Artykuł metodologiczny

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

DOI:

10.3791/68842

⸱

14 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Stem Cells Basic Biology, Carlos Chagas Institute, 2Hospital Israelita Albert Einstein, 3Postgraduate Program in Animal Science - School of Medicine and Life Sciences, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, 4Knee Surgery Department at Cajuru University Hospital, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, 5Core for Cell Technology - School of Medicine and Life Sciences, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, 6National Institute of Science and Technology for Regenerative Medicine, INCT-REGENERA

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się, trauma, predyspozycje genetyczne i styl życia wpływają na degradację chrząstki organizmu. Po urazie ciągłe obelgi wynikające z codziennych czynności mogą wywołać choroby patologiczne, takie jak choroba zwyrodnieniowa stawów, będąca główną przyczyną niepełnosprawności i strat społeczno-ekonomicznych na całym świecie. Głównym celem wszystkich ortopedów leczących urazy chrząstki stawowej jest zmniejszenie anatomicznego rozległości zmiany, naprawa powierzchni chrząstki oraz przywrócenie stabilności stawu. Modele zwierzęce są niezbędne do rozwoju leków terapeutycznych, ale obecne modele defektów chrząstki są niezadowalające. Zmiany kościowe u owiec są cennym modelem do testowania nowych terapii i biomateriałów, które mogą wspomagać regenerację chrząstki i kości w środowisku stawów ludzkich. Badanie to ustanowiło efektywny protokół indukowania ostrych defektów osteochondralnych u dużych zwierząt. W obu przyśrodkowych kłykciach kości udowej powstała ustandaryzowana zmiana. Jedno kolano zostało losowo przypisane do leczenia żelatyno-metacryloilem, natomiast przeciwległe kolano pełniło funkcję kontroli. Sześć miesięcy po zabiegu usunięto obszar kłykcia udowego, rozcięte stawy kolanowe zostały odwapnięte, osadzone w parafinie i pocięte na fragmenty, które barwione były hematoksyliną i eozyną. Do oceny zmiany użyto wyników. Ta metoda pozwala na natychmiastową obserwację makroskopową po indukcji urazu. Dodatkowo model ten skutecznie odtwarza kliniczne wady chrząstki, stanowiąc cenny model do badania ich patologii i opracowywania innowacyjnych metod terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chrząstka jest niezbędna do zachowania mechanicznej kompetencji układu szkieletowego poprzez zapewnienie beztarciowej powierzchni między kośćmi w stawach dwuskładnikowych, zapobiegając tym samym erozji powierzchni stawowej1. Zdolność chrząstki do wykonywania tych wymagających funkcji mechanicznych w dużej mierze zależy od unikalnego składu i organizacji jej macierzy zewnątrzkomórkowej – szczególnie od wyjątkowo wysokiej zawartości wody. Woda odgrywa kluczową rolę w budowie i funkcji chrząstki stawowej, stanowiąc około 70-80% jej składu. Woda jest głównym pierwiastkiem odpowiedzialnym za noszenie podczas ściskania. Zdolność tkanki do opierania się siłom ściskającym zależy od tego, jak woda jest zbudowana i ograniczona w macierzy. Taka organizacja jest możliwa dzięki interakcji wody z głównymi makrocząsteczkami chrząstki, takimi jak kolagen i proteoglikany, zwłaszcza agregaty związane kwasem hialuronowym1. Działają one jak struktury zabezpieczające, które regulują i ograniczają przepływ wody. Ta interakcja zapewnia tkance nie tylko sztywność, ale także odporność i zdolność do regeneracji po deformacji. Interakcja między wodą wolną, związaną wodą i macierzą makrocząsteczkową stanowi rdzeń biomechanicznego zachowania chrząstki2.

Pomimo niezwykłej zdolności do podtrzymywania i rozkładania obciążeń fizycznych i mechanicznych docierającej do stawów, po uszkodzeniu chrząstka stawowa (AC) ma ograniczony potencjał do samoistnej naprawy z powodu niskiej aktywności mitotycznej chondrocytów i słabej unaczynienia tkanek2. Uszkodzenie stawów zwykle wiąże się z postępującą utratą cząsteczek i białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które stanowią 95% tkanki i nadają AC3 cechy biomechaniczne. Nierównowaga między syntezą a degradacją komponentów ECM, przesuwająca się w kierunku procesów katabolicznych, może prowadzić do choroby zwyrodnieniowej stawów (OA), najpowszechniejszej choroby zwyrodnieniowej stawów na świecie. Choroba zwyrodnieniowa stawów dotyka około 10-12% dorosłych osób, powodując ból, ograniczając mobilność i znacząco ograniczając autonomię pacjentów4. Choroba zwyrodnieniowa stawów jest częściej występująca w starszych populacjach ze względu na kumulacyjne uszkodzenia stawu przez całe życie; Jednak z początkiem klinicznego stanu wiążą się różne czynniki ryzyka, takie jak płeć, predyspozycje genetyczne, otyłość oraz codzienne nawyki4. Do tej pory podejścia terapeutyczne do leczenia OA polegały na klinicznym leczeniu objawów oraz całkowitej zamiennicy stawu w najcięższych przypadkach5. Bez solidnej, powtarzalnej i niezawodnej strategii terapeutycznej skutecznego leczenia OA badane są innowacyjne podejścia do zrozumienia i rozwiązania problemów związanych z uszkodzeniem chrząstki stawowej.

Aby naprawić, zregenerować i poprawić ruchomość stawów w stawach artretycznych, postęp w medycynie regeneracyjnej stał się nową nadzieją na przywrócenie uszkodzonego AC 6,7. Wykorzystanie autologicznych chondrocytów w połączeniu z implantacją ECM i intraartykularnym wstrzykiwaniem komórek macierzystych stanowi obecny stan wiedzy w tej dziedzinie 8,9,10. Głównym wyzwaniem tych podejść jest zapewnienie odpowiedniej różnicacji i funkcjonalnej syntezy ECM przez wszczepione komórki. Chondrocyty autologiczne mają tendencję do tworzenia włóknistości chrząstki lub przechodzenia do stanu przerostu, tworząc nową dysfunkcyjną tkankę, która nie odzwierciedla fizjologicznych cech AC, prowadząc do niepełnego powrotu do zdrowia i często późnego pogorszeniastanu stanu 11. Biomateriały mogą być wykorzystywane do kierowania zachowaniem komórek podczas regeneracji tkanek, zapewniając tymczasową konstrukcję, dzięki której komórki mogą się przyklejać i syntetyzować nową, naturalną i funkcjonalną macierz zewnątrzkomórkową 12,13,14. Idealny biomateriał do inżynierii chrząstki musi zapewnić silną integrację z otaczającymi tkankami, zwłaszcza z kością podchrząstkową, ponieważ awaria na tym styku zagraża długoterminowej naprawie. Jednak słabe wiązanie między warstwami chrząstki i kości rusztowania kostnego oraz słaba integracja z tkanką gospodarza pozostają poważnym wyzwaniem15. Chociaż rusztowania próbują naśladować rodzimą architekturę osteochondralną, odtworzenie złożonej mikrostruktury interfejsu nadal jest trudne. Podkreśla to znaczenie badań i rozwoju rusztowań o właściwościach biologicznych, które jednocześnie wspierają regenerację chrząstki i kości, zachowując stabilność interfejsu16. Żelatyna, pochodząca z kolagenu – kluczowego składnika tkanki chrząstki – posiada właściwości takie jak motywy wiążące komórki i biodegradowalność, co sugeruje jej potencjał jako biomateriału wspierającego w połączeniu z czynnikami regeneracyjnymi w leczeniu zmian kostchondralnych. Po chemicznej modyfikacji bezwodnikem metakrylu w celu powstania metakryloylu żelatynowego (GelMA), staje się on fotosieciowalny, umożliwiając iniekcję i fotopolimeryzację in situ, co zwiększa stabilność mechaniczną w zastosowaniach w medycynie regeneracyjnej17.

Zmiany osteochondralne mają ograniczoną zdolność regeneracyjną, co stanowi wyzwanie kliniczne. Badania przedkliniczne wykorzystujące modele urazów stawu kolanowego na dużych zwierzętach są niezbędne dla badań translacyjnych, ponieważ umożliwiają systematyczną ocenę zmiennych wpływających na mechanizmy choroby i efekty terapeutyczne. Najczęściej stosowane gatunki to świnie, kozy, psy, konie i owce, z których każdy ma specyficzne zalety i ograniczenia, które należy uwzględnić przy projektowaniu eksperymentów. Co więcej, wszystkie te gatunki wykazują ograniczoną endogenną naprawę defektów chondralnych i osteochondralnych, co zaobserwowano u ludzi18. Aby zapewnić, że modele te są przewidywalne dla wyników ludzkich, muszą odtwarzać istotne parametry, takie jak anatomia, fizjologia i właściwości biomechaniczne18. Dla porównania, grubość ludzkiej chrząstki stawowej w kłykciach udowych wynosi od 1,8 do 2 mm19, a średnica zmian chrząstki wymagających leczenia to 10 mm lubwiększa 20.

Model wieprzowy oferuje zalety w badaniach regeneracji chrząstki i kości kostnodźndralnej, ponieważ rozmiar stawów, grubość chrząstki oraz wymagania dotyczące obciążenia są bardzo podobne do tych obserwowanych u ludzi18. Niektóre miniaturowe rasy świń, takie jak miniświnia z Getyngi, są łatwe w obsłudze i osiągają dojrzałość szkieletową między 18 a 22 miesiącami życia21 lat. Grubość chrząstki waha się od 1 do 2 mm, a defekty 6 do 8 mm mogą powstać18 mm. Cechy kości, takie jak grubość trawek, szybkość aportacji kości oraz organizacja włókien kolagenowych, są porównywalne z cechami u ludzi22. Jednak model wieprzowy ma również ograniczenia: nawet u miniaturowych ras staw kolanowy (kolenowy) jest mniejszy niż u ludzi, co ogranicza powstawanie dużych wad eksperymentalnych. Ponadto większość badań wykorzystuje zwierzęta szkieletowo niedojrzałe ze względu na związane z tym koszty utrzymania, które mogą przeszacować potencjał naprawy23.

Kozy wykazują anatomię stawów, biomechanikę i grubość chrząstki podobne do ludzkiej24. Nie wymagają specjalistycznych udogodnień, są łatwe w obsłudze i stosunkowo niedrogie25. Grubość chrząstki koziej wynosi od 0,8 do 2,0 mm, a najczęściej zgłaszany krytyczny defekt to 6 mm26. Jednak istnieje znaczna różnica w grubości chrząstki między rasami, rozmiarami i płciami, co może prowadzić do niespójnych wyników27. Stosunek kości chrząstki do kości podchonidrowej oraz struktura kości trawekowej są również porównywalne z tymi u ludzi. Dojrzałość szkieletu następuje stosunkowo późno, między 24. a 36. miesiącem życia29 lat. Z biomechanicznego punktu widzenia kolano kozy doświadcza nacisków stawowych i obciążeń cyklicznych podobnych do ludzkich25, choć zgięcie kolana podczas chodu jest większe (50°-70° u kóz w porównaniu do <30° u ludzi), co skutkuje wyraźnymi obszarami kontaktu30. Ta różnica, w połączeniu z wyższym ciśnieniem szczytowym, może przyczyniać się do mniej efektywnej naprawy chrząstki30.

Wśród modeli dużych zwierząt psy wyróżniają się zdolnością do tolerowania rehabilitacji, unieruchamiania stawów oraz treningu do chodzenia na bieżni, pływania i kontrolowanych ćwiczeń obciążających18. Grubość chrząstki stawowej waha się od 0,9 do 1,3 mm, a krytyczny rozmiar defektu to około 4 mm, co ogranicza bezpośrednie porównanie do ludzkiego modelu25. Dojrzałość szkieletu występuje między 8,5 a 13,7 miesiąca życia31 lat. Anatomicznie kolano psa różni się od ludzkiego, a różnice w biomechanice, wzorcach obciążenia i dojrzałości między rasami komplikują ekstrapolację wyników32. Pomimo tych różnic anatomicznych i niewielkiego rozmiaru defektu, model psa pozostaje cenny w badaniach takich jak protokoły rehabilitacyjne lub spontaniczne patologie chrząstki podobne do tych u ludzi. Jednak jego zastosowanie eksperymentalne jest ograniczone przez względy etyczne29.

Model konia jest największym dostępnym modelem zwierzęcym do badań nad naprawą chrząstki i naturalnie rozwija zmiany chondralne związane z wiekiem lub urazami oraz chorobę zwyrodnieniową stawów podobną do tych u ludzi. Konie wykazują cechy anatomiczne i biomechaniczne porównywalne do ludzkich, takie jak wyprostowany staw kolanowy, duży rozmiar stawu, grubość chrząstki od 2 do 3 mm bliższa ludzkiemu – pełne wyprostowanie kolana podczas chodu oraz porównywalną gęstość mineralną kości34. Dojrzałość szkieletu występuje między 24 a 48 miesiącami, a rozmiary defektów powszechnie badanych wahają się od 6 do 20 mm32,33. Ograniczenia obejmują wysokie pionowe obciążenie stawu końskiego podczas poruszania się, które naraża implanty na większe siły niż u ludzi i utrudnia długotrwałe gojenie35. Ponadto koszty zakupu i utrzymania są wysokie, a specjalistyczne obiektysą wymagane 36.

Owce są szeroko wykorzystywane jako wzór w badaniach nad naprawą chrząstki ze względu na dostępność, łagodny temperament, dobrą tolerancję na operacje stawów oraz łatwość manipulacji37. Dojrzałość szkieletowa u owiec zwykle osiąga się około 2-3 lat w wieku25 lat. Ponadto kolano owcze wykazuje anatomiczne i biomechaniczne podobieństwa do ludzkiego stawukolanowego 38. Grubość chrząstki w kłykciu przyśrodkowym kości udowej waha się od 0,7 do 1,7 mm, a gęstość mineralna kości i ciśnienie kontaktowe są również porównywalne, choć frakcja objętości kości jest wyższa u owiec39. Ze względu na zmniejszoną grubość chrząstki, indukowane defekty często sięgają kości podchrząstki, co czyni ten model bardziej odpowiednim do badań wad osteochondralnych32. Zmiany o średnicy od 6 do 8 mm zwykle powstają w miejscach takich jak kłykcia udowe i krętka32. Ponadto model owiec oferuje zalety dla badań dwustronnych, umożliwiając porównywanie miejsc leczenia i kontroli w obrębie tego samego zwierzęcia, co zmniejsza zmienność związaną z gospodarzem, poprawia spójność i powtarzalność oraz minimalizuje liczbę zwierząt wymaganych40. Każdy model wykazuje różne stopnie podobieństwa do fizjologii i biomechaniki człowieka. Dlatego wybór modelu powinien równoważyć znaczenie biologiczne, praktyczną wykonalność oraz względy etyczne. W niniejszym badaniu uwzględniono samice owiec o zerowych zerwaczkach w wieku 12 miesięcy, oceniane w okresie sezonowego roztrusia.

Badanie miało na celu opracowanie skutecznego protokołu generowania ostrych defektów osteochondralnych u dużych zwierząt. Protokół polega na stworzeniu pełnogrubej zmiany kościowej w kości, aby stworzyć model odpowiedni do badań medycyny regeneracyjnej. Dodatkowo badane jest zastosowanie hydrożelu GelMA jako przewodnika do gojenia tkanek oraz jako prospektywnej metody dostarczania regeneracyjnych cząsteczek i komórek. Protokół określa procedurę chirurgiczną powstania zmian osteochondralnych w chrząstce stawowej kolan owcy. Jest adaptowalny do różnych zastosowań inżynierii tkankowej, w tym do indukcji podobnych urazów w innych modelach dużych zwierząt w medycynie regeneracyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie uzyskało zgodę Komitetu Etyki ds. Badań i zostało certyfikowane Certyfikatem Etycznej Prezentacji o numerze 6092250823/2023. W niniejszym badaniu wybrano dziewięć samic białego Suffolk w wieku 12 miesięcy. Wada powstała w obu przyśrodkowych kłykciach udowych każdego zwierzęcia. Puste defekty były używane jako kontrole. Każde zwierzę miało jedno kolano losowo przydzielone do leczenia GelMA, a drugie jako kontrolę. Ta strategia pozwoliła nam ocenić naturalną zdolność regeneracyjną i zmniejszyć wpływ indywidualnych wariantów, takich jak czynniki genetyczne czy dojrzałość szkieletowa. Zwierzęta były obserwowane przez 6 miesięcy w celu oceny powstawania chrząstki hejlinowej.

1. Zabieg znieczulający

  1. Pozbawić zwierzęta jedzenia i wody przez około 24 godziny przed zabiegiem chirurgicznym.
  2. Należy podawać domięśniową meperydynę 4 mg/kg w połączeniu z midazolamem 0,3 mg/kg.
  3. Napełnij waporyzator znieczulający dzień przed użyciem, gdy pomieszczenie jest puste, i noś rękawice ochronne, aby zminimalizować ryzyko narażenia zawodowego.
  4. Przed każdym zabiegiem sprawdź obwód znieczulający pod kątem nieszczelności i wykonuj wszystkie manipulacje w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa.
  5. Po 15 minutach kanuluj zwierzęta cewnikem 18 G i podawaj roztwór Ringera mlecznego z częstotliwością 10 mL∙kg-1∙h-1.
  6. Podawaj znieczulenie dożylne z użyciem 1% propofolu w dawce 4 mg/kg.
  7. Intubuj zwierzęta rurką endotracylną o długości 7,5-8,0 mm i utrzymuj je pod samoistą wentylacją za pomocą półzamkniętego, okrągłego systemu oddychania, który dostarcza tlen z FiO₂ 1,0 i przepływem 50 mL/kg.
  8. Stosuj technikę częściowej znieczulenia dożylnego (PIVA), utrzymuj propofol w ciągłej infuzji 0,1 mg∙kg-1 min-1 i dostosowuj stężenie izofluranu jedynie, aby uzyskać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego. Monitoruj głębokość znieczulenia przez cały czas zabiegu.
  9. Wykonaj blokady perineuralne nerwów udowych i rwy kulszowej, prowadzone przez lokalizator neurologiczny. Podawaj 0,2 mL/kg lidokainy 2% na każdą blokadę.
    UWAGA: Operacja powinna rozpocząć się dopiero po potwierdzeniu znieczulenia chirurgicznego (brak reakcji na mocne uszczypanie kopyta i brak napięcia szczęki).

2. Zabieg chirurgiczny in vivo

  1. Dezynfekuj ogolone kolano miejscowym środkiem antyseptykowym chlorheksydyną glukonianem i umieść zwierzę w pozycji grzbietowej dekubitu na sali operacyjnej.
  2. Zlokalizuj jamę stawową, dotykając kolana zwierzęcia, aby określić dokładne miejsce nacięcia. Wykonaj podwójnie zakrzywione nacięcie skórne (zaczynając dalej od bocznego nadkłykcia kości udowej, kończąc przyśrodkowo na poziomie guzowości piszczeli).
  3. Zidentyfikuj ścięgno rzepki, rzepkę, więzadło rzepkowe oraz przyśrodkową część torebki stawowej. Nacinaj torebkę, aby odsłonić kłykieć przyśrodkowy kości udowej. Nadmiernie rozciągnij kolano, aby zobaczyć najbardziej dalszy obszar chrząstki stawowej kłykciu.
  4. Wykonaj chirurgiczne nacięcie o długości około 3-5 cm w okolicy kłykcia zwierzęcia. Usuń warstwy tkanek pod skórą, aby uzyskać dostęp do kłykcia i utrzymuj miejsce nacięcia w czystości, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  5. Zbieraj płyn maziowy za pomocą strzykawki i igły. Przenieś część próbki do probówki EDTA do analizy i wykorzystaj pozostały materiał do przygotowania szkiełek rozmazowych.
  6. Ustaw pchlery tak, aby całkowicie odsłonić powierzchnię kłykciu. Im bardziej odsłonięty jest kłykcik, tym łatwiej będzie wywołać uraz w kolejnym etapie.
    UWAGA: W tym momencie zwracaj uwagę na łapę zwierzęcia. Zgięcie lub wyprostowanie kolana może pomóc odsłonić kłykciu.
  7. Wierć defekt o średnicy 8 mm i głębokości 5 mm w centrum kłykcia przyśrodkowego kości udowej za pomocą wiertła ortopedycznego wyposażonego w wiertło trefinowe o średnicy 8 mm, zapewniając prawidłowe ustawienie i unikanie niezamierzonych wymiarów lub kształtów, oraz utrzymując kąt 0° względem najbardziej dalszego obszaru chrząstki stawowej.
    UWAGA: Trepanację wykonuj z najniższą możliwą prędkością, delikatnie obsługując sterowanie wiertłem i używając tylko tyle rotacji, by przeciąć chrząstkę i kość podchęstną, a także lokalnie chłodzić z 0,9% NaCl w temperaturze pokojowej, nawet przy niskiej prędkości.
  8. Wykonaj chirurgiczne usunięcie korka osteochondralnego za pomocą ortopedycznego młotka i osteotomu.
  9. Oczyść przedłużenie rany sterylną gazą, upewniając się, że wnętrze zmiany jest wolne od krwi i zanieczyszczeń tkanek.
  10. Nałóż 200 μL płynnej formuły GelMA o stężeniu 20% (w/v), zawierającej 0,25% (w/v) litowofenyl-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian (LAP) jako inicjator fotoinicjatora do wnętrza urazu, aż dotrze do powierzchni.
  11. Foto-krzyżowanie hydrożelu GelMA pod diodą LED 395-405 nm (łączna moc 9 W) umieszczoną około 5 cm od próbki przez 180 s. W tych warunkach szacowana ilość naświetlenia na powierzchni wynosi ~10 mW/cm², co daje łączną energię ekspozycji około 1,8 J/cm².
    UWAGA: Używaj ochronnych okularów podczas korzystania ze światła ultrafioletowego.
  12. Ostrożnie wyjmij rozciągacze.
  13. Zamknąć zmianę za pomocą niezależnych szwów w różnych warstwach tkanek, aby zapobiec powstawaniu seromów. Liczba potrzebnych szwów zależy od zakresu nacięcia chirurgicznego.
  14. Załóż sterylny bandaż na szwy, aby zapobiec infekcjom.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Monitoruj zwierzęta podczas rekonwalescencji po znieczuleniu, w tym parametry życiowe, takie jak tętno (70-90 uderzeń/min), częstość oddechu (12-20 oddechów/min), temperatura ciała (39 °C do 40,5 °C) oraz prawidłowe błony śluzowe z czasem uzupełnienia przez kapilary 1-2 s. Regularnie palpuj tętnice twarzowe i udowe, aby sprawdzić, czy puls jest łatwo wyczuwalny.
    UWAGA: Odzyskiwanie znieczulenia powinno odbywać się w cichym, czystym, ciepłym, wyściełanym środowisku, przy minimalnym oświetleniu i niskim poziomie hałasu.
  2. Wykonaj opatrunki na miejscu operacji z użyciem miejscowej penicyliny (benzathine penicylina G: 1 250 000 IU; prokaina penicylina G: 1 250 000 IU; dihydrostreptomycyna: 1,25 g; mocznik: 2,50 g) raz dziennie przez 10 dni.
  3. Upewnij się, że zwierzęta pozostają w pozycji czworonożnej zaraz po przebudzeniu z narkozy, opierają się na operowanej kończynie i nie wykazują żadnych oznak dyskomfortu.
  4. Pooperacyjne leczenie obejmowało meloksykam (0,4 mg/kg co 24 godziny) oraz tramadol (2 mg/kg co 12 godzin) przez 5 dni. Dodatkową dawkę tramadolu podano, gdy mimika związana z bólem została zidentyfikowana za pomocą Sheep Grimace Scale41, zweryfikowanego narzędzia opartego na konkretnych jednostkach ruchu twarzy (w tym zaciskaniu oczodołu, reakcji flehmena, pozycji ucha i pozycji głowy) do oceny bólu i dyskomfortu pooperacyjnego u owiec.

4. Analiza histologiczna

  1. Sześć miesięcy po zabiegu operacyjnym przeprowadź eutanazję. Aby osiągnąć głęboką sedację przed podaniem środka eutanazji, należy podawać zwierzętom dożylnie ketaminę (10 mg/kg) i ksylazynę (1 mg/kg), stosując dawki celowo wyższe niż zwykle zalecane w procedurach klinicznych, aby zapewnić szybkie począcie głębokiej sedacji, zgodnie z przyjętymi protokołami eutanazji. Następnie podaj propofol, aby wywołać śpiączkę znieczuloną. Następnie podawaj chlorek potasu w dawce 2 mEq/kg dożylnie, aż do zatrzymania oddechu i sercowo-naczyniowego zatrzymania się, a wszelkie odruchy ochronne znikną.
  2. Przeciąć dalszą epifię kości udowej, aby usunąć obszar kłykciów. Utrwal rozcięte stawy kolanowe w 10% neutralno-buforowanej formalinie i odwapniał w 5% EDTA (kwas etylendiaminetetraoctowy) w temperaturze 34 °C, zmieniając roztwór EDTA co 3 dni.
  3. Materiał osadzić w parafinie i pociąć na sekcje o wymiarach 4 μm. Usuń parafinę ze szkiełek, mocząc je w ksylenie w 65 °C przez 3 x 5 minut. Nawadnij się 10-20 razy zanurzając w etanolu (99%, 95%, 70%), a następnie przez 5 minut i42 minuty w wodzie dejonizowanej.
  4. W barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E) barw przekroje hematoksyliną Harrisa i kontrbarw eozyną, skanuj z powiększeniem 20× za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu szkiełkowego i analizuj za pomocą powiązanego oprogramowania.
  5. Ocena zmiany według inicjatywy histopatologicznej Osteoarthritis Research Society International (OARSI)43: wynik 0 wskazuje na prawidłową chrząstkę; wynik 1 oznacza migotanie powierzchowne bez utraty chrząstki; wynik 2 odpowiada pionowym szczelinom sięgającym warstwy bezpośrednio pod strefą powierzchniową, którym towarzyszy częściowa utrata warstwy powierzchniowej; wynik 3 wskazuje na pionowe szczeliny lub erozję, które rozciągają się na zwapniałą chrząstkę i dotykają mniej niż 25% powierzchni stawowej; Wyniki 4, 5 i 6 oznaczają pionowe szczeliny lub erozję, które sięgają zwapniałej chrząstki i obejmują odpowiednio 25-50%, 50-75% oraz ponad 75% powierzchni stawowej.
    UWAGA: W tym badaniu zmiany z pionowymi szczelinami lub erozjami sięgającymi w zwapniałą chrząstkę i obejmujące ponad 25% powierzchni stawowej otrzymały wynik 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukcja defektu kości krążeniowej

Celem tego badania było opracowanie efektywnego protokołu indukującego ostre defekty osteochondralne u dużych zwierząt. Urazy powstały mechanicznie podczas zabiegu chirurgicznego, co skutkowało uszkodzeniem o średnicy około 8 mm i głębokości 5 mm (Rysunek 1). Biorąc pod uwagę wyniki ustalone przez International Cartilage Regeneration & Condition Preservation Society, ten typ urazu stanowi zmianę stopnia 4, defini...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby pokonać wyzwania w terapii chrząstki, takie jak niewystarczająca różnicacja chondrogenowa i dojrzewanie ECM, pozostają niezbędne badania niekliniczne do oceny strategii terapeutycznych. Metody nieklinicznych modeli uszkodzonej tkanki chrząstki zostały wcześniej opisane przy użyciu różnych technik45. Jednak literatura wciąż nie zawiera szczegółowych raportów ani ustandaryzowanych procedur wywoływania ostrego urazu kości kostczonioralnej u kolan dużych zwierząt, co powoduje znaczne zróżnicowanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Fundację Araucaria (grant numer PDT2020221000005). Dziękujemy całemu personelowi Instytutu Carlosa Chagasa oraz Programu Rozwoju Technologicznego w Narzędziach Zdrowotnych-RPT-FIOCRUZ za korzystanie z laboratorium mikroskopowego w FIOCRUZ/PR, Core of Cell Technology oraz Farmie Eksperymentalnej Uniwersytetu Katolickiego do Parana. Autorzy dziękują wsparciu finansowemu ze strony Programu de Estímulo à Pesquisa do Instituto Carlos Chagas – Fiocruz Paraná. Dziękujemy także Wagnerowi Nagibowi z Biura Komunikacji Instytutu Carlosa Chagasa za jego wkład w produkcję audiowizualną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
25 nici szwów poliglekaprinowych, nr 2-0EthiconNitka sza do ogólnego zamknięcia tkanek miękkich była używana do zszywania torebki stawowej i tkanki komórkowej podskórnej.
Przeciwciała przeciw-beta;-TubulinaInvitrogenPA516863Przeciwciała przeciwko β-tubulinie, czyli dwóm podjednostkom (&alfa;/β) tworzącym mikrotubule cytoszkieletu
Urządzenie znieczulająceHB hospitalarSprzęt do znieczulenia inhalacyjnego
Axio Scan Z1Zeiss, Monachium, NiemcyMikroskop
Benzatyna penicylina GOurofinoAntybiotyki
Cewnik 18 G SolidorCewnik dożylny
CefaleksynaVirbacTerapia przeciwdrobnoustrojowa
Roztwór wodny diglukonianu chlorheksydinyRIOQU Í MICAŚrodek antyseptyczny stosowany w leczeniu przeciwsepsy skóry
Skrzynka endotchawicowa 7,5 i zaciśnięta; 8,0 mmSolidorSkrzyniona rurka endotchealna z mankietami
DAPISigmaD9542Barwnik fluorescencyjny
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy DulbeccoGibco12100-046
Medium hodowlane komórek
Siarczan dihydrostreptomycynyOurofinoAntybiotyki
Rurka EDTABecton Dickinson362788Rurka zbiorcza
EosinNeon1795Barwnik używany do wizualizacji morfologii komórek, barwienia   cytoplazma.
Kwas etylendiaminetetraoctowySigmaE5134Sprzyja stopniowej demineralizacji tkanki kostnej
Serum bydlęce płodoweGibco12657-029Suplement do hodowli komórkowej z czynnikami wzrostu
FormalinaSigma-Aldrich47608Zachowanie morfologii tkanek
GelMA LiofilizowanyTissueLabsGLMA-LYO-1Hydrożel fotokrzyżowy
Harris hematoksylina  Laborclin620503Barwnik używany do wizualizacji morfologii komórek, barwienia jąder.
IsofluranoCristá LiaUtrzymanie znieczulenia
Ketamina 10%VETNILProcedura eutanazji
Rozwiązanie Ringera z laktacjąFresenius KabiTerapia płynami
L-Glutamina 200 mMGibco25030-081Aminokwas niezbędny do hodowli komórkowej
Lidokaina chlorowodorek Cristá LiaZnieczulenie miejscowe
Zestaw żywotności/żywotności ŻYWYCH/MARTWYCHInvitrogenL3224Zestaw do testowania fluorescencyjnego do oceny żywotności komórek
MeloksykamOuro finoPrzeciwzapalne i przeciwbólowe w okresie pooperacyjnym
Chlorowodorek midazolamuCristá LiaLeki preanestezjowe
Nić do szwów mononylonowych, nr 3-0EthiconSzew stosowany do zamykania skóry
NaCl 0,9%CristaliaRoztwór soli fizjologicznej
Lokalizator neuroNeurolocalizador DL 250 DeltaLifeZnieczulenie miejscowe prowadzone przez neurolokalizator i elektrostymulator nerwów obwodowych.
Ortopedyczne ćwiczeniaKanulowany Mini Ortopedyczny Wiertar (delikatny) - chromowany mandrel - marka MakitaStosowane w operacjach ortopedycznych.
Młotek ortopedyczny  EdloHammer Neufield (10-3155)Ogólne cechy: 20 cm długości i 560 gr wagi; materiał: wysokiej jakości stal nierdzewna; Zastosowanie: Wskazane do zabiegów traumatologicznych i ortopedycznych wymagających kontrolowanego uderzenia. Certyfikaty: produkty posiadają certyfikaty jakości, takie jak ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjną): 13485:2016, z europejskimi standardami zgodności i dobrych praktyk produkcyjnych.
Osteotom lambotteEdloOsteotom lambotte (10-0749)Osteotom Lambotte (6 mm x 17 cm / 6 3/4") to precyzyjny instrument chirurgiczny stosowany głównie w chirurgii ortopedycznej oraz procedurach neurochirurgicznych związanych z manipulacją kośćmi.

Z końcówką o szerokości 6 mm jest idealny do delikatnych cięć, przekształcania oraz usuwania zwartej chrząstki i kości podchrząstki.
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122Antybiotyk o szerokim spektrum szeroko stosowany w hodowli komórek
chlorowodorek petydyny Cristá LiaLeki preanestezjowe
Chlorek potasu 19,1%SamtekowieProcedura eutanazji
Prokaina penicylina GOurofinoAntybiotyki
PropofolCristá LiaIndukcja i utrzymanie znieczulenia
Mleczan RingeraCristá LiaTerapia płynami
Półzamknięty system oddychania kołowego;HB hospitalarObwód oddechowy w znieczuleniu
Sterylny plaster z krepyCremerSterylny opatrunek z krepy, używany do zakrycia dalszych końców kończyn poddawanych operacji.
Stimuplex D, 22 Ga. x 2 cale. (50 mm) Igła izolowana z zestawem przedłużającym 30 stopni; Faza (STIMD2250/30)BBRAUNZnieczulenie miejscowe w obwodzie nerwowym
Chlorek tramadoluCristá LiaAnalgezja pooperacyjna
Trephine DrillBone Trephine Drill, średnica mm & ndash; model: Contra-angle, marka: chirurgiczny WFWiertło Trephine do zbierania kości 8,0 mm; produkowany ze stali chirurgicznej; stosowane w operacjach przeszczepów kości; Służy do usunięcia bloku kostnego na potrzeby analizy histologicznej lub autograftu.
Xylazyna 10%VETNILProcedura eutanazji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Q., et al. An ultrasound study of altered hydration behaviour of proteoglycan-degraded articular cartilage. BMC Musculoskelet Disord. 14, 289(2013).
  2. Cederlund, A. A., Aspden, R. M. Walking on water: revisiting the role of water in articular cartilage biomechanics in relation to tissue engineering and regenerative medicine. J R Soc Interface. 19 (193), 20220364(2022).
  3. Gahunia, H. K., Pritzker, K. P. H. Effect of exercise on articular cartilage. Orthop Clin North Am. 43 (2), 187-199 (2012).
  4. Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (7), 437-441 (2014).
  5. Rahmati, M., Nalesso, G., Mobasheri, A., Mozafari, M. Aging and osteoarthritis: central role of the extracellular matrix. Ageing Res Rev. 40 (1), 20-30 (2017).
  6. Zhang, L., Hu, J., Athanasiou, K. A. The role of tissue engineering in articular cartilage repair and regeneration. Crit Rev Biomed Eng. 37, 1-57 (2009).
  7. Coccia, M. Cartilage tissue engineering with chondrogenic cells versus artificial joint replacement: the insurgence of new technological paradigms. Health Technol. 2, 235-247 (2012).
  8. Muhammad, H., et al. Human migratory meniscus progenitor cells are controlled via the TGF-β pathway. Stem Cell Rep. 3, 789-803 (2014).
  9. Shen, W., et al. Intra-articular injection of human meniscus stem/progenitor cells promotes meniscus regeneration and ameliorates osteoarthritis through stromal cell-derived factor-1/CXCR4-mediated homing. Stem Cells Transl Med. 3, 387-394 (2014).
  10. Gille, J., et al. Outcome of autologous matrix-induced chondrogenesis (AMIC) in cartilage knee surgery: data of the AMIC registry. Arch Orthop Trauma Surg. 133, 87-93 (2012).
  11. Richardson, S. M., et al. Mesenchymal stem cells in regenerative medicine: focus on articular cartilage and intervertebral disc regeneration. Methods. 99, 69-80 (2016).
  12. Kang, H., et al. In vivo cartilage repair using adipose-derived stem cell-loaded decellularized cartilage ECM scaffolds. J Tissue Eng Regen Med. 8, 442-453 (2012).
  13. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomater. 74, 74-89 (2018).
  14. Sun, Y., Yan, L., Chen, S., Pei, M. Functionality of decellularized matrix in cartilage regeneration: a comparison of tissue versus cell sources. Acta Biomater. 74, 56-73 (2018).
  15. Niu, X., Li, N., Du, Z., Li, X. Integrated gradient tissue-engineered osteochondral scaffolds: challenges, current efforts and future perspectives. Bioact Mater. 20, 574-597 (2023).
  16. Deng, C., et al. Bioactive scaffolds for regeneration of cartilage and subchondral bone interface. Theranostics. 8, 1940-1955 (2018).
  17. Armiento, A. R., Alini, M., Stoddart, M. J. Articular fibrocartilage: why does hyaline cartilage fail to repair. Adv Drug Deliv Rev. 146, (2018).
  18. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Eng Part B Rev. 16, 105-115 (2010).
  19. Pane, R. V., Setiyaningsih, R., Widodo, G., Al Hajiri, A. Z. Z., Salsabil, J. R. Femoral cartilage thickness in knee osteoarthritis patients and healthy adults: an ultrasound measurement comparison. Sci World. 2023, e3942802(2023).
  20. Milano, F., Chevrier, A., De Crescenzo, G., Lavertu, M. Injectable lyophilized chitosan-thrombin-platelet-rich plasma implant to promote tissue regeneration: in vitro and ex vivo solidification properties. Polymers. 15 (13), 2919(2023).
  21. Dias, I. R., Viegas, C. A., Carvalho, P. P. Large animal models for osteochondral regeneration. Osteochondral tissue engineering. , 441-501 (2018).
  22. Fernandes, T. L., et al. Development of a novel large animal model to evaluate human dental pulp stem cells for articular cartilage treatment. Stem Cell Rev. 14, 734-743 (2018).
  23. González Vázquez, A. G., et al. Systematic comparison of biomaterials-based strategies for osteochondral and chondral repair in large animal models. Adv Healthc Mater. 10, e2100878(2021).
  24. Brehm, W., et al. Repair of superficial osteochondral defects with an autologous scaffold-free cartilage construct in a caprine model: implantation method and short-term results. Osteoarthritis Cartilage. 14, 1214-1226 (2006).
  25. Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. J Exp Orthop. 3, (2016).
  26. Getgood, A. M. J., et al. Evaluation of early-stage osteochondral defect repair using a biphasic scaffold based on a collagen-glycosaminoglycan biopolymer in a caprine model. Knee. 19, 422-430 (2012).
  27. Cook, J. L., et al. Animal models of cartilage repair. Bone Joint Res. 3, 89-94 (2014).
  28. Jackson, D. W., Lalor, P., Aberman, H. M., Simon, T. M. Spontaneous repair of full-thickness defects of articular cartilage in a goat model. J Bone Joint Surg Am. 83, 53-64 (2001).
  29. Meng, X., et al. Animal models of osteochondral defect for testing biomaterials. Biochem Res Int. 2020, 1-12 (2020).
  30. Patil, S., Steklov, N., Song, L., Bae, W. C., D'Lima, D. D. Comparative biomechanical analysis of human and caprine knee articular cartilage. Knee. 21, 119-125 (2014).
  31. Stewart, H. L., et al. A missed opportunity: a scoping review of the effect of sex and age on osteoarthritis using large animal models. Osteoarthritis Cartilage. 32, 501-513 (2024).
  32. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. Knee. 19, 493-499 (2012).
  33. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone Joint Res. 1, 297-309 (2012).
  34. Liu, T. P., et al. Updates on mesenchymal stem cell therapies for articular cartilage regeneration in large animal models. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
  35. Murray, R. C., Vedi, S., Birch, H. L., Lakhani, K. H., Goodship, A. E. Subchondral bone thickness, hardness and remodelling are influenced by short-term exercise in a site-specific manner. J Orthop Res. 19, 1035-1042 (2001).
  36. Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis Cartilage. 20, 1147-1151 (2012).
  37. Kon, E., et al. Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial. J Orthop Res. 28, 116-124 (2009).
  38. Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. The surgical anatomy of the stifle joint in sheep. Vet Surg. 27, 596-605 (1998).
  39. Chevrier, A., Kouao, A. S. M., Picard, G., Hurtig, M. B., Buschmann, M. D. Interspecies comparison of subchondral bone properties important for cartilage repair. J Orthop Res. 33, 63-70 (2015).
  40. Orth, P., et al. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19, 885-891 (2013).
  41. Häger, C., et al. The sheep grimace scale as an indicator of post-operative distress and pain in laboratory sheep. PLOS ONE. 12, e0175839(2017).
  42. Smart, A., et al. Protocol for tissue processing and paraffin embedding of mouse brains following ex vivo MRI. STAR Protoc. 4, 102681(2023).
  43. Glasson, S. S., Chambers, M. G., van den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative: recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  44. Sprecher, D. J., Hostetler, D. E., Kaneene, J. B. A lameness scoring system that uses posture and gait to predict dairy cattle reproductive performance. Theriogenology. 47, 1179-1187 (1997).
  45. Hunziker, E. B. Articular cartilage repair: basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects. Osteoarthritis Cartilage. 10, 432-463 (2002).
  46. Ahern, B. J., Parvizi, J., Boston, R., Schaer, T. P. Preclinical animal models in single-site cartilage defect testing: a systematic review. Osteoarthritis Cartilage. 17, 705-713 (2009).
  47. Maglio, M., Brogini, S., Pagani, S., Giavaresi, G., Tschon, M. Current trends in the evaluation of osteochondral lesion treatments: histology, histomorphometry and biomechanics in preclinical models. Biomed Res Int. 2019, 1-27 (2019).
  48. Bell, A. D., et al. Bone-induced chondroinduction in sheep Jamshidi biopsy defects with and without treatment by subchondral chitosan-blood implant. Cartilage. 4, 131-143 (2012).
  49. Levingstone, T. J., et al. Multi-layered collagen-based scaffolds for osteochondral defect repair in rabbits. Acta Biomater. 32, 149-160 (2016).
  50. Jia, S., et al. Multilayered scaffold with a compact interfacial layer enhances osteochondral defect repair. ACS Appl Mater Interfaces. 10, 20296-20305 (2018).
  51. Schinhan, M., Bijak, M., Unger, E., Nau, T. Electromyographic study of the popliteus muscle in the dynamic stabilization of the posterolateral corner structures of the knee. Am J Sports Med. 39, 173-179 (2011).
  52. Bernstein, A., et al. Microporous calcium phosphate ceramics as tissue engineering scaffolds for the repair of osteochondral defects: histological results. Acta Biomater. 9, 7490-7505 (2013).
  53. Crovace, A. M., et al. Evaluation of in vivo response of three biphasic scaffolds for osteochondral tissue regeneration in a sheep model. Vet Sci. 6, 90(2019).
  54. Salerno, M., et al. Biomimetic tri-layered osteochondral scaffold: study of early implant stability in a sheep model. Bone Joint Res. 14, 953-968 (2025).
  55. Lewis, J. A., et al. A bioactive supramolecular and covalent polymer scaffold for cartilage repair in a sheep model. Proc Natl Acad Sci U S A. 121, (2024).
  56. Tamaddon, M., et al. In vivo evaluation of additively manufactured multi-layered scaffold for the repair of large osteochondral defects. Bio-Des Manuf. 5, 481-496 (2022).
  57. Petrovova, E., et al. PHB/CHIT scaffold as a promising biopolymer in the treatment of osteochondral defects: an experimental animal study. Polymers. 13, 1232(2021).
  58. Saber, A. S., Bolbol, A. E., Schenk-Saber, B. A. A radiographic study of the development of the sheep carpus from birth to 18 months of age. Vet Radiol. 30, 189-192 (1989).
  59. Cambra-Moo, O., et al. Multidisciplinary characterization of long-bone cortex growth patterns through sheep ontogeny. J Struct Biol. 191, 1-9 (2015).
  60. Arens, D., et al. Seasonal changes in bone metabolism in sheep. Vet J. 174, 585-591 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Osteochondral DefectSheep ModelCartilage RegenerationJoint InjuryGelatin MethacryloylLarge Animal ModelHistological EvaluationOsteoarthritis ModelArticular CartilageSurgical Protocol

Powiązane artykuły