Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar przepuszczalności bariery jelitowej poprzez wykrywanie strumienia fluorescencyjnych znaczników przez monowarstwy ludzkiej kolonoidy

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68857

⸱

17 października 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy technikę pomiaru integralności bariery jelitowej, przy której szybkość translokacji znakowanego fluorescencyjnie cukru o znanej wielkości odzwierciedla przepuszczalność kolonoidów jelitowych człowieka pochodzenia tkankowego.

Streszczenie

Bariera jelitowa jest krytycznym miejscem regulacji między antygenami świetlnymi a układem odpornościowym gospodarza, a jej rozregulowanie jest związane z wieloma chorobami przewodu pokarmowego. Organoidy jelitowe mogą być użytecznym narzędziem do zrozumienia i modelowania różnic w integralności bariery jelitowej. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje ludzkie kolonoidy do ilościowego określenia funkcjonalnych różnic w barierze jelitowej poprzez pomiar strumienia znaczników fluorescencyjnych przez monowarstwy organoidów. Po wyhodowaniu monowarstw do konfluencji, dodajemy znacznik fluorescencyjny, taki jak dekstran FITC, do komory wierzchołkowej i wykrywamy jego translokację do komory podstawno-bocznej w czasie. Zwiększona translokacja znacznika fluorescencyjnego odzwierciedla bardziej przepuszczalną lub słabszą barierę nabłonkową. Protokół ten jest elastyczną platformą, która umożliwia ocenę różnic w funkcjonalnej barierze jelitowej w wielu stanach równolegle. Korzystając z wariantów tego protokołu, można ocenić przepuszczalność przeznabłonkową dla cząsteczek o różnej wielkości, kształcie i budowie chemicznej, a także różnice przepuszczalności w kontekście izolowanych zabiegów lub zmian mikrośrodowiskowych po wierzchołkowej lub podstawno-bocznej stronie komórek nabłonka. Pozwala to na głębsze zrozumienie mechanizmu i leczenia zaburzeń bariery w stanach chorobowych.

Wprowadzenie

Błona śluzowa jelit jest złożoną strukturą, która odgrywa ważną rolę w regulacji kontaktu między metabolitami, antygenami i drobnoustrojami w świetle jelita a układem odpornościowym i krążeniem jelitowym. Komórki nabłonka jelitowego są kluczowym elementem tego układu, a w zdrowych warunkach tworzą wysoce selektywną barierę. Transport przez nabłonek może zachodzić poprzez wiele mechanizmów: transkomórkowy transport aktywny lub bierny, parakomórkowe drogi porów lub przecieki regulowane przez połączenia ścisłe i połączenia adherens. To, czy którykolwiek z tych szlaków może być wykorzystany przez cząsteczkę do translokacji przez nabłonek, zależy od hydrofobowości, wielkości i struktury chemicznej. Po przekroczeniu nabłonka cząsteczki te mogą łatwiej wchodzić w interakcje z komórkami odpornościowymi błony śluzowej i przedostawać się do krążenia krwionośnego lub limfatycznego jelita 1,2 Przerwanie bariery jelitowej jest cechą charakterystyczną kilku chorób zapalnych przewodu pokarmowego, takich jak nieswoiste zapalenie jelit i celiakia 1,3,4,5,6,7. Uważa się, że ta osłabiona bariera jelitowa odgrywa rolę w patofizjologii tych procesów chorobowych poprzez rozregulowaną translokację antygenów patogennych, które mogą następnie wywołać miejscową lub ogólnoustrojową odpowiedź zapalną.

Istnieje kilka ustalonych protokołów pomiaru bariery jelitowej. W badaniach in vitro tradycyjnie wykorzystuje się linie komórek nowotworowych, takie jak komórki T84 lub Caco-2, do pomiaru przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) oraz do ilościowego określenia składników połączeń ścisłych i adherenów8. Ex vivo można wykonać pomiary prądu przeznabłonkowego za pomocą komór Ussinga na biopsji lub wyciętych próbkach jelita9. Badania in vivo zazwyczaj obejmują doustne podawanie obojętnych znaczników, a następnie pomiar wchłaniania tych znaczników przez krew lub mocz10,11. Chociaż techniki te okazały się przydatne w badaniu bariery jelitowej, mają kilka ograniczeń: przekształcone nieśmiertelne linie komórkowe z natury mają zmiany metaboliczne i cytoszkieletowe, które wpływają na barierę jelitową w słabo zdefiniowany sposób; dostęp do pacjentów, próbek pobranych od pacjentów lub organizmów modelowych może być ograniczony; Badania in vivo są trudne do kontrolowania pod kątem czynników zakłócających lub wyciągania wniosków na poziomie molekularnym. Tak więc, chociaż dowody na to zakłócenie bariery zostały zgłoszone w wielu modelach choroby, zrozumienie mechanizmu tych defektów bariery jelitowej pozostaje ograniczone, a nasza zdolność do celowania i leczenia tego aspektu choroby przewodu pokarmowego pozostaje nieuchwytna.

Ludzkie organoidy jelitowe oferują wyjątkową i ekscytującą zdolność do wyjaśniania przyczyn i leczenia wad bariery jelitowej. Organoidy jelitowe ludzkie pochodzenia tkankowego są pierwotnymi kulturami komórkowymi pochodzącymi z dorosłych komórek macierzystych znajdujących się u podstawy krypt jelitowych12. Komórki te można wyizolować z biopsji lub próbek chirurgicznych i hodować w celu utrzymania zmian genetycznych i epigenetycznych obserwowanych u pacjentów, od których pochodzą 13,14,15. Służą jako bardziej fizjologicznie odpowiedni model niż tradycyjne nieśmiertelne linie komórkowe, ponieważ nie mają zmian metabolicznych linii komórek rakowych i mogą być różnicowane w różne typy komórek obecne w dojrzałym nabłonku jelita 16,17,18. Ponadto, ponieważ mogą być rozszerzane in vitro, są bardziej dostępne i przydatne w kontrolowanych badaniach wpływu komórkowego różnych metod leczenia i warunków wzrostu równolegle. Chociaż istnieją ograniczenia nieodłącznie związane z modelami organoidów jelitowych, w szczególności brak innych typów komórek nienabłonkowych i kontekst całego układu ciała, wykazano, że organoidy jelitowe człowieka stanowią wiarygodny model dla wielu aspektów choroby przewodu pokarmowego13.

Wśród nich wykazano, że organoidy jelitowe ściśle modelują defekty bariery jelitowej, wykazując oczekiwane zmiany w organizacji połączeń ścisłych i TEER w przypadku uszkodzeń bariery 19,20,21. Tutaj adaptujemy jedną technikę oceny integralności bariery w ludzkich kolonoidach, w której wykrywany jest strumień fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek przez monowarstwy organoidów22. W tym protokole organoidy są hodowane i dojrzewają do postaci spolaryzowanych dwuwymiarowych monowarstw na półprzepuszczalnych membranach. Test polega na dodaniu znacznika fluorescencyjnego do wierzchołkowej powierzchni monowarstwy nabłonka, a jego obecność po przeciwnej stronie jest określana ilościowo w czasie. Zwiększony strumień znacznika odzwierciedla bardziej nieszczelny lub bardziej przepuszczalny nabłonek. Test ten zapewnia funkcjonalny odczyt bariery, który może być addytywny do oceny struktury połączeń szczelnych i przylegających. Ponadto, chociaż pomiary TEER są często wykorzystywane do zapewnienia podstawowej oceny integralności bariery, opisany tutaj test strumienia można dostosować do wykrywania przepuszczalności cząsteczek o różnych klasach, ładunku i wielkości, charakteryzując w ten sposób barierę w znacznie bardziej szczegółowy sposób. W tym celu można użyć kilku dostępnych na rynku znaczników fluorescencyjnych. Ponadto, dzięki zastosowaniu nienakładających się widm fluorescencyjnych, można jednocześnie ocenić przepuszczalność dla wielu znaczników. Co więcej, jednowarstwowa konfiguracja tego testu pozwala na ocenę odpowiedzi bariery na warunki wzrostu stosowane specyficznie do wierzchołkowej lub podstawno-bocznej powierzchni komórek. Dzięki temu możliwa jest kontrolowana ocena wpływu terapii, zmian mikrośrodowiskowych i warunków kohodowli.

