Artykuł badawczy

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy mikrokropelkowej do precyzyjnego wykrywania mutacji niedrobnokomórkowego raka płuc

DOI:

10.3791/68770

⸱

29 lipca 2025

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do czułego i specyficznego wykrywania mutacji EGFR T790M za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ddPCR), który może być również rozszerzony o szybką identyfikację innych mutacji nowotworowych, takich jak G719S, L858R, L861Q i S768I.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na skalę globalną, rak płuc nadal jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do zgonów związanych z rakiem, a jego rozpowszechnienie ustępuje tylko rakowi nerki. Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) stanowi około 80-85% wszystkich zgłoszonych przypadków raka płuca. Mutacja T790M w genie EGFR jest powszechnie uznaną pierwotną determinantą nabytej oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR-TKI). Obecność tego stanu zaobserwowano u około 50-60% osób doświadczających postępującej choroby. W związku z tym wdrożenie szybkiego i wysoce responsywnego podejścia do wykrywania mutacji T790M w genie EGFR ma zasadnicze znaczenie dla szybkiej identyfikacji niedrobnokomórkowego raka płuca. W obecnym badaniu ddPCR zastosowano do wykrycia mutacji T790M z granicą wykrywalności wynoszącą 10 kopii/μl, która jest 10-krotnie wyższa niż czułość qPCR (1 × 102 kopii/μl). W przypadku 15 symulowanych próbek ddPCR był w stanie wykryć obecność mutacji T790M w genie EGFR, które zaobserwowano jako obniżone poziomy podczas analizy za pomocą qPCR. Wykrywanie mutacji T790M wewnątrz genu EGFR za pomocą metody szybkiego wykrywania jest badane w celu określenia jego przydatności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie i jest drugim najczęściej występującym nowotworem złośliwym. Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) stanowi znaczną większość, około 80% do 85%, wszystkich zgłoszonych przypadków raka płuc1,2,3,4. W przypadku pacjentów, u których zdiagnozowano zaawansowany NSCLC z mutacjami EGFR, ustalone podejście terapeutyczne obejmuje zastosowanie inhibitorów kinazy tyrozynowej receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) pierwszej, drugiej lub trzeciej generacji (TKI)5,6,7. Jednak u większości pacjentów leczonych EGFR-TKI pierwszej lub drugiej generacji ostatecznie rozwija się nabyta oporność na ten lek. Oporność ta jest często przypisywana obecności mutacji T790M w genie EGFR, która występuje u około 50-60% pacjentów doświadczających progresji choroby8,9,10,11,12.

Tradycyjnie, nieprawidłowości genetyczne w DNA guza z próbek tkanek są identyfikowane za pomocą technik takich jak hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) lub sekwencjonowanie nowej generacji (NGS)13,14. Jednak biopsje tkanek mogą być trudne ze względu na niedostępność guza, zły stan zdrowia pacjenta lub niewystarczającą zawartość komórek nowotworowych15,16,17. Alternatywnie, płynne biopsje, szczególnie z osocza, oferują mniej inwazyjny sposób identyfikacji mutacji napędzających poprzez wykrywanie krążącego DNA guza (ctDNA). Komórki nowotworowe wydalają DNA do krwiobiegu, płynu opłucnowego, śliny lub kału, stanowiąc cenne źródło do analizy genetycznej18,19. Profil genetyczny ctDNA często odzwierciedla skład genetyczny guza, oferując kompleksowy obraz heterogeniczności guza - kluczowego czynnika dla dokładnej diagnozy i spersonalizowanego leczenia raka20,21.

Wśród różnych technik identyfikacji mutacji EGFR we krwi obwodowej, w tym sekwencjonowania, reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), cyfrowego PCR, denaturacji wysokosprawnej chromatografii cieczowej (DHPLC), systemu amplifikacji opornych na mutacje (ARMS) i PCR wzbogaconego o mutanty (ME-PCR), cyfrowy PCR mikrokropelkowy (ddPCR) okazał się wysoce skutecznym narzędziem do wykrywania mutacji ctDNA22,23. Wyróżnia się wyjątkową czułością, precyzją i zdolnością do wykrywania mutacji o niskiej liczebności z dużą dokładnością. W przeciwieństwie do tradycyjnego PCR, ddPCR dzieli próbki na tysiące kropel, umożliwiając absolutną kwantyfikację docelowych sekwencji DNA bez standardowych krzywych. To sprawia, że doskonale nadaje się do wykrywania rzadkich mutacji, takich jak mutacja T790M w EGFR. Pomimo zalet ddPCR, jego szerokie zastosowanie kliniczne zostało ograniczone przez wyzwania związane z przygotowaniem próbek, optymalizacją systemu i porównawczą analizą wydajności przy użyciu uznanych technik, takich jak qPCR. Istnieje krytyczna luka w optymalizacji protokołów ddPCR do wykrywania mutacji ctDNA, szczególnie w odniesieniu do czułości, swoistości i odtwarzalności niezbędnych do przyjęcia klinicznego.

