Artykuł metodologiczny

Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

979 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68830

⸱

12 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano szereg metod, w tym izolację lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z ludzkiego osocza, różnicowanie komórek HL-60 w komórki podobne do neutrofili, przygotowanie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w obecności LDL oraz stymulację ludzkich komórek śródbłonka aorty mieszaniną NET i LDL.

Streszczenie

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) pojawiły się jako czynniki sprawcze w różnych chorobach niezakaźnych i są związane z zaburzeniami sercowo-naczyniowymi, takimi jak miażdżyca i zakrzepica. Tworzenie NET obserwuje się w ścianie naczynia krwionośnego i istnieją przekonujące dowody na to, że markery powstawania NET w osoczu zwiększają się wraz z nasileniem choroby. Składniki NET pochodzące z neutrofili, w tym mieloperoksydazy i proteazy, wpływają na lipoproteiny osocza i homeostazę naczyń krwionośnych. W tym miejscu opisano szereg metod stymulacji komórek naczyniowych za pomocą NET powstających w obecności lipoprotein o niskiej gęstości (LDL). LDL frakcjonowano z ludzkiego osocza za pomocą ultrawirowania. Komórki HL-60 potraktowano kwasem all-trans retinowym w celu różnicowania ich w komórki podobne do neutrofili, a następnie stymulowano 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA) w celu indukowania tworzenia NET. Po usunięciu i wypłukaniu PMA, komórki były dalej inkubowane z LDL. Pobrane supernatanty zawierające NET i LDL natychmiast wykorzystano do stymulacji ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC). Jako reprezentatywną odpowiedź, zmiana morfologiczna HAEC wywołana leczeniem NET została wzmocniona przez obecność LDL, co sugeruje, że tworzenie NET w połączeniu z LDL wzmacnia odpowiedź HAEC. Metody te są korzystne dla badania wpływu LDL na komórki śródbłonka pod wpływem aktywacji neutrofili i zapalenia związanego z NET, dostarczając w ten sposób nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw chorób sercowo-naczyniowych związanych ze zwiększonym stężeniem LDL w osoczu.

Wprowadzenie

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET), wytwarzane przez aktywowane neutrofile po zakażeniu bakteryjnym, a także w niezakaźnych fizjologicznie prawdopodobnych warunkach, uwalniają zdekondensowane DNA i białka, takie jak histony, mieloperoksydaza (MPO) i elastaza neutrofilowa1. Ponieważ składniki te mogą demontować komórki i tkanki brzeżne, powodując uporczywy stan zapalny, tworzenie NET stało się czynnikiem sprawczym w inicjowaniu i postępie różnych ostrych i przewlekłych chorób, w tym reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycy, cukrzycy, choroby Alzheimera, przerzutów raka i chorób sercowo-naczyniowych2. Analizy histologiczne zmian naczyniowych człowieka w miażdżycy3 i tętniaku aorty brzusznej4 wykazały kolokalizację nacieku neutrofili i tworzenia NET. W krążącej krwi poziomy markerów NETs, takich jak cytrulinowane histony, NET-DNA i MPO, wzrastają wraz z ciężkością choroby wieńcowej5. We wczesnych stadiach miażdżycy tworzenie NET często poprzedza akumulację lipidów, która zachodzi poprzez tworzenie komórek piankowatychprzez makrofagi 6,7. Zjawiska te silnie sugerują, że MPO i enzymy proteolityczne uwalniane zewnątrzkomórkowo podczas tworzenia NET mogą działać nie tylko na tkanki naczyniowe, ale także na składniki krwi, takie jak lipoproteiny. Lipoproteiny to delikatne kompleksy lipidowo-białkowe, które mogą zostać uszkodzone przez białka pochodzące z NET, takie jak MPO8; w związku z tym tworzenie NET może powodować zmiany strukturalne i biochemiczne w lipoproteinach, wpływając w ten sposób na homeostazę naczyń. Jednak synergiczny wpływ tworzenia NET i lipoprotein na dysregulację i reakcje zapalne wywołane przez komórki naczyniowe pozostaje niejasny.

W tym artykule przedstawiono metodę badania odpowiedzi komórkowych ludzkich komórek śródbłonka naczyń krwionośnych indukowanych przez leczenie NET przygotowanymi z komórek podobnych do neutrofili pochodzących z HL-60 i lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) frakcjonowanych z ludzkiego osocza. Reprezentatywne wyniki wskazują na frakcjonowanie LDL z ludzkiego osocza za pomocą ultrawirowania oraz odpowiedzi komórkowe ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC) stymulowanych NET po jednoczesnej inkubacji z LDL. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniu komórek naczyniowych z udziałem innych lipoprotein.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół przygotowania LDL został zatwierdzony przez komisję bioetyczną Szkoły Farmacji Uniwersytetu Medycznego Showa (nr 231). Pisemną świadomą zgodę uzyskano zgodnie z Deklaracją Helsińską, a wszyscy uczestnicy dobrowolnie złożyli swoje podpisy pod wnioskiem o udział w tym badaniu. Komórki manipulowano w sposób aseptyczny za pomocą okapu z przepływem laminarnym. Kryterium włączenia był przedział wiekowy 22-65 lat. Kryteria wykluczenia obejmowały nawyki palenia, istniejące wcześniej choroby sercowo-naczyniowe (takie jak choroba niedokrwienna serca, udar mózgu i choroby tętnic obwodowych), ciężką dysfunkcję wątroby i niekontrolowane stany przewlekłe, w tym cukrzycę, nadciśnienie, dyslipidemię, ciężkie choroby zapalne i nowotwory. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja LDL z ludzkiego osocza

  1. Pobrać pełną krew od zdrowego ochotnika w obecności heparyny przeciwzakrzepowej (10 jednostek/ml).
  2. Odwirować 45-50 ml ludzkiej krwi pełnej otrzymanej w probówce z heparyną (700 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C). Upewnij się, że powoli zmniejszasz prędkość wirówki. Zebrać górną warstwę zawierającą frakcję osocza.
  3. Przeprowadzić dwukrotne odwirowanie (700 × g, 15 minut w temperaturze 4 °C) przy tym samym ustawieniu opóźnienia, co w kroku 1.2 w celu wyeliminowania krwinek. Dodaj 1:1,000 objętości 250 mM EDTA (pH 7,4), aby zapobiec utlenianiu lipoprotein za pośrednictwem jonów metali dwuwartościowych.
  4. Umieścić 2,7 ml osocza w probówce z poliwęglanu o pojemności 4 ml (4 szt.), nałożyć na 900 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 250 μM EDTA (PBS/EDTA) i ultrawirować (600 000 × g, 7 min w temperaturze 4 °C).
  5. Wyrzuć 900 μl wierzchniej warstwy, aby wyeliminować chylomikron. Ułóż 900 μl PBS/EDTA na osoczu i ultrawirówce (600 000 × g, 2,5 h w temperaturze 4 °C).
  6. Odrzuć 900 μl wierzchniej warstwy, aby wyeliminować lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Ten krok jest ważny, aby zapobiec zanieczyszczeniu LDL innymi frakcjami lipoprotein.
  7. Dodać 540 μl roztworu o stężeniu 0,5 g/ml KBr, aby dostosować gęstość do d = 1,063, a następnie delikatnie wymieszać pipetą, a następnie ultrawirować (600 000 x g, 2,5 h w temperaturze 4 °C).
  8. Zebrać 540 μl wierzchniej warstwy zawierającej LDL. Żółto-pomarańczowa warstwa wskazuje na udaną separację LDL9. Przenieść do membrany dializowej.
  9. Trzykrotnie dializować frakcję LDL w stosunku do 2 l PBS/EDTA w temperaturze 4 °C w ciemności, aby wyeliminować KBr.
  10. Przed użyciem przechowywać LDL w temperaturze 4 °C w ciemności.

2. Przygotowanie studzienek pokrytych poli-L-lizyną lub żelatyną

  1. Przygotuj 0,01% roztwór poli-L-lizyny10 , rozcieńczając 0,1% roztwór poli-L-lizyny sterylną wodą, a następnie przefiltruj sterylnym filtrem 0,2 μm. Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Dodać 152 μl/basenik 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka na 12-dołkowej płytce i inkubować przez co najmniej 5 minut.
  3. Usunąć roztwór, a następnie przemyć raz 200 μl/studzienkę sterylnej wody i suszyć przez co najmniej 2 godziny.
  4. Przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem do przygotowania NET.

3. Przygotowanie studzienek pokrytych żelatyną

  1. Przed użyciem przygotuj 0,1% roztwór żelatyny, rozcieńczając 2% roztwór żelatyny sterylną wodą.
  2. Dodać 152 μl/basenik 0,1 % roztworu żelatyny do każdego dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować przez co najmniej 5 minut11.
  3. Usunąć roztwór, a następnie przemyć raz 200 μl/studzienkę sterylnej wody i suszyć przez co najmniej 2 godziny.
  4. Przed użyciem przechowywać w temperaturze pokojowej.

4. Utrzymanie i przygotowanie ludzkich komórek śródbłonka aorty (HAEC)

  1. Hodowla pierwotnych HAEC w niepowlekanej kolbie hodowlanej przy użyciu kompletnego podłoża zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów, 20 ng/ml insulinopodobnego czynnika wzrostu, 0,5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, 1 μg/ml kwasu askorbinowego, 22,5 μg/ml heparyny i 0,2 μg/ml hydrokortyzonu, zgodnie ze wskazaniami w instrukcji producenta. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż komórki zlewają się w 70%-80%.
  2. W celu stymulacji wysiewaj HAEC na 12-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do osiągnięcia zbiegu. Przeprowadź eksperyment między fragmentami 4 i 7.

5. Przygotowanie komórek neutrofilopodobnych pochodzących z HL-60, a następnie NET

  1. Utrzymuj komórki HL-60 za pomocą pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 5% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny, używając naczyń niepoddanych działaniu substancji.
  2. W celu przygotowania komórek obojętnopodobnych pochodzących z HL-60 należy hodować od 2 × 106 komórek na 10 ml komórek HL-60 przez 4 dni w pożywce RPMI-1640 zawierającej 2 μM kwas all-trans-retinowy (AtRA).

6. Przygotowanie sieci NET z LDL

  1. Pobrać komórki HL-60 4 dni po leczeniu 2 μM AtRA. Po różnicowaniu komórek HL-60 w komórki podobne do neutrofili, komórki stają się mniejsze.
  2. Odwirować komory (220 × g, 4 min w temperaturze 18-22 °C). Odessać supernatant i przemyć komórki równą objętością RPMI-1640 bez surowicy.
  3. Odwirować komórki (220 × g, 4 min w temperaturze 18-22 °C), a następnie ponownie zawiesić komórki za pomocą RPMI-1640 bez surowicy.
  4. Policz komórki, a następnie ponownie zawieś komórki do 2 × 106 komórek/ml w RPMI-1640 bez surowicy i zamieść 0,5 ml zawiesiny komórek w dołkach 12-dołkowej płytki wstępnie pokrytej poli-L-lizyną. Hodowla przez co najmniej 30 minut.
  5. Dodać 100 μl RPMI-1640 bez surowicy z lub bez 300 nM 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) do końcowego stężenia 0 lub 50 nM PMA. Kultura przez 30 min.
  6. Usuń pożywkę i umyj komórki raz za pomocą RPMI-1640 bez surowicy. Zastąp pożywkę RPMI-1640 bez surowicy z lub bez 20 μg/ml LDL, a następnie hoduj przez 2 godziny.
  7. Zebrać pożywkę hodowlaną i odwirować (700 × g, 3 min w temperaturze 18–22 °C) w celu usunięcia resztek komórek.

7. Stymulacja HAEC za pomocą NET i LDL

  1. Zastąp pożywkę 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej. Posiew przez co najmniej 30 minut przed stymulacją.
  2. Dodać 167 μl pożywki zawierającej NET i LDL (krok 6.7) oraz LDL do szalek HAEC. Sprawdź zmiany morfologiczne w HAEC wywołane po stymulacji przez 12 godzin lub dłużej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po usunięciu chylomikronów, a następnie frakcji VLDL z ludzkiego osocza poprzez sekwencyjne ultrawirowanie, ludzkie osocze zmieszano z roztworem KBr w celu dostosowania gęstości do d = 1,063. Na tym etapie pozostały środek strącający nie został całkowicie rozpuszczony w roztworze i uniknięto silnego mieszania, które tworzyło pęcherzyki gazu, aby utrzymać LDL w stanie nienaruszonym. Po ultrawirowaniu LDL został wizualnie oceniony na górnej warstwie na podstawie jego żółto-pomarańczowego koloru9<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje przygotowanie NET z komórek dHL-60 indukowanych przez współistnienie LDL, które są następnie wykorzystywane do analizy odpowiedzi HAEC. Znaczenie tego protokołu polega na użyciu świeżej pożywki zawierającej NET i LDL do stymulacji komórek, mimo że wiele innych badań wykorzystuje podstawowy roztwór NET zamrożony w temperaturze -20 °C. Ponieważ lipoproteiny są kompleksami lipidowo-białkowymi, ich nienaruszone struktury i cechy są tracone podczas zamrażania i rozmrażania, powodując denaturację i agregac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie to było częściowo wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki, KAKENHI (numery grantów 23K10897 i 19K07069). Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% poli-L-lizynySigmaAldrichZobacz materiał P8920-100ML
Naczynie 10 cmCorning430591
12-dołkowe płytki do hodowli tkankowychSokół353043
2% żelatynySigmaAldrichG1393-20ML
Rura 4 PCHimac powiedział:S404332A
Kwas all-trans retinowyWako188-01113Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Rurki do dializy celurozowejMISUMI Group Inc.0327-23-37-07 (UC18-32-100)Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
EDTADojindo powiedział:345-01865Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Zestaw do pomiaru wzrostu komórek śródbłonka 2Komórka promocyjnaNr kat. C-22111
Surowica bydlęca płoduGibco (firma Gibco)10270-106Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Heparyna sodowa (5 000 jednostek/5 ml)Mochida Pharmaceutical Co., Sp. z o.o.Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkościTOMYZobacz materiał SRX-201Przyspieszenie: 9, Opóźnienie: 7
ludzkie komórki śródbłonka aortyLonzaKlasa CC-2535
KBrWako168-03475Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Oprogramowanie do mikroskopii KEYENCEKLUCZ POWIEDZIAŁ:Analizator BZ-II
Mikro ultrawirówkaHimac powiedział:CS150GX
MikroskopiaOLYMPUSZobacz materiał CK40
MikroskopiaKLUCZ POWIEDZIAŁ:BZ-9000Do obrazowania poklatkowego (opcja)
Kamera mikroskopowaNikonSkaner DS-Fi3
Oprogramowanie kamery mikroskopowejNikonCzytnik DS-L4
Penicylina/StreptomycynaGibco (firma Gibco)15140-122 100MLMoże być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (&razy; 10)Rozpuścić 2,6 g NaH2PO4· 2H2O, 29 g Na2HPO4· 12H2O, 80 g NaCl i 2,0 g KCl w wodzie destylowanej i dostosować do objętości 1 L.  (Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę)
PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu)Wako162-23591Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Pakiet odczynnikówLonzaCC-5034 powiedział:(CC-5022: Buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES, CC-5012: Trypsyna/EDTA, CC-5002: Roztwór neutralizujący trypsynę) 
WirnikHimac powiedział:S100AT6-0242
RPMI-1640 (z czerwienią fenolową)Wako189-02025Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej)Wako186-02155Może być zastąpiony przez dowolnego dostawcę
Kolba T-25Corning3275

Bibliografia

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
  3. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
  4. Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
  5. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  6. Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
  7. Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
  8. Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
  9. Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
  10. Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
  11. Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
  12. Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
  13. Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
  14. Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
  15. Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
  16. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  17. Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
  18. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
  19. Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie NETkom rki HL 60ultrawir wkafrakcjonowanie osocza ludzkiegooctan mirystanu forboluzmiany morfologicznemechanizmy chor b uk adu sercowo naczyniowego

Powiązane artykuły