Method Article

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

DOI:

10.3791/68788

⸱

September 5th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiom człowieka składa się z różnorodnych i dynamicznych społeczności drobnoustrojów, które odgrywają istotną rolę w zdrowiu gospodarza. Zrozumienie tych społeczności i ich reakcji na czynniki środowiskowe ma kluczowe znaczenie dla rozwoju terapii opartych na mikrobiomie. Tradycyjne modele in vitro do hodowli mikrobioty ludzkiej często nie są skalowalne i wymagają rozległej wiedzy technicznej, co ogranicza ich dostępność i przepustowość. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy system Minibioreactor Array (MBRA) – modułową, jednostopniową platformę o ciągłym przepływie do wysokowydajnej hodowli zbiorowisk drobnoustrojów. System ten umożliwia równoległą hodowlę do 48 odrębnych zbiorowisk mikroorganizmów, wspierając elastyczność eksperymentalną przy jednoczesnym utrzymaniu stabilnego wzrostu złożonych ekosystemów. Protokół ten zawiera szczegółowe wskazówki dotyczące wytwarzania, montażu, sterylizacji i obsługi MBRA. Modułowa konstrukcja systemu pozwala na łatwą integrację z komorami beztlenowymi i umożliwia dostosowanie do szerokiego zakresu zastosowań eksperymentalnych. Został wykorzystany do badania reakcji mikrobiologicznych na antybiotyki, związki dietetyczne i inwazję patogenów oraz do badań przesiewowych w poszukiwaniu społeczności odpornych na patogeny. Dzięki swojej dostępności, skalowalności i odtwarzalności, MBRA stanowi potężny system modelowy do badania interakcji mikrobiologicznych i postępów w badaniach nad mikrobiomem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiom człowieka to złożony ekosystem mikroorganizmów, który odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i ma głęboki wpływ na zdrowie człowieka. Ludzki mikrobiom obejmuje wiele anatomicznych miejsc w całym naszym ciele, z których każde zawiera dynamiczne społeczności drobnoustrojów aktywnie oddziałujących na siebie w sposób, którego jeszcze w pełni nie rozumiemy1. Poszerzanie naszej wiedzy na temat udziału społeczności drobnoustrojów w zdrowiu i chorobie zależy od naszego zrozumienia interakcji mikrobiologicznych zachodzących w tych środowiskach1. Aby skutecznie badać i manipulować tymi skomplikowanymi systemami w celach terapeutycznych, konieczne jest podejście redukcjonistyczne. Badanie indywidualnych interakcji mikrobiologicznych przy użyciu uproszczonych systemów modelowych ułatwia lepsze zrozumienie pełnej złożoności mikrobiomu2.

Dostępna jest szeroka gama systemów modelowych do hodowli społeczności mikrobiologicznych pochodzących od człowieka. Systemy te poszerzyły naszą wiedzę na temat społeczności drobnoustrojów związanych z człowiekiem i obejmują zarówno jednoetapową hodowlę wsadową, jak i bardziej złożone wieloetapowe systemy ciągłego przepływu. Systemy modelowe, takie jak symulator ekosystemu mikrobiologicznego jelit człowieka3, jednostopniowy system chemostatu dwunaczyniowego4 oraz system kontroli środowiska mikrobiotyjelitowej 5 odtwarzają warunki fizjologiczne określonych miejsc anatomicznych i zapewniają bliskie przybliżenia środowisk mikrobiologicznych in vitro . Jednak ich zastosowanie przez mikrobiologów jest ograniczone, ponieważ są kosztowne, wymagają wysokiej jakości wiedzy technicznej do obsługi i konserwacji oraz mają ograniczoną przepustowość.

Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy system Minibioreactor Array (MBRA) – jednostopniowy system hodowli o ciągłym przepływie, zaprojektowany w celu ułatwienia stabilnego wzrostu społeczności drobnoustrojów z różnych źródeł w kontrolowanym środowisku 6,7,8. System MBRA wyróżnia się na tle innych modeli jelit prostotą montażu i obsługi w połączeniu z wysoką przepustowością, która pozwala na jednoczesną hodowlę wielu społeczności drobnoustrojów, zwiększając wydajność eksperymentów. Co więcej, prosty i kompaktowy charakter tego systemu pozwala na jego działanie w komorach beztlenowych i mikrooksykowych, aby ułatwić rozwój bakterii z miejsc beztlenowych i niedotlenionych, takich jak przewód pokarmowy i pochwa. Wszechstronny charakter tego systemu został wykorzystany do badań przesiewowych zbiorowisk przewodu pokarmowego opornych na Clostridioides difficile9, a także do testowania wpływu antybiotyków10,11 i substratów dietetycznych12 na społeczności drobnoustrojów.

MBRA są wytwarzane przez druk 3D lub produkcję addytywną, przy czym priorytetem jest przejrzystość i wodoodporność w naszym wyborze materiałów (patrz Tabela materiałów , aby uzyskać informacje o polimerach). Każda tablica składa się z sześciu oddzielnych komór, z których wszystkie są wyposażone w porty do importu mediów, eksportu odpadów i pobierania próbek. Świeże media są w sposób ciągły dostarczane do systemu, podczas gdy odpady są jednocześnie usuwane, a natężenie przepływu jest precyzyjnie kontrolowane przez dwie pompy perystaltyczne. Zawartość systemu jest stale mieszana za pomocą mieszadeł i 60-punktowej płytki mieszającej, aby ułatwić uzyskanie jednorodnych kultur. Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem objętości roboczej 15 ml na komorę, chociaż każdy bioreaktor może pomieścić zakres 1-20 ml w zależności od wymagań eksperymentalnych. Pompa perystaltyczna i rurka pompy mogą obsługiwać natężenia przepływu w zakresie od 0,016 do 2,9 ml/min, co odpowiada szybkościom obrotu wynoszącym odpowiednio około 15,63 do 0,09 h. Chociaż system jest kompatybilny z szeroką gamą preparatów pożywek oraz dodatków dietetycznych lub odżywczych, należy wziąć pod uwagę pewne względy praktyczne: media o dużej lepkości mogą wymagać ponownej kalibracji natężenia przepływu, a obecność nierozpuszczonych cząstek lub nierozpuszczalnych składników może zatkać rurki pompy lub wąskie złącza, szczególnie przy niższych natężeniach przepływu. Modułowość systemu pozwala na szybkie i łatwe dostosowanie eksperymentów poprzez dostosowanie wyboru podłoża, pobierania próbek, natężenia przepływu i objętości roboczej. W połączeniu z czterema 24-kanałowymi pompami perystaltycznymi i dwiema 60-punktowymi płytkami mieszającymi, system może obsługiwać 48 oddzielnych komór na eksperyment w jednej komorze beztlenowej, wspierając wysokoprzepustowe badania przesiewowe beztlenowe.

Protokół ten służy jako wizualny przewodnik i zaktualizowana wersja wcześniej opublikowanej metody montażu i obsługi MBRA opracowanej przez nasze laboratorium4. Wprowadzono kilka kluczowych ulepszeń w celu zwiększenia odtwarzalności, usprawnienia przepływu pracy i zminimalizowania zanieczyszczeń. Po pierwsze, słomki z PTFE są teraz trawione chemicznie, aby zapobiec ich odklejaniu się i wpadaniu do komór bioreaktora. Po drugie, do linii zasilających dodano słomkę do pożywki, aby skierować przepływ mediów do dna komór, zapobiegając spływaniu mediów po ściankach komory. Było to znane źródło powstawania biofilmu. Po trzecie, długości rurek C-flex zostały ustandaryzowane i skrócone, a wydrukowany w 3D uchwyt na rurkę został zaprojektowany, aby stworzyć bardziej kompaktową, zorganizowaną konfigurację. Wreszcie, bioreaktory nie są już w pełni demontowane między każdym użyciem, co znacznie skraca czas i koszty materiałowe związane z powtarzającymi się eksperymentami. Te i inne przyrostowe udoskonalenia odzwierciedlają iteracyjną optymalizację opartą na szerokim wykorzystaniu systemu w wielu projektach w naszym laboratorium.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół służy do przygotowania i montażu pojedynczej taśmy MBRA (Rysunek 1). Każdy MBRA składa się z bioreaktora wydrukowanego w 3D, rurek ułatwiających napływ pożywki wzrostowej oraz rurek ułatwiających odpływ odpadów z komór bioreaktora. Pełna lista części składających się na pojedynczy MBRA, wraz z obrazami, znajduje się w tabeli 1. Wymagane dodatkowe wyposażenie obejmuje dwie pompy perystaltyczne i płytkę mieszającą (szczegóły dotyczące urządzenia znajdują się w tabeli materiałów ).

1. Przygotowanie do montażu wstępnego

  1. Wytrawianie politetrafluoroetylenem (PTFE)
    UWAGA: Chociaż właściwości chemiczne PTFE sprawiają, że idealnie nadaje się on do stosowania w tym systemie MBRA, jego smarowność uniemożliwia połączenie z innymi częściami bioreaktora przy użyciu samej żywicy epoksydowej. Aby zamocować rurkę PTFE w gwintowanych męskich luerach, należy ją najpierw wytrawić chemicznie, aby umożliwić połączenie żywicy epoksydowej. Stosuje się wytrawiacz fluorowęglowodorowy (patrz tabela materiałów). Rysunek 2A służy jako wizualny przewodnik po oklejaniu rurki PTFE w celu ułatwienia tego procesu trawienia.
    1. Wytnij dwanaście odcinków rurki PTFE o długości 25 mm. Sześć z nich zostanie przeciętych na pół po wytrawieniu, aby służyć jako słomki do linii paszowych ("słomka pożywkowa").
      UWAGA: Tylko klejony odcinek powinien być wytrawiony. Aby zapobiec wytrawianiu wewnętrznej powierzchni i niepożądanych obszarów, rurka musi być zaklejona taśmą i uszczelniona na obu końcach.
    2. Używając taśmy do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczenia (szerokość 19 mm), owiń taśmę całkowicie wokół góry, zakrywając ~5 mm rurki PTFE (rysunek 2A). Nałóż kolejny odcinek taśmy wokół dna, zakrywając ~10 mm rurki PTFE (Rysunek 2A).
    3. Mocno ściśnij końce taśmy, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu trawiącego do wnętrza PTFE (Rysunek 2A). Powinno to pozostawić ~10 mm rurki PTFE odsłonięte do wytrawienia.
    4. Przygotować cztery roztwory: roztwór wytrawiacza fluorowęglowodorowego podgrzany do 55 °C (szczegóły dotyczące roztworu wytrawiacza fluorowęglowodorowego znajdują się w Tabeli materiałów ), 100% etanol (EtOH), destylowanyH2Opodgrzany do temperatury 70 °C i destylowanyH2O+ 2-5% kwas octowy podgrzany do temperatury 70 °C.
      UWAGA: Roztwór wytrawiacza fluorowęglowodorowego jest silnie. Wszystkie czynności należy wykonać w dygestorium przy użyciu środków ochrony indywidualnej. Chemikalia należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    5. Podgrzej wszystkie roztwory do temperatur wskazanych w kroku 1.1.4. Roztwór wytrawiacza fluorowęglowodorowego należy podgrzać w łaźni wodnej, pozostałe roztwory można podgrzać na płycie grzejnej. Wlej roztwory do 4 oddzielnych szklanych pojemników wystarczająco głębokich, aby całkowicie zanurzyć zaklejoną taśmą rurkę.
    6. Zanurz wszystkie rurki PTFE w roztworze wytrawiacza fluorowęglowodorowego. Obracać, aby zapewnić równomierną ekspozycję powierzchni. Moczyć przez 1 minutę, aż wytrawiona powierzchnia zmieni kolor na brązowy.
      UWAGA: Metalowa łyżka sitka skimmera może być używana do przenoszenia rurek PTFE między roztworami.
    7. Przenieś rurkę do kąpieli EtOH na 5-20 s.
    8. Przenieść rurkę do łaźni 70 °C H20 na 15-30 s.
    9. Przenieść rurkę do kąpieli w temperaturze 70 °C H20 + 2-5% kwasu octowego na 1 min.
    10. Wyjmij rurkę i umieść ją na podkładce chłonnej wewnątrz dygestorium. Pozostaw wytrawioną rurkę do wyschnięcia przez noc (co najmniej 16 godzin). Po wyschnięciu usuń taśmę z wytrawionej rurki.
    11. Wytrawiony PTFE jest gotowy do klejenia i pozostanie wiążący przez kilka miesięcy, jeśli będzie przechowywany w temperaturze pokojowej. Gdy brązowe zabarwienie na powierzchniach trawienia wyblaknie, nie można go już skleić.
      UWAGA: Nie wystawiaj wytrawionego PTFE na działanie promieniowania UV, ponieważ spowoduje to degradację wytrawiania.
    12. Przeciąć 6 wytrawionych rurek PTFE na pół, aby służyły jako słomki do przewodów zasilających (Rysunek 2A).
  2. Odpady epoksydowe i słomki z podłoża
    1. Włóż każdą z 6 wytrawionych słomek odpadowych PTFE i 6 wytrawionych słomek z PTFE do odpowiednich gwintowanych męskich słomek luer. Upewnij się, że wytrawione powierzchnie są wyrównane z dolną częścią męskiego luera (Rysunek 2).
    2. Wymieszaj żywicę epoksydową i utwardzacz w stosunku 1:1 w łódce do ważenia lub szalce Petriego. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml nałóż żywicę epoksydową wokół podstawy gwintowanego męskiego luera w miejscu, w którym styka się z rurką PTFE.
    3. Ustaw każdy element pionowo i pozwól żywicy epoksydowej zastygnąć przez 24 godziny.
      UWAGA: Puste pudełko na końcówki do pipet o pojemności 1 ml dobrze sprawdza się, aby utrzymać je w pozycji pionowej.

2. Montaż MBRA

  1. MBRA i przygotowanie części
    1. Upewnij się, że paski macierzy minibioreaktora są wydrukowane w 3D (patrz plik uzupełniający 1) i zawierają 6 niezależnych komór bioreaktora. Każda komora zawiera trzy porty 1/4 cala, które muszą być gwintowane, aby włożyć złączki. Wykonaj gwintowanie za pomocą gwintownika o frakcji 1/4 cala-28NF za pomocą klucza do gwintowników z uchwytem T.
      UWAGA: Podczas gwintowania portów zaleca się stosowanie prowadnicy kranu, aby zapewnić gwint pionowy.
    2. Po gwintowaniu umyj każdą komorę bioreaktora wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości plastiku. Do każdej komory dodać mieszadło magnetyczne o wymiarach 10 x 3 mm i 1 ml wody destylowanej. Woda pomoże w procesie sterylizacji podczas autoklawowania.
    3. Umieść gumową podkładkę na górze każdego portu bioreaktora. Do każdej komory wkręcić 1 odpadowy męski luer z gwintem słomy, 1 męski luer z gwintem słomy i 1 pusty gwint męski luer do każdego z portów, jak pokazano na rysunku 2B.
    4. Włóż 6 gumowych przegród na żeńskie zadziory luer 3/32 cala. Złóż górny rękaw przegrody w dół, aby zakryć szyję. Przymocuj je do portów każdej komory wskazanej na rysunku 2B.
    5. Wytnij paski rur C-flex o następującej długości: 2 3/8 cala, 3 11/16 cala, 5 1/4 cala, 6 1/2 cala, 7 13/16 cala i 9 cali (po dwa z każdej długości będą potrzebne zarówno dla przewodów odpływowych, jak i przewodów zasilających). Po przecięciu przymocuj żeński zadzior luer 1/8 cala do jednego końca i męskie złącze luer lock do przeciwległego końca każdej długości rurki.
      UWAGA: Zastosowane tutaj długości są zoptymalizowane w celu zmniejszenia bałaganu i dla pomp umieszczonych w odległości ~1 cala od płyty mieszającej. W zależności od pożądanej konfiguracji mogą być wymagane większe długości.
    6. Włóż żeński zadzior luer 1/16 cala do każdego końca czerwonej 2-stopniowej rurki E-lab (średnica wewnętrzna 1.14 mm) i pomarańczowej rurki E-lab z 2 stopami (średnica wewnętrzna 0.89 mm). Powtórz ten proces sześć razy dla każdego paska MBRA.
      UWAGA: Aby ułatwić wkładanie żeńskiego zadzioru luer 1/16 cala, zanurz na krótko końce rurki E-lab w prawie wrzącej wodzie, aby zmiękczyć plastik.
    7. Podłącz rurkę E-lab do rurki C-flex przygotowanej w kroku 2.1.5. Każda z 6 długości rurki C-flex powinna być podłączona do jednej czerwonej i jednej pomarańczowej linii E-lab za pomocą żeńskich luerów.
    8. Wytnij dwadzieścia jeden kawałków 1 calowych, jeden kawałek 2 cale, trzy kawałki 3 cale i jeden 12-calowy kawałek rurki C-flex. Przymocuj żeński zadzior luer 1/8 cala i męskie złącze luer lock do końców jednego 3-calowego elementu i 12-calowego odcinka rurki. Do pozostałej rurki przymocuj męskie złącza luer lock na obu końcach. Elementy te będą składać się z zespołów drzew linii kanalizacyjnej i linii zasilającej.
  2. Montaż drzew linii kanalizacyjnej
    1. Postępuj zgodnie ze schematem 3D pokazanym na rysunku 3B , aby zmontować drzewo linii kanalizacji.
    2. Przymocuj odsłonięte końce czerwonej 2-stopniowej rurki E-lab (średnica wewnętrzna 1.14 mm) do zaciskowych męskich zamków luer na zmontowanym drzewie linii odpływowej. Podłącz je w kolejności rosnącej w oparciu o długość rurki C-flex dołączonej do 2-stopniowej rurki E-lab. Przymocuj 3-calową rurkę C-flex z żeńskim zadziorem luer 1/8 cala i męskim złączem luer lock do górnej części drzewa linii kanalizacyjnej.
  3. Zespół drzewa linii zasilającej
    1. Postępuj zgodnie ze schematem 3D pokazanym na rysunku 3A , aby zmontować drzewo linii zasilającej.
      UWAGA: Drzewa linii zasilającej nie zawierają złączy luer męsko-męskich stosowanych w drzewie linii kanalizacyjnej. Z naszego doświadczenia wynika, że złącza te są podatne na przeciekanie i mogą się łatwo poluzować, co zwiększa ryzyko zanieczyszczenia zarówno w komorach bioreaktora, jak i w butelkach z mediami. Aby temu zapobiec, drzewo linii zasilających jest skonstruowane bez tych komponentów.
    2. Przymocuj odsłonięte końce pomarańczowego 2-stopniowego przewodu E-lab (średnica wewnętrzna 0.89 mm) do zaciskowych męskich zamków luer na zmontowanym drzewie linii zasilającej. Przymocuj je w kolejności rosnącej w oparciu o długość rurki C-flex dołączonej do 2-stopniowej rurki E-lab. Przymocuj 12-calową rurkę C-flex do górnej części drzewa linii zasilającej.
  4. Kompletny montaż: Połącz przygotowane komponenty w system hodowli MBRA.
    1. Przymocuj rurkę C-flex o zmiennej długości na końcu drzewa linii zasilającej do bioreaktora, w kolejności rosnącej, przy czym najkrótsza linia znajduje się po lewej stronie paska bioreaktora, a najdłuższa po prawej.
    2. Przymocuj rurkę C-flex o zmiennej długości na końcu drzewa linii odpadowej do paska bioreaktora w kolejności malejącej, przy czym najdłuższa żyłka znajduje się po lewej stronie, a najkrótsza po prawej. Najkrótsza linia odpływowa znajduje się po prawej stronie pasa bioreaktora, ponieważ znajduje się najbliżej pompy odpadowej. Natomiast najdłuższy przewód zasilający znajduje się po prawej stronie, ponieważ pompa zasilająca znajduje się po lewej stronie (ilustracja 1).
  5. Sterylizacja zmontowanych macierzy: Przygotuj zmontowany system do sterylizacji.
    1. Zwiąż wszystkie przewody zasilające C-flex po lewej stronie MBRA i zabezpiecz opaską zaciskową. To samo należy zrobić z liniami odpływowymi po prawej stronie paska.
    2. Utwórz pętlę z pomarańczowym 2-stopniowym wężem E-lab między liniami C-flex. Zabezpiecz pętlę za pomocą taśmy autoklawu. Zrób to samo dla czerwonej rurki E-lab z 2 przystankami po stronie odpadowej paska bioreaktora. Pozwoli to zaoszczędzić miejsce podczas autoklawowania.
    3. Przykryj żeński łuźnik na końcu linii odpływowej i drzewa linii zasilającej kawałkiem folii, aby zapobiec zanieczyszczeniu po wyjęciu z autoklawu. Poluzuj luery z gwintem zewnętrznym z przegrodami w każdej komorze bioreaktora, aby umożliwić ucieczkę pary podczas autoklawowania.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby zapewnić możliwość wydostania się pary z bioreaktora podczas autoklawowania. Jeśli nie zostanie odpowiednio odpowietrzony, może dojść do pękania komór bioreaktora.
    4. Umieść MBRA w pojemniku na autoklaw i rozciągnij linię zasilającą i drzewa linii odpadowej do oddzielnych pojemników przylegających do pojemnika zawierającego MBRA. Jeśli rurka E-lab w pobliżu żeńskiego króćca luer 1/16 cala lub jakiekolwiek odcinki rurki C-flex zostaną zagięte podczas autoklawowania, rurka może się zatkać, utrudniając przepływ mediów lub odpadów.
    5. Autoklaw w temperaturze 121 °C, ≥ 15 psi przez 25 min. Używaj programu powolnego wydechu typowego dla cykli cieczy. Pozwól bioreaktorowi ostygnąć w temperaturze pokojowej po cyklu autoklawu. Po wystarczającym ostygnięciu MBRA ponownie dokręć gwintowane męskie luery za pomocą przegród.
      UWAGA: Autoklawowane paski bioreaktora stają się plastyczne i podatne na pękanie w przypadku ściśnięcia. Poczekaj, aż ostygnie wystarczająco dużo czasu przed dokręceniem złączek.
      UWAGA: Pomarańczowa 2-stopniowa rurka E-lab jest podatna na pękanie podczas procesu autoklawu i może oddzielić się od żeńskiego klinga luer 1/16 cala. Jeśli dojdzie do pękania, spryskaj oba końce 70% etanolem, a następnie odetnij pęknięty koniec sterylną brzytwą i ponownie przymocuj rurkę do zadzioru luer. Alternatywnie, dodatkowe rurki E-lab z dołączonymi żeńskimi luerami 1/16 cala można sterylizować osobno w torbie autoklawu, a całe rurki można wymienić.

3. Montaż nośników i pojemników na odpady

  1. Zespół butelki z mediami
    UWAGA: W niniejszym przykładzie cały system jest zasilany pojedynczą butelką o pojemności 2 litrów. Patrz rysunek 4A , aby zobaczyć obraz zespołu nakrętki butelki z nośnikiem.
    1. Przykręć adaptery Dibafit (adaptery do nakrętek do butelek) w dwa gwintowane porty na górze nakrętki butelki serii Q. Dodaj 3-calowy odcinek rurki C-flex do jednego z adapterów i 12-calowy odcinek rurki C-flex do drugiego. Na końcu każdej sekcji rurki dodaj męskie złącze luer lock.
      UWAGA: Długość rurki wymagana do dotarcia do drzewa linii zasilającej MBRA może się różnić i można ją odpowiednio dostosować.
    2. Wytnij 12-calowy kawałek rurki PTFE, aby służył jako słomka, z której pobierasz media. Odetnij koniec pod kątem 45° za pomocą żyletki, aby zapobiec zatykaniu się bocznej ścianki butelki. Włóż PTFE do małego otworu na spodzie nakrętki butelki połączonego z 12-calowym odcinkiem rurki C-flex.
    3. Wytnij 2-calowy kawałek rurki C-flex i przymocuj żeński zadzior luer do jednego końca, a męskie złącze luer lock do drugiego. Podłącz tę rurkę do 12-calowego odcinka rurki, który ostatecznie połączy się z drzewem linii zasilającej. Zabezpiecz 2-calowy kawałek za pomocą szczypcy. Umieść pętlę kurka wokół 3-calowej rurki nakrętki butelki. Będzie to służyć jako tymczasowy korek, aby zapobiec wyciekowi mediów podczas i po autoklawowaniu.
    4. Przygotuj żądany nośnik. Zamontuj w pełni zmontowaną nakrętkę butelki na butelce z pożywką. Owiń 12-calową rurkę C-flex wokół butelki i zabezpiecz koniec zaciskiem na 2-calowej rurce, jak opisano powyżej. Nie dokręcaj mocno nakrętki, ale raczej lekko ją poluzuj, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia podczas autoklawowania.
    5. Użyj folii, aby przykryć koniec 3-calowej rurki wychodzącej z nakrętki butelki. Autoklaw na czas odpowiedni do protokołu pożywki. Po sterylizacji zdejmij folię z 3-calowej rurki i wkręć filtr strzykawkowy 0,22 μm do męskiego złącza luer lock. Umożliwi to przepływ powietrza do butelki z pożywką podczas pompowania, ale zapobiegnie zanieczyszczeniu.
      UWAGA: Przed użyciem upewnij się, że nakrętki butelek serii Q są szczelnie zamknięte na butelkach, ponieważ niewłaściwe uszczelnienie może uniemożliwić prawidłowy przepływ.
  2. Montaż butelek na odpady: Aby uniknąć codziennej wymiany butelek na odpady, laboratorium stworzyło wielopoziomowy system zbiórki odpadów (rysunek 4B), który pozwala na napełnianie wielu butelek o pojemności 2 litrów odpadami podczas eksperymentu. Konfiguracja tego wielopoziomowego systemu postępowania z odpadami jest następująca:
    1. Wkręć adaptery zakrętki do butelki w dwa gwintowane porty na górze nakrętki butelki serii Q. Powtórz dla 2-4 nakrętek do butelek, w zależności od wymaganej liczby butelek do przechowywania odpadów.
    2. Wytnij 2-calowy kawałek PTFE na każdą nakrętkę butelki. Włóż ten element do wnętrza nakrętki butelki w otworze przeznaczonym do usuwania odpadów do następnej butelki w systemie.
    3. Przyciąć rurkę C-flex na tyle długą, aby rozciągała się między drzewem linii odpływowej wyrastającej z pompy a miejscem, w którym znajduje się system butelek na odpady. Zamontuj męskie złącze luer lock na końcu przylegającym do drzewa linii odpływowej i podłącz drugi koniec do adaptera nakrętki butelki bez rurki PTFE na nakrętce butelki.
    4. Wytnij drugą długość rurki C-flex, aby połączyć nakrętki na pierwszej i drugiej butelce na odpady. Przymocuj rurkę do adaptera nakrętki butelki ze słomką PTFE na pierwszej butelce i na adapterze nakrętki do butelki bez słomki z PTFE na drugiej butelce.
      UWAGA: Każda butelka w wielopoziomowej kaskadzie butelek na odpady musi być umieszczona powyżej pierwszej, aby grawitacja mogła wspomagać przepływ z jednej butelki do drugiej (Rysunek 4B). Zaleca się umieszczenie wszystkich butelek w dodatkowym pojemniku (np. otwartym plastikowym pojemniku do przechowywania) i ułożenie ich w kolejności malejącej za pomocą pionów, takich jak odwrócone pojemniki na ostre przedmioty.
    5. Kontynuuj ten łańcuch dla tylu butelek, ile chcesz. Na ostatniej butelce przymocuj 3-calowy segment rurki C-flex z męskim złączem luer lock do wolnego adaptera nakrętki butelki. Następnie podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml, aby zastosować próżnię i ułatwić kaskadę odpadów.

4. Połączenie, obsługa i demontaż MBRA

  1. Podłączanie do pomp
    1. Usuń taśmę autoklawu trzymającą razem rurki E-lab zarówno dla przewodów odpływowych, jak i zasilających. Rozwiąż wiązki węży C-flex.
    2. Umieść MBRA między dwiema pompami na górze płyty mieszającej. Można go zacisnąć na płycie za pomocą uchwytów wydrukowanych w 3D (patrz plik uzupełniający 2). Upewnij się, że jest wyrównany ze wskazanymi pozycjami mieszania na płytce mieszającej.
    3. Podłącz rurkę E-lab przewodu zasilającego do wkładów pompy perystaltycznej. Umieść ograniczniki rurki E-lab w szczelinach we wkładach. Zrób to samo dla rurki E-lab przewodu odpływowego na pompie po prawej stronie płytki mieszającej.
    4. Zablokuj wkłady pompy perystaltycznej w pompie. Upewnij się, że wkłady są całkowicie osadzone na pompie, a rurka znajduje się wewnątrz kanału wkładów.
      UWAGA: Wkłady należy zablokować na pompach tylko wtedy, gdy zamierza się rozpocząć przepływ w ciągu 24 godzin. W przypadku pozostawienia zaciśniętych bez przepływu mediów przez okres dłuższy niż 24 godziny, rurki mogą zostać ściśnięte i zatkane. Jeśli tak się stanie, po prostu zdejmij zacisk i delikatnie masuj rurkę w miejscu ucisku.
    5. Uporządkuj rurki C-flex za pomocą uchwytów na probówki wydrukowanych w 3D (plik uzupełniający 3).
    6. Przymocuj koniec drzewa linii odpływowej do rurki prowadzącej do butelek na odpady.
      UWAGA: W przypadku uruchamiania wielu MBRA, drzewa linii odpływowej będą musiały zostać rozwidlone razem przed przymocowaniem do rurki prowadzącej do butelek na odpady. Można to zrobić, tworząc proste drzewo rozgałęzień dla każdego dodatkowego MBRA.
    7. Podłącz żeński luer na rurce wejściowej przewodu zasilającego do męskiego złącza na 12-calowej rurze z nakrętki butelki z mediami.
      UWAGA: W tym momencie oba końce powinny być sterylne. Unikaj dotykania ich potencjalnym źródłem zanieczyszczenia. Jeśli podejrzewa się zanieczyszczenie, namocz każdy koniec w 10% wybielaczu przez 10 minut przed podłączeniem.
    8. Włącz obie pompy, aby rozpocząć przepływ mediów. Upewnij się, że pompy płyną we właściwym kierunku (obie ustawione zgodnie z ruchem wskazówek zegara ("CW"), jeśli odpady znajdują się po prawej stronie pomp).
    9. Obserwuj wielkość i częstotliwość kropelek pożywki wpadających do każdej komory bioreaktora; Wszelkie duże różnice w tym zakresie mogą wskazywać na zmienność natężenia przepływu. W przypadku zaobserwowania zmienności zaleca się wymianę pomarańczowego 2-stopniowego przewodu zasilającego E-lab podłączonego do komory uszkodzonego bioreaktora. Pomoże to ograniczyć zmienność natężenia przepływu w serii eksperymentalnej.
      UWAGA: Nadszedł czas, aby zdiagnozować i naprawić wszelkie nieszczelności w systemie, dlatego uważnie monitoruj proces początkowego napełniania.
    10. Gdy komory bioreaktora osiągną pojemność, wyłącz obie pompy i pozwól bioreaktorom siedzieć przez 24-48 godzin. Ten krok jest niezbędny, aby sprawdzić, czy w komorach nie ma potencjalnego zanieczyszczenia przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Inokulacja MBRA
    UWAGA: Tutaj opisujemy podstawowy protokół sterylizacji przegród i wstrzykiwania inokulum.
    1. Przygotuj inokulum zgodnie z pożądanymi specyfikacjami.
    2. Nałóż świeżo przygotowany 10% roztwór wybielacza na wierzch przegrody w każdej komorze bioreaktora za pomocą plastikowego zakraplacza. Umieść wystarczającą ilość wybielacza, aby całkowicie pokryć górną część przegrody. Pozostaw na 10 minut. Osusz przegrodę za pomocą sterylnej chusteczki laboratoryjnej.
    3. Za pomocą igły o długości 3 cali 22 G i strzykawki zawierającej próbkę, przekłuć środek przegrody. Upewnij się, że igła dotyka podłoża wewnątrz komory, a następnie wstrzyknij inokulum do komory bioreaktora. Przepłukać strzykawkę, usuwając pożywkę i ponownie wstrzykując ją z powrotem do komory. Usuń igły z przegrody i wyrzuć je do pojemnika na ostre przedmioty.
    4. Pozwól inokulum rosnąć przez odpowiedni okres, w oparciu o projekt doświadczalny, przed rozpoczęciem przepływu. Na przykład zbiorowiska bakterii kałowych wymagają początkowego wzrostu partii trwającego 4-16 godzin, aby zwiększyć wystarczającą ilość biomasy8.
    5. Włącz obie pompy na żądane natężenie przepływu, w zależności od wymaganego czasu obrotu. Więcej informacji na temat natężeń przepływu można znaleźć w instrukcji obsługi pompy perystaltycznej.
      UWAGA: Niezależnie od pożądanego natężenia przepływu, pompa odpadowa powinna zawsze pracować z większą prędkością niż pompa mediów, aby zapewnić, że komory bioreaktora nie przepełnią się. Do hodowli bakterii przewodu pokarmowego stosujemy szybkość obrotu 1,92 ml/h, którą osiąga się poprzez ustawienie pompy mediów na 1,0 obr./min, a pompy odpadowej na 2,0 obr./min.
    6. Ponownie, obserwuj wielkość i rytm kropelek mediów wpadających do każdej komory bioreaktora, wszelkie duże różnice w tym zakresie mogą wskazywać na zmienność natężenia przepływu. W przypadku zaobserwowania zmienności zaleca się wymianę wszystkich pomarańczowych 2-stopniowych przewodów zasilających E-lab podłączonych do komory uszkodzonego bioreaktora. Pomoże to ograniczyć zmienność natężenia przepływu w seriach eksperymentalnych.
  3. Próbkowanie MBRA
    1. Nałóż 10% roztwór wybielacza na wierzch przegrody na każdej komorze bioreaktora, wystarczająco dużo, aby całkowicie pokryć powierzchnię. Pozostaw na 10 minut. Po 10 minutach osusz przegrodę za pomocą sterylnej chusteczki laboratoryjnej.
    2. Za pomocą igły i strzykawki o długości 3 cali i rozmiarze 22 przekłuj środek przegrody i całkowicie włóż igłę do komory bioreaktora. Trzymając strzykawkę, pociągnąć tłok do tyłu, aby wyjąć próbkę z komory.
      UWAGA: Unikaj jednorazowego usuwania więcej niż 20% całkowitej objętości komory bioreaktora. Usunięcie większej ilości może zakłócić społeczność mikrobiologiczną, ponieważ odpływ odpadów jest przerywany do momentu, gdy świeże media ponownie wypełnią komorę do poziomu słomy odpadowej PTFE.
    3. Wyjąć igłę i przelać próbkę do odpowiedniego pojemnika. Wyrzuć igłę do pojemnika na ostre przedmioty.
  4. Demontaż i renowacja MBRA
    UWAGA: Po eksperymentach MBRA będzie musiała zostać wysterylizowana i przygotowana do przyszłych eksperymentów.
    1. Zamień wejście nośnika na 1 l 10% wybielacza w wodzie dejonizowanej (DI). Zwiększ natężenie przepływu na obu pompach do maksimum, aby wyprzeć zawartość komór bioreaktora z roztworem wybielacza.
    2. Gdy komory staną się czyste (wszystkie media zostały zastąpione wybielaczem), odwróć MBRA, aby zdezynfekować powyżej linii napełnienia przez 5 minut. Po 5 minutach należy wyrównać pasek i odczekać dodatkowe 5 minut na sterylizację.
      UWAGA: Nie pozwól, aby wybielacz siedział dłużej niż 10 minut, jak opisano powyżej, ponieważ spowoduje to odbarwienie plastiku i osłabienie mediów i rurek odpływowych.
    3. Zastąp 10% roztwór wybielacza 1 litrem wody DI. Przepłucz system wodą DI, aż cała woda przejdzie. Odłącz rurki E-lab bioreaktora od pomp i wyjmij MBRA.
    4. Aby odnowić, usuń zużyte przegrody i wszystkie oprócz 1 ml wody z każdej komory.
    5. Wymień przegrody i pomarańczową rurkę E-lab z 2 przystankami i postępuj zgodnie z poprzednimi krokami, aby przygotować się do autoklawowania (kroki od 2.5.1 do 2.5.5) do 3 razy. Po trzecim ponownym użyciu MBRA należy całkowicie zdemontować, rurkę C-flex wymienić, a każdą pojedynczą część wysterylizować 70% EtOH lub wymienić, jeśli jest uszkodzona. Żywica epoksydowa zawierająca odpady i zasilająca PTFE stanie się krucha po kilku cyklach autoklawu i będzie musiała zostać ponownie nałożona.
      UWAGA: Pomarańczowa 2-stopniowa rurka E-lab jest wymieniana między każdym przebiegiem, aby ograniczyć zmienność natężenia przepływu spowodowaną zużyciem i powtarzającymi się cyklami autoklawu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ułatwić rozwój bakterii beztlenowych, takich jak te znajdujące się w przewodzie pokarmowym, MBRA można skonfigurować i obsługiwać w komorach beztlenowych. Aby zademonstrować zdolność do hodowli złożonych zbiorowisk bakteryjnych bezpośrednio z odpowiednich miejsc w ludzkim ciele, przygotowano próbkę kału ludzkiego i wyhodowano ją w tym systemie. Wszystkie prace przeprowadzono w komorze beztlenowej ustawionej na 37°C, a kultury hodowano w naszym bioreaktorze BRM37.

Gnojowicę kałową przygotowano przez beztlenowe rozmrożenie ludzkiego stolca, a następnie zmieszanie z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 25% w/v. Po potwierdzeniu sterylności, dziewięć komór bioreaktora zaszczepiono po 3 ml tej samej gnojowicy kałowej. Zbiorowiska mikrobiologiczne hodowano przez noc bez użycia pożywki i usuwania odpadów, w wyniku czego przez 16 godzin prowadzono oddzielne kultury wsadowe. Następnie włączono pompy zasilające i ustawiono je na natężenie przepływu 1,92 ml na godzinę. Po czterech dniach ciągłego przepływu próbki pobrano z bioreaktorów i przeanalizowano je pod kątem składu zbiorowiska drobnoustrojów przy użyciu sekwencjonowania genu 16S rRNA, a następnie odszumiania za pomocą Deblur i klasyfikacji taksonomicznej z bazą danych SILVA 138 SSU w QIIME 213. We wszystkich dziewięciu powtórzeniach wykryto łącznie 65 rodzajów, ale bioreaktory były zdominowane tylko przez 18 rodzajów, z których każdy zawierał co najmniej 2% liczebności w każdej z dziewięciu kontrprób (ryc. 5). Bioreaktory wykazały wysoką odtwarzalność, tak że 22 z 65 rodzajów wykryto we wszystkich dziewięciu powtórzeniach, a dodatkowe 17 rodzajów wykryto w co najmniej połowie powtórzeń. Większość rodzajów nieobecnych w co najmniej jednym reaktorze (37 z 43 rodzajów) to gatunki rzadkie, z których każdy ma względną liczebność poniżej 2% w bioreaktorach. Podsumowując, kultury MBRA o ciągłym przepływie wspierały złożone, powtarzalne zbiorowiska drobnoustrojów pochodzących z tej samej próbki kału, nawet po oddzielnych hodowlach wsadowych przez 16 godzin w każdej komorze bioreaktora.

figure-results-1
Rysunek 1: Matryca minibioreaktorów (MBRA). W pełni zmontowany MBRA, w tym etykiety na drzewo rur linii zasilającej i kanalizacyjnej, komory bioreaktora i pas bioreaktora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przewodnik po wytrawianiu PTFE i układ portów MBRA. (A) Schemat blokowy do naśladowania dla wytrawiania mediów i odpadów słomek PTFE. (B) Każda komora bioreaktora zawiera port na słomkę z pożywką + gwintowany męski luer, odpadowy słomę + gwintowany męski luer i przegrodę + gwintowany męski luer. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Drzewa linii zasilających i odpadowych MBRA. Reprezentatywne obrazy do naśladowania podczas montażu (A) drzewa linii zasilającej i (B) drzewa linii ścieków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: System nakrętek do butelek z nośnikami i systemu poziomów odpadów. (A) Przykład zmontowanej nakrętki do butelki serii Q używanej do wciągania mediów do MBRA. (B) Obraz wielopoziomowego systemu zbierania odpadów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Względna liczebność rodzajów bakterii. (A) Skumulowany wykres słupkowy przedstawia względną liczebność wszystkich rodzajów, które zawierają co najmniej 2% liczebności w którejkolwiek z wyświetlanych próbek. (B) Wskaźniki różnorodności alfa obserwowanych OTU i różnorodności Shannona między wszystkimi dziewięcioma komorami bioreaktora. Wszystkie dziewięć komór bioreaktora zostało zaszczepionych tą samą gnojowicą kałową przygotowaną z ludzkiego kału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Składowe MBRA. Zdjęcia i opisy wszystkich poszczególnych części wymaganych do pełnego montażu MBRA, wraz z ilością potrzebną dla każdego komponentu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów. Typowe problemy napotkane podczas uruchamiania MBRA wraz z ich potencjalnymi przyczynami i zalecanymi rozwiązaniami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Plik Stl do drukowania 3D pasków Minibioreactor Array. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik Stl do drukowania 3D uchwytów bioreaktorów używanych do zakotwiczania bioreaktorów do płytek mieszających. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3.: Plik Stl do drukowania 3D uchwytów rur używanych do organizowania rur odpływowych C-flex i rurek zasilających wychodzących z MBRA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje kompletny montaż i podstawową obsługę macierzy minibioreaktorów (MBRA) do wysokowydajnej hodowli społeczności bakteryjnych, wprowadzając kilka kluczowych udoskonaleń do wcześniej opublikowanej metody. System MBRA pozostaje wszechstronnym i opłacalnym narzędziem, które umożliwia naukowcom hodowlę złożonych ekosystemów mikrobiologicznych przy jednoczesnym wspieraniu wielu replik eksperymentalnych. W tej zaktualizowanej wersji wprowadzamy ulepszenia, które zwiększają odtwarzalność, usprawniają przepływ pracy i zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia. Należą do nich chemicznie trawione słomki PTFE (rysunek 2), aby zapobiec odklejaniu, słomka zasilająca na linii mediów (rysunek 2) w celu zminimalizowania tworzenia się biofilmu, znormalizowane długości rurek z dołączonym uchwytem na rurki wydrukowanym w 3D (plik uzupełniający 3) dla bardziej kompaktowej i zorganizowanej konfiguracji oraz zoptymalizowany protokół ponownego użycia, który eliminuje potrzebę pełnego demontażu między eksperymentami. Łącznie te udoskonalenia stanowią iteracyjne ulepszenia opracowane dzięki szerokiemu wykorzystaniu systemu MBRA w różnych zastosowaniach eksperymentalnych w naszym laboratorium. Odnosząc się zarówno do krytycznych etapów montażu, jak i praktycznych ulepszeń, dyskusja ta podkreśla użyteczność MBRA jako stale rozwijającego się systemu modelowego do badań nad mikrobiomem.

Sukces systemu MBRA zależy w dużej mierze od precyzyjnego montażu i sterylizacji komponentów w celu zapewnienia pracy bez zanieczyszczeń. Kluczowe kroki obejmują prawidłowy montaż nasadek, przewodów i złączy serii Q, które ułatwiają montaż modułowy i umożliwiają wprowadzanie mediów oraz zbieranie odpadów. Zapewnienie szczelnego uszczelnienia między butelkami z mediami, zbiornikami na odpady i komorami bioreaktora ma zasadnicze znaczenie dla zapobiegania wyciekom i utrzymania sterylnych warunków. Kolejnym krytycznym krokiem jest weryfikacja natężenia przepływu pompy perystaltycznej przed eksperymentami, ponieważ niespójności mogą prowadzić do nierównomiernego dostarczania pożywki i mogą wpływać na dynamikę wzrostu drobnoustrojów. Większość wielokanałowych pomp perystaltycznych wykorzystujących kasety zawiera mechanizm regulacji okluzji, który powinien być używany do precyzyjnego dostrojenia natężenia przepływu każdego kanału. Nawet przy prawidłowej kalibracji rurki E-lab pozostają głównym źródłem zmienności. Aby temu zapobiec, ważne jest wizualne monitorowanie częstotliwości i wielkości kropel pożywki wchodzących do każdej komory bioreaktora zarówno podczas początkowego napełniania, jak i na początku eksperymentów. Te kontrole wizualne pozwalają na wczesne wykrycie niespójności natężenia przepływu, które w przeciwnym razie mogłyby zagrozić odtwarzalności eksperymentalnej. Tabela 2 zawiera strategie rozwiązywania typowych problemów napotkanych podczas montażu i użytkowania MBRA. Te kroki rozwiązywania problemów zapewniają powtarzalność między eksperymentami i zapobiegają zakłóceniom podczas długotrwałej uprawy.

Pomimo swoich mocnych stron, system MBRA ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów. W przeciwieństwie do bardziej zaawansowanych systemów, MBRA nie ma możliwości aktywnego monitorowania, takich jak pomiary gęstości optycznej (OD) w czasie rzeczywistym, kontrola pH i regulacja temperatury. Ten brak aktywnego pomiaru ogranicza zdolność systemu do monitorowania dynamicznych zmian we wzroście drobnoustrojów i aktywności metabolicznej w czasie rzeczywistym. Ponadto, chociaż system obsługuje uprawę beztlenową w komorach, nie obejmuje zintegrowanej kontroli gazów, co może ograniczać zastosowania wymagające precyzyjnych środowisk mikroaerofilowych lub wzbogaconych w CO2 . W przypadku badań wymagających takiej kontroli bardziej odpowiednie mogą być alternatywne systemy z wbudowaną regulacją gazu.

System MBRA oferuje kluczowe zalety w porównaniu z istniejącymi modelami bioreaktorów, w tym wysoką przepustowość, skalowalność i opłacalność, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do hodowli złożonych społeczności bakteryjnych w ciągłym przepływie, aby naśladować dynamiczne środowiska, takie jak ludzki przewód pokarmowy 6,8,10. Jego kompaktowa, modułowa konstrukcja pozwala na jednoczesną pracę wielu bioreaktorów, dzięki czemu idealnie nadaje się do badań wysokoprzepustowych, takich jak badania przesiewowe społeczności pochodzących z kału pod kątem odporności na inwazję patogenów9. Ta modułowa konstrukcja zapewnia dużą elastyczność eksperymentalną: każdy pasek może być zasilany przez pojedynczą butelkę z pożywką, jak pokazano w tym protokole, lub przez maksymalnie sześć różnych źródeł pożywki, po jednym na każdą komorę bioreaktora. Objętość robocza zależy od długości cienkiej słomy odpadowej PTFE włożonej do króćca odpływowego każdej komory, która określa wysokość cieczy; w tym protokole słomki o średnicy 25 mm utrzymują objętość roboczą 15 ml, ale objętości w zakresie 1-20 ml można osiągnąć poprzez przycinanie lub wydłużanie słomki. Dodatkowo krótsze słomki paszowe są wkładane do wlotu mediów, aby skierować dopływ w kierunku podstawy komory, zapobiegając spływaniu mediów po ściankach komory i zmniejszając tworzenie się biofilmu powyżej linii napełniania. Prędkości pompy lub średnicę przewodów pompy można również regulować, aby zmienić szybkość obrotu systemu. Do tej pory system MBRA był szeroko stosowany do badania zmian funkcjonalnych i składowych społeczności drobnoustrojów w odpowiedzi na różne czynniki, w tym antybiotyki10, leki przeciwnowotworowe14 i różne związki dietetyczne 12,15,16,17 . Prosta, modułowa konstrukcja sprawia, że idealnie nadaje się do adaptacji do różnych potrzeb eksperymentalnych. Na przykład MBRA został zmodyfikowany do badania biofilmów w warunkach podobnych do chemostatu18, co dowodzi jego wszechstronności w badaniach ekologii drobnoustrojów poza kulturami planktonu.

Przyszłe wersje systemu MBRA mogą skorzystać z dodatkowych ulepszeń inżynieryjnych, które zwiększą jego funkcjonalność, precyzję i potencjał przepustowości. Jednym z takich ulepszeń jest włączenie dodatkowych portów do każdej komory bioreaktora. Porty te mogą być wykorzystywane do wspomagania aktywnego monitorowania parametrów środowiskowych, takich jak pH, temperatura, gaz czy gęstość optyczna. Rozwiązałoby to jedno z najważniejszych ograniczeń modelu, umożliwiając informacje zwrotne i monitorowanie w czasie rzeczywistym. Ulepszenia geometrii komory lub portu mogą ułatwić dokładniejsze i bardziej dostępne czyszczenie, zmniejszając gromadzenie się pozostałości i przebarwienia oraz poprawiając długoterminową możliwość ponownego użycia. Integracja dodatkowych pomp perystaltycznych z programowalnymi timerami pozwoliłaby na pulsacyjne lub dobowe wprowadzanie mediów, lepiej symulując środowiska związane z gospodarzem, takie jak cykle żywieniowe w ludzkim jelicie. Wreszcie, druk 3D z alternatywnych materiałów, takich jak odporne chemicznie, autoklawowalne polimery, może pozwolić na większą trwałość i kompatybilność z szerszą gamą odczynników. Razem te ulepszenia mogą znacznie rozszerzyć eksperymentalny zakres i wierność platformy MBRA.

Podsumowując, MBRA zapewnia potężną, wysokowydajną platformę do hodowli i badania społeczności mikrobiologicznych w kontrolowanych warunkach. Chociaż ma ograniczenia w aktywnym monitorowaniu i kontroli pH, jego elastyczność, skalowalność i opłacalność sprawiają, że jest nieocenionym narzędziem dla szerokiego zakresu badań mikrobiologicznych, szczególnie tych wymagających wysokiej powtarzalności i przepustowości eksperymentalnej. Co ważne, modułowa konstrukcja i podejście do produkcji systemu sprawiają, że jest on z natury elastyczny; Naukowcy mają i mogą nadal dostosowywać MBRA do szerokiego wachlarza celów eksperymentalnych. Ta zdolność adaptacji zapewnia, że MBRA może nadal ewoluować wraz z pojawiającymi się pytaniami naukowymi i technologiami, zachowując swoje znaczenie jako wszechstronna platforma do badań nad mikrobiomem.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez NIH T32 Molecular Basis of Infectious Disease Predoctoral Fellowship, NIH T32DK007664 oraz NIH U19AI157981 Microbiome Discovery and Mechanisms to Combat Antibiotic Resistance at Mucosal Surfaces.

Autorzy dziękują Haydenowi Curnynowi za jego wkład w projektowanie i produkcję uchwytów bioreaktorów i uchwytów rurek stosowanych w tym systemie.

Rysunek 2 i rysunek 3 zostały częściowo utworzone w https://BioRender.com

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Prowadnica V-Tap, standardowe rozmiary od 0-80 do 5/8"Narzędzia Big GatorSTD500NP 
0,22 &m; M Filtr strzykawkowyRybakSLGVR33RS
Napęd mieszający 2mag MIXdrive 60 (tylko napęd)Magazyn 2MAGMF 41060
Igły podskórne Air-tite, 22G x3"Firma VWR89219-274
BD 1mL Sterylne strzykawki z końcówką ślizgową SterylneRybak14-823-434
BioreaktorProto-Labs (Proto-Labs)NIEWydrukowano w 3D z tworzywa sztucznego DMS Somos Watershed. Zobacz plik uzupełniający 1 dla szablonu
Uchwyty do bioreaktorówProto-Labs (Proto-Labs)NIEWydrukowano w 3D z PA 12 Black. Zobacz plik uzupełniający 2 dla szablonu.
Zakrętka do butelki z rozpuszczalnikiem Diba Omnifit Q-Series, GL38/38-430 (szkło), 2 porty UNF(F) bez zaworów, niebieskaCole'a ParmeraEW-21942-86
Rurka Diba Omnifit, PTFE, 1/8" (3,2 mm) średnicy zewnętrznej x 1,5 mm średnicy wewnętrznejCole'a ParmeraEW-21942-76
Adapter Dibafit, 1/4"-28 UNF(M) płaskie dno do 3,2 mm średnica wewnętrzna, PEEKCole'a ParmeraEW-21941-49
IRWIN 12001ZR Klucz do gwintowników #0-1/4" Rękojeść TAmazonkaB00004YOB0
Irwin Hanson Gwintownik frakcji SAE ze stali wysokowęglowej 1/4 cala. 1 szt.Zoro powiedział:G7695682
Loctite Heavy Duty Epoxy Quick Set 8-płynowa butelka o uncjiAmazonkaB0044F59N0
Złącze męsko-męskie Luer LockMikrofluidyka DarwinaDM-MM-LUER-PP Alternatywa: Strategic Applications Inc Złącze Luer męskie na męskie - 10/opk - Fisher - NC9876577
Złączki adaptera Masterflex, Luer na Luer, Nylon, AvantorFirma VWRMFLX45502-56
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, żeńska adapter luer na króciec węża, 1/16" IDFirma VWRMFLX45502-00
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, żeńska adapter luer do króćca węża, średnica wewnętrzna 3/32"Firma VWRMFLX45502-02
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, żeńska Adaptery Luer do króćca węża, 1/8"Firma VWRMFLX45502-04
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer Lock do adaptera kolczastego węża, 1/8Firma VWRMFLX45505-04
Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer x 1/4-28 UNFFirma VWRMFLX45505-82
Złączka Masterflex, polipropylen, kolanko, przejściówka typu luer na złączkę męskąFirma VWRMFLX45508-26
Przewód pompy Masterflex Ismatec, 2-stopowy, Tygon S3 E-Lab, średnica wewnętrzna 0.89 mmFirma VWRMFLX96460-26
Przewód pompy Masterflex Ismatec, 2-punktowy, Tygon S3 E-Lab, średnica wewnętrzna 1.14 mmFirma VWRMFLX96460-30
Masterflex® Rurka przesyłowa, C-Flex, nieprzezroczysta biała, 1/8" ID x 1/4" OD; 25 stópFirma VWRMFLX06424-67
Mohr' powiedział: s Szczypta do rurek Firma VWR470201-374
Podkładki błotników z gumy neoprenowej ½ ” OD x ¼ ” Średnica wewnętrzna x 1/16" Grubość AmazonkaB01A29F1R0
Precyzyjna uszczelka gumowa septaSigma AldrichZ553905
Spinbar Micro Stir BaryFirma VWR58948-375
Tetra-EtchFirma R.S. HughestTE-500
Uchwyt na rurkiProto-Labs (Proto-Labs)NIEWydrukowano w 3D z PA 12 Black. Zobacz plik uzupełniający 3 dla szablonu.
Wielokanałowa pompa kasetowa Watson-Marlow 205SWatsona-Marlowa020.3724.00AAlternatywa: Cyfrowe pompy perystaltyczne Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 lub Pompa perystaltyczna Masterflex Ismatec IPC, 0,1 do 11,25 obr./min, 24-kanałowa, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).">Gilbert, J. A., et al. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).
  2. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).">Sarkar, S., et al. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).
  3. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).">Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).
  4. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).">McDonald, J. A. K., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  5. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).">Feria-Gervasio, D., Denis, S., Alric, M., Brugère, J. F. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).
  6. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
  7. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).">Robinson, C. D., Auchtung, J. M., Collins, J., Britton, R. A. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).
  8. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).
  9. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).">Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).
  10. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).">Hobson, C. A., et al. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).
  11. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).">Auchtung, T. A., Lerma, A. I., Schuchart, K., Auchtung, J. M. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).
  12. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).">Naimi, S., Viennois, E., Gewirtz, A. T., Chassaing, B. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).
  13. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).">Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
  14. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).">Hobson, C. A., et al. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).
  15. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).">Jensen, N., et al. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).
  16. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).">Ghimire, S., et al. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).
  17. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).">Hu, W., et al. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).
  18. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).">Jens, J. N., et al. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Minibioreactor ArrayGut MicrobiomeMicrobial CommunitiesContinuous Flow CultureIn Vitro Gut ModelHigh Throughput CultivationMicrobiome ResearchBioreactor AssemblyMicrobial Community AnalysisColonization Resistance

Related Articles