Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Wpływ i mechanizm kwasu tauroursodeoksycholowego w żółci lisa niebieskiego na ostre uszkodzenie wątroby związane z alkoholem u myszy

738 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68763

⸱

17 października 2025

 ,  , 
1School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W badaniu tym oceniano hepatoprotekcyjne działanie żółci niebieskiego lisa na uszkodzenie wątroby wywołane alkoholem u myszy. Żółć niebieskiego lisa, zawierająca TUDCA, UDCA, bilirubinę i TCDCA, zmniejszała markery uszkodzenia wątroby i działała poprzez szlak AGE-RAGE, AKT1 i PPARG, wykazując właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające.

Streszczenie

Żółć zwierzęca, taka jak żółć niedźwiedzia, od dawna jest stosowana w medycynie tradycyjnej ze względu na swoje korzyści terapeutyczne. Żółć niebieskiego lisa, podobnie jak żółć niedźwiedzia, jest uważana w niektórych tradycyjnych praktykach za posiadającą właściwości hepatoprotekcyjne. W badaniu tym zbadano składniki i wpływ żółci niebieskiego lisa na uszkodzenie wątroby związane z alkoholem u myszy. Żółć pobrano od 30 lisów błękitnych i przetworzono na wysuszony proszek. Skład chemiczny żółci lisa błękitnego analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i ultrasprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z kwadrupolową spektrometrią mas czasu przelotu. Wykorzystano farmakologię sieciową do identyfikacji potencjalnych związków bioaktywnych, celów i szlaków związanych z uszkodzeniem wątroby związanym z alkoholem. Mysi model uszkodzenia wątroby związanego z alkoholem ustalono przy użyciu myszy z Kunming, którym podawano sproszkowaną żółć lisa niebieskiego w niskich i wysokich dawkach. Mierzono poziom aminotransferazy alaninowej w surowicy, aminotransferazy asparaginianowej i cholesterolu całkowitego. Tkanki wątroby oceniano za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną oraz testu dialdehydu malonowego. Dokowanie molekularne przeprowadzono w celu przewidzenia powinowactwa wiązania między związkami aktywnymi a celami rdzenia. Stwierdzono, że żółć niebieskiego lisa zawiera kwas tauroursodeoksycholowy (TUDCA), kwas ursodeoksycholowy, bilirubinę i kwas taurochenodeoksycholowy. Analiza histopatologiczna nie wykazała żadnych istotnych nieprawidłowości ani skutków toksycznych w głównych narządach po doustnym podaniu sproszkowanej żółci lisa niebieskiego. Główne cele żółci lisa błękitnego obejmowały białko AKT1, PPARG, IGF1, MMP9 i CASP3. Leczenie żółcią lisa niebieskiego obniżało poziomy AlAT, AspAT, cholesterolu i MDA w surowicy w mysich modelach uszkodzenia wątroby związanego z alkoholem. Farmakologia sieciowa i dokowanie molekularne sugerują, że hepatoprotekcyjne działanie żółci lisa niebieskiego może być związane z zaawansowanym receptorem produktu końcowego glikacji dla szlaku sygnałowego produktu końcowego zaawansowanej glikacji. Ogólnie rzecz biorąc, żółć lisa niebieskiego, której zawartość TUDCA jest podobna do żółci niedźwiedzia, jest ukierunkowana na białka takie jak AKT1 i PPARG, wykazując potencjalne działanie przeciwzapalne i przeciwutleniające w leczeniu uszkodzenia wątroby związanego z alkoholem.

Wprowadzenie

Alkoholowa choroba wątroby (ALD) obejmuje spektrum uszkodzeń wątroby, począwszy od bezobjawowych nieprawidłowości laboratoryjnych, a skończywszy na zaawansowanej chorobie wątroby z marskością wątroby, a w najcięższej postaci zagrażającej życiu schyłkowej niewydolności wątroby, której towarzyszy niewydolność wielonarządowa1. Częstość występowania ALD, w tym stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z alkoholem, stanowi stosunkowo łagodną i potencjalnie odwracalną postać ALD1. Alkoholowe zapalenie wątroby charakteryzuje się stanem zapalnym, którego objawy kliniczne wahają się od bezobjawowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby do ostrego alkoholowego zapalenia wątroby, które objawia się ostrą żółtaczką i może przejść do niewydolności wątroby z wysoką śmiertelnością krótkoterminową1. Alkohol i jego metabolity zmieniają metabolizm lipidów i sprzyjają akumulacji lipidów (stłuszczeniu) poprzez kilka mechanizmów, w tym hamowanie β-oksydacji mitochondrialnych kwasów tłuszczowych i stymulację lipogenezy2. Etanol zwiększa ekspresję receptora transferyny 1, zwiększając w ten sposób wychwyt żelaza przez wątrobę2. Zarówno alkohol, jak i aldehyd octowy mogą bezpośrednio uszkadzać hepatocyty, prowadząc do zwiększonego stresu oksydacyjnego, zahamowania regeneracji s-adenozylometioniny, uwolnienia wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMPS), narażenia na endotoksyny bakteryjne w krążeniu wrotnym i tworzenia adduktów białkowych2. Leczenie ALD pozostaje wyzwaniem ze względu na liczne szlaki patogenne3. Przyszłe strategie, które są obecnie badane, obejmują empiryczne probiotyki, czynniki wzrostu, przeciwutleniacze, przeciwciała monoklonalne ukierunkowane na czynniki związane ze stanem zapalnym oraz interwencje behawioralne wspomagane technologią. Jednak dodatkowe kompleksowe strategie terapeutyczne pozostają do zbadania.

Pojawiające się dowody sugerują, że żółć zwierzęca może mieć potencjał terapeutyczny w leczeniu alkoholowej choroby wątroby (ALD) ze względu na jej właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające 4,5. Żółć zwierzęca jest ważnym składnikiem tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM)6. W TCM żółć zwierzęca jest stosowana w celu wzmocnienia funkcji wątroby i pęcherzyka żółciowego oraz złagodzenia bólu, gorączki, kaszlu i stanu zapalnego. Jest stosowany w leczeniu chorób wątroby, w tym marskości wątroby6. Żółć zwierzęca ma właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające6, a stan zapalny i stres oksydacyjny odgrywają kluczową rolę w patogenezie ALD7. Doniesiono również, że suplementacja kwasami żółciowymi poprawia stłuszczenie wątroby8. Obecnie żółć niedźwiedzia jest najczęściej stosowanym lekiem pochodzącym z żółci, a głównymi składnikami aktywnymi są kwas ursodeoksycholowy (UDCA) i kwas taurocholowy (TUDCA) 6,9. Warto zauważyć, że TUDCA jest nieobecna w żółci innych zwierząt, takich jak owce, krowy, kurczaki i węże6. TUDCA wykazała potencjał terapeutyczny w leczeniu ostrego uszkodzenia wątroby10. Obecnie TUDCA uzyskuje się poprzez drenaż żółci niedźwiedzia (co budzi obawy dotyczące dobrostanu zwierząt), syntezę chemiczną (która jest kosztowna) lub biotransformację proszku z żółci kurczaka w ekwiwalent żółci niedźwiedziej (który pozostaje nierównoważny z autentyczną żółcią niedźwiedzia)11,12. Lis niebieski (Alopex lagopus), znany również jako lis polarny, jest hodowany w niewoli przede wszystkim ze względu na futro. Chiny są jednym z trzech największych eksporterów odzieży futrzanej na świecie, a narządy wewnętrzne odłowionych lisów niebieskich są zazwyczaj wyrzucane13. Stwarza to okazję do waloryzacji pęcherzyka żółciowego jako potencjalnego zasobu medycznego. Zarówno lisy niebieskie, jak i niedźwiedzie są mięsożercami, mają podobieństwa w fizjologii układu pokarmowego, metabolizmie i diecie, co sugeruje, że ich skład żółci i działanie mogą być również podobne. Taka możliwość nie została jednak jeszcze zbadana.

W związku z tym badanie to miało na celu zbadanie działania farmakologicznego i mechanizmów leżących u podstaw żółci lisa niebieskiego w modelach ALD. Odkrycia mogą zapewnić nowe możliwości badawcze w zakresie opracowywania substytutów żółci niedźwiedziej, ustanowić podstawy naukowe do wykorzystania pęcherzyka żółciowego lisa niebieskiego jako zasobu medycznego, przekształcić odpady przemysłowe w wartościowe produkty i informować o przyszłym rozwoju terapeutycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół badania został zweryfikowany i zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Heilongjiang (zatwierdzenie #2023021101). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) oraz odpowiednimi krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Ponieważ badanie to obejmowało doświadczenia na zwierzętach, świadoma zgoda nie miała zastosowania. Wszystkie procedury hodowli zwierząt i pozyskiwania zwierząt futerkowych są ściśle przestrzegane zgodnie z chińskimi przepisami technicznymi dotyczącymi zarządzania hodowlą dzikich zwierząt. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Heilongjiang w Chinach (zatwierdzenie #2023021101).

Przygotowanie próbki żółci lisa niebieskiego
Zasób żółci lisa niebieskiego znajduje się w tabeli materiałów. W sumie 30 lisów niebieskich (Vulpes lagopus) zostało poddanych eutanazji przez porażenie prądem, a następnie zebranie futra i woreczek żółciowy. Pęcherzyk żółciowy niebieskiego lisa ma owalny kształt, z wąską górną częścią i opuchniętą dolną częścią. Jej zewnętrzna powierzchnia jest ciemnobrązowa z widocznymi fałdami, a błona kapsułki jest cienka. Żółć została natychmiast odessana za pomocą sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml i wydawała się ciemnoczarna lub ciemnozielona. Pęcherzyki żółciowe suszono następnie w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w celu uzyskania suszonego proszku żółci lisa niebieskiego (ryc. 1). Powstały w ten sposób proszek żółciowy miał żółto-brązowy odcień i błyszczącą, kruchą konsystencję. Średnia wydajność suszonej żółci w proszku na woreczek żółciowy wynosiła około 0,82 ± 0,30 g. W celu przygotowania próbki, 250 mg suszonej żółci w proszku od lisa błękitnego (jak opisano powyżej) lub niedźwiedzia (patrz tabela materiałów) rozpuszczono w 1 ml 70% metanolu o czystości chromatograficznej. Roztwór poddano sonikacji ultradźwiękowej (40 kHz, 300 W), przefiltrowano przez membranę 0,22 μm, rozcieńczono do końcowej objętości 50 ml (tj. do 5 mg/ml), a następnie rozcieńczono do stężenia roboczego 0,5 mg/ml do dalszej analizy. Ogólny przebieg eksperymentu podsumowano na rysunku uzupełniającym 1.

W tym badaniu zakres dawkowania sproszkowanej żółci lisa niebieskiego stosowanej w doświadczeniach na zwierzętach wynosił 5-10 g/kg w oparciu o wcześniejsze oceny toksyczności i badania farmakologiczne, bez zaobserwowania znaczących działań niepożądanych w tych stężeniach14,15. Podczas przygotowywania proszku żółciowego woreczki żółciowe suszono w temperaturze 37 °C przez 48 godzin; Jednak czas schnięcia może się różnić w zależności od lokalnej wilgotności i objętości próbki, dlatego należy sprawdzić zawartość wilgoci, aby zapewnić całkowite odwodnienie. W przypadku rozpuszczenia, stężenie 5 mg/ml w metanolu chromatograficznym było optymalne dla analiz HPLC i UPLC-Q-TOF-MS; Niepełne rozpuszczenie lub pozostałości cząstek stałych mogą wpływać na dokładność analityczną, wymagając dodatkowej sonikacji lub filtracji. Znanym ograniczeniem jest zmienność składu żółci wynikająca z sezonowych, dietetycznych i indywidualnych różnic fizjologicznych wśród lisów błękitnych, co może wpływać na względną obfitość związków aktywnych, takich jak TUDCA i UDCA16. W związku z tym przed zastosowaniem farmakologicznym zaleca się walidację partii za pomocą profilowania chromatograficznego w celu zapewnienia spójnych profili składników.

Sieciowa analiza farmakologiczna
Skład chemiczny żółci lisa błękitnego analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (patrz tabela materiałów) i ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z kwadrupolową spektrometrią mas czasu przelotu (UPLC-Q-TOF-MS). HPLC przeprowadzono przy użyciu kolumny SB-C18 (4,6 mm x 150 mm, 5 μm) z fazą ruchomą składającą się z 0,03 M diwodorofosforanu sodu (pH dostosowanego do 4,4 przy użyciu kwasu fosforowego) jako fazy A i metanolu (patrz tabela materiałów) jako fazy B (tabela 1). Długość fali detekcji ustalono na 210 nm, przy natężeniu przepływu fazy ruchomej 1,0 ml/min, a temperatura kolumny wynosiła 40 °C. Objętość iniekcji wynosiła 10 μL. ANALIZĘ UPLC-Q-TOF/MS przeprowadzono przy użyciu kolumny UPLCTM HSS T3 (patrz tabela materiałów). Faza ruchoma składała się z wodnego roztworu acetonitrylu (A)-0,1% kwasu mrówkowego (B; patrz tabela materiałów). Program elucji gradientowej był następujący: 0-25,0 min, 98%-2% A i 25,0-28,0 min, 2%-2% A przy natężeniu przepływu 4 ml/min. Temperaturę kolumny utrzymywano na poziomie 35 °C. Spektrometrię mas prowadzono przy użyciu źródła jonizacji elektronrozpylacyjnej, ESI o następujących parametrach: natężenie przepływu gazu rozpuszczalnikowego 650 L/h, temperatura gazu rozpuszczalnikowego 350 °C, natężenie przepływu gazu stożkowego 50 L/h, temperatura źródła jonów 120 °C, napięcie kapilarne 2,8 kV (tryb jonów dodatnich) i 2,0 kV (tryb jonów ujemnych), napięcie stożka 25 V i energia zderzenia 6 eV. Widma zbierano co 0,2 s w odstępie 0,02 s. Leucyna-enkefalina (patrz tabela materiałów; [M+H]+=556.2771) zastosowano jako referencyjny roztwór kalibracyjny przy stężeniu 40 fmol/μL i natężeniu przepływu 15 μL/min17.

Analiza składu chemicznego i przewidywanie celów
Aktywne składniki żółci lisa błękitnego zidentyfikowano za pomocą HPLC i UPLC-Q-TOF/MS, z kwasem aurocholowym i tauroursodeoksycholanem sodu (patrz tabela materiałów) jako wzorce wewnętrzne18. Wzory strukturalne zidentyfikowanych związków pobrano z bazy danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Aby zbadać potencjalne cele bioaktywne, w bazie danych PharmMapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/) przeprowadzono zapytanie o aktywne składniki żółci lisa niebieskiego w celu zidentyfikowania powiązanych celów genowych.

Używając alkoholowego uszkodzenia wątroby i alkoholowego uszkodzenia wątroby jako słów kluczowych, uzyskano geny związane z chorobą z baz danych GeneCards (https://www.genecards.org/) i OMIM (https://omim.org/). W bazie danych GeneCards cele zostały przebadane zgodnie z oceną istotności, z progiem ustalonym na ≥ 20. To powszechnie stosowane empiryczne odcięcie zapewnia równowagę między czułością a swoistością, zachowując najbardziej potencjalnie istotne geny (wysoka pamięć) przy jednoczesnym odfiltrowywaniu słabo spokrewnionych lub hałaśliwych genów (wysoka precyzja). W przeciwieństwie do tego, w bazie danych OMIM nie zastosowano dodatkowego filtrowania, ponieważ przechwytuje ona cele z silnymi dowodami genetycznymi, uzupełniając w ten sposób wyniki istotności obliczeniowej kart GeneCards. Uzyskane dane docelowe zostały scalone i zduplikowane w celu identyfikacji celów związanych z ALD. Docelowe składniki aktywne i cele chorobowe porównano przy użyciu Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) do wizualizacji. Skrzyżowania zostały zidentyfikowane jako potencjalne cele żółci lisa niebieskiego przeciwko ALD i zostały zaimportowane do bazy danych STRING (http://version10.string-db.org/). W bazie danych STRING sieć interakcji została skonstruowana z domyślnymi parametrami (średni współczynnik ufności ≥ 0,4), a wolne węzły zostały ukryte w celu poprawy przejrzystości wizualizacji. Wolne węzły zostały ukryte, aby wygenerować diagram sieci interakcji białko-białko (PPI), który został zwizualizowany za pomocą oprogramowania Cytoscape (wersja 3.9.1). Przeprowadzono analizę topologiczną w celu obliczenia wartości stopni, a sześć celów o najwyższych wartościach stopnia zidentyfikowano za pomocą bazy danych adnotacji, wizualizacji i zintegrowanego odkrywania (DAVID, https://david.ncifcrf.gov/) z progiem istotności p < 0,05. Do analizy wzbogacania szlaków wykorzystano bazę danych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Dokowanie molekularne
Dokowanie molekularne przeprowadzono w celu oceny interakcji między podstawowymi białkami docelowymi a bioaktywnymi składnikami żółci lisa błękitnego. Trójwymiarowe struktury podstawowych białek docelowych uzyskano z Banku Danych Białkowych (https://www.rcsb.org/) Laboratorium Badawczego Bioinformatyki Strukturalnej (RCSB), a struktury składników żółciowych uzyskano z bazy danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Symulacje dokowania przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Molecular Operating Environment (MOE) (wersja 2022.02). W przypadku AKT1 pobrano strukturę krystaliczną (PDB ID: 4EKL), a wstępne przetwarzanie w MOE obejmowało usunięcie cząsteczek wody i oryginalnych ligandów, dodanie wodoru z protonacją przy fizjologicznym pH (7,0) i minimalizację energii. Struktury ligandów (TUDCA, UDCA, TCDCA, TCCA i bilirubina) zostały pobrane z PubChem, a energia zminimalizowana przed dokowaniem. Podczas procesu dokowania wygenerowano wiele konformacji ligandów, a każda konformacja została umieszczona w kieszeni wiążącej receptora w różnych orientacjach przestrzennych. Dokowanie przeprowadzono przy użyciu protokołu Induced Fit, z London dG dla początkowego umieszczenia i Affinity dG jako funkcją punktacji. Dla każdego liganda wygenerowano trzydzieści konformacji, a końcowe pozy zostały dopracowane przez optymalizację pola siłowego. Wszystkie inne parametry zostały ustawione na wartości domyślne MOE bez dalszego dostrajania. Powinowactwo między każdą konformacją liganda a receptorem oceniono za pomocą funkcji punktacji oprogramowania. Wyniki dokowania oceniano poprzez wiązanie energii swobodnej, przy czym najbardziej ujemna konformacja energii w największym klastrze została wybrana jako reprezentatywny tryb wiązania. Do wizualizacji wybrano tryb wiązania o największym powinowactwie i optymalnej konformacji. Wartości powinowactwa poniżej -4,25 kcal/mol wskazują na wiązanie ligand-cel, wartości poniżej -5,0 kcal/mol wskazują na umiarkowane wiązanie, a wartości poniżej -7,0 kcal/mol wskazują na silne powinowactwo wiązania 19.

Mysie modele ALD
Do tego badania zakupiono 30 myszy Kunming wolnych od specyficznych patogenów (SPF) (18-22 g, 6-8 tygodni, 15 samców, 15 samic). Zwierzęta trzymano w kontrolowanych warunkach w temperaturze 25 ± 2 °C przy wilgotności względnej 60% ± 10%, z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Przed eksperymentem myszy aklimatyzowano się przez 1 tydzień.

Model ALD został ustalony w następujący sposób. Roztwór etanolu o stężeniu 70% v/v przygotowano, odmierzając 70,21 ml bezwodnego etanolu do kolby miarowej i dodając ultraczystą wodę do końcowej objętości 100 ml. Roztwór mieszano mieszadłem magnetycznym przez 1 minutę i pozostawiono na 5 minut, aż nie zaobserwowano separacji faz. Dawka zgłębnika wynosiła 2 ml/kg masy ciała i była podawana raz na dobę przez 7 kolejnych dni. Rankiem 7 dnia, 4 godziny po ostatnim zgłębniku, pobrano próbki krwi i tkanek wątroby do dalszej analizy. Ustalenie modelu zostało potwierdzone poprzez ocenę typowych wskaźników uszkodzenia wątroby. Mierzono stężenie aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST), cholesterolu całkowitego (T-CHO) i dialdehydu malonowego (MDA) w surowicy. Dodatkowo tkanki wątroby poddano badaniu histopatologicznemu z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu oceny morfologii hepatocytów, wakuolizacji cytoplazmatycznej, martwicy i naciekania komórek zapalnych. Myszy zostały losowo przydzielone do pięciu grup (n = 6 na grupę): Ślepa próba kontrolna otrzymała 2 ml / kg wody destylowanej; grupa modelowa otrzymywała 2 ml/kg 70% etanolu bez leczenia; grupie kontroli dodatniej podawano tabletki hepatoprotekcyjne w dawce 0,4 g/kg mc. (patrz tabela materiałów); Grupie otrzymującej duże dawki żółci niebieskiego lisa w proszku podawano 10 g/kg proszku żółci niebieskiego lisa; Grupie otrzymującej sproszkowaną żółć niebieskiego lisa w małych dawkach podawano 5 g / kg proszku żółci niebieskiego lisa. Wszystkim grupom, z wyjątkiem ślepej próby kontrolnej, podawano doustnie 70% etanol (2 ml / kg) raz dziennie przez 7 kolejnych dni w celu wywołania alkoholowego uszkodzenia wątroby. W 7, 4 godzinach po podaniu etanolu podano odpowiednie zabiegi (tabletki hepatoprotekcyjne lub sproszkowaną żółć lisa niebieskiego) i przeprowadzono kolejne eksperymenty. Grupa kontrolna ze ślepą próbą otrzymywała wodę destylowaną przez cały czas trwania eksperymentu.

Pomiar aminotransferaz w surowicy (ALT i AspAT) i zestawu cholesterolu całkowitego (T-CHO)
Próbki krwi odwirowywano przy 1 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania surowicy. Próbki przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu analizy. Do pomiaru poziomów ALT, AST i T-CHO użyto komercyjnych zestawów (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.

Monitorowanie masy ciała
Po 7 kolejnych dniach podawania etanolu, leczenie podawano w 7 dniu, a eksperymenty prowadzono 4 godziny po porannym dawkowaniu. Masę ciała rejestrowano 2 razy dziennie w okresie obserwacji. Masę ciała na czczo mierzono za pomocą elektronicznej wagi analitycznej w dniach 1., 2., 3., 5., 7., 10. i 14. po podaniu.

Przetwarzanie próbek tkanek
W 14 dniu po podaniu zarejestrowano masę ciała i pozostałe spożycie pokarmu. Po południu zwierzęta poszczono z możliwością swobodnego dostępu do wody. Następnego dnia (po okresie postu trwającym 12-16 godzin) mierzono masę ciała na czczo przed eutanazją poprzez zwichnięcie szyjki macicy. Makroskopowe badania patologiczne przeprowadzono w celu oceny zmian morfologicznych w głównych narządach, w tym między innymi w sercu, wątrobie, śledzionie, płucach, nerkach, nadnerczach, mózgu, żołądku, jelitach, jądrach, prostacie, jajnikach i macicy. Próbki tkanek z serca, wątroby, śledziony, płuc, nerek, żołądka i jelit zostały losowo pobrane z ślepej próby kontrolnej (CN) i grupy żółci niebieskiego lisa (LH) o niskiej dawce, utrwalone w 4% paraformaldehydzie, osadzone w parafinie, podzielone i wybarwione hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu oceny histopatologicznej. Wycinki tkanek zostały zbadane i zobrazowane pod mikroskopem.

Barwienie H&E
Próbki wątroby utrwalono za pomocą 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), zatopiono w parafinie i podzielono na sekcje. Sekcje zostały odparafinowane w ksylenie I i II, ponownie uwodnione w malejących stężeniach etanolu (100%, 95%, 85% i 75%), a następnie przemyte wodą, rozdzielone, ponownie przemyte i zaniebieszczone roztworem do niebieszczenia. Po wypłukaniu skrawki odwadniano w 85% i 95% etanolu przez 5 min każda, barwiono eozyną przez 5 min i odwadniano w bezwodnym etanolu I, II i III (po 5 min). Na koniec skrawki oczyszczono z ksylenu I i II (po 5 min każda) i zamontowano za pomocą gumy neutralnej. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu świetlnego (100x).

Oznaczanie dialdehydu malonowego (MDA) w tkankach wątroby
Próbki wątroby homogenizowano w 9 objętościach soli fizjologicznej za pomocą młynka do tkanek. Homogenat odwirowywano przy sile 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Test MDA przeprowadzono na supernatance przy użyciu dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.

Analiza statystyczna
Dane są prezentowane jako średnie ± odchyleń standardowych (SD). Porównania grupowe przeprowadzono za pomocą analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc najmniejszej istotnej różnicy (LSD). Obustronne wartości p <0,05 uznano za statystycznie istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Identyfikacja związków czynnych w żółci lisa błękitnego
Zarówno lisy niebieskie, jak i niedźwiedzie są mięsożercami, mają podobną fizjologię trawienną i metabolizm20. Dlatego ich żółć może mieć porównywalny skład. Korzystając z opisanych powyżej warunków chromatograficznych, każdy związek został dobrze oddzielony (ryc. 2). W tym eksperymencie czas retencji standardu TUDCA21 został wykorzystany do identyfikacji TUDCA w żółci ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 2018 r. na temat globalnego stanu alkoholu i zdrowia, spożycie alkoholu na mieszkańca w Chinach wzrosło z 4,1 l w 2005 r. do 7,2 l w 2016 r., co stanowi wzrost o 76%. ALD spowodowane przewlekłym spożywaniem alkoholu pozostaje główną etiologią zachorowalności i śmiertelności związanej z wątrobą22. Bo i in. ustalili model uszkodzenia wątroby wywołanego czterochlorkiem węgla (CCl 4) u myszy i zaobserwowali, że żółć niebieskiego lisa znac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chińskiej Fundacji Nauki Młodzieżowej (NO.82204562).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,03 mln Diwodorofosforan soduN/AN/AHPLC faza ruchoma A
0,1% Kwas mrówkowy w wodzieFisher Scientific, Stany ZjednoczoneN/AFaza ruchoma dla UPLC
0,22 &m; M Filtr membranowyN/AN/AFiltracja próbek
4% paraformaldehyduN/AN/AUtrwalanie tkanek
Acetonitryl, klasa chromatograficznaFisher Scientific, Stany ZjednoczoneN/AFaza ruchoma dla UPLC
Zestawy ALT, AST, T-CHOShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., ChinyN/AAnaliza biochemiczna surowicy
Waga analitycznaN/AN/APomiar masy ciała zwierzęcia
Kwas auocholowyChiński Instytut Kontroli Żywności i LekówN/AWzorzec wewnętrzny do HPLC/MS
Żółć niedźwiedzia w proszkuChiński Instytut Kontroli Żywności i Leków, PekinN/AMateriał źródłowy
BilirubinaNie określonoN/AZidentyfikowany związek aktywny w żółci
Lis niebieskiSuihua Fox Farm, Heilongjiang, ChinyN/AŹródło żółci
Żółć niebieskiego lisa w proszkuPrzygotowanie we własnym zakresieN/APróbka do analizy komponentów
Kolumna C18 HPLCAgilent Technologies, Stany ZjednoczoneZORBAX SB-C18 (4,6 razy; 150 mm, 5 μ m)Separacja metodą HPLC
Cytoscape (Cytokrajobraz)https://cytoscape.org/Wersja 3.9.1Wizualizacja sieci i analiza topologiczna
DAWIDNIHhttps://david.ncifcrf.gov/Analiza wzbogacenia GO/KEGG
Karty genetyczneInstytut Weizmannahttps://www.genecards.org/Pobieranie genów związanych z chorobą
Hematoksylina i eozyna (H& E)N/AN/ABarwienie histologiczne
System HPLCAgilent Technologies, Stany Zjednoczone1200 NieskończonośćAnaliza składu żółci
Myszy Kunming (SPF, 18– 22g)Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.SCXK (Liao) 2020-0010Model alkoholowego uszkodzenia wątroby
Leucyna-enkefalinaSigma, Stany ZjednoczoneN/AWzorzec kalibracji MS (40 fmol/μ L)
Zestaw do wykrywania MDAShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., ChinyN/APomiar stresu oksydacyjnego wątroby
Metanol klasy chromatograficznejFisher Scientific, Stany ZjednoczoneN/ARozpuszczalnik do przygotowania próbki
MOEGrupa Obliczeń ChemicznychMOE 2022.02Molekularna analiza dokowania
OMIM (Pominięcie)NIHhttps://omim.org/Pobieranie genów związanych z chorobą
Mikroskop optycznyN/AN/AObserwacja histologiczna
PharmMapper (PharmMapper)ECUST (EKSTA)http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/Przewidywanie docelowych związków aktywnych
Kwas fosforowyN/AN/ARegulacja pH fazy ruchomej
PubChemNCBI (Krajowa Sieć Informacjihttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/Odzyskiwanie struktury złożonej
Bank Danych o Białkach RCSBhttps://www.pdbus.org/N/AŹródło struktury białka 3D
Wirówka z chłodzeniemN/AN/ASeparacja surowicy i tkanek
Tauroursodeoksycholan sodu (TUDCA)Chiński Instytut Kontroli Żywności i LekówN/AWzorzec wewnętrzny do HPLC/MS
STRUNACertyfikat EMBLhttp://version10.string-db.org/Analiza interakcji białko-białko
UniProtEMBL-EBI (Międzynarodowa Agencja Finansowa Emitenta)https://www.uniprot.org/Standaryzacja celów
System UPLC-Q-TOF-MSWody, Stany ZjednoczoneUPLC HSS T3 (100 i razy; 2,1 mm, 1,8 i mu; m)Identyfikacja komponentów
VennyKonferencja Śledczahttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmlWizualizacja skrzyżowania docelowego

Bibliografia

  1. Thursz, M., et al. EASL Clinical Practice Guidelines: Management of alcohol-related liver disease. J Hepatol. 69 (1), 154-181 (2018).
  2. Sugimoto, K., Takei, Y. Pathogenesis of alcoholic liver disease. Hepatol Res. 47 (1), 70-79 (2017).
  3. Adekunle, A. D., Adejumo, A., Singal, A. K. Therapeutic targets in alcohol-associated liver disease: progress and challenges. Therap Adv Gastroenterol. 16, 17562848231170946(2023).
  4. Wang, Y., et al. bile powder prevents drunkenness and alcohol-induced liver injury in mice via the gut microbiota and metabolic modulation. Chin Med. 19 (1), 39(2024).
  5. Li, L., Liu, C., Mao, W., Tumen, B., Li, P. Taurochenodeoxycholic Acid Inhibited AP-1 Activation via Stimulating Glucocorticoid Receptor. Molecules. 24 (24), 4513(2019).
  6. Wang, D. Q., Carey, M. C. Therapeutic uses of animal biles in traditional Chinese medicine: an ethnopharmacological, biophysical chemical and medicinal review. World J Gastroenterol. 20 (29), 9952-9975 (2014).
  7. Yang, Y. M., Cho, Y. E., Hwang, S. Crosstalk between Oxidative Stress and Inflammatory Liver Injury in the Pathogenesis of Alcoholic Liver Disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 774(2022).
  8. Quintero, P., et al. Bile acid supplementation improves established liver steatosis in obese mice independently of glucagon-like peptide-1 secretion. J Physiol Biochem. 70 (3), 667-674 (2014).
  9. Feng, Y., et al. Bear bile: dilemma of traditional medicinal use and animal protection. J Ethnobiol Ethnomed. 5, 2(2009).
  10. Song, G., et al. Potential therapeutic action of tauroursodeoxycholic acid against cholestatic liver injury via hepatic Fxr/Nrf2 and CHOP-DR5-caspase-8 pathway. Clin Sci (Lond). 137 (7), 561-577 (2023).
  11. Li, J., et al. Pharmacological studies on the comparison between the drainage and certified Fel Ursi. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 16 (12), 749-763 (1991).
  12. Allegri, F. Respect, Inherent Value, Subjects-of-a-Life Some. Reflections on the Key Concepts of Tom Regan's Animal Ethics. Relations Beyond Anthropocentrism. 7, 1-2 (2020).
  13. Underwood, L. S., Reynolds, P. Photoperiod and fur lengths in the arctic fox (Alopex lagopus L). Int J Biometeorol. 24 (1), 39-48 (1980).
  14. Wu, L., et al. Toxicological evaluation of porcine bile powder in Kunming mice and Sprague-Dawley rats. Front Pharmacol. 15, 1424940(2024).
  15. Chen, D. X., et al. Therapeutic Effects of Different Animal Bile Powders on Lipid Metabolism Disorders and Their Composition Analysis. Chin J Integr Med. 28 (10), 918-923 (2022).
  16. Liu, J., et al. Effect of Dietary Supplementation with Calcium, Phosphorus and Vitamin D(3) on Growth Performance, Nutrient Digestibility, and Serum Biochemical Parameters of Growing Blue Foxes. Animals (Basel). 12 (14), 1814(2022).
  17. Desiderio, D. M., Dass, C. The Measurement of Leucine Enkephalin at the Femtomole Level by Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry/Mass Spectrometry Methods. Anal Lett. 19 (19-20), 1963-1971 (1986).
  18. Li, S., et al. Substitutes for Bear Bile for the Treatment of Liver Diseases: Research Progress and Future Perspective. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 4305074(2016).
  19. Ji, L., et al. Identification of bioactive compounds and potential mechanisms of Scutellariae Radix-Coptidis Rhizoma in the treatment of atherosclerosis by integrating network pharmacology and experimental validation. Biomed Pharmacother. 165, 115210(2023).
  20. Shi, J., Zhou, B., Ding, C. Study on the Chemical Components of Blue Fox Gall Powder. J Trad Chinese Med Herald. 31 (03), 83-88 (2025).
  21. Gómez, C., Stücheli, S., Kratschmar, D. V., Bouitbir, J., Odermatt, A. Development and Validation of a Highly Sensitive LC-MS/MS Method for the Analysis of Bile Acids in Serum, Plasma, and Liver Tissue. Metabolites. 10 (7), 282(2020).
  22. Wu, M., et al. Estimated projection of incidence and mortality of alcohol-related liver disease in China from 2022 to 2040: a modeling study. BMC Med. 21 (1), 277(2023).
  23. Bo, Z., Rui, W., Jingbo, J. Arctic fox bile can alleviate carbon tetrachloride-induced acute liver injury. Intl J Clin Exp Med. 9 (2), 5050-5055 (2016).
  24. Zhou, C. F., Gao, G. J., Liu, Y. Advances in studies on bear bile powder. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40 (7), 1252-1258 (2015).
  25. Zhou, C. S., Yin, Z. Y., Zhao, W. X. Bear bile affects immunologic feature of hepatic stellate cells. J Hepatol Surg. 20 (3), 204-208 (2012).
  26. Wang, N., et al. A comparative study on the hepatoprotective action of bear bile and Coptidis Rhizoma aqueous extract on experimental liver fibrosis in rats. BMC Complement Altern Med. 12, 239(2012).
  27. Ratziu, V., et al. A randomized controlled trial of high-dose ursodesoxycholic acid for nonalcoholic steatohepatitis. J Hepatol. 54 (5), 1011-1019 (2011).
  28. Moorhouse, T. P., et al. Substitutes for wildlife-origin materials as described in China's "TCM" research literature. Global Ecol Conservation. 34 (April), e02042(2022).
  29. Steyn, W. J., Wand, S. J., Jacobs, G., Rosecrance, R. C., Roberts, S. C. Evidence for a photoprotective function of low-temperature-induced anthocyanin accumulation in apple and pear peel. Physiol Plant. 136 (4), 461-472 (2009).
  30. Intagliata, S., et al. Discovery of a Highly Selective Sigma-2 Receptor Ligand, 1-(4-(6,7-Dimethoxy-3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)butyl)-3-methyl-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-one (CM398), with Drug-Like Properties and Antinociceptive Effects In Vivo. AAPS J. 22 (5), 94(2020).
  31. Contreras-Zentella, M. L., Villalobos-Garcia, D., Hernandez-Munoz, R. Ethanol Metabolism in the Liver, the Induction of Oxidant Stress, and the Antioxidant Defense System. Antioxidants (Basel). 11 (7), 1258(2022).
  32. Lala, V., Zubair, M., Minter, D. A. Liver Function Tests. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  33. Seo, E., Kang, H., Choi, H., Choi, W., Jun, H. S. Reactive oxygen species-induced changes in glucose and lipid metabolism contribute to the accumulation of cholesterol in the liver during aging. Aging Cell. 18 (2), e12895(2019).
  34. Freitas, I. N., et al. Insights by which TUDCA is a potential therapy against adiposity. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1090039(2023).
  35. Lu, W., Xi, R., Huaiwu, H. Ursodeoxycholic acid (UDCA) reduces hepatocyte apoptosis by inhibiting farnesoid X receptor (FXR) in hemorrhagic shock (HS). Curr Mol Med. 23 (6), 550-558 (2022).
  36. Reyes-Gordillo, K., et al. Akt1 and Akt2 Isoforms Play Distinct Roles in Regulating the Development of Inflammation and Fibrosis Associated with Alcoholic Liver Disease. Cells. 8 (11), 1337(2019).
  37. Li, J., Guo, C., Wu, J. The Agonists of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma for Liver Fibrosis. Drug Des Devel Ther. 15, 2619-2628 (2021).
  38. Dichtel, L. E., Cordoba-Chacon, J., Kineman, R. D. Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor 1 Regulation of Nonalcoholic Fatty Liver Disease. J Clin Endocrinol Metab. 107 (7), 1812-1824 (2022).
  39. Takahashi, Y. The Role of Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor-I in the Liver. Int J Mol Sci. 18 (7), 1447(2017).
  40. Feng, M., et al. Kupffer-derived matrix metalloproteinase-9 contributes to liver fibrosis resolution. Int J Biol Sci. 14 (9), 1033-1040 (2018).
  41. Ma, X. Y., et al. Ursolic acid reduces hepatocellular apoptosis and alleviates alcohol-induced liver injury via irreversible inhibition of CASP3 in vivo. Acta Pharmacol. 42 (7), 1101-1110 (2021).
  42. Taguchi, K., Fukami, K. RAGE signaling regulates the progression of diabetic complications. Front Pharmacol. 14, 1128872(2023).
  43. Lino Rodrigues, K., et al. Aerobic Exercise Training Improves Microvascular Function and Oxidative Stress Parameters in Diet-Induced Type 2 Diabetic Mice. Diabetes Metab Syndr Obes. 15, 2991-3005 (2022).
  44. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metab Dispos. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  45. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  46. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: an important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dzia anie hepatoprotekcyjnefarmakologia sieciowadokowanie molekularnewysokosprawna chromatografia cieczowahistopatologia w trobydzia anie przeciwutleniaj ceszlaki zapalne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.