Method Article

Normalizacja uwalniania glicerolu oparta na MTT w celu dokładnego ilościowego określenia lipolizy w pierwotnych adipocytach najądrza szczura

DOI:

10.3791/68853

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1College of Bee Science and Biomedicine, Fujian Agriculture and Forestry University, 2School of Pharmacy and Medical Technology, Putian University, 3School of Medicine, Huaqiao University, 4Department of Pharmacy, Taining County General Hospital, 5School of Pharmacy, Fujian Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artefakty eksperymentalne, w tym wahania żywotności komórek i interferencja testu, utrudniają dokładne określenie ilościowe uwalniania glicerolu w pierwotnych adipocytach bogatych w lipidy. Aby złagodzić te wyzwania, stosuje się strategię normalizacji opartą na MTT w celu dostosowania pomiarów glicerolu do aktywności metabolicznej komórek, zwiększając w ten sposób wiarygodność kwantyfikacji lipolizy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipoliza, krytyczny szlak metaboliczny, polega na hydrolizie zmagazynowanych trójglicerydów do wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Jednak dokładna kwantyfikacja produkcji glicerolu w pierwotnych adipocytach bogatych w lipidy jest często mylona przez artefakty eksperymentalne, takie jak zmienność żywotności komórek i interferencja testu. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowano prostą metodę normalizacji pomiarów uwalniania glicerolu za pomocą testu żywotności komórek opartego na bromku 3-(4,5-dimetylotiazolu-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT). Protokół ten wykorzystuje różnicę w ciężarze właściwym między adipocytami a roztworami wodnymi, umożliwiając jednoczesną ocenę ilościową produkcji lipolitycznej i żywotności komórek. W eksperymentach przesiewowych z użyciem narkotyków prawastatyna i symwastatyna znacznie zwiększały uwalnianie glicerolu z adipocytów w jamie brzusznej, podczas gdy atorwastatyna i lowastatyna nie zmieniały znacząco produkcji glicerolu. Odkrycia te sugerują, że normalizacja oparta na MTT oferuje solidne i wygodne podejście do dokładnej oceny ilościowej lipolizy, z potencjalnymi zastosowaniami w odkrywaniu leków ukierunkowanych na otyłość i zespół metaboliczny. Badanie to podkreśla potrzebę ponownej oceny konwencjonalnych testów lipolizy w celu odróżnienia prawdziwych odpowiedzi metabolicznych od niespecyficznego przecieku błonowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkankę tłuszczową można podzielić na białą tkankę tłuszczową (WAT) i brunatną tkankę tłuszczową (BAT)1. WAT pełni funkcję magazynowania nadmiaru energii w postaci trójglicerydów, podczas gdy BAT pełni funkcję wytwarzania ciepła w celu utrzymania temperatury ciała, która przekształca energię chemiczną w energię cieplną pod wpływem stymulacji zimna1. Tkanka tłuszczowa pełni również funkcję hormonalną2. Może wydzielać różne hormony, cytokiny i metabolity (zbiorczo określane jako adipokiny) i kontrolować równowagę energetyczną organizmu poprzez regulację zachowań związanych z poszukiwaniem pożywienia z ośrodkowego układu nerwowego i aktywności metabolicznej otaczających tkanek2.

Lipoliza to stopniowy proces hydrolizy lipidów wewnątrzkomórkowych pod wpływem szeregu enzymów lipolitycznych 3,4. W adipocytach lipidy są magazynowane głównie w kropelkach lipidów w postaci trójglicerydów5. Kropelki lipidów są pokryte białkiem z rodziny perylipiny związanym z kropelkami lipidów, które zapobiega hydrolizie trójglicerydów przez enzymy lipolityczne 6,7. Jednak gdy sygnał lipolizy jest wzmocniony, poziomy ekspresji rodziny perylipiny w adipocytach są zmniejszone, a enzymy lipolityczne dostają się do kropelek lipidów 3,4. W konsekwencji trójglicerydy rozkładają się na glicerol i wolne kwasy tłuszczowe 3,4,5.

Lipoliza, czyli rozkład zmagazynowanych trójglicerydów na glicerol i wolne kwasy tłuszczowe, jest podstawowym procesem metabolizmu adipocytów8. Podczas gdy bezpośredni pomiar produktów lipolizy, takich jak glicerol, dostarcza cennych informacji, dokładna kwantyfikacja była trudna, szczególnie w zawieszonych adipocytach pierwotnych z powodu błędów operacyjnych wynikających z różnic w liczbie komórek między grupami eksperymentalnymi. Badanie to miało na celu sprostanie temu wyzwaniu poprzez zastosowanie testu żywotności komórek w celu normalizacji kwantyfikacji uwalniania glicerolu z pierwotnych adipocytów jamy brzusznej szczura. Standaryzując metodę pomiaru, znormalizowany test uwalniania glicerolu został zastosowany jako potencjalne narzędzie do odkrywania leków ukierunkowanych na otyłość i zespół metaboliczny w adipocytach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykorzystuje różnicę w ciężarze właściwym między adipocytami a roztworami wodnymi, aby umożliwić jednoczesny pomiar uwalniania glicerolu (jako wskaźnika lipolizy) i żywotności komórek bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) w tych samych dołkach płytki 96-dołkowej, usprawniając w ten sposób przebieg eksperymentu i zwiększając wydajność.

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi ARRIVE i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (publikacja NIH nr 8023, poprawiona w 1978 r.). Protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (numer zatwierdzenia 202112, zatwierdzony 5 maja 2021 r.). Samce szczurów rasy Wistar wykorzystane w tym badaniu miały co najmniej 8 tygodni i masę ciała ≥200 g w standardowych warunkach inwentarskich. Pobrano białą tkankę tłuszczową najądrza z typową wydajnością 0,6-0,8 g na szczura. Warto zauważyć, że starsze szczury lub osoby karmione dietą wysokotłuszczową wykazywały znacznie zwiększoną masę białej tkanki tłuszczowej (często 1,5-3 g), co wymagało proporcjonalnego dostosowania stężeń enzymów trawiennych (np. kolagenazy) w celu utrzymania stałej wydajności dysocjacji tkanek. Wyłączne wykorzystanie samców szczurów pozwoliło uniknąć potencjalnych zakłóceń spowodowanych wahaniami hormonalnymi cyklu rujowego samic. Selekcja szczepów (np. Sprague-Dawley, Wistar lub Long-Evans) była konsekwentnie utrzymywana w eksperymentach, aby zapewnić jednorodność genetyczną w odpowiedziach tkanki tłuszczowej. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja pierwotnych adipocytów brzusznych szczura

  1. Znieczulić dorosłego samca szczura rasy Wistar wstrzyknięciem dootrzewnowym 7% hydratu chloralu (rozpuszczonego w destylowanymH2O) (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
  2. Potwierdź pełne znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma reakcji odruchowych, a następnie wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych.
  3. Ostrożnie usuń trzewną tkankę tłuszczową z lewej i prawej strony poduszeczki tłuszczowej najądrza.
    UWAGA: Adipocyty najądrza są stosunkowo duże i wyporne, co ułatwia separację i analizę.
  4. Przenieść pobraną tkankę do roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami (PBS; Rysunek 1A).
  5. Umyj tkankę dwukrotnie PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, w tym przylegające naczynia krwionośne i skrzepy krwi.
  6. Umytą chusteczkę pokrój na małe kawałki.

2. Oczyszczanie pierwotnych adipocytów brzusznych szczura

  1. Inkubować wypreparowaną tkankę tłuszczową z trypsyną i kolagenazą typu II (10 mg w 10 ml roztworu trypsyny) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny pod wstrząsem.
  2. Przefiltruj strawioną tkankę tłuszczową przez sitko komórkowe (ryc. 1A).
  3. Odwirować filtrat o sile 120 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałej aktywności enzymatycznej.
  4. Przenieś zawieszone adipocyty (górna biała warstwa) do czystej probówki i umyj je PBS.
  5. Odwirować filtrat o stężeniu 120 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia PBS.
  6. Inkubować przefiltrowane adipocyty (górna biała warstwa) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny i streptomycyny nie dłużej niż 30 minut.

3. Analiza uwalniania glicerolu

  1. Wysiewaj przefiltrowane adipocyty (10,4-10,5 komórek na dołek; 200 μl) na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek.
    UWAGA: Adipocyty oznaczono ilościowo za pomocą standardowego hemocytometru. Ze względu na duże różnice w wielkości adipocytów, niektórych większych komórek nie można było dokładnie policzyć. Dlatego liczba komórek może nie odzwierciedlać dokładnie rzeczywistej liczby adipocytów. Głównym celem było osiągnięcie równomiernego rozmieszczenia komórek w studzienkach, a nie dokładna kwantyfikacja.
  2. Traktować adipocyty 0,05% dimetylosulfotlenku (DMSO; jako grupa kontrolna) i 50 μM atorwastatyny, prawastatyny, lowastatyny i symwastatyny przez 4 godziny w temperaturze 37 °C pod delikatnym wstrząsaniem.
    UWAGA: Te warunki leczenia są podane jako odniesienie i mogą być dostosowywane w razie potrzeby w oparciu o konkretne cele i projekt eksperymentu.
  3. Zebrać pożywkę do hodowli komórkowej (dolna czerwona warstwa), aby przeanalizować uwalnianie glicerolu, co wskazuje na początek lipolizy (ryc. 1B).
  4. Użyj komercyjnego zestawu do oznaczania uwalniania glicerolu, aby ocenić lipolizę adipocytów w odpowiedzi na różne zabiegi.
  5. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

4. Analiza żywotności komórek

  1. Rozpuść proszek MTT w stężeniu 5 mg/ml w destylowanym H₂O i wysterylizuj przez filtr 0,22 μm przed użyciem.
  2. Po analizie uwalniania glicerolu dodać roztwór MTT (do końcowego 0,5 mg/ml) do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  3. Przenieś zawieszone adipocyty (górna fioletowa warstwa) do czystej probówki zawierającej DMSO w celu analizy żywotności komórek (ryc. 1B).
  4. Krótko wiruj, aby rozpuścić fioletowe kryształy formazanu.
  5. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

5. Obliczanie normalizacji

  1. Przeprowadzić wszystkie doświadczenia w trzech egzemplarzach i powtórzyć cztery razy (n = 4).
    UWAGA: W każdym niezależnym eksperymencie (n = 4) adipocyty wyizolowano od trzech szczurów, a każdy warunek leczenia przeprowadzono w trzech egzemplarzach.
  2. Dla każdej grupy poddanej działaniu substancji należy podzielić wartość absorbancji uwalniania glicerolu przez odpowiednią wartość absorbancji żywotności komórek.
  3. Przedstaw dane jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).
    UWAGA: Średnia i SD zostały obliczone przy użyciu programu Microsoft Excel z funkcjami =ŚREDNIA(zakres) i =ODCH.STANDARDOWE. S(zakres). W przypadku porównań grupowych przeprowadzono niesparowane dwustronne testy t przy użyciu GraphPad Prism 6 z testem t-funkcji średnich porównawczych.
  4. Określ istotność statystyczną różnic między grupami za pomocą testu t-Studenta, przy czym wartość P mniejsza niż 0,05 jest uważana za statystycznie istotną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po wstępnych badaniach przesiewowych leków, statyny leków przeciwhiperlipidemicznych zastosowano do zbadania efektów lipolitycznych w adipocytach metodą znormalizowanego uwalniania glicerolu9.

Wpływ statyn na uwalnianie glicerolu z pierwotnych adipocytów jamy brzusznej szczura
Wpływ statyn na lipolizę w pierwotnych adipocytach jamy brzusznej szczura oceniano, traktując komórki 50 μM prawastatyny, symwastatyny, atorwastatyny, lowastatyny i 0,5% DMSO p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zapewnia dokładniejszą metodę pomiaru lipolizy w pierwotnych adipocytach obciążonych lipidami. Stwierdzono, że prawastatyna i symwastatyna indukują uwalnianie glicerolu i zmniejszają żywotność adipocytów najądrza szczura, podczas gdy atorwastatyna i lowastatyna nie wykazywały znaczącego wpływu. Podanie symwastatyny spowodowało minimalny wzrost uwalniania glicerolu z adipocytów. Aby rozwiązać ten problem, zastosowano test MTT w celu standaryzacji pomiaru lipolizy. Podejście to wykazało znaczną poprawę w ocenie ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub osobistych, które mogłyby wpłynąć na pracę opisaną w tym badaniu.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Uniwersytet Rolnictwa i Leśnictwa Fujian oraz Uniwersytet Putian (oba z Leo Tsui).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22-&mikro; M FiltrSangon Biotech Co., Sp. z o.o.F513165-0001Filtr strzykawkowy, system Aquo, sterylny
Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy bromek Sangon Biotech Co., Sp. z o.o.A600799-00011 gramów
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych Sangon Biotech Co., Sp. z o.o.F603204-0001sterylny
Sól wapniowa atorwastatynyChemiczny Kajmany10493-55 mg tabletki powlekania
Sitko do komórek Sangon Biotech Co., Sp. z o.o.F513450-0001Siatka sitowa 80
Hydrat chloraluSangon Biotech Co., Sp. z o.o.A500288-0250250 gramów
DimetylosulfotlenekSangon Biotech Co., Sp. z o.o.A460700-0100100 ml
Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco Średni Sangon Biotech Co., Sp. z o.o.E600003500 mL, wysoki poziom glukozy, sterylny
Surowica bydlęca płoduSangon Biotech Co., Sp. z o.o.E600001100 ml, sterylne
Zestaw do oznaczania kolorymetrycznego gliceroluChemiczny Kajmany10010755-9696 studni
LowastatynaChemiczny Kajmany10010338-55 mg tabletki powlekania
Dorosłe samce szczurów Uniwersytet PutiańskiWistar powiedział:około 10-12 tygodni
Roztwór penicyliny i streptomycyny Sangon Biotech Co., Sp. z o.o.B540732-001010 mL, sterylne
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSangon Biotech Co., Sp. z o.o.E607009-0500500 mL, sterylne, bez wapnia i magnezu
Sól sodowa prawastatynyChemiczny Kajmany10010343-55 mg tabletki powlekania
Simwastatyna Chemiczny Kajmany10010344-55 mg tabletki powlekania
Roztwór trypsyny Sangon Biotech Co., Sp. z o.o.E607003-0100100 mL, bez EDTA i czerwieni fenolowej, sterylne
Kolagenaza typu II Sangon Biotech Co., Sp. z o.o.A004174-0100100 mg tabletki powlekania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saely, C. H., Geiger, K., Drexel, H. Brown versus white adipose tissue: A mini-review. Gerontology. 58 (1), 15-23 (2012).
  2. Ahima, R. S., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. Trends Endocrinol Metab. 11 (8), 327-332 (2000).
  3. Lass, A., Zimmermann, R., Oberer, M., Zechner, R. Lipolysis - A highly regulated multi-enzyme complex mediates the catabolism of cellular fat stores. Prog Lipid Res. 50 (1), 14-27 (2011).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metab. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
  6. Blanchette-Mackie, E. J., et al. Perilipin is located on the surface layer of intracellular lipid droplets in adipocytes. J Lipid Res. 36 (6), 1211-1226 (1995).
  7. Sztalryd, C., Brasaemle, D. L. The perilipin family of lipid droplet proteins: Gatekeepers of intracellular lipolysis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1862 (10 Pt B), 1221-1232 (2017).
  8. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
  9. Mangione, C. M., et al. Statin use for the primary prevention of cardiovascular disease in adults: us preventive services task force recommendation statement. Jama. 328 (8), 746-753 (2022).
  10. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nat Metab. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  11. Roh, E., Yoo, H. J. The role of adipose tissue lipolysis in diet-induced obesity: Focus on vimentin. Diabetes Metab J. 45 (1), 43-45 (2021).
  12. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. J Biol Chem. 237, 3354-3358 (1962).
  13. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12827(2021).
  14. Miller, C. N., et al. Isoproterenol increases uncoupling, glycolysis, and markers of beiging in mature 3T3-L1 adipocytes. PLoS One. 10 (9), e0138344(2015).
  15. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (4), 242-258 (2019).
  16. Dias, S., Paredes, S., Ribeiro, L. Drugs involved in dyslipidemia and obesity treatment:Focus on adipose tissue. Int J Endocrinol. 2018, 2637418(2018).
  17. Redberg, R. F. Statins and weight gain. JAMA Intern Med. 174 (7), 1046(2014).
  18. Ferrieres, J., et al. Body mass index impacts the choice of lipid-lowering treatment with no correlation to blood cholesterol - Findings from 52,916 patients in the Dyslipidemia International Study (DYSIS). Diabetes Obes Metab. 20 (11), 2670-2674 (2018).
  19. Chait, A., Jden Hartigh, L. J. Adipose tissue distribution, inflammation and its metabolic consequences, including diabetes and cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 7, 22(2020).
  20. Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. J Clin Invest. 129 (10), 3990-4000 (2019).
  21. Reiter-Brennan, C., et al. ACC/AHA lipid guidelines: Personalized care to prevent cardiovascular disease. Cleve Clin J Med. 87 (4), 231-239 (2020).
  22. Sahebkar, A., et al. Statin therapy and plasma free fatty acids: a systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. Br J Clin Pharmacol. 81 (5), 807-818 (2016).
  23. Zhai, W., et al. Increased lipolysis in adipose tissues is associated with elevation of systemic free fatty acids and insulin resistance in perilipin null mice. Horm Metab Res. 42 (4), 247-253 (2010).
  24. Teusink, B., et al. Contribution of fatty acids released from lipolysis of plasma triglycerides to total plasma fatty acid flux and tissue-specific fatty acid uptake. Diabetes. 52 (3), 614-620 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipolysis QuantificationGlycerol ReleaseMTT AssayCell ViabilityPrimary AdipocytesRat Epididymal AdipocytesTriglyceride HydrolysisDrug ScreeningStatin EffectsMetabolic Syndrome

Related Articles