Wiadomo, że defekty bariery jelitowej odgrywają ważną rolę patogenną w rozwoju wielu chorób przewodu pokarmowego, ale termin "nieszczelne jelito" jest coraz częściej używany w popularnych mediach bez precyzji23, a wysiłki zmierzające do wyeliminowania wadliwej bariery jelitowej są ograniczone. Podkreśla to potrzebę ulepszonych modeli do oceny i charakterystyki bariery jelitowej. Opisany system wykorzystuje fizjologiczne monowarstwy organoidów jelitowych pochodzących z tkanek ludzkich do oceny integralności bariery funkcjonalnej w kontrolowanych warunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki zostały pobrane i wykorzystane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez University of Colorado Institutional Review Board (IRB), numer protokołu 14-2012.

UWAGA: Wszystkie procedury w krokach 1-3 powinny być wykonywane w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu sterylnej techniki. Schemat protokołu przedstawiono na rysunku 1.

1. Tworzenie kolonoidów ludzkich z zamrożonych kultur

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie materiały są gotowe w komorze bezpieczeństwa biologicznego przed rozmrożeniem komórek, aby zminimalizować narażenie rozmrożonych organoidów na zamrożenie. Protokół rozpoczyna się od kriokonserwowanych kolonoidów ludzkich pochodzących z tkanek. Protokoły pozyskiwania i kriokonserwacji ludzkich kolonoidów zostały opisane wcześniej24.

  1. Przygotowanie pożywki z pnia ludzkiego organoidu jelitowego
    1. Przygotować pożywkę kondycjonowaną Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 (L-WRN) zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami25,26.
    2. Uzupełnij pożywkę L-WRN w następujące czynniki wzrostu: Naskórkowy czynnik wzrostu [50 ng/ml], Nikotynamid [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], Tiazowiwina [4 μM], SB431542 [4 μM], Gastryna I [10 nM].
    3. Zmieszać uzupełnioną pożywkę L-WRN w stosunku 1:1 z komercyjnymi pożywkami organoidowymi jelitowymi.
    4. Tuż przed użyciem uzupełnić Y-27632 [10 μM].
      UWAGA: Optymalny skład podłoża z organoidów jelitowych może się różnić w zależności od laboratorium i linii okrężnicy. Możliwe może być również stosowanie samych suplementowanych pożywek L-WRN lub stosowanie samych komercyjnych pożywek organoidowych jelitowych. Wykorzystanie w tym protokole równych części mediów kondycjonowanych L-WRN i nośników komercyjnych jest bardziej odporne na zmienność między partiami w porównaniu z użyciem samych mediów kondycjonowanych i jest bardziej opłacalne w porównaniu z użyciem samych mediów komercyjnych.
  2. Przygotowanie pożywki różnicującej
    1. Suplement DMEM/F12 zawiera 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 1% penicylinę-streptomycynę i 2 mM dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy.
    2. Wymieszać uzupełniony DMEM/F12 1:1 z podłożem z organoidów jelitowych z kroku 1.1
  3. Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)
    1. Rozmrozić ECM przez noc na lodzie, a następnie przygotować 100 μl porcji.
      UWAGA: Podwielokrotności można ponownie zamrozić w temperaturze -20 °C. Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach producenta.
    2. Inkubować podwielokrotności na lodzie do czasu posiewu komórek.
  4. Organoidy do rozmrażania i powlekania
    1. Rozmrozić zawartość kriowialu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, upewniając się, że fiolka pozostaje zanurzona, ale nakrętka znajduje się nad wodą, aż do momentu rozmrożenia.
    2. Przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 13 ml lodowato wzbogaconej pożywki DMEM/F12 w lodowaty sposób (od kroku 1.2.1).
    3. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odessać supernatant, pozostawiając około 1 ml resztkowej objętości nad osadem komórkowym.
    5. Umieść rurkę na lodzie. Dodać 1 ml lodowatego DMEM/F12 (z kroku 1.2.1) i odpipetować zawiesinę 10-15 razy, aby ponownie zawiesić osad.
    6. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Usunąć supernatant za pomocą pipety, pozostawiając jak najmniej resztek pożywki płuczącej na osadach komórek.
    8. Dodać 100 μl rozmrożonego ECM do osadu. Dokładnie zawiesić, upewniając się, że organoidy są równomiernie rozproszone bez grudek. Pipetować powoli, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    9. Płytkować ECM, pipetując około 10 kopułek lub trójwymiarowych kropelek ECM, około 10 μl każda, do jednego dołka na płytce 6-dołkowej.
    10. Szybko odwrócić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut lub do momentu, gdy kopułki zastygną.
    11. Po ustawieniu kopuł dodaj 2 ml pożywki z organoidów jelitowych (z kroku 1.1) do studzienki.
    12. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 . Wymieniaj nośnik co 2 dni.
    13. Kontynuuj krok 2, gdy organoidy albo zajmują więcej niż około 75% powierzchni kopuły ECM, albo gromadzą centralne szczątki.

2. Pasażowanie i rozszerzanie się kolonoidów ludzkich

  1. Dla każdej studzienki należy zassać pożywkę wzrostową ze studzienek bez naruszania kopuł ECM.
  2. Delikatnie umyj kopuły 1 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie usuń PBS.
  3. Dodaj 1 ml lodowatej trypsyny do każdej studzienki. Za pomocą pipety rozdrobnij kopułki ECM, pipetując w górę i w dół. Odpipetować mieszaninę 10-15 razy, aby całkowicie oddzielić ECM.
  4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
  5. Dodaj 1 ml lodowatego suplementu DMEM/F12 (z kroku 1.2.1) do studzienki, aby zneutralizować trypsynę. Energicznie pipetować mieszaninę 20-30 razy, aż komórki zostaną zdysocjowane na klastry po 2-3 komórki każde.
  6. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej zawiesiny o pojemności 15 ml.
  7. Użyć dodatkowego 1 ml uzupełnionego DMEM/F12 (z kroku 1.2.1) do umycia studzienki i dodać roztwór myjący do 15 ml stożka.
  8. Dodać uzupełniony DMEM/F12 (z kroku 1.2.1), aby osiągnąć całkowitą objętość 13 ml w stożkowym 15 ml.
  9. Postępuj zgodnie z krokami 1.4.3-1.4.12 kroku 1, używając odpowiedniej ilości ECM w celu rozszerzenia na dodatkowe studzienki.
    UWAGA: Studzienka zlewająca się z organoidami w 100 μl ECM może być zazwyczaj przepuszczana do 2-3 dołków (200-300 μl ECM). Jedna studzienka zlewająca się z organoidami wystarcza na około 3-6 monowarstw w kroku 3.

3. Generowanie monowarstw ludzkiej kolumnoidy

  1. Wkładki do hodowli komórkowych pokrywające kolagen
    1. Umieść wkładki do hodowli komórek polistyrenowych (wielkość porów 0,4 μm) na płytce 24-dołkowej i dodaj 100 μl roztworu powlekającego kolagen do komory wierzchołkowej każdej wkładki.
    2. Uszczelnij płytkę folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu.
    3. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 4-24 godziny.
      UWAGA: Nie ma różnicy w wynikach w tym czasie inkubacji, ale krótszy lub dłuższy czas inkubacji można wybrać, aby dopasować go do wygodnego punktu pauzy.
  2. Poszycie monowarstw organoidowych
    1. Wykonaj kroki 2.1-2.5, aby oddzielić organoidy.
    2. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Przepłukać studzienki po 1 ml dodanego DMEM/F12 (od kroku 1.2.1). Zebrać ten środek myjący i przepuścić go przez sitko do komórek.
    4. Przemyć sitko do komórek uzupełnionym DMEM/F12 (od kroku 1.2.1) do momentu, gdy całkowita objętość w stożkowej probówce o pojemności 50 ml osiągnie 15 ml.
    5. Przenieść filtrat do stożkowego o pojemności 15 ml.
    6. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Odessać supernatant, pozostawiając 1 ml nad osadem.
    8. Dodać dodatkowy 1 ml uzupełnionej pożywki DMEM/F12 (z kroku 1.2.1) i ponownie zawiesić.
    9. Zbadaj zawiesinę pod mikroskopem, aby potwierdzić całkowitą dysocjację. W razie potrzeby energicznie pipetuj komórki, aż będą to w większości pojedyncze komórki.
    10. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety, pozostawiając jak najmniej resztek pożywki płuczącej na osadach komórek.
    11. Zawiesić w małej objętości (200-1000 μl) pożywki z organoidów jelitowych (od kroku 1.1). Trzymaj na lodzie.
    12. Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórkowej w celu wykorzystania jej do policzenia komórek żywotnych przy użyciu preferowanej metody. Użyj liczby żywotnych komórek, aby określić objętość zawiesiny komórek potrzebną do pokrycia 100 000 żywych komórek na wkładkę.
    13. Odessać roztwór powłoki kolagenowej z każdej wkładki bez dotykania membrany wkładki.
    14. Dodać odpowiednią objętość pożywki macierzystej organoidów jelitowych (z kroku 1.1) do komory wierzchołkowej każdej wkładki, aby doprowadzić końcową objętość do 200 μl po dodaniu zawiesiny komórek.
      UWAGA: Jeśli jest to preferowane, zawiesinę komórek w kroku 3.2.12 można dostosować do końcowego stężenia 100 000 komórek/200 μl, a następnie 200 μl można posiać w komorze wierzchołkowej. Jeśli jednak cała zawiesina komórek nie jest używana do powlekania jednowarstwowego, może to prowadzić do nadmiernego marnotrawstwa pożywki.
    15. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórek do komory wierzchołkowej.
    16. Dodać 500-1000 μl pożywki z organoidów jelitowych do komory podstawno-bocznej.
      UWAGA: 500 μL jest wystarczające dla typowych kolonoidów. Jeśli komórki są bardziej aktywne metabolicznie lub w inny sposób wrażliwe na gromadzenie się produktów przemiany materii, użycie większej objętości w komorze podstawno-bocznej może być pomocne w utrzymaniu wzrostu.
    17. Powtórz te czynności dla wszystkich wkładek/dołków.
    18. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .
    19. Wymieniaj nośniki raz w tygodniu.
      UWAGA: Zabiegi, które są przedmiotem zainteresowania, można zastosować do komór wierzchołkowych i/lub podstawno-bocznych wkładek w dowolnym momencie przed lub po poszyciu.

4. Pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i dojrzewania jednowarstwowego

  1. Zmierz rezystancję
    1. Użyj nabłonkowego woltomierza/oma przy ustawieniu omów. Wyczyść sondę, przecierając ją ściereczką zadaniową nasączoną 70% etanolem. Umieść dłuższe ramię elektrody w komorze podstawno-bocznej, a krótsze ramię w komorze wierzchołkowej wkładki. Rekord pomiaru.
      UWAGA: Jeśli pomiary TEER są również interesującym punktem końcowym, należy również wykonać pomiary rezystancji wkładki pokrytej kolagenem bez komórek jako tła. Następnie TEER oblicza się jako (rezystancja - rezystancja wkładki tła) x pole powierzchni wkładki. Pole powierzchni wkładki w tym protokole wynosi 0,33cm2. W tym obliczeniu otrzymasz TEER w omach2 cm2. W przypadku korzystania z nabłonkowego woltomierza/omomierza niż wymieniony w Tabeli materiałów, do pomiaru rezystancji należy skorzystać z instrukcji obsługi miernika producenta.
    2. Powtarzaj codziennie, aż pomiary ustabilizują się.
      UWAGA: Plateau zwykle występuje po 2 do 3 tygodniach z TEER większym niż 200 omów·cm2, ale różni się w zależności od linii okrężnicy i warunków wzrostu.
  2. Gdy odporność ustabilizuje się, zainicjuj dojrzewanie organoidów, zastępując pożywki macierzyste pożywkami różnicującymi (od kroku 1.2).
  3. Kontynuuj codzienne pomiary TEER. Należy spodziewać się wzrostu wskaźnika TEER i drugiego plateau.
    UWAGA: Drugi plateau zwykle występuje około 7 dni z TEER 1500-2500 ohm·cm2, ale różni się to w zależności od linii okrężnicy i warunków wzrostu.
  4. Gdy pomiary TEER ustabilizują się po raz drugi, przejdź do kroku 5.

5. Test strumienia FITC-dekstranu

UWAGA: W tym protokole używany jest FITC-dekstran 4 kDa (promień Stokesa 14 A). Jednak w zależności od potrzeb eksperymentalnych można stosować znaczniki fluorescencyjne o różnych rozmiarach, ładunkach i fluoroforach22. W tym samym czasie można również stosować wiele znaczników, w którym to przypadku należy potwierdzić nienakładające się widma wzbudzenia i fluorescencji emisyjnej. Kroki 5.1-5.3 zaleca się wykonywać w komorze grzewczej (inkubator bez nawilżania, bezCO2 ) ustawionym na 37 °C. Jeśli nie jest to możliwe, odczynniki należy ogrzać do 37 °C przed użyciem, a komórki, i pobrane próbki należy przechowywać w temperaturze 37 °C w czasie inkubacji.

  1. Przygotowanie odczynnika
    1. Przygotuj buforowany roztwór soli fizjologicznej Hanka (HBSS) z 10 mM HEPES i dostosuj pH do 7,4. Ogrzać do 37 °C.
      UWAGA: W razie potrzeby przygotuj HBSS+HEPES z interesującymi Cię zabiegami. Przygotować wystarczającą ilość na 80 μl/studzienkę w komorze wierzchołkowej i 1 ml/studzienkę w komorze podstawno-bocznej.
    2. Wlej około 50 ml ciepłego HBSS+HEPES do małej zlewki w celu wypłukania wkładek. Miej w pobliżu większą zlewkę na odpady płynne.
    3. Całkowicie rozmrozić FITC-dekstran 4 kDa. Przygotować roztwór o stężeniu 1,25 mg/ml w HBSS z HEPES. Przygotować odpowiednią objętość roztworu FITC-dekstranu, aby przydzielić 80 μl na studzienkę i 1 μl na krzywą wzorcową.
      UWAGA: Stężenie początkowe można dostosować w zależności od wielkości i oczekiwanej przepuszczalności znacznika. Na przykład mniejsze lub bardziej przepuszczalne znaczniki mogą być dodawane w niższym stężeniu, aby zachować odczynniki. W przypadku konieczności zastosowania leczenia w komorze wierzchołkowej, należy przygotować roztwór FITC-dekstranu w odpowiednio potraktowanym HBSS+HEPES.
  2. Zastosowanie dekstranu FITC do monowarstw
    1. Przygotuj świeżą 24-dołkową płytkę, dodając 1 ml HBSS+HEPES (w razie potrzeby z obróbką) do odpowiednich dołków.
    2. Umyć monowarstwy organoidów, chwytając wkładkę kleszczami, wyjmując ją ze studzienki, zanurzając w zlewce zawierającej ciepły HBSS+HEPES (od kroku 5.1.2) w celu napełnienia komory wierzchołkowej, a następnie odwracając ją nad zlewką na odpady, aby opróżnić roztwór myjący.
    3. Powtórz to pranie jeszcze 2 razy.
    4. Umieścić wkładkę w odpowiednim dołku świeżej płytki przygotowanej w kroku 5.2.1.
    5. Delikatnie odpipetować 80 μl roztworu FITC-dekstranu do komory wierzchołkowej. Pipetę należy odpipetować z boku wkładu, aby nie naruszyć monowarstwy.
    6. Powtórz krok 5.2.5 dla wszystkich monowarstw.
    7. Dodaj HBSS lub PBS do wszystkich pustych studzienek, aby utrzymać wilgotność.
  3. Pobieranie próbek topnika
    1. Niezwłocznie po wykonaniu kroku 5.2.7 pobrać 70 μl z komory podstawno-bocznej każdej studzienki do studzienki z płaską, czarną 96-dołkową płytką o przezroczystym dnie i chronić przed światłem w temperaturze 37 °C. Będzie to punkt czasowy 0.
    2. Inkubować płytkę, chroniąc ją przed światłem, w temperaturze 37 °C.
    3. Co 30 minut przez 2 godziny mieszać bufor w basenie bocznym, a następnie zebrać dodatkowe 70 μl do pustych studzienek 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem z kroku 5.3.1.
  4. Przygotowanie krzywej wzorcowej
    1. Dodać 1 μl zarezerwowanego roztworu FITC-dekstranu (1,25 mg/ml; krok 5.1.3) do 999 μl HBSS+HEPES. Będzie to rozcieńczenie 1:1000 lub 1,25 μg/ml dla krzywej wzorcowej.
    2. Seryjnie rozcieńczyć ten roztwór w stosunku 1:1, pobierając 150 μl roztworu i dodając go do 150 μl HBSS+HEPES, a następnie dobrze mieszając. Powtórzyć to kolejno dziesięć dodatkowych razy, co daje w sumie 12-stopniowe rozcieńczenie.
      UWAGA: Spowoduje to utworzenie krzywej standardowej: 1250, 625, 312.5, 156.25, 78.13, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88, 2.44, 1.22 i 0.61 ng/ml. W zależności od przepuszczalności linii komórkowych, krzywa standardowa może wymagać mniej lub bardziej skoncentrowanej. Przy pierwszym uruchomieniu eksperymentu należy zarezerwować dodatkowy roztwór FITC-dekstranu 1,25 mg/ml na wypadek, gdyby konieczne było ponowne wykonanie krzywej wzorcowej przy innym stężeniu.
    3. Odpipetować 70 μl każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej do pustych studzienek 96-dołkowej przezroczystej płytki dennej zgodnie z krokami 5.3.1 i 5.3.3. Powtórz te czynności dla drugiej replikacji.
  5. Zmierz fluorescencję na czytniku płytek fluorescencyjnych z następującymi ustawieniami: wzbudzenie 490 nm, emisja do 520 nm, odczyt od spodu płytki, ze wzmocnieniem 100 i wysokością odczytu 7 mm.
    UWAGA: Dostosuj długości fal wzbudzenia/emisji odpowiednio do wybranego fluoroforu.
  6. Analiza danych
    1. Wykreślić krzywą wzorcową ze stężeniem na osi x i fluorescencją na osi y. Użyj tego, aby wyznaczyć równanie regresji liniowej.
    2. Użyj tego równania regresji liniowej i odczytów fluorescencyjnych próbek, aby obliczyć stężenie FITC-dekstranu w każdym punkcie czasowym dla każdej próbki.
    3. Wykreślić stężenie w czasie dla każdej próbki i obliczyć nachylenie równania regresji liniowej, które reprezentuje mikrogramy/min (μg/min). Podziel to przez powierzchnię wkładki do hodowli komórkowej (0,33 cm), aby określić szybkość strumienia w mikrogramach na minutę na centymetr kwadratowy (μg/min/cm2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Za pomocą tego protokołu przeanalizowano przepuszczalność zdrowych ludzkich kolonoidów w obecności i braku sygnalizacji zapalnej. Wcześniej wykazano, że dodanie mieszaniny cytokin zapalnych, zwanych cytomiksem, która obejmuje IFNγ, TNFα i IL-1β (każda w stężeniu 10 ng / ml), indukuje dysfunkcję bariery jelitowej, mierzoną za pomocą TEER w modelach komórek nabłonka jelitowego20,27. Naszym celem było ustalenie, czy tę dysfunkcję bariery można zrekapitulować za pomo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jest to protokół oceny bariery jelitowej w fizjologicznie reprezentatywnym modelu monowarstw ludzkiej kolonoidy. Opisany tutaj test strumienia znacznika fluorescencyjnego dostarcza informacji o integralności funkcjonalnej bariery wykraczających poza to, co jest zbierane za pomocą innych typów testów barierowych, takich jak TEER, pomiary w komorze Ussing lub ocena ekspresji białek o ścisłym połączeniu. Dodatkowo, zastosowanie modeli organoidów jelitowych pochodzących od pacjenta przynosi korzyści z rekapitulacji złożonej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma żadnych ujawnień ani konfliktów interesów.

Podziękowania

Dr Sean Colgan jest finansowany z grantów NIH DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 i VA Merit BX002182.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlLeczenie komórkowe229411
2 ml fiolka kriogeniczna z gwintem wewnętrznym Corning430488
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mlLeczenie komórkowe229421
Płytka 6-dołkowa, poddana działaniu kultur tkankowychLeczenie komórkowe229106
70 μ M Sitko komórkoweSokół352350
96-dołkowa/przezroczysta płyta dolnaThermo Scientific165305
A83-01 R& D2939
Czytnik płytek BioTek SynergyAgilentSynergia H1
Celometr Auto T4 Licznik komórek BrightfieldNexcelcom powiedział:CMT-AT4P
Komory do liczenia komórek celometrycznychNexcelcom powiedział:NC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
Roztwór do powlekania kolagenem Zastosowania komórkowe125-50
DMEM/F-12Gibco (firma Gibco)11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
Etanol 100%Fisher NaukowyCertyfikat A4094
Miernik woltowomierzy EVOM2 z elektrodą Stx2Światowe instrumenty precyzyjneNC9792051
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Cytiva (Cytiwa)SH30396.03HI
Końcówki do pipet filtrującychFisher Naukowy02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrin I (człowiek)R& D3006
GlutaMAX Fisher Naukowy35050061200 mM dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy
Hanks buforowany roztwór soli fizjologicznej 10xThermo Scientific14065056
SZYBY SZPALKOWE 1MThermo Scientific15630080
Interferon gamma rekombinowany przez człowiekaLegenda biologiczna575308
Interleukina 1 beta rekombinowana u ludziTermo naukowy200-01B-500UG
IntestiCult Pożywka do organoidów jelitowych (ludzka)Technologie STEMCELLNumer katalogowy: 06010 Komercyjne podłoża organoidowe jelitowe
Odwrócony mikroskop na żywoOlympusZobacz materiał IX85
MatrigelCorning354234Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)
Inkubator mikrobiologicznyFