Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET), wytwarzane przez aktywowane neutrofile po zakażeniu bakteryjnym, a także w niezakaźnych fizjologicznie prawdopodobnych warunkach, uwalniają zdekondensowane DNA i białka, takie jak histony, mieloperoksydaza (MPO) i elastaza neutrofilowa¹. Ponieważ składniki te mogą demontować komórki i tkanki brzeżne, powodując uporczywy stan zapalny, tworzenie NET stało się czynnikiem sprawczym w inicjowaniu i postępie różnych ostrych i przewlekłych chorób, w tym reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycy, cukrzycy, choroby Alzheimera, przerzutów raka i chorób sercowo-naczyniowych². Analizy histologiczne zmian naczyniowych człowieka w miażdżycy³ i tętniaku aorty brzusznej⁴ wykazały kolokalizację nacieku neutrofili i tworzenia NET. W krążącej krwi poziomy markerów NETs, takich jak cytrulinowane histony, NET-DNA i MPO, wzrastają wraz z ciężkością choroby wieńcowej⁵. We wczesnych stadiach miażdżycy tworzenie NET często poprzedza akumulację lipidów, która zachodzi poprzez tworzenie komórek piankowatych^przez makrofagi ^6,7. Zjawiska te silnie sugerują, że MPO i enzymy proteolityczne uwalniane zewnątrzkomórkowo podczas tworzenia NET mogą działać nie tylko na tkanki naczyniowe, ale także na składniki krwi, takie jak lipoproteiny. Lipoproteiny to delikatne kompleksy lipidowo-białkowe, które mogą zostać uszkodzone przez białka pochodzące z NET, takie jak MPO⁸; w związku z tym tworzenie NET może powodować zmiany strukturalne i biochemiczne w lipoproteinach, wpływając w ten sposób na homeostazę naczyń. Jednak synergiczny wpływ tworzenia NET i lipoprotein na dysregulację i reakcje zapalne wywołane przez komórki naczyniowe pozostaje niejasny.

W tym artykule przedstawiono metodę badania odpowiedzi komórkowych ludzkich komórek śródbłonka naczyń krwionośnych indukowanych przez leczenie NET przygotowanymi z komórek podobnych do neutrofili pochodzących z HL-60 i lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) frakcjonowanych z ludzkiego osocza. Reprezentatywne wyniki wskazują na frakcjonowanie LDL z ludzkiego osocza za pomocą ultrawirowania oraz odpowiedzi komórkowe ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC) stymulowanych NET po jednoczesnej inkubacji z LDL. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniu komórek naczyniowych z udziałem innych lipoprotein.

Protokół przygotowania LDL został zatwierdzony przez komisję bioetyczną Szkoły Farmacji Uniwersytetu Medycznego Showa (nr 231). Pisemną świadomą zgodę uzyskano zgodnie z Deklaracją Helsińską, a wszyscy uczestnicy dobrowolnie złożyli swoje podpisy pod wnioskiem o udział w tym badaniu. Komórki manipulowano w sposób aseptyczny za pomocą okapu z przepływem laminarnym. Kryterium włączenia był przedział wiekowy 22-65 lat. Kryteria wykluczenia obejmowały nawyki palenia, istniejące wcześniej choroby sercowo-naczyniowe (takie jak choroba niedokrwienna serca, udar mózgu i choroby tętnic obwodowych), ciężką dysfunkcję wątroby i niekontrolowane stany przewlekłe, w tym cukrzycę, nadciśnienie, dyslipidemię, ciężkie choroby zapalne i nowotwory. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja LDL z ludzkiego osocza

1. Pobrać pełną krew od zdrowego ochotnika w obecności heparyny przeciwzakrzepowej (10 jednostek/ml).
2. Odwirować 45-50 ml ludzkiej krwi pełnej otrzymanej w probówce z heparyną (700 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C). Upewnij się, że powoli zmniejszasz prędkość wirówki. Zebrać górną warstwę zawierającą frakcję osocza.
3. Przeprowadzić dwukrotne odwirowanie (700 × g, 15 minut w temperaturze 4 °C) przy tym samym ustawieniu opóźnienia, co w kroku 1.2 w celu wyeliminowania krwinek. Dodaj 1:1,000 objętości 250 mM EDTA (pH 7,4), aby zapobiec utlenianiu lipoprotein za pośrednictwem jonów metali dwuwartościowych.
4. Umieścić 2,7 ml osocza w probówce z poliwęglanu o pojemności 4 ml (4 szt.), nałożyć na 900 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 250 μM EDTA (PBS/EDTA) i ultrawirować (600 000 × g, 7 min w temperaturze 4 °C).
5. Wyrzuć 900 μl wierzchniej warstwy, aby wyeliminować chylomikron. Ułóż 900 μl PBS/EDTA na osoczu i ultrawirówce (600 000 × g, 2,5 h w temperaturze 4 °C).
6. Odrzuć 900 μl wierzchniej warstwy, aby wyeliminować lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Ten krok jest ważny, aby zapobiec zanieczyszczeniu LDL innymi frakcjami lipoprotein.
7. Dodać 540 μl roztworu o stężeniu 0,5 g/ml KBr, aby dostosować gęstość do d = 1,063, a następnie delikatnie wymieszać pipetą, a następnie ultrawirować (600 000 x g, 2,5 h w temperaturze 4 °C).
8. Zebrać 540 μl wierzchniej warstwy zawierającej LDL. Żółto-pomarańczowa warstwa wskazuje na udaną separację LDL⁹. Przenieść do membrany dializowej.
9. Trzykrotnie dializować frakcję LDL w stosunku do 2 l PBS/EDTA w temperaturze 4 °C w ciemności, aby wyeliminować KBr.
10. Przed użyciem przechowywać LDL w temperaturze 4 °C w ciemności.

2. Przygotowanie studzienek pokrytych poli-L-lizyną lub żelatyną

1. Przygotuj 0,01% roztwór poli-L-lizyny¹⁰ , rozcieńczając 0,1% roztwór poli-L-lizyny sterylną wodą, a następnie przefiltruj sterylnym filtrem 0,2 μm. Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Dodać 152 μl/basenik 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka na 12-dołkowej płytce i inkubować przez co najmniej 5 minut.
3. Usunąć roztwór, a następnie przemyć raz 200 μl/studzienkę sterylnej wody i suszyć przez co najmniej 2 godziny.
4. Przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem do przygotowania NET.

3. Przygotowanie studzienek pokrytych żelatyną

1. Przed użyciem przygotuj 0,1% roztwór żelatyny, rozcieńczając 2% roztwór żelatyny sterylną wodą.
2. Dodać 152 μl/basenik 0,1 % roztworu żelatyny do każdego dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować przez co najmniej 5 minut¹¹.
3. Usunąć roztwór, a następnie przemyć raz 200 μl/studzienkę sterylnej wody i suszyć przez co najmniej 2 godziny.
4. Przed użyciem przechowywać w temperaturze pokojowej.

4. Utrzymanie i przygotowanie ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC)

1. Hodowla pierwotnych HAEC w niepowlekanej kolbie hodowlanej przy użyciu kompletnego podłoża zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów, 20 ng/ml insulinopodobnego czynnika wzrostu, 0,5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, 1 μg/ml kwasu askorbinowego, 22,5 μg/ml heparyny i 0,2 μg/ml hydrokortyzonu, zgodnie ze wskazaniami w instrukcji producenta. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż komórki zlewają się w 70%-80%.
2. W celu stymulacji wysiewaj HAEC na 12-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do osiągnięcia zbiegu. Przeprowadź eksperyment między fragmentami 4 i 7.

5. Przygotowanie komórek neutrofilopodobnych pochodzących z HL-60, a następnie NET

1. Utrzymuj komórki HL-60 za pomocą pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 5% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny, używając naczyń niepoddanych działaniu substancji.
2. W celu przygotowania komórek obojętnopodobnych pochodzących z HL-60 należy hodować od 2 × 10⁶ komórek na 10 ml komórek HL-60 przez 4 dni w pożywce RPMI-1640 zawierającej 2 μM kwas all-trans-retinowy (AtRA).

6. Przygotowanie sieci NET z LDL

1. Pobrać komórki HL-60 4 dni po leczeniu 2 μM AtRA. Po różnicowaniu komórek HL-60 w komórki podobne do neutrofili, komórki stają się mniejsze.
2. Odwirować komory (220 × g, 4 min w temperaturze 18-22 °C). Odessać supernatant i przemyć komórki równą objętością RPMI-1640 bez surowicy.
3. Odwirować komórki (220 × g, 4 min w temperaturze 18-22 °C), a następnie ponownie zawiesić komórki za pomocą RPMI-1640 bez surowicy.
4. Policz komórki, a następnie ponownie zawieś komórki do 2 × 10⁶ komórek/ml w RPMI-1640 bez surowicy i zamieść 0,5 ml zawiesiny komórek w dołkach 12-dołkowej płytki wstępnie pokrytej poli-L-lizyną. Hodowla przez co najmniej 30 minut.
5. Dodać 100 μl RPMI-1640 bez surowicy z lub bez 300 nM 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) do końcowego stężenia 0 lub 50 nM PMA. Kultura przez 30 min.
6. Usuń pożywkę i umyj komórki raz za pomocą RPMI-1640 bez surowicy. Zastąp pożywkę RPMI-1640 bez surowicy z lub bez 20 μg/ml LDL, a następnie hoduj przez 2 godziny.
7. Zebrać pożywkę hodowlaną i odwirować (700 × g, 3 min w temperaturze 18–22 °C) w celu usunięcia resztek komórek.

7. Stymulacja HAEC za pomocą NET i LDL

1. Zastąp pożywkę 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej. Posiew przez co najmniej 30 minut przed stymulacją.
2. Dodać 167 μl pożywki zawierającej NET i LDL (krok 6.7) oraz LDL do szalek HAEC. Sprawdź zmiany morfologiczne w HAEC wywołane po stymulacji przez 12 godzin lub dłużej.

Po usunięciu chylomikronów, a następnie frakcji VLDL z ludzkiego osocza poprzez sekwencyjne ultrawirowanie, ludzkie osocze zmieszano z roztworem KBr w celu dostosowania gęstości do d = 1,063. Na tym etapie pozostały środek strącający nie został całkowicie rozpuszczony w roztworze i uniknięto silnego mieszania, które tworzyło pęcherzyki gazu, aby utrzymać LDL w stanie nienaruszonym. Po ultrawirowaniu LDL został wizualnie oceniony na górnej warstwie na podstawie jego żółto-pomarańczowego koloru9 (ryc. 1), co odróżniało go od bezbarwnego roztworu znajdującego się tuż pod nim. Zwykle po dializie pobranej frakcji LDL przeciwko PBS/EDTA, około 23-25 ml osocza można pobrać z 45-50 ml ludzkiej krwi, co daje 4,3 ml frakcji LDL z około 4 mg/ml białka.

Leczenie komórek HL-60 2 μM AtRA indukowało różnicowanie komórek w komórki podobne do neutrofili (dHL-60) ze zmniejszoną wielkością komórek. W szczególności podczas przygotowywania dHL-60 należy unikać stosowania szalek hodowlanych dla przylegających komórek, ponieważ komórki dHL-60 mają tendencję do przylegania do powierzchni tych szalek, co prowadzi do zmniejszenia wydajności komórek. Dodatkowo komórki dHL-60 powinny być odwirowywane przez dłuższy czas niż komórki HL-60, aby zapobiec utracie komórek dHL-60. Kiedy tworzenie NET zostało wywołane w 12-dołkowej płytce, pokrycie studzienek poli-L-lizyną ułatwiło przyczepienie komórek do powierzchni płytki, sprzyjając tworzeniu NET. Jak wcześniej informowano, jednoczesna inkubacja z LDL podczas tworzenia NET nie zwiększa uwalniania DNA do pożywki z komórek dHL-60; jednak wydłużenie HAEC wywołane stymulacją NET jest wzmocnione przez współistnienie z LDL12. W tym protokole szczątki komórkowe komórek dHL-60 usunięto przez odwirowanie, zebrano mieszaninę rozpuszczalnych składników NET i LDL, a rozpuszczalne składniki zastosowano do późniejszej stymulacji HAEC.

Mikroskopia z kontrastem fazowym ujawniła, że HAEC stymulowane NET, z LDL lub bez, wykazywały zależne od dawki zmiany morfologiczne od formy przypominającej bruk do wydłużonej struktury (Figura 2A). Odpowiedź tę oceniano również za pomocą obrazowania poklatkowego przy użyciu mikroskopii z kontrastem fazowym, która wyraźnie wykazała wydłużenie w ciągu 6 godzin (ryc. 2B). Gdy HAEC były stymulowane za pomocą NET indukowanych przez natywny LDL, zmiany morfologiczne uległy znacznemu wzmocnieniu. Te zmiany morfologiczne były związane ze zmniejszonym barwieniem VE-kadheryny, jak wcześniej opisano12.

Rysunek 1: Obraz reprezentatywny dla frakcjonowania LDL. LDL unosi się na górnej warstwie po ultraodwirowaniu osocza ludzkiego zmieszanego z roztworem KBr w celu dostosowania gęstości do d = 1,063. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne obrazy dla wydłużenia HAEC stymulowanych NET. (A) Komórki neutrofilopodobne pochodzące z HL-60 stymulowano 50 nM PMA przez 30 minut. Po usunięciu pożywki i umyciu świeżą pożywką, komórki inkubowano w świeżej pożywce przez dodatkowe 2 godziny. Pobraną pożywkę następnie odwirowano w celu wyeliminowania resztek komórkowych, a następnie wykorzystano do stymulacji HAEC. Wskazano na krotne zmiany w ilości pożywki z lub bez NET stosowanych do stymulacji HAEC. Podziałka skali: 20 μm. (B) Obrazowanie poklatkowe HAEC stymulowanych pożywką hodowlaną zawierającą NET i LDL przez 18 godzin. Paski skali na obrazach o mniejszym i większym powiększeniu wskazują odpowiednio 100 μm i 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.