Artykuł metodologiczny

Prosty protokół izolacji i hodowli hepatocytów od myszy z MASLD

DOI:

10.3791/68782

⸱

18 lipca 2025

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie ustanawia standardowy protokół izolowania pierwotnych hepatocytów od myszy z metaboliczną stłuszczeniową chorobą wątroby (MASLD) związaną z dysfunkcją metaboliczną, umożliwiając badania stłuszczenia i dysfunkcji metabolicznej bez sztucznego obciążania lipidami. Metoda pozwala uzyskać hepatocyty o wysokiej wydajności i żywotności, odpowiednie do badań mechanistycznych i terapeutycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stłuszczeniowa choroba wątroby związana z dysfunkcją metaboliczną (MASLD), charakteryzująca się patologiczną akumulacją lipidów (stłuszczeniem) w hepatocytach, stanowi znaczące i rosnące globalne obciążenie zdrowotne. Pierwotne hodowle hepatocytów myszy służą jako niezbędne modele ex vivo do wyjaśnienia patogenezy MASLD i interwencji terapeutycznych. Jednak niezawodna izolacja wysokiej jakości hepatocytów ze stłuszczeniowej wątroby pozostaje wyzwaniem technicznym. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół skutecznej izolacji pierwotnych hepatocytów od myszy MASLD przy użyciu techniki perfuzji kolagenazy. Protokół ten generuje hepatocyty wykazujące wrodzone stłuszczenie bez konieczności sztucznej indukcji poprzez suplementację palmitynianem i kwasem oleinowym, zachowując w ten sposób bardziej fizjologicznie istotny fenotyp. Protokół daje wysoce żywotne i wysokiej czystości hepatocyty i ma uniwersalne zastosowanie do izolowania dużych ilości hepatocytów od myszy MASLD. Ponadto nadaje się do oceny farmakologicznej lub badań interwencji genetycznej. Podsumowując, zapewniamy powtarzalny protokół izolowania hepatocytów o wysokiej wydajności, wysokiej czystości i wysokiej żywotności do dalszych badań biologicznych komórek, aby ułatwić odkrycie nowych celów terapeutycznych i leków na MASLD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaboliczna stłuszczeniowa choroba wątroby związana z dysfunkcją metaboliczną (MASLD) charakteryzuje się patologiczną akumulacją lipidów w hepatocytach i stanowi najbardziej rozpowszechnioną przewlekłą chorobę wątroby na świecie1. Szacuje się, że MASLD dotyka 38% dorosłej populacji świata i stał się poważnym zagrożeniem dla zdrowia ludzkiego2. Mechanizmy MASLD nie zostały w pełni wyjaśnione, a możliwości leczenia są bardzo ograniczone. Odkrywanie nowych celów terapeutycznych i opracowywanie leków celowanych dla MASLD stało się krytyczną potrzebą kliniczną. Hepatocyty, jako dominujący typ komórek tworzących wątrobę, są głównym miejscem wątrobowego metabolizmu glukozy, lipidów i leków. Hepatocyty pierwotne zachowują pełniejszą funkcję hepatocytów niż linie komórkowe hepatocytów i są użytecznym narzędziem do badania mechanizmów chorób wątroby i opracowywania leków3. Izolacja i hodowla pierwotnych hepatocytów od myszy ze stłuszczeniem wątroby jest podstawową techniką badania patofizjologii wątroby, w tym metabolizmu lipidów, insulinooporności i reakcji zapalnych. Wcześniejszy protokół ustalony do izolacji hepatocytów z mysich modeli stłuszczenia wątroby wykorzystywał wirowanie gradientowe, aby umożliwić oddzielenie zarówno normalnych, jak i gromadzących się w lipidach populacji hepatocytów. Te izolowane hepatocyty obciążone lipidami stanowią zatem krytyczny system modelowy in vitro do badania patobiologii stłuszczeniowej choroby wątroby3. Głównym celem tego podejścia jest łatwe i ekonomiczne uzyskanie wysoce żywotnych i wysokowydajnych hepatocytów, które zachowują specyficzne dla choroby cechy fenotypowe, a tym samym są w stanie naśladować MASLD in vitro.

Ogólna procedura izolacji hepatocytów u myszy składa się z dwuetapowego procesu, który rozpoczyna się od wypłukania krwi z wątroby izotonicznym roztworem perfuzyjnym, takim jak Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (HBSS), a następnie trawienie wątroby za pomocą roztworu trawiącego zawierającego kolagenazę. Ostatnie postępy w technikach perfuzji wątroby i trawienia enzymatycznego poprawiły wydajność i żywotność pierwotnych hepatocytów u samic myszy4. Ulepszenia tradycyjnych dwuetapowych metod perfuzji kolagenazy, takie jak optymalizacja składu buforu i skrócenie czasu trawienia, miały kluczowe znaczenie w dostosowaniu protokołów eksperymentalnych do próbek stłuszczenia wątroby. Hepatocyty pierwotne służą jako niezbędne modele do wyjaśnienia mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw MASLD i jego powikłań kardiometabolicznych, szczególnie poprzez ich rolę w pośredniczeniu w przesłuchach serca i wątrobie oraz interakcjach osi wątroba-naczynie za pośrednictwem mediatorów śródbłonka i czynników angiogennych5,6. Komórki te dostarczają krytycznych informacji na temat wielonarządowych sieci komunikacyjnych napędzających postęp choroby, o czym świadczą kliniczne powiązania między MASLD, przewlekłą chorobą nerek i chorobą niedokrwienną serca7, oferując jednocześnie fizjologicznie istotną platformę do opracowywania terapii celowanych dotyczących zarówno wątrobowych, jak i sercowo-naczyniowych objawów zespołu metabolicznego. Obecne badania in vitro MASLD opierają się głównie na stymulowanych przez kwas palmitynowy/oleinowy (PA/OA) normalnych hepatocytach lub ludzkich liniach komórkowych hepatocytów (np. HepG2 i Huh7), które nieodpowiednio replikują patofizjologiczne cechy hepatocytów stłuszczeniowych w warunkach chorobowych, co ogranicza ich znaczenie translacyjne dla badania interakcji serce-wątroba-naczynia. Podejście to nie jest w stanie uchwycić przewlekłej dysfunkcji metabolicznej, mikrośrodowiska zapalnego i specyficznych dla choroby przesłuchów międzynarządowych charakterystycznych dla progresji MASLD.

Ten protokół może być używany do izolowania hepatocytów od myszy MASLD, bez potrzeby sztucznego dodawania leczenia kwasem palmitynowym i oleinowym. Podsumowując, przedstawiamy prostą i powtarzalną metodę uzyskiwania hepatocytów o wysokiej wydajności i doskonałej żywotności, która jest odpowiednia dla dalszych badań biologii komórki w celu wsparcia odkrywania nowych celów terapeutycznych i opracowywania leków na MASLD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie etapy eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Nauki i Technologii w Chinach. Samce myszy C57BL / 6J były karmione dietą wysokotłuszczową (HFD, #12492, dieta badawcza) przez ponad 12 tygodni w tym badaniu.

1. Przygotowanie płytki lub potrawy pokrytej kolagenem

  1. Dodać 15 ml 100% EtOH do 35 ml podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O). Przygotować roztwór kolagenu typu I 50 μg/ml w 30% EtOH. Filtr ze sterylną końcówką filtra 0,22 μm.
  2. Pokryj płytkę lub naczynie do hodowli komórkowej 30 μl roztworu kolagenu na cm2. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
  3. Usuń nadmiar płynu pipetą i osusz płytkę lub naczynie hodowlane. Naświetlać powlekane naczynia światłem ultrafioletowym przez 0,5 godziny w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C krócej niż 1 miesiąc.
    UWAGA: Długość fali lampy UV wynosi 254 nm, a intensywność promieniowania UV nie mniejsza niż 400 mw/m2. Odległość źródła lampy UV od naczyń pokrytych kolagenem wynosi 1 m.

2. Przygotowanie roztworu perfuzyjnego

  1. Na kilka dni przed wyizolowaniem hepatocytów należy przygotować odczynniki do izolacji hepatocytów i pożywki hodowlane określone w tabeli 1. Filtruj roztwór perfuzyjny A i B ze sterylną końcówką filtra 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C krócej niż 1 miesiąc. Przygotuj łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 37 °C.
  2. Podgrzej roztwory perfuzyjne A i B w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Przed zabiegiem dodaj 40 mg kolagenazy typu IV do 80 ml roztworu perfuzyjnego B.
  3. Pompować 75% EtOH z szybkością 4 ml/min przez 5 minut za pomocą pompy perystaltycznej w temperaturze pokojowej. Zmienić rurkę pompy z 75% EtOH na wstępnie podgrzany roztwór perfuzyjny A.
    UWAGA: Zmontuj podgrzewaną jednostkę napełniającą obieg zgodnie z konfiguracją zilustrowaną na Rysunek 1A.

3. Zabieg chirurgiczny

  1. Znieczulij mysz zatwierdzoną metodą. Pentobarbital sodu (50 mg/kg) wstrzyknąć dootrzewnowo. Przed kontynuowaniem sprawdź utratę odruchu skrętnego.
  2. Zabezpiecz górne i dolne kończyny myszy na desce preparcyjnej. Wysterylizuj obszar operacyjny 75% alkoholem.
  3. Przeciąć wewnętrzną i zewnętrzną błonę brzuszną za pomocą narzędzi preparacyjnych. Obróć narządy trzewne na lewą stronę myszy za pomocą bawełnianego wacika, aby odsłonić żyłę główną dolną (IVC) i żyłę wrotną wątroby (PV).
  4. Naciśnij żyłę główną dolną wacikiem, aby ją wybrzuszyć. Wprowadzić igłę 22-G równolegle do żyły głównej dolnej.
  5. Wyciągnąć żelazną część igły na stałe. Pozostaw cewnik w żyle głównej dolnej. Podłącz igłę do linii perfuzyjnej z końcówką filtra 0,22 μm.
    UWAGA: Igła umieszczona na stałe składa się z żelaznej części igły i plastikowej części cewnika. Zapewnić dokładne wprowadzenie do żyły głównej dolnej i poczekać, aż igła wypełni się krwią. Pozbądź się wszystkich pęcherzyków powietrza z igły zamieszkującej na miejscu. Zakończ całą procedurę szybko, aby uniknąć zakrzepicy.
  6. Ustaw szybkość perfuzji na 5 ml/min płynu perfuzyjnego A. Rozpocznij perfuzję i obserwuj wątrobę, aż pojawi się obrzęk. Natychmiast odetnij żyłę wrotną.
  7. Delikatnie masuj wątrobę za pomocą bawełnianego wacika, aby zapewnić dokładne spłukiwanie krwi. Kontynuuj perfuzję, aż wątroba zmieni kolor na ziemistożółty.
  8. Przełącz się na płyn perfuzyjny B zawierający 0,05% kolagenazy typu IV. Kontynuuj perfuzję, aż wątroba zostanie w pełni strawiona.
    UWAGA: Trawienie wątroby zajmuje co najmniej 10 minut na mysz. Objętość 80 ml roztworu perfuzyjnego B zawierającego kolagenazę wystarcza jednej myszy do strawienia wątroby. Tkanka wątroby ulega całkowitemu trawieniu enzymatycznemu, aż do osiągnięcia maksymalnego zmiękczenia, przy czym miąższ otoczony torebką osiąga stan ekstremalnej kruchości podatnej na zakłócenia mechaniczne.
  9. Usuń wątrobę z brzucha myszy. Umieść wątrobę w 10 cm naczyniu zawierającym DMEM.
  10. Postępuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozdrobnij wątrobę na proszek za pomocą pęsety (dobrze strawiona wątroba łatwo uwalnia hepatocyty).
  11. Przefiltrować zawiesinę przez filtr siatkowy 70 μm do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dostosuj głośność do 45 ml (na mysz) za pomocą pożywki DMEM.
  12. Wirować przy 50 × g przez 4 min. Całkowicie odlewać supernatant.
  13. Zawiesić osad z podłożem DMEM do końcowej objętości 25 ml (na mysz). Ponownie odwirować przy 50 × g przez 2 min.
  14. Całkowicie odlewać supernatant. Zawiesić osad w 25 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% FBS.
  15. Zawiesinę dokładnie wymieszać. Zabarwić komórki błękitem trypanowym w celu policzenia. Natychmiast przystąp do zaszczepiania w celu uzyskania posiewu.
    UWAGA: Umieść 2 ml pożywki zawierającej 2 × 105 komórek na studzienkę w 6-dołkowych naczyniach pokrytych kolagenem. Wymień pożywkę DMEM po 2 godzinach inokulacji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół został wdrożony na samcach myszy C57BL/6J karmionych HFD przez ponad 12 tygodni. Wyizolowane hepatocyty pierwotne zbadano pod kątem morfologii i funkcji. Uzyskaliśmy średnią wydajność 2 × 107 komórek na izolację z około 40 g wątroby myszy. Żywotność komórek określono na 85%-86% za pomocą barwienia żywych komórek Calceiną AM. Wydajność z każdej izolacji myszy otyłych wywołanych dietą (DIO) była wystarczająca do wysiewu 15 standardowych płytek 6-dołkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja żywotnych hepatocytów myszy obejmuje krytyczną dwuetapową procedurę, rozpoczynającą się od dokładnej perfuzji naczyniowej przy użyciu roztworu izotonicznego w celu usunięcia składników krwi, a następnie kontrolowanego trawienia enzymatycznego aktywnym roztworem kolagenazy 9,10. Skuteczna izolacja zależy od utrzymania optymalnych warunków fizjologicznych w całym procesie, w szczególności stabilnej temperatury (37 °C) i pH (7,2-7,4) roztworów perfuzyjnych,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [nr 82373967].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50 ml sterylne probówki wirówkoweNest602052
przeciwciało anty-HNF4 i alfa Przeciwciało anty-IgGImmunowayYM8517
Proteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
WirówkaThermo Sorvall ST16R
Kolagen Typ I Corning354236
Collagenase, typ 4Sangon BiotechA004186-0001
Igła zatrzymującaBRAUN4254074B
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
EtanolMerck (SigmaAldrich)493511
Płodowa surowica bydlęcaSigmaF2442
GlukozaMerck (SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
Isoginkgetin MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 · 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3Merck (SigmaAldrich)S6014
Filtr igłowy 0,22&mikro; MMillex-GPSLGV033RB
Nile RedInvitrogenN1142
Penicylina/streptomycyna (100X)Gibco15140122
Rekombinowany adenowirusObio Technology Corp., ltd. Rekombinowane adenowirusy kodujące mysz IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) i adenowirus kontrolny (Ad-NC) zostały skonstruowane przez Obio Technology Corp., ltd.
Pentobarbital soduMerck (SigmaAldrich)P3761
Sterylne sitka komórkowe, 100 μ mFisher Scientific22363549
Trypan BlueBeyotimeST2780-5g
Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływieDłuższyBT100-1F

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
  2. Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
  3. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
  4. Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
  5. Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
  6. Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
  7. Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
  8. Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
  9. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
  10. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  11. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  12. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
  13. Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
  14. Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
  15. Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
  16. Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
  17. Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja hepatocyt wperfuzja kolagenazpierwotne hepatocytyst uszczona w trobahodowla hepatocyt wakumulacja lipid wmodele ex vivointerwencja genetycznaocena farmakologiczna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły