenotransplantacja u myszy jest procedurą wysoce inwazyjną, która wymaga wysokiego poziomu kompetencji technicznych i konsekwencji od operatora. Podczas ustanawiania modelu operator ma znaczący wpływ na wyniki eksperymentu14,15. W przypadku jednoosobowego przepływu pracy, złożoność i długość procedury prowadzą do czasu operacji wynoszącego około 30 minut na jeden model, co prowadzi do niskiej wydajności. Ponadto, indywidualne różnice w sekcji anatomicznej, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To dzieło zostało sfinansowane przez Frontier Biotechnology Key Project Narodowego Programu Badań i Rozwoju Ministerstwa Nauki i Technologii Chin (2023YFC3404300), Narodowy Program Badań i Rozwoju Chin (2023YFF0724701), Fundusze na Badania Kliniczne dla Centralnych Szpitali Wysokiego Poziomu Fuwai Hospital, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych, Badania Prekliniczne nad Sercami Darczyńców Edytowanych Genamiksenogenecznymi dla Ortotopycznej Transplantacji Serca u Dzieci z Niewydolnością Serca (2025-GSP-ZD-4) oraz przez Państwowe Laboratorium Badań nad Chorobami Układu Krążenia, Fuwai Hospital, Chińska Akademia Nauk Medycznych, Wykrywanie i Rozwój Celów Leków dla Długotrwałego Przeżycia Ortotopycznej Ksenoprotezacyjnej Transplantacji Serca (2025-GSP-GG-42).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anti-CD3 antibodyAbcamab16669
Anti-CD68 antibodyBiossbs-1432R
DAPIThermofisherP36971
Depilatory creamVeet-
Electrocautery penYuyan Instrument-
Fluorescent secondary antibodiesThermofisherA-11008
HE staining kitBeyotimeC0105S
Ice makerShjingmiIMS-20
Insulin syringesKDLU-40
Lidocaine gelTide Pharm
MeloxicamSigma-Aldrich444800
Microsurgical forcepsZHENHAOFS217
Microsurgical needle holdersBIOFIVENHH01231
Microsurgical scissorsZHENHAOFS237
Normal salineKelun Pharmaceutical-
Polyimide tubingGuangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.-Średnica wewnętrzna: 0,3-0,5 mm
Polyimide tubingGuangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.-Średnica wewnętrzna: 0,4-0,7 mm
Povidone-iodine solutionINOHV-
Sodium heparinQianhong bio-pharma-
StereomicroscopeMurziderMSD204
Surgical suturesJinhuan Medical8-0 and 4-0 silk sutures
Surgical warming padHani Pet-
Tribromoethanol JitianbioJT0781
University of Wisconsin solutionBelzer-
Vascular clampsRWD LifeR31005-10

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ali, A., Kemter, E., Wolf, E. Advances in organ and tissue xenotransplantation. Annu Rev Anim Biosci. 12, 369-390 (2024).
  2. Griffith, B. P., et al. Genetically modified porcine-to-human cardiac xenotransplantation. N Engl J Med. 387 (1), 35-44 (2022).
  3. Griffith, B. P., et al. Transplantation of a genetically modified porcine heart into a live human. Nat Med. 31 (2), 589-598 (2025).
  4. Mohiuddin, M. M., et al. Graft dysfunction in compassionate use of genetically engineered pig-to-human cardiac xenotransplantation: A case report. Lancet. 402 (10399), 397-410 (2023).
  5. Kawai, T., et al. Xenotransplantation of a porcine kidney for end-stage kidney disease. N Engl J Med. 392 (19), 1933-1940 (2025).
  6. Lu, T. Y., et al. Advances in innate immunity to overcome immune rejection during xenotransplantation. Cells. 11 (23), 3865(2022).
  7. Zhou, Q., et al. Current status of xenotransplantation research and the strategies for preventing xenograft rejection. Front Immunol. 13, 928173(2022).
  8. Habibabady, Z., et al. Antibody-mediated rejection in xenotransplantation: Can it be prevented or reversed. Xenotransplantation. 30 (4), e12816(2023).
  9. Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. Lancet. 402 (10408), 1158-1169 (2023).
  10. Kinoshita, K., et al. Novel factors potentially initiating acute antibody-mediated rejection in pig kidney xenografts despite an efficient immunosuppressive regimen. Xenotransplantation. 31 (2), e12859(2024).
  11. Tseng, H. T., et al. Animal models for heart transplantation focusing on the pathological conditions. Biomedicines. 11 (5), 1414(2023).
  12. von Bibra, C., Hinkel, R. Non-human primate studies for cardiomyocyte transplantation—ready for translation. Front Pharmacol. 15, 1408679(2024).
  13. Jia, H., Chang, Y., Song, J. The pig as an optimal animal model for cardiovascular research. Lab Anim NY. 53 (6), 136-147 (2024).
  14. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  15. Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ksenotransplantacja mysiaostre odrzucenie kom rkoweodrzucanie ksenoprzeszczepumodele ma ych zwierz todrzucenie immunologicznestrategie immunosupresyjneniewydolno przeszczepuprzedkliniczna ksenotransplantacja
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły