Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączony test amplifikacji polimerazy rekombinazy CRISPR/Cas12a do wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

678 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68841

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole ilustrowano test amplifikacji polimerazy rekombinazowej CRISPR/Cas12a do wykrywania inwazyjnego patogenu roślinnego, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Streszczenie

Regularny i dokładny nadzór jest kluczowy dla skutecznego zarządzania chorobami roślin. Może wskazywać, który sposób działania jest najbardziej odpowiedni oraz czy konieczne jest zapobieganie, zwalczanie działań lub brak działania. Monitorowanie oparte wyłącznie na symptomologii u roślin żywicielskich często nie jest wiarygodne ze względu na podobieństwa objawów wywołanych stresem biotycznym i abiotycznym. Laboratoryjne metody molekularne, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i ilościowe (q)PCR, są najczęściej i najbardziej wiarygodnie stosowane do wykrywania patogenów roślinnych, ale opierają się na kosztownym sprzęcie i wykwalifikowanych operatorach. Tutaj opisujemy protokół łączący uproszczoną ekstrakcję DNA, amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) oraz regularnie skupione, przeplatane krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) do wykrywania inwazyjnego patogenu, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc TR4). Technika ta stanowi prostą alternatywę dla detekcji w pojedynczej rurce, która jest analitycznie odporna i ma lepszą specyficzność w porównaniu z dostępnymi testami detekcji molekularnej i eliminuje potrzebę drogiego i zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego.

Wprowadzenie

Więdnięcie fusarium, spowodowane przez glebowego patogena grzybowego Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), jest globalnie uznawane za jeden z najbardziej niszczycielskich patogenów roślin transgranicznych w historii1. Po wprowadzeniu do nowego obszaru Foc pozostaje niewidoczny, dopóki zainfekowane rośliny nie rozwiną objawów. Może to zająć miesiące, pozwalając grzybowi rozprzestrzenić się i rozprzestrzenić nieświadomie. Po ugruntowaniu jest niemal niemożliwe ekonomiczne wyeliminowanie ze względu na produkcję odpornych chlamydospor oraz wieloletni charakter uprawy bananów. Znaczenie profilaktyki i wczesnego wykrywania jest zatem kluczowe dla ochrony wrażliwych hodowców1. Obecna epidemia choroby, wywołana przez tropikalną rasę Foc 4 (TR4), wymaga regularnego monitorowania w celu identyfikacji objawowych bananowców w obszarach wysokiego ryzyka. Ograniczenia abiotyczne, takie jak stres wodny i niedobory składników odżywczych, powodują żółknięcie zewnętrzne, które jest podobne do objawów wywołanych infekcją Foc TR4. Dodatkowo, nie można odróżnić objawów zakażenia przez różne rasy Foc. Dlategodo wiarygodnego wykrywania Foc TR4 2 konieczne jest oczyszczanie laboratoryjne oraz późniejsze wykrywanie fenotypowe i molekularne. Dostępne są różne testy molekularne do wykrywania Foc TR4, w tym PCR, ilościowe (q) PCR oraz testy amplifikacji izotermicznej z pętlą (LAMP) 3,4,5,6,7. Większość tych protokołów jednak nadal wymaga kosztownych i specjalistycznych umiejętności oraz sprzętu, które muszą być realizowane w warunkach laboratoryjnych. Amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) może być przeprowadzana izotermicznie, co eliminuje potrzebę stosowania takiego sprzętu i może być rozważane jako metoda detekcji w terenie8.

Systemy CRISPR)-Cas są coraz częściej wykorzystywane do ulepszaniadiagnostyki molekularnej w regularnych przestrzeniach i regularnych powtórek palindromicznych (CRISPR)-Cas. Systemy te są stosowane, ponieważ są tanie, proste i nie wymagają użycia specjalnej aparatury instrumentacyjnej, dlatego mogą być rozważane do wykrywania w terenie. Diagnostyka oparta na CRISPR zazwyczaj polega na izotermicznej amplifikacji sekwencji docelowej, następnie rozpoznaniu celu za pomocą białek CRISPR-Cas oraz rozszczepienia bocznego barwnika fluorescencyjnego DNA lub RNA, aby wskazać obecność celu 10,11. W systemach CRISPR-Cas12a, konkretnie, RNA CRISPR (crRNA) kieruje Cas12a, aby rozpoznać i rozszczepić cele kwasów nukleinowych. To crRNA może być zaprojektowane tak, aby celować w konkretny obszar DNA lub RNA poprzez hybrydyzację do sekwencji komplementarnej. Po związaniu powoduje rozszczepienie celu przez Cas12a specyficzność pojedynczych nukleotydów, a następnie rozszczepienie cząsteczek reporterowych12. Ostatnio zastosowano systemy CRISPR-Cas12a do wykrywania różnych ekonomicznie ważnych grzybowych patogenów roślinnych 13,14,15,16,17,18,19,20.

W tym protokole opisano opracowanie techniki detekcji pojedynczej rurki, łączącej uproszczoną ekstrakcję DNA, amplifikację polimerazy rekombinazowej (RPA) oraz technologię CRISPR/Cas12a (RPA-Cas12a) do wykrywania Foc TR4, co było wizualizowane zarówno na przenośnym fluorometrze, jak i gołym okiem pod niedrogim diodą LED w transilluminatorze niebieskim światłem21. Metoda ta może być dodatkowo optymalizowana pod kątem wykrywania w terenie, aby poprawić strategie zapobiegania i ograniczania działań. Podobne podejście można również wykorzystać do projektowania testów wykrywających na podstawie Cas12a dla innych patogenów roślinnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uproszczona ekstrakcja DNA z materiału roślinnego

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla przeglądu.

  1. Wykonaj ekstrakcję DNA.
    1. Przelej 250 mg każdego kawałka objawowego pseudostemu do osobnego worka ekstrakcyjnego (patrz Tabela materiałów).
    2. Dodaj 2 mL 0,5 M NaOH-PVP (Tabela materiałów) do worków z materiałem roślinnym. Mielę zainfekowane naczynia w worku ekstrakcyjnym, używając ręcznego młynka jak tłuczka.
      UWAGA: Dodaj 1-2 mL dodatkowego 0,5 M NaOH-PVP, jeśli to konieczne, aby uzyskać wystarczającą ilość płynnego ekstraktu z worka.
    3. Dodaj 195 μL 100 mM Tris-HCL (pH 8,0) (Tabela materiałów) do probówek o pojemności 1,5 mL.
    4. Pipeta 5 μL ekstraktu z worka do probówki 1,5 mL z 195 μL 100 mM Tris-HCL (pH 8,0), rozcieńczając ekstrakt 40-krotnie.
    5. Przekręć rurki przez 15-30 sekund i przechowywać w temperaturze -20 °C do użycia.

2. synteza crRNA i kontrola jakości

  1. Wykonaj transkrypcję.
    1. Korzystając z zestawu transkrypcyjnego RNA (Tabela materiałów), do probówki PCR o pojemności 0,2 mL dodaj następujące składniki: 1,5 μL buforu reakcji 10x T7, 1,5 μL każdego dNTP, 1,5 μL mieszanki polimerazy DNA T7, 1 μL wody wolnej od nukleazy oraz 10 μL 100 μM szablonowego DNA T7, co daje łączną objętość 20 μL.
    2. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej lub na maszynie PCR przez co najmniej 4 godziny.
    3. Użyj spektrofotometru (Tabela materiałów) do określenia ilości przepisanego RNA. Rozcieńcz RNA do 250 ng/μL (10 μg) w objętości 40 μL przy użyciu wody wolnej od nukleazy lub buforu TE (Plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Przepisane RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu kontynuowania leczenia DNazą i etapów oczyszczania.
  2. Wykonaj leczenie DNazą i czyszczenie crRNA.
    UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj w temperaturze pokojowej. Trzymaj RNA i enzymy DNazy I na lodzie.
    1. Traktuj próbkę RNA DNazą I zawartą w zestawie do czyszczenia RNA (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta22.
    2. Oczyść próbkę RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z instrukcjami producenta, zgodnie z protokołem II22.
    3. Nanodrop oczyszczonego crRNA, aby określić ilość i jakość. Rozcieńcz RNA do 100 ng/μL w wodzie wolnej od nukleazy i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    4. Podgrzej crRNA barwnikiem ładującym RNA (Tabela materiałów) do 70 °C przez 10 minut w kąpieli wodnej i poddaj crRNA elektroforezie na żelu agarozowym o 1,5% w celu wizualizacji syntezy crRNA (Rysunek 2).

3. Reakcja jednorurkowa amplifikacji polimerazy rekombinazowej (RPA)-Cas12a do wykrywania in vitro Foc TR4

UWAGA: Zobacz Rysunek 3 dla przeglądu.

  1. Przygotuj miksy reakcji RPA i Cas12a.
    UWAGA: Upewnij się, że te kroki są wykonywane w przestrzeni wolnej od DNA na lodzie, z odczynnikami i materiałami wstępnie schładzonymi. Przed eksperymentem przetrzyj powierzchnię roboczą i pipety wybielaczem i 70% etanolem. Zobacz Tabelę 1 , aby uzyskać informacje o wszystkich oligonukleotydach używanych w tym badaniu.
    1. Przygotuj mieszaninę reakcji Cas12a o pojemności 20 μL w osobnej probówce 0,5 mL (Tabela materiałów) z następującymi objętościami odczynników: 2 μL 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL rekombinowanej albuminy, pH 7,9), 0,4 μL 10 μM białka LbCas12a, 0,6 μL crRNA o pojemności 100 ng/μL, 0,4 μL raportu 10 μM oraz 16,6 μL wody zdejonizowanej.
      UWAGA: Końcowe stężenia białka LbCas12a, crRNA i reportera wynoszą odpowiednio 200 nM.
    2. Przygotuj mieszaninę reakcji RPA o pojemności 9,5 μL w osobnej probówce 0,5 mL o następujących objętościach odczynników: 5 μL buforu reakcji 2x (stężenie końcowe 1x zgodnie z wytycznymi producenta), 1,6 μL mieszanki dNTP (stężenie końcowe 1,6 mM), 1 μL 10x bazowej mieszanki E-Mix (stężenie końcowe 1x zgodnie z wytycznymi producenta), 0,5 μL każdego zapalnika RPA o pojemności 10 μM (końcowe stężenie 0,5 μM każda), 0,5 μL mieszanki reakcji rdzeniowej 20x (stężenie końcowe 1x zgodnie z wytycznymi producenta) oraz 0,4 μL wody dejonizowanej.
    3. Włóż 8-rurkowy pasek do stojaka na rury (Tabela Materiałów) na lodzie.
    4. Przelej mieszankę reakcji Cas12a o stężeniu 20 μL do podstawy rurki.
    5. Przelej mieszankę reakcji RPA o pojemności 9,5 μL do pokrywy rurki. Dodaj 0,5 μL 280 nM MgOAc (końcowe stężenie 14 nM) do mieszanki reakcji RPA w pokrywce rurki i mieszaj przez pipetowanie w górę i w dół.
    6. Dodaj 0,5 μL wody dejonizowanej do pokrywy rurki bez szablonu (NTC) i ostrożnie zamknij, aby nie połączyć się mieszanin reakcji RPA i Cas12a.
      UWAGA: Uwzględniono kontrolę nieszablonową (NTC), aby zapewnić wiarygodność wyników.
  2. Dodaj szablonowe DNA i rozpocznij reakcję.
    1. Dodaj 0,5 μL DNA szablonowego do 10 μL mieszaniny reakcji RPA zawierającej MgOAc w pokrywce rurki, z wyjątkiem NTC, z dejonizowaną wodą zamiast DNA. Zawsze dodaj znane pozytywnie kontrolowane DNA Foc TR4 do jednego dołku, aby upewnić się, że test zadziałał zgodnie z zamierzeniem. Mieszaj, pipetując w górę i w dół.
    2. Ostrożnie zamknij pokrywki z rurką, aby reakcja RPA i Cas12a się nie pomieszała.
    3. Włącz przenośny fluorometr (Tabela materiałów) i stwórz profil przebiegu dla testu RPA-Cas12a (Plik Uzupełniający 2). Otwórz zapisany profil Run i umieść pasek rurki w przenośnym fluorometrze, aby inkubował przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Uważaj, aby nie dotykać dna rurek podczas obsługi paska rurkowego; zamiast tego trzymaj zewnętrzne krawędzie na górnym lewym i prawym końcu.
    4. Usuń pasek z przenośnego fluorometru po 30 minutach. Odwróć rurki sześć razy, aby wymieszać reakcje RPA i Cas12a, i obracaj w mini wirówce (patrz Tabela materiałów) przez 5 sekund.
    5. Włóż pasek rurki z powrotem do przenośnego fluorometru i inkubuj przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C, korzystając z zapisanego profilu biegu.
  3. Wyobraź sobie efekty.
    1. Interpretuj średnie względne jednostki fluorescencji (RFU) mierzone na przenośnym fluorometrze (Plik uzupełniający 2 oraz instrukcja obsługi23).
    2. Zwizualizuj lampy pod niebieskim światłem LED o długości fali wzbudzenia 465 nm za pomocą transiluminatora niebieskiego światła (Plik uzupełniający 3). Rób zdjęcia aparatem w telefonie.

   

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skuteczne wykrycie Foc TR4 z zakażonego materiału roślinnego za pomocą uproszczonej ekstrakcji DNA, a następnie połączonego testu RPA-Cas12a przeprowadzonego w przenośnym fluorometrze Genie III zostało zilustrowane na Rysunku 4A. Próbki pozytywne wykazują widoczną fluorescencję (ścieżki 6-8), natomiast próbki negatywne wykazują niską fluorescencję końcową (ścieżka 1-5). Gdy próbki były oglądane pod niebieskim światłem LED, próbki zakażone Foc TR4 również wykazywały widoczną fluorescencję (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Regularna inwigilacja to ważna strategia skutecznej zapobiegawczej i zwalczającej Foc TR4 oraz innych ważnych inwazyjnych szkodników. Protokoły wykrywania, które można stosować w terenie, a które umożliwiają szybkie i precyzyjne identyfikowanie patogenów, mogą przyspieszyć podejmowanie decyzji i ograniczyć koszty związane z działaniami nadzorczymi. W tym celu przedstawiony tutaj protokół łączył uproszczoną ekstrakcję DNA, przeprowadzoną bezpośrednio na próbce materiału roślinnego, która następnie została włączona do jedn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych ani intelektualnych.

Podziękowania

Przyjmujemy wsparcie finansowe od National Research Foundation of South Africa, numer grantu: 138109, w ramach konkurencyjnego wsparcia dla programu badaczy bez oceny. Dziękujemy również stypendium programu badawczo-innowacyjnym Unii Europejskiej Horyzont 2020 Marie Sklodowska-Curie Fellowship w ramach grantu INDICANTS Project Grant: 890856.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białko EnGen Lba Cas12a (Cfp1)New England BiolabsM0653T
EnGen Lba Cas12a DiluentNew England BiolabsB0653A
Rurki PCR EppendorfMerckEP0030124332
Mikroprobówki Eppendorf Safe-LockMerckEP0030121708
Worki ekstrakcyjne uniwersalneBIOREBA430100
GeneRuler 100 bp drabiny DNAThermo Fischer ScientificSM0241 / SM0242
Wirówka Genie Mini-6KOOptiGeneOP-FUGE
Dżin IIIOptiGenehttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
Uchwyt na paski GenieOptiGeneGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
Genie StripsOptiGeneOP-0008-50 / OP-0008-500
HiScribe T7 Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajnościNew England BiolabsE2040S
NanoDrop ND-1000 spektrofotometr UV/VisThermo Fischer Scientifichttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3New England BiolabsB7003S
NEBuffer r2.1New England BiolabsB6002S
Proszek poliwinylpirolidion (PVP)Sigma-Aldrich9003-39-8
Zestaw do czyszczenia RNA i koncentratora-5Zymo ResearchR1013
Barwnik ładunkowy RNAThermo Fischer ScientificR0641
Transiluminator światła SmartBlue BlueAccuris InstrumentsE4000-E
Pellety wodorotlenku sodu (NaOH)Merck, EMPARTAK277
Tris (hydroksylmetylo) aminometanMerck77-86-1
TwistAmp Liquid Basic KitTwistDxTALQBAS01

Bibliografia

  1. Viljoen, A., Ma, L. J., Molina, A. B. Fusarium Wilt (Panama Disease) and Monoculture in Banana Production: Resurgence of a Century-Old Disease. Emerging Plant Diseases and Global Food Security. , The American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (2020).
  2. Viljoen, A., et al. Banana Diseases and Pests: Field Guide for Diagnostics and Data Collection. , IITA, Ibadan. (2017).
  3. Dita, M. A., Waalwijk, C., Buddenhagen, I. W., Souza, M. T., Kema, G. H. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana. Plant Pathol. 59 (2), 348-357 (2010).
  4. Li, M., et al. Identification and application of a unique genetic locus in diagnosis of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Can J Plant Pathol. 35 (4), 482-493 (2013).
  5. Aguayo, J., et al. Development of a hydrolysis probe-based real-time assay for the detection of tropical strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. PLoS One. 12 (2), e0171767(2017).
  6. Matthews, M. C., Mostert, D., Ndayihanzamaso, P., Rose, L. J., Viljoen, A. Quantitative detection of economically important Fusarium oxysporum f. sp. cubense strains in Africa in plants, soil and water. PLoS One. 15 (7), e0236110(2020).
  7. Ordóñez, N., et al. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay based on unique markers derived from genotyping by sequencing data for rapid in planta diagnosis of Panama disease caused by tropical race 4 in banana. Plant Pathol. 68 (9), 1682-1693 (2019).
  8. Martzy, R., et al. Challenges and perspectives in the application of isothermal DNA amplification methods for food and water analysis. Anal Bioanal Chem. 411, 1695-1702 (2019).
  9. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and potential solutions toward point-of-care applications. ACS Synth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  10. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  11. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  12. Chen, Y., Mei, Y., Jiang, X. Universal and high-fidelity DNA single nucleotide polymorphism detection based on a CRISPR/Cas12a biochip. Chem Sci. 12 (12), 4455-4462 (2021).
  13. Shin, K., Kwon, S. H., Lee, S. C., Moon, Y. E. Sensitive and rapid detection of citrus scab using an RPA-CRISPR/Cas12a system combined with a lateral flow assay. Plants (Basel). 10 (10), 2132(2021).
  14. Zhang, Y. M., Zhang, Y., Xie, K. Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice. Mol Breed. 40 (1), 11(2020).
  15. Wang, Q., Qin, M., Coleman, J. J., Shang, W., Hu, X. Rapid and sensitive detection of Verticillium dahliae from complex samples using CRISPR/Cas12a technology combined with RPA. Plant Dis. 107 (6), 1664-1669 (2023).
  16. Sun, X., et al. Rapid and sensitive detection of two fungal pathogens in soybeans using the recombinase polymerase amplification/CRISPR-Cas12a method for potential on-site disease diagnosis. Pest Manag Sci. 80 (3), 1168-1181 (2024).
  17. Chen, Z., et al. A frontline, rapid, nucleic acid-based Fusarium circinatum detection system using CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification. Plant Dis. 107 (6), 1902-1910 (2023).
  18. Mu, K., et al. CRISPR-Cas12a-based diagnostics of wheat fungal diseases. J Agric Food Chem. 70 (23), 7240-7247 (2022).
  19. Li, Y., et al. Visual detection of Fusarium temperatum by using CRISPR-Cas12a empowered LAMP assay coupled with AuNPs-based colorimetric reaction. LWT. 185, 115190(2023).
  20. Liang, X., et al. Development of an RPA-based CRISPR/Cas12a assay in combination with a lateral flow strip for rapid detection of toxigenic Fusarium verticillioides in maize. Food Control. 157, 110172(2024).
  21. Matthews, M. C., et al. A combined recombinase polymerase amplification CRISPR/Cas12a assay for detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Sci Rep. 15 (1), 2436(2025).
  22. RNA Clean & Concentrator-5: Instruction Manual Version 3.1.3. , Zymo Research Corporation. Irvine, CA. (2023).
  23. Genie III user manual, instrument software version v3.18.2. , Optigene. Horsham, U.K. (2021).
  24. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 4, 1-4 (2018).
  25. Magdama, F., et al. Comparative analysis uncovers the limitations of current molecular detection methods for Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 strains. PLoS One. 14 (9), e0222727(2019).
  26. Mckillop, C. Independent review blames unreliable test, not Biosecurity Queensland, for false Panama diagnosis. , ABC News, Australia. (2016).
  27. Mckillop, C., Craig, Z. Quarantine lifted on Mareeba banana farm suspected of having Panama disease. , ABC News, Australia. (2015).
  28. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  29. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333 (2021).
  30. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat Commun. 11 (1), 4711(2020).
  31. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
  32. Zeng, R., et al. CRISPR-Cas12a-driven MXene-PEDOT:PSS piezoresistive wireless biosensor. Nano Energy. 82, 105711(2021).
  33. Zhang, J., et al. Rapid and sensitive detection of toxigenic Fusarium asiaticum integrating recombinase polymerase amplification, CRISPR/Cas12a, and lateral flow techniques. Int J Mol Sci. 24 (18), 14134(2023).
  34. Manzo-Sánchez, G., Orozco-Santos, M., Martínez-Bolaños, L., Garrido-Ramírez, E., Canto-Canche, B. Diseases of quarantine and economic importance in banana tree (Musa sp.) in México. Rev Mex Fitopatol. 32 (2), 89-107 (2014).
  35. Blomme, G., et al. Bacterial diseases of bananas and enset: Current state of knowledge and integrated approaches toward sustainable management. Front Plant Sci. 8, 1290(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie Fusarium oxysporumRPA Cas12awykrywanie patogen w ro linnychekstrakcja DNAprzeno ny fluorymetrdetekcja fluorescencyjnafuzarioza bananowcadiagnostyka molekularna
Połączony test amplifikacji polimerazy rekombinazy CRISPR/Cas12a do wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.