W tym badaniu stawiamy hipotezę, że ddPCR oferuje wyższą czułość i niezawodność w wykrywaniu mutacji EGFR T790M w ctDNA w porównaniu z tradycyjnymi metodami qPCR. Skupiliśmy się na optymalizacji procesu ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu zwiększenia wydajności, a następnie na optymalizacji ddPCR pod kątem wykrywania mutacji. Dodatkowo porównaliśmy wydajność ddPCR i qPCR pod względem czułości, swoistości i odtwarzalności przy użyciu symulowanych próbek. Poprzez systematyczną ocenę potencjału ddPCR, dążymy do ustalenia, że jest on realną i lepszą alternatywą dla qPCR do wykrywania mutacji EGFR w płynnych biopsjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie nie obejmowało ludzi, tkanek ludzkich ani eksperymentów na żywych zwierzętach; dlatego nie była wymagana żadna formalna etyczna zgoda. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi. Zmutowany plazmid T790M został zsyntetyzowany komercyjnie. Krew świni użyta do symulacji próbek klinicznych została uzyskana od certyfikowanego dostawcy przestrzegającego przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt, bez udziału żywych zwierząt. Wszystkie inne odczynniki, w tym kulki magnetyczne, startery, sondy i enzymy PCR, były pozyskiwane komercyjnie i używane zgodnie z instrukcjami producentów.

Ekstrakcja kwasów nukleinowych
Ekstrakcję kwasów nukleinowych przeprowadzono przy użyciu zestawu do ekstrakcji kulek magnetycznych i w pełni automatycznego przyrządu do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Standardowa procedura polegała na dodaniu 200 μl próbki i 20 μl proteinazy K do kolumny 1 lub 7 wstępnie wypełnionej płytki głębokiej dołka. Następnie do kolumny 2 lub 8 dodano 15 μl kulek magnetycznych dostarczonych z zestawem. Program ekstrakcji został zainicjowany na instrumencie, z tuleją magnetyczną umieszczoną w wyznaczonym miejscu. Po ekstrakcji ciecz z kolumny 6 lub 12 przeniesiono do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od nukleazy i przechowywano w temperaturze -20 °C.

Aby zoptymalizować ekstrakcję docelowych kwasów nukleinowych o niskim stężeniu, przeprowadzono eksperymenty optymalizacyjne. Zalecanymi parametrami ekstrakcji były: temperatura lizy 70 °C, czas lizy 10 min, 1 min dla każdego z trzech roztworów myjących, 2 min suszenie i 3 min elucja w temperaturze 56 °C. Systematycznie optymalizowano najważniejsze parametry: temperaturę lizy (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C i 78 °C), czas lizy (1, 3, 5, 7 i 9 min) oraz wielkość kulki magnetycznej (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm i 1000 nm). Optymalizacje te przeprowadzono przy użyciu zmutowanego plazmidu T790M w stężeniu 1 ×10 5 kopii/μl. Kulki magnetyczne o długości fali 100 nm zostały dostarczone z zestawem do ekstrakcji, podczas gdy inne rozmiary cząstek uzyskano z firmy biotechnologicznej. Wydajność każdego warunku ekstrakcji oceniono, analizując krzywe amplifikacji qPCR i wartości Ct wyekstrahowanych próbek. Analizę statystyczną tych wyników przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego.

Standardowe DNA plazmidu<br /> Zmutowany plazmid genu EGFR T790M został zsyntetyzowany na zamówienie przez firmę biotechnologiczną. Cztery mikrogramy suchego proszku plazmidu zawieszono ponownie w 100 μl 1x buforu TE. Stężenie plazmidu oznaczono za pomocą spektrofotometru. Liczba kopii na mikrolitr została obliczona za pomocą wzoru: Liczba kopii/μL = [(6,02 × 1023) × (stężenie DNA (ng/μL) × 10-9)] / (długość DNA w parach zasad × 660). Stężenie zsyntetyzowanego fragmentu wynosiło 1,26 × 109 kopii/μL. Ten podstawowy plazmid został następnie rozcieńczony 126-krotnie, aby uzyskać stężenie robocze 1 ×10 8 kopii/μl.

Projektowanie i synteza podkładów
Startery i sonda TaqMan dla mutacji EGFR T790M zostały zaprojektowane przy użyciu Primer 6 w oparciu o standardowe zasady projektowania starterów. Podkład upstream: 5′-CCTCACCTCCACCACCGTGC-3′; Starter końcowy24: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; Sonda: 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. Wszystkie startery i sondy zostały zsyntetyzowane za pomocą komercyjnej usługi syntezy oligonukleotydów.

Stworzenie i optymalizacja ilościowego systemu detekcji fluorescencji ddPCR i TaqMan
Zapas plazmidu T790M o stężeniu 1 × 108 kopii/μl rozcieńczono do 1 × 106 kopii/μl przy użyciu buforu 1× TE do stosowania w eksperymentach optymalizacji systemu ddPCR i qPCR.

Optymalizacja systemu ddPCR: System ddPCR został zoptymalizowany w oparciu o zalecenia producenta enzymu. Początkowy zalecany system obejmował: 7,5 μl 4x mieszanki PCR, 1,2-3 μl startera upstream (10 μM), 1,2-3 μl startera downstream (10 μM), 0,3-1,8 μl sondy (10 μM), 1-15 μl matrycy DNA i wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 30 μL. Zalecany cykl amplifikacji obejmował początkowe 10 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C i 60 s w temperaturze 55-65 °C. Temperatura wyżarzania (55-61,8 °C), stężenie startera (1-3 μL), stężenie sondy (0,75-1,75 μL) i stężenie matrycy (3-15 μL) były systematycznie optymalizowane. Wyniki optymalizacji poddano analizie statystycznej za pomocą oprogramowania statystycznego.

Optymalizacja systemu qPCR: System qPCR został zoptymalizowany zgodnie z zaleceniami producenta enzymu. Początkowo sugerowany system obejmował: 5 μL polimerazy Taq, 0,45 μL 250 mM MgCl2, 0,5-2,5 μL startera (10 μM), 0,5-2,5 μL startera odwrotnego (10 μM), 0,5-2,5 μL sondy (10 μM), 5 μL próbki DNA oraz wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 25 μL. Zalecany program amplifikacji wynosił 5 minut w temperaturze 95°C; następnie 45 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C i 30 s w temperaturze 56–64 °C, z kolekcją fluorescencji w temperaturze 56–64 °C. Zoptymalizowano temperaturę wyżarzania (56-64 °C), stężenie startera (1-3 μL), stężenie sondy (0,5-2,5 μL) i stężenie matrycy (1-5 μL). Analizę statystyczną tych wyników przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego.

ddPCR i ilościowy test wrażliwości PCR fluorescencji Taqmana
Aby ocenić czułość ddPCR w porównaniu z qPCR, plazmid T790M o sile 1 × 108 kopii/μl został seryjnie rozcieńczony 10-krotnie przy użyciu 1x buforu TE, aby utworzyć gradient stężeń w zakresie od 106 do 101 kopii/μl. W przypadku ddPCR przygotowano siedem roztworów reakcyjnych zgodnie ze zoptymalizowanym systemem ddPCR, po jednym dla każdego stężenia, w tym kontroli ujemnej. Próbki załadowano do układu generatora mikrokropel i przetworzono za pomocą przyrządu do generowania kropel w celu wygenerowania mikrokropel. Kropelki te zostały następnie amplifikowane za pomocą termocyklera PCR, a następnie przeanalizowane za pomocą cyfrowego instrumentu do wykrywania PCR. Równolegle przygotowano siedem roztworów reakcyjnych opartych na zoptymalizowanym systemie qPCR, z identycznymi szablonami. Przeprowadzono je na instrumencie PCR w czasie rzeczywistym, aby ocenić odpowiednią czułość obu podejść (n = 3).

testy powtarzalności ddPCR
Aby ocenić powtarzalność, standardowy plazmidowy DNA T790M o stężeniu 1 ×10 8 kopii/μl rozcieńczono w celu uzyskania wysokich (1 × 106 kopii/μl), pośrednich (1 ×10 4 kopii/μl) i niskich (1 × 102 kopii/μl) stężeń. Sześć roztworów reakcyjnych przygotowano zgodnie ze zoptymalizowanym systemem ddPCR. Próbki załadowano do układu generatora mikrokropel i przetworzono za pomocą przyrządu do generowania kropel w celu utworzenia mikrokropel. Mikrokropelki zostały następnie amplifikowane za pomocą termocyklera i przeanalizowane za pomocą cyfrowego instrumentu do wykrywania PCR. Uwzględniono kontrolę ujemną. Eksperyment przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Odtwarzalność oceniono, porównując profile amplifikacji i obliczając wartości współczynnika zmienności (CV) z trzech powtórzeń eksperymentalnych.

Badanie próbki analogowej
W celu przetestowania wiarygodności systemów ddPCR i qPCR z mutacją T790M, użyliśmy krwi świni losowo zmieszanej odpowiednio z wysokimi i niskimi stężeniami standardowych plazmidów mutacji T790M, a krew świni bez mieszanych standardowych plazmidów użyto jako próbek ujemnych, a 15 symulowanych próbek przygotowano losowo, a kwas nukleinowy wyekstrahowano z symulowanych próbek, i wykrywane odpowiednio przy użyciu metod ddPCR i qPCR.

Analiza statystyczna
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w co najmniej trzech powtórzeniach technicznych. Dane są prezentowane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 10. Różnice między grupami analizowano za pomocą testu t Studenta lub jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Wartość p mniejsza niż 0,05 została uznana za statystycznie istotną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja ekstrakcji kwasów nukleinowych
Oparty na ddPCR przepływ pracy wykrywania mutacji EGFR T790M jest schematycznie podsumowany w Rysunek 1. Najpierw określiliśmy optymalną temperaturę lizy. Jak pokazano na rysunku Rysunek 2A, temperatura łupliwości wynosząca 66 °C dała najmniejszą średnią wartość Ct, wskazując na najbardziej efektywne rozszczepienie. Dlatego do kolejnych eksperymentów wybrano 66 °C. Następnie zoptymalizowaliśmy czas lizy w w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc, jako główna przyczyna zgonów związanych z rakiem na całym świecie, zawsze był centralnym punktem badań medycznych. W tym badaniu badamy wiele krytycznych aspektów raka płuc, mając na celu zapewnienie głębszego wglądu w jego diagnozę, leczenie i rokowanie. Podstawą precyzyjnej diagnostyki i leczenia raka płuc są dokładne badania genetyczne. Jak wykazali Zhao i wsp.25, tradycyjne testy genetyczne w dużej mierze opierają się na wysokiej jakości próbkach tkanek i są kosztowne i czasochłonne....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Departament Nauki i Technologii Prowincji Yunnan oraz Uniwersytet Medyczny w Kunming – wspólny projekt specjalny dotyczący badań podstawowych, 202101AY070001-134

WKŁAD AUTORA
Youming Lei i Guoli Lv w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy i są współautorami. Youming Lei i Guoli Lv wymyślili i zaprojektowali badanie. Qingmei Yang przyczyniła się do gromadzenia i analizy danych. Jin Duan i Yunfei Shi nadzorowali analizę i interpretację danych, poprawili manuskrypt i zatwierdzili ostateczną wersję do publikacji. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 i razy; Bufor TEComber Sangon BiotechB548144Bufor Tris-EDTA stosowany do rozcieńczania DNA
4 razy; Mieszanka enzymatyczna Unimix-UTargetingOne BioUNIMIXU-4Xmieszanka enzymów ddPCR
A300 Szybki termocyklerLongGeneA300Amplifikacja PCR
Analizator biochipówSEED BioDigitalPCR-Biochipmarkerów kroplowych PCR
Xinyi BiotechnologyCyfrowa platforma PCR TD-2Przygotowanie mikrokropelek
Zestaw do ekstrakcji kwasów nukleinowych z kulkami magnetycznymiTechnologia LemnisCareMXP-1005Ekstrakcja kwasów nukleinowych
Układ generatora mikrokropelTargetingOne BiotechMG-Chip-01Służy do generowania mikrokropelek do ddPCR
NanoDropAllshengNC-500Pomiar stężenia kwasów nukleinowych po ekstrakcji próbki
Spektrofotometr NanoDrop ND-500Allsheng InstrumentyND-500do kwantyfikacji DNA
Przyrząd do PCR Szybki termocykler A300LongGeneA300Termocykler do amplifikacji PCR
Startery i sonda TaqManSangon BiotechSpecjalnie syntetyzowanestartery i sonda TaqMan do wykrywania T790M
Instrument qPCR Gentier mini TechnologiaTianlongGentier miniPCR w czasie rzeczywistym instrument
T790M mutacja plazmiduTsingke biologiaT790MStandardowa krzywa i test granicy wykrywalności
System wykrywania do cyfrowego przyrządu do przygotowywania próbek Spektrofotometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Harkati, I., Hilali, M. K., Oumghar, N., Khouchani, M., Loukid, M. Lifestyle and sociodemographic and economic characteristics of patients with lung cancer in Morocco. Can Respir J. 2020 (1), 8031541(2020).
  4. Zhang, X., Zhao, Y., Wang, M., Yap, W. S., Chang, A. Y. -c Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutations in cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 60 (2), 175-182 (2008).
  5. Hackner, K., et al. Detection of EGFR activating and resistance mutations by droplet digital PCR in sputum of EGFR-mutated NSCLC patients. Clin Med Insights Oncol. 15, 1179554921993072(2021).
  6. Hanna, N., et al. Systemic therapy for stage IV non-small-cell lung cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (30), 3484-3515 (2017).
  7. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 378 (2), 113-125 (2018).
  8. Rosell, R., Bivona, T. G., Karachaliou, N. Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment. Lancet. 382 (9893), 720-731 (2013).
  9. Ohashi, K., Maruvka, Y. E., Michor, F., Pao, W. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease. J Clin Oncol. 31 (8), 1070-1080 (2013).
  10. Simarro, J., et al. Technical validation and clinical implications of ultrasensitive PCR approaches for EGFR-Thr790Met mutation detection in pretreatment FFPE samples and in liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Int J Mol Sci. 23 (15), 8526(2022).
  11. Yu, H. A., et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 19 (8), 2240-2247 (2013).
  12. Wang, W., Song, Z., Zhang, Y. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Cancer Med. 6 (1), 154-162 (2017).
  13. Hendriks, L. E., et al. Lung cancer in the Netherlands. J Thorac Oncol. 16 (3), 355-365 (2021).
  14. Visser, E., et al. Up-front mutation detection in circulating tumor DNA by droplet digital PCR has added diagnostic value in lung cancer. Transl Oncol. 27, 101589(2023).
  15. Ilié, M., Hofman, P. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy. Transl Lung Cancer Res. 5 (4), 420(2016).
  16. Cheng, M. L., et al. Circulating tumor DNA in advanced solid tumors: clinical relevance and future directions. CA Cancer J Clin. 71 (2), 176-190 (2021).
  17. Weber, B., et al. Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays. BMC Cancer. 14, 1-6 (2014).
  18. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  19. Bruhn, N., et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 906 (1), 72-82 (2000).
  20. Kohsaka, S., Petronczki, M., Solca, F., Maemondo, M. Tumor clonality and resistance mechanisms in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: implications for therapeutic sequencing. Future Oncol. 15 (6), 637-652 (2018).
  21. Takeda, M., et al. Impact of coexisting gene mutations in EGFR-mutated non-small cell lung cancer before treatment on EGFR T790M mutation status after EGFR-TKIs. Lung Cancer. 139, 28-34 (2020).
  22. Demuth, C., et al. Measuring KRAS mutations in circulating tumor DNA by droplet digital PCR and next-generation sequencing. Transl Oncol. 11 (5), 1220-1224 (2018).
  23. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Rev Mol Diagn. 18 (1), 7-17 (2018).
  24. Yu, Q., et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Mol Med Rep. 16 (2), 1157-1166 (2017).
  25. Zhao, Y., et al. Deep learning using histological images for gene mutation prediction in lung cancer: a multicentre retrospective study. Lancet Oncol. 26 (1), 136-146 (2025).
  26. Williamson, D. F., et al. Detection of EGFR mutations in non-small cell lung cancer by droplet digital PCR. PLoS One. 17 (2), e0264201(2022).
  27. Tang, C., et al. Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients. Clin Chim Acta. 510, 88-96 (2020).
  28. Xu, S., et al. Exploring the impact of egfr T790m neighboring snps on arms-based t790m mutation assay. Oncol Lett. 12 (5), 4238-4244 (2016).
  29. Merker, J. D., et al. Circulating tumor DNA analysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists joint review. J Clin Oncol. 36 (16), 1631-1641 (2018).
  30. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  31. Newman, A., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med. 20 (5), 548-554 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

cyfrowy PCRPCR mikrokropelkowymutacja EGFRmutacja T790Mdetekcja mutacjiczu o qPCRoporno na EGFR TKIbiomarkery raka p ucaonkologia precyzyjna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły