Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeszczepy białego i brązowego tłuszczu: podejście do korekty deficytów rozrodczych, metabolicznych i nerkowych u myszy otyłych czarno-brązowych brachyury (BTBR)

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68759

⸱

9 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein Research and Education Institute, Hospital Israelita Albert Einstein, 2School of Medicine, Faculdade Israelita de Ciências da Saúde Albert Einstein, 3Nephrology Division, Federal University of São Paulo

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół przeszczepu tkanki tłuszczowej białej i brązowej, który oferuje obiecującą strategię odwrócenia niepłodności, otyłości i hiperglikemii, jednocześnie poprawiając funkcję nerek u myszy z cukrzycą i otyłością BTBR.

Streszczenie

Przeszczepianie białej tkanki tłuszczowej (WAT) oraz brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) stało się obiecującą strategią terapeutyczną w celu odwrócenia zaburzeń metabolicznych bez konieczności ciągłego podawania substancji egzogennych. WAT pełni funkcję kluczowego narządu hormonalnego zaangażowanego w homeostazę energii, natomiast BAT jest tkanką termogeniczną kluczową dla termoregulacji. Model otyłej myszy Black and Tan Brachyuric (BTBR) wiernie naśladuje kluczowe cechy otyłości, cukrzycy typu 2 (T2DM) oraz cukrzycowej choroby nerek (DKD), w tym hiperglikemię, insulinooporność, hipometabolizm i subpłodność.

Stosując poniżej opisany protokół, połączona transplantacja WAT i BAT pochodzących od dawców typu dzikiego i heterozygotycznego BTBR do biorców BTBR z otyłością doprowadziła do odwrócenia subpłodności, zmniejszenia przyrostu masy ciała, normalizacji kontroli glikemii oraz poprawy parametrów nerek. Co istotne, przerost nerek i apoptoza zostały zmniejszone, podczas gdy liczba podocytów została zachowana. Wyniki te sugerują, że połączona transplantacja WAT i BAT może stanowić alternatywną strategię terapeutyczną w leczeniu T2DM, z równoczesnymi korzyściami w łagodzeniu DKD i otyłości. Ponadto takie podejście może pomóc zwiększyć liczbę otyłych myszy BTBR w koloniach viwariów. Dalsze badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw mogą ułatwić kliniczne przełożenie tej interwencji.

Wprowadzenie

Cukrzycowa choroba nerek (DKD), cukrzyca typu 2 (T2DM) oraz otyłość to powiązane, wieloczynnikowe schorzenia, które stanowią poważne i rosnące globalne wyzwania zdrowotne. DKD, definiowane jako współistnienie cukrzycy (DM) i przewlekłej choroby nerek bez innych identyfikowalnych przyczyn uszkodzenia nerek, dotyka około 20-40% osób z DM 1,2. T2DM to ogólnoustrojowe zaburzenie metaboliczne charakteryzujące się przewlekłą hiperglikemią oraz zaburzeniami homeostazy glukozy, lipidów i insuliny. Należy do dziesięciu najczęstszych przyczyn śmiertelności na świecie, obecnie dotykając ponad 500 milionów osób3. Otyłość, spowodowana przewlekłą nierównowagą między spożyciem a wydatkiem energii, dotyka obecnie jedną na osiem osób na świecie i jest głównym czynnikiem zarówno zachorowalności, jak i śmiertelności4. Te trzy schorzenia są ze sobą ściśle powiązane: otyłość znacząco zwiększa ryzyko rozwoju T2DM, co z kolei znacząco podnosi ryzyko DKD 1,4. Rosnąca globalna częstość występowania otyłości, T2DM i DKD podkreśla pilną potrzebę głębszego zrozumienia ich mechanizmów patofizjologicznych oraz opracowania skutecznych strategii terapeutycznych.

Przeszczep BAT stał się obiecującą strategią terapeutyczną w walce z otyłością i cukrzycą typu 22. Ta interwencja wiąże się ze spadkiem masy ciała, poprawą insulinooporności i steatozą wątroby oraz wzrostem krążącej adiponektyny, ekspresji receptorów β3-adrenergicznych oraz genów zaangażowanych w utlenianie kwasów tłuszczowych5. Warto zauważyć, że tkankę tłuszczową ssaków można podzielić na trzy główne typy w zależności od koloru: białą, brązową i beżową6. WAT zaczyna się rozszerzać wkrótce po narodzinach i jest szeroko rozproszony po całym ciele. Pełni funkcję kluczowego narządu hormonalnego, magazynując nadmiar energii w postaci trójglicerydów poprzez sekwestrowanie krążącej glukozy i wolnych kwasów tłuszczowych6. Natomiast BAT odgrywa kluczową rolę w termoregulacji, rozpraszając energię w postaci ciepła poprzez niedrżącą termogenezę, zamiast magazynować ją jako ATP6. Aktywność BAT-ów maleje wraz z wiekiem, otyłością i DM. U dorosłych BAT stanowi niewielką część całkowitej tkanki tłuszczowej i znajduje się głównie w okolicach nadłopatkowych i szyjnych u ludzi, natomiast u myszy przeważnie w obszarze międzyłopatkowym6. Bogaty w mitochondria, BAT zużywa znaczne ilości glukozy i kwasów tłuszczowych i wiąże się z opornością na przyrost masyciała 7. Pojawiające się dowody potwierdzają rolę BAT w promowaniu bardziej smukłego i metabolicznie korzystnego fenotypu, co wzbudza rosnące zainteresowanie jego terapeutycznym zastosowaniem poprzez przeszczepy.

Leptyna, hormon wydzielany głównie przez WAT, odgrywa kluczową rolę w regulacji równowagi energetycznej, metabolizmu i płodności8. Działa na ośrodkowy układ nerwowy, stymulując wydzielanie hormonu uwalniającego gonadotropinę (GnRH) w podwzgórzu, co następnie sprzyja uwalnianiu hormonu luteinizującego (LH) oraz hormonu folikulostymulującego (FSH) z przedniego przysadki9. Leptyna działa także bezpośrednio na komórki teki jajnika i ziarniskow, wspierając rozwój pęcherzyków9.

Model myszy BTBRob/ob (BTBR otyły), genetycznie oznaczony jako BTBR. Cg-Lep ob/WiscJ (czarno-opalony, otyły, puchowaty; patrz Tabela materiałów) jest homozygotą dla spontanicznej utraty funkcji w genie leptyny (Lep) i wykazuje szereg nieprawidłowości metabolicznych i rozrodczych, w tym hiperglikemię, nietolerancję glukozy, hiperinsulinemię, hipertriglicerydemię, upośledzenie gojenia ran, hipometabolizm, hipotermię oraz subpłodność spowodowaną hipogonadotropowym hipogonadizmem. Mężczyźni zazwyczaj rozwijają T2DM do szóstego tygodnia życia, natomiast samice do ósmego tygodniai 10. Hiperglikemia jest ciężka i postępująca, a poziom glukozy na czczo przekracza 400 mg/dL po dziesięciu tygodniach. Dodatkowo, otyłe samce BTBR wykazują albuminurię zależną od czasu już w ósmym tygodniu, przechodzącą do histologicznie widocznego DKD, w tym rozszerzanie mezangialnej i podocyturię. Te cechy ustanawiają otyłe myszy BTBR jako solidny model przedkliniczny, który wiernie odzwierciedla ludzki DKD10.

Biorąc pod uwagę głębokie konsekwencje metaboliczne niedoboru leptyny, opracowano kilka strategii mających na celu odwrócenie fenotypu ob/położnika , w tym terapię zastępczą leptyną oraz przeszczep tkanki tłuszczowej. Podczas gdy większość badań wykorzystywała myszy ob/ob na tle C57BL/6, stosunkowo niewiele badało te interwencje w bardziej metabolicznie upośledzonym szczepie BTBR. U myszy C57BL/6 ob/ob transplantacja WAT wykazuje normalizację poziomu insuliny, poprawę wrażliwości na insulinę oraz przywracanie płodności8. Ponadto wykazano, że transplantacja BAT u chudych myszy C57BL/6 zapobiega przyrostowi masy ciała, poprawia tolerancję glukozy i wrażliwość na insulinę, a jednocześnie zmniejsza insulinooporność, szczególnie w kontekście otyłości wywołanej dietą wysokotłuszczową11. Dodatkowo, przeszczep BAT wykazał poprawę hemodynamiki serca i zdrowia metabolicznego12. Pomimo obiecujących wyników, badania te mają kilka istotnych ograniczeń. Większość badań przeprowadzono na myszach C57BL/ 6 ob/ob , które wykazują stosunkowo łagodny fenotyp metaboliczny w porównaniu do ciężej dotkniętego szczepu BTBR ob/ob . W konsekwencji uogólnialność tych wyników na modele z bardziej wyraźną insulinoopornością, hiperglikemią, otyłością i chorobami nerek jest ograniczona. Ponadto skutki zastępowania leptyną i przeszczepu tkanki tłuszczowej zostały niewystarczająco zbadane w tle BTBR, co stanowi istotną lukę w literaturze. Wiele z tych interwencji było również oceniane u szczupłych zwierząt lub w krótkim okresie, co może nie oddać w pełni złożoności i przewlekłego charakteru ludzkich chorób metabolicznych. Chociaż zgłaszano poprawę wrażliwości na insulinę, tolerancji glukozy i płodności, mechanizmy leżące u podstaw pozostają słabo poznane, a translacyjne znaczenie tych wyników w warunkach klinicznych pozostaje niepewne. Co istotne, łączne efekty metaboliczne przeszczepów tkanki tłuszczowej białej i brązowej u myszy ob/ob BTBR pozostają w dużej mierze niezbadane.

Celem tego badania jest ustandaryzowanie protokołu łączonego przeszczepu WAT i BAT u myszy otyłych BTBR oraz ocena jego wpływu na przywracanie płodności, funkcję nerek oraz zmiany histologiczne. Drugim celem jest ułatwienie ekspansji kolonii otyłych BTBR, przy jednoczesnym ograniczeniu utraty myszy heterozygotycznych (BTBR ob/+) i dzikich (BTBR +/+) w wiwarium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety Opieki i Wykorzystania Zwierząt Szpitala Israelita Albert Einstein (HIAE) i zarejestrowane w Żydowskim Instytucie Badań i Edukacji w São Paulo, SP, Brazylia (nr 3309-18 oraz nr 4900-21). Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

UWAGA: Myszy BTBR z otyłością (nokaut genu leptynowego, homozygotyczne, ob/ob) zostały użyte jako model dla T2DM, DKD i otyłości. Samice otyłych myszy BTBR w wieku 4-5 tygodni były odbiorcami przeszczepu tkanki tłuszczowej. Zwierzętami dawcami były samice BTBR ob/+ (heterozygotyczne) lub +/+ (typ dziki) (genotyp niepotwierdzony, ale fenotypowo chudy). W momencie przeszczepu myszy biorące miały średnią masę ciała od 25 do 32 g. Wszystkie zwierzęta były trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach w standardowych warunkach, z dostępem do jedzenia i wody ad libitum, 12-godzinnym cyklem światła/ciemności oraz kontrolą temperatury otoczenia. Maksymalnie pięć zwierząt było w klatce.

1. Zabieg chirurgiczny

UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być sterylizowane przed operacją, podgrzewając do 240-270 °C w gorącym sterylizatorze z kulkami, a następnie 70% z alkoholem. Wszystkie rurki powinny zostać wysterylizowane przez autoklawowanie przed użyciem.

  1. Uśpiewanie myszy dawcy przy użyciu 100% przedawkowania izofluranu (2,5-5%), a następnie zwichnięcia szyjki macicy (Rysunek 1A).
  2. Umieść zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej (na brzuchu) i zdezynfekuj dolną część brzucha 0,5% alkoholowym diglukonianem chlorheksydyny. Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 2-3 cm, aby pobrać WAT pachwinowe (Rysunek 1B). Umieść usuniętą tkankę w probówce o pojemności 3 mL na lodzie.
  3. Przestaw zwierzę w pozycji brzusznej leżącej (na brzuchu) i zdezynfekuj okolice łopatek 0,5% alkoholowym diglukonianem chlorheksydyny. Wykonaj nacięcie środkowe o szerokości 1-2 cm między łopatkami, aby pobrać nietoperza międzyłopatkowego (Rysunek 1C). Zebranie tkanki tłuszczowej od 10-14 dawców. Upewnij się, że łączna wartość WAT + BAT odpowiada 10–15% masy ciała odbiorcy.
  4. Ostrożnie oczyść tłuszcz, aby usunąć wszelkie zebrane włosy. Ujednolicaj WAT i BAT osobno, używając igły 16 G i strzykawki 3 mL (Rysunek 1D).
  5. Zmierz ostateczną wagę tłuszczu za pomocą wagi analitycznej (rysunek 1E) i trzymaj próbki na lodzie aż do przeszczepu.
  6. Znieczulanie biorców myszy BTBR z otyłością w komorze izofluranowej w 100% v/v (indukcja 2,5-5%) oraz utrzymywanie znieczulenia za pomocą maseczki na twarz (1,5-2,5%). Gdy oddech spadnie do ≤1 oddechu co 3 s, potwierdź głębokość znieczulenia testem odruchu odstawienia i umieść zwierzę w pozycji brzusznej leżącej (Rysunek 1F).
  7. Dezynfekuj grzbietową część za pomocą 2,0% bezalkoholowego diglukonianu chlorheksydyny (Rysunek 1G).
  8. Wstrzyknąć 100-200 μL zhomogenizowanego tłuszczu na miejsce za pomocą igły 16 G na 6-26 miejscach na grzbietowej powierzchni. Użyj kleszczy, aby ułatwić rozprowadzanie. Po przeszczepieniu należy nałożyć roztwór chlorheksydyny 0,5% do każdego miejsca wstrzyku (rysunek 1H).
  9. Podawaj dawkę tramadolu domięśniową (40 mg/kg; 50 mg/mL) w leczeniu przeciwbólu oraz zwierzęta domowe indywidualnie, aby zapobiec urazom podczas rekonwalescencji.
    UWAGA: Obserwuj zwierzę przez 1-1,5 godziny co 15 minut bezpośrednio po operacji, a następnie kontrolne badanie 6-8 godzin po operacji, aby ocenić kliniczne objawy bólu i w razie potrzeby podać środek przeciwbólowy.
  10. Następnego dnia oczyść miejsca wstrzyknięcia roztworem chlorheksydyny 0,5% i podać drugą dawkę tramadolu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat procedury przeszczepu tłuszczu. (A) Eutanazja dawcy z użyciem izofluranu w zamkniętym pudełku. (B) Zbieranie pachwinowego WAT. (C) Pozyskiwanie międzyłopatkowego BAT. (D) Homogenizacja tłuszczu. (E) Ważenie tłuszczu. (F) Znieczulenie u odbiorcy. (G) Asepsa pleców. (H) Zastrzyk tłuszczu z techniką wspomaganą kleszczemi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

2. Kopulacja po przeszczepieniu

  1. Dwa tygodnie po przeszczepieniu współdomem samic otyłych myszy BTBR z samcami myszy BTBR ob/+ (heterozygotycznych) do kopulacji.

3. Oceny funkcjonalne

  1. Mierz masę ciała co tydzień, używając analitycznej wagi.
  2. Zmierz poziom glukozy na czczo za pomocą glukometru w pięciu punktach czasowych: tygodnie 4-7, 8-10, 14-16, 18-20 oraz 24-26.
  3. Umieść zwierzę w klatce metabolicznej z dostępem do wody na 6 godzin, aby pobrać próbkę moczu.
  4. Mierz poziom albuminy moczu metodą ELISA i określaj kreatyninę w moczu metodą kolorymetrycznego kwasu pikrynowego w 6-8 tygodniach. Oblicz stosunek albuminy do kreatyniny w moczu moczu (uACR), dzieląc stężenie albuminy (μg) przez stężenie kreatyniny (mg).

4. Analiza morfologiczna

  1. Uśpienie myszy biorcy w wieku 24 tygodnia, podając 100% przedawkowanie izofluranu (2,5-5%), a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
  2. Pobieranie jajników, nerek i trzustki w wieku 24 tygodni.
  3. Umieść pobrane organy w 10% neutralnej formynie buforowanej i utrwal w temperaturze pokojowej przez 24-48 godzin.
  4. Po fiksacji przetwarza się tkanki za pomocą automatycznego procesora tkankowego, usuwając wodę i osadzając ją w parafinie do analizy histologicznej.
    1. Kolejno zanurz tkanki w następujących roztworach etanolu przez 1 godzinę każdy: 70%, 85%, 95% (2x) i 100% (2x).
    2. Przenieś tkanki do świeżego ksylenu na 1 godzinę, a następnie poddaj drugą kąpiel ksylenową na kolejne 1 godzinę.
    3. Zanurz tkanki w roztopionym wosku parafinowym w 6 °C przez godzinę, a następnie przelej do świeżej parafiny na kolejną godzinę.
    4. Ułóż tkanki w podgrzewanej formie wypełnionej stopioną parafiną i pozwól zastygnąć w temperaturze pokojowej.
    5. Wytnij cztery niekolejne sekcje o grubości 3,5 μm z każdego bloku za pomocą mikrotomu. Unieś wstążki na kąpieli wodnej o temperaturze 4 °C, aby się spłaszczyć, a następnie mocuj poszczególne sekcje na dodatnio naładowanych szklanych szkiełkach. Opróżnij nadmiar wody i umieść szkiełki na podgrzewaczu o temperaturze 3°C na 60 minut.
  5. Należy zmierzyć liczbę mieszków mieszkowych w jajnikach i wielkości wyspy trzustkowej za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E).
    1. Inkubuj tkanki z osadzoną parafiną w piekarniku w temperaturze 6 °C przez 1 godzinę. Przełóż preparaty do pojemnika ze świeżym ksylenem i inkubuj przez 30 minut, aby rozpuścić parafinę, a po 15 minutach zastąpić ksylen świeżym roztworem.
    2. Zanurz preparaty kolejno przez 30 sekund w mieszance ksylenu i etanolu, 100% etanolu, 85% etanolu i 70% etanolu.
    3. Przepłukaj wodą z kranu (10 s), barw hematoksylinę Harris (30 s) i zanurz w 95% etanolu (3 s).
    4. Kolejno zanurz preparaty w mieszance 70%, 85%, 100% etanolu oraz ksylenu:etanolu na 30 sekund każda.
    5. Zanurz szkiełka w świeżym ksylenie na 5 minut, a następnie poddaj drugą kąpiel ksylenową na dodatkowe 5 minut, aby utrzymać plamę.
    6. Montaż slajdów za pomocą pokrywek za pomocą nośnika montażowego.
  6. Ocena rozmiaru kłębuszków i rozszerzenia macierzy mezangialnej za pomocą barwienia przekrojów nerek kwasowo-Schiffowym (PAS).
    1. Inkubuj w 6 °C przez 1 godzinę i zanurz w świeżym ksylenie przez 5 minut, aby odparaffinizować fragmenty tkanki.
    2. Sekwencyjnie zanurz slajdy w 99%, 95% i 70% etanolu po 30 sekund każdy.
    3. Płukaj wodą z kranu przez 10 sekund.
    4. Nałóż 10 kropel kwasu okresowego i inkubuj przez 10 minut.
    5. Przepłucz w bieżącej wodzie przez 3 minuty i wysusz.
    6. Dodaj 10 kropli odczynnika Schiffa i inkubuj przez 15 minut w ciemnej komorze.
    7. Przepłucz w bieżącej wodzie przez 3 minuty i wysusz.
    8. Dodaj 10 kropli hematoksyliny Harrisa do barwienia przeciwbarwnego i inkubuj przez 3 minuty.
    9. Płucz wlew do bieżącej wody przez 3 minuty i wysusz.
    10. Zanurz preparaty kolejno w mieszance 70%, 85%, 100% etanolu i ksylenu:etanolu po 30 sekund każda.
    11. Zanurz szkiełka w świeżym ksylenie na 5 minut, a następnie poddaj drugą kąpiel ksylenową na kolejne 5 minut, aby utrwalić plamę.
    12. Montaż slajdów za pomocą pokrywek za pomocą nośnika montażowego.
  7. Ocenić apoptozę pęcherzyków (rozszczepiona kaspaza-3) w jajnikach i nerkach oraz liczbę podocytów (komórki WT-1+) w nerkach za pomocą immunohistochemii (IHC).
    1. Inkubuj preparaty w temperaturze 6 °C przez 1 godzinę, a następnie lecz ksylenem przez 30 minut (wymień ksylen po 15 minutach).
    2. Kolejno zanurzaj zlewki w 100%, 90% i 70% etanolu oraz w wodzie (po 30 sekund każda).
    3. Wykonaj pobieranie antygenów, podgrzewając preparaty w buforze cytrynianowym (pH 6,0) w temperaturze 95 °C przez 12 minut, używając mikrofalówki do odkrycia miejsc antygenowych.
    4. Przepłucz 1 raz w buforze do mycia przez 15 minut, zmieniając bufor co 5 minut.
    5. Blokuj endogenną nadtlenek wodoru, aby uniknąć barwienia tła i zapobiec niespecyficznemu wiązaniu za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
      UWAGA: W przypadku barwienia kaspazy rozszczepionej-3 blokuj aktywność endogennej peroksydazy przez 7 minut i 30 sekund; do bejcowania WT-1 blokuj przez 5 minut.
    6. Powtarzaj wash jak w wersji 4.7.4.
    7. Należy zastosować 10 μL przeciwciał pierwotnych przeciwko rozszczepionym kaspazam-3 (apoptoza) i WT-1 (podocytom). Inkubuj przez noc w temperaturze °C w ciemnej, wilgotnej komorze.
    8. Powtarzaj wash jak w wersji 4.7.4.
    9. Stosuj 10 μL przeciwciał wtórnych sprzężonych z nadoksydazą chrzanową (HRP) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
    10. Powtarzaj wash jak w wersji 4.7.4.
    11. Należy zastosować 10 μL DAB (3,3'-diaminobenzydyny) jako chromogen, aby zobrazować aktywność HRP, co daje brązowy wypad.
      UWAGA: W przypadku barwienia kaspazą rozszczepioną-3 inkubuj z DAB przez 1 minutę i 30 sekund; do barwienia WT-1 inkubuj przez 45 sekund.
    12. Powtarzaj wash jak w wersji 4.7.4.
    13. Preparat kontrbarwi hematoksyliną Harrisa przez 30 sekund do 1 minuty, w zależności od pożądanej intensywności.
    14. Płukaj wodą z kranu przez 1-2 minuty lub aż woda stanie się czysta.
    15. Kolejno zanurzaj preparaty w 70%, 85%, 95% i 100% etanolu (po 30 sekund) oraz mieszance ksylen:etanol (30 sekund).
    16. Włóż szkiełka do świeżego roztworu ksylenowego na 5 minut, a następnie przelej do drugiej kąpieli ksylenowej na dodatkowe 5 minut.
    17. Montaż slajdów za pomocą pokrywek za pomocą nośnika montażowego.
  8. Przeanalizuj barwione przekroje za pomocą mikroskopu odwróconego światła przy powiększeniu 40x. Użyj automatycznego oprogramowania do analizy obrazów, aby wybrać obszary zainteresowania (ROI) dla każdego organu.
    1. Jajniki (H&E): Liczenie i klasyfikowanie typów pęcherzyków w poszczególnych przekrojach.
    2. Trzustka (H&E): Wybierz wysepki za pomocą narzędzia ROI , aby ręcznie wyznaczyć kontur każdej wysepki trzustkowej. Po zdefiniowaniu zwrotu z inwestycji oprogramowanie automatycznie oblicza powierzchnię w mikrometrach kwadratowych (μm2).
    3. Nerka (H&E): Ilościowo określ powierzchnię kłębuszków, wybierając narzędzie ROI , aby ręcznie śledzić zewnętrzną krawędź każdego kępka kłębuszkowego. Użyj funkcji Measure Area , aby uzyskać jej pole w μm2. Po prześledzeniu oprogramowanie automatycznie oblicza pole w μm2.
    4. Nerki (PAS)
      1. Aby ilościowo określić macierz mezangielną, użyj narzędzia Threshold do identyfikacji i wyboru obszarów PAS-dodatnich (magenta/różowych) w kłębusku. Dostosowuj progi kolorów i intensywności w razie potrzeby, aby dokładnie wybrać obszary zabarwione PAS, korzystając z okna podglądu do doprecyzowania wyboru. Zdefiniuj wybrany region PAS jako zwrot z inwestycji. Po prześledzeniu oprogramowanie automatycznie oblicza pole w μm2.
      2. Normalizuj rozszerzanie macierzy mezangialnej, obliczając procent powierzchni PAS-dodatniej względem całkowitej powierzchni kłębuszków.
    5. Jajniki i nerki (IHC dla rozszczepionej kaspazy-3)
      1. Wybieraj zwroty z inwestycji odpowiadające strukturom pęcherzykowym lub kłębuszkowym. Nałóż maskę kolorystyczną, aby zidentyfikować zabarwienia DAB-dodatnie (brązowe), regulując progi odcienia, nasycenia i intensywności. Użyj funkcji podglądu , aby zapewnić dokładny wybór sygnału DAB i doprecyzować progowe ustawienia, aby wykluczyć barwienie przeciwbarwne hematoksylyny (niebieskie) oraz niespecyficzne tło.
      2. Po zdefiniowaniu pożądanego progu ustaw wybór jako ROI i zmierz pole dodatnie DAB (μm2). Oblicz procent powierzchni zabarwionej, dzieląc obszar DAB-dodatni przez całkowity obszar zwrotu z inwestycji i mnożąc przez 100.
    6. Nerki (IHC dla WT-1+): Liczenie jąder brązowobarwionych na kłębuszkach w celu oszacowania liczby podocytów.
      UWAGA: Liczba pęcherzyków na sekcję (średnia ± SD) wynosiła: otyłość BTBR (7,7 ± 3,11), przeszczepiona (5,8 ± 3,24), BTBR szczupła (4,6 ± 5,62). Liczba wysepek na sekcję (średnia ± SD) wynosiła: BTBR otyły (18,3 ± 8,42), przeszczepione (9,7 ± 5,45), BTBR szczupłe (6,8 ± 1,72). Ocenić 30 kłębuszków na zwierzę dla pomiaru powierzchni kłębuszków i rozszerzenia macierzy mezangialnej. Dane wyrażano jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) lub błąd standardowy średniej (SEM), w zależności od stosowności. Normalność oceniano za pomocą testu Shapiro-Wilka. Jednokierunkowa ANOVA z testem post hoc Tukeya została zastosowana do porównań między grupami rozkładającymi się normalnie. Powtarzane pomiary analizowano przy użyciu dwukierunkowych modeli ANOVA lub o efektach mieszanych, z korekcją Geissera-Greenhouse tam, gdzie było to konieczne. Dla danych nierozproszonych normalnie zastosowano test Kruskala-Wallisa z wieloma porównaniami Sidaka. Wszystkie analizy wykonuj przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego, z istotnością statystyczną ustawioną na p < 0,05 (szczegóły w tabeli materiałów ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ilość przeszczepionego tłuszczu i skuteczność protokołu
Po standaryzacji protokołu oceniono dwie objętości przeszczepów tłuszczu (5-9,9% i 10-15% w stosunku do masy ciała dawcy), definiowane jako osiągnięcie co najmniej jednej ciąży skutkującej płodnym potomstwem. Grupa 5-9,9% wykazała skuteczność na poziomie 23,8%, natomiast grupa 10-15% osiągnęła 52,2%, co odpowiada 2,2-krotnemu wzrostowi skuteczności protokołu (Rysunek 2A). Jeśli cho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to wykazuje, że połączona transplantacja WAT i BAT jest skuteczną metodą terapeutyczną w kontroli hiperglikemii, zapobieganiu przyrostowi masy ciała i hipertrofii komórek wysepek, przywracaniu żeńskiej subpłodności oraz poprawie funkcji nerek poprzez zmniejszenie apoptozy i zachowanie liczby podocytów w przedklinicznym modelu T2DM, DKD i otyłości.

Chociaż wcześniejsze badania analizowały przeszczepy WAT i BAT jako strategie regulujące homeostazę glukozy i wrażliwość na insulinę

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy zespołom technicznym Centrum Szkolenia Eksperymentalnego i Chirurgicznego (CETEC) oraz Żydowskiemu Instytutowi Badań i Edukacji (IIEP) za ich wsparcie. Prace te były wspierane przez stypendium badawcze na studia magisterskie od CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel) dla S.B, bezpośrednie stypendium badawcze na doktorat od CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel) dla M.L.F. grant badawczy na studia magisterskie od FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; nr 2024/08173-6) dla M.O.M. oraz grant naukowy inicjacyjny od FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; nr 2019/12636-3) dla M.T.A.B-R. Prace te były również wspierane przez granty od FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; nr 2017/23195-2 i nr 2021/02216-7) oraz EFSD (Europejskiej Fundacji Badań nad Cukrzycą) dla É.B.R. Autorzy deklarują, że nie wykorzystali w tym manuskrypcie prac generowanych przez sztuczną inteligencję (AI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% alkoholowy roztwór diglukonianu chlorheksydynyRioquí MicaSKU 1068253
Igła 16-gaugeBecton DickinsonSKU 305198
2,0% bezalkoholowy roztwór diglukonianu chlorheksydynyRioquí MicaSKU 1113045
3 mL strzykawkiBecton DickinsonSKU 309657
Accu-Check paski – PerformaRocheEAN 4015630981960
Zestaw Alcian Blue PASEasyPathSKU EP-11-20019
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA4612
Oprogramowanie CellSensOlympusCELLSENS
Bufor cytryninowy pH 6,0: kwas cytrynowy monohydrat + wodorotlenek soduSigma-AldrichC1909 + 28-3010
Przeciwciało rozszczepione kaspaza-3Technologia sygnalizacji komórkowej9661
Analizator Cobas C 111Roche4528778001
Kreatynina KLaboratorium96-300
EnVision FLEX DAB+ ChromogenAgilent-DakoK3468
Reagent wykrywający EnVision FLEX / HRPAgilent-DakoSM802
Envision FLEX Odczynnik blokujący nadtlenkowąAgilent-DakoSM801
Bufor podłoża EnVision FLEXAgilent-DakoSM803
EnVision FLEX był buforowany 20xAgilent-DakoK800721-2
EosinAgilent-DakoCS701
Czytnik mikropłyt GloMax DiscoverPromegaGM3000
Glucometer Accu-Check - PerformaRocheEAN 4015630980512
Oprogramowanie GraphPad Prism 8 (oprogramowanie statystyczne)GraphPad od Dotmatics-
100% v/v izoforyna (izofluran)Cristá Lia-
HematoksylynaAgilent-DakoCS700
Mikroskop świetlny IX51OlympusIX51
Klatka metabolyczna dla pojedynczej myszyTecniplast3600M021
Medium montażowe - EntellanSigma-Aldrich100869
Zestaw ELISA do albuminu myszyAbcamAb207620
Szczep myszy: BTBR. Cg-Lepob/WiscJLaboratoria JAX4824
Zestaw kwasu okresowego Schiffa (PAS)EasyPathEP-11-20014
RM255 mikrotomLeica Biosystems14050237960
TP1020 Procesor tkanekLeica BiosystemsTP-1020
Tramadol 50 mg/mLGrü Nenthal4022444
Przeciwciało WT-1Santa CruzSC-192

Bibliografia

  1. Zhao, M., Cao, Y., Ma, L. New insights in the treatment of DKD: recent advances and future prospects. BMC Nephrol. 26 (1), 72(2025).
  2. van Raalte, D. H., et al. Combination therapy for kidney disease in people with diabetes mellitus. Nat Rev Nephrol. 20 (7), 433-446 (2024).
  3. Xu, M., et al. Trends and future predictions of chronic kidney disease due to diabetes mellitus type 2 attributable to dietary risks: insights based on GBD 2021 data. Front Nutr. 11, 1494383(2024).
  4. GBD 2021 Adult BMI Collaborators. Adult BMI Collaborators. Global, regional, and national prevalence of adult overweight and obesity, 1990-2021, with forecasts to 2050: a forecasting study for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 405 (10481), 813-838 (2025).
  5. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  6. Ghesmati, Z., et al. An update on the secretory functions of brown, white, and beige adipose tissue: Towards therapeutic applications. Rev Endocr Metab Disord. 25 (2), 279-308 (2024).
  7. Dewal, R. S., et al. Transplantation of committed pre-adipocytes from brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis. iScience. 27 (2), 108927(2024).
  8. Klebanov, S., Astle, C. M., DeSimone, O., Ablamunits, V., Harrison, D. E. Adipose tissue transplantation protects ob/ob mice from obesity, normalizes insulin sensitivity and restores fertility. J Endocrinol. 186 (1), 203-211 (2005).
  9. Childs, G. V., Odle, A. K., MacNicol, M. C., MacNicol, A. M. The importance of leptin to reproduction. Endocrinology. 162 (2), 1-18 (2021).
  10. Hudkins, K. L., et al. BTBR Ob/Ob mutant mice model progressive diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 21 (9), 1533-1542 (2010).
  11. Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin Invest. 123 (1), 215-223 (2013).
  12. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released Lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  13. Valgas da Silva, P. C., et al. Brown adipose tissue prevents glucose intolerance and cardiac remodeling in high-fat-fed mice after a mild myocardial infarction. Int J Obes (Lond). 46 (2), 350-358 (2022).
  14. Zhang, Y., et al. Brown adipose tissue transplantation ameliorates diabetic nephropathy through the miR-30b pathway by targeting Runx1. Metabolism. 125, 154916(2021).
  15. Clee, S. M., Nadler, S. T., Attie, A. D. Genetic and genomic studies of the BTBR ob/ob mouse model of type 2 diabetes. Am J Ther. 12 (6), 491-498 (2005).
  16. Stoehr, J. P., et al. Identification of major quantitative trait loci controlling body weight variation in ob/ob mice. Diabetes. 53 (1), 245-249 (2004).
  17. Liu, X., Zhang, Z., Song, Y., Xie, H., Dong, M. An update on brown adipose tissue and obesity intervention: Function, regulation and therapeutic implications. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1065263(2022).
  18. Mollah, M. L., Yang, H. S., Jeon, S., Kim, K., Cheon, Y. P. Overaccumulation of fat caused rapid reproductive senescence but not loss of ovarian reserve in ob/ob mice. J Endocr Soc. 5 (1), bvaa168(2021).
  19. Serke, H., et al. Leptin-deficient (ob/ob) mouse ovaries show fatty degeneration, enhanced apoptosis and decreased expression of steroidogenic acute regulatory enzyme. Int J Obes (Lond). 36 (8), 1047-1053 (2012).
  20. Diamanti-Kandarakis, E., Dunaif, A. Insulin resistance and the polycystic ovary syndrome revisited: an update on mechanisms and implications. Endocr Rev. 33 (6), 981-1030 (2012).
  21. Chang, A. S., Dale, A. N., Moley, K. H. Maternal diabetes adversely affects preovulatory oocyte maturation, development, and granulosa cell apoptosis. Endocrinology. 146 (5), 2445-2453 (2005).
  22. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  23. Beyerstedt, S., et al. Combining sodium-glucose co-transporter-2 inhibitor with mesenchymal stem cells and brown adipose tissue (BAT) and white adipose tissue (WAT) transplantation to mitigate the progression of diabetic kidney disease: a pre-clinical approach. Stem Cell Res Ther. 16 (254), 1-15 (2025).
  24. Sávio-Silva, C., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells in a pre-clinical model of diabetic kidney disease and obesity. Int J Mol Sci. 22 (4), 1546(2021).
  25. Takemura, S., Shimizu, T., Oka, M., Sekiya, S., Babazono, T. Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cell sheets directly into the kidney suppresses the progression of renal injury in a diabetic nephropathy rat model. J Diabetes Investig. 11 (3), 545-553 (2020).
  26. Pichaiwong, W., et al. Reversibility of structural and functional damage in a model of advanced diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 24 (7), 1088-1102 (2013).
  27. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  28. O'Brien, P. D., et al. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analysis. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  29. Sávio-Silva, C., et al. Mesenchymal stem cell therapy for diabetic kidney disease: A review of the studies using syngeneic, autologous, allogenic, and xenogenic cells. Stem Cells Int. 2020, 8833725(2020).
  30. Morsy, M. A., et al. Leptin gene therapy and daily protein administration: a comparative study in the ob/ob mouse. Gene Ther. 5 (1), 8-18 (1998).
  31. Wang, Y., Asakawa, A., Inui, A., Kosai, K. Leptin gene therapy in the fight against diabetes. Expert Opin Biol Ther. 10 (10), 1405-1414 (2010).
  32. Blüher, S., Shah, S., Mantzoros, C. S. Leptin deficiency: clinical implications and opportunities for therapeutic interventions. J Investig Med. 57 (7), 784-788 (2009).
  33. Paz-Filho, G., Mastronardi, C. A., Licinio, J. Leptin treatment: facts and expectations. Metabolism. 64 (1), 146-156 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeszczep tkanki tłuszczowejbrunatna tkanka tłuszczowabiała tkanka tłuszczowadysfunkcja metabolicznadeficyty rozrodczedysfunkcja nerekpoziom glukozy we krwi na czczoapoptoza jajnikówgeneza pęcherzykowa
Przeszczepy białego i brązowego tłuszczu: podejście do korekty deficytów rozrodczych, metabolicznych i nerkowych u myszy otyłych czarno-brązowych brachyury (BTBR)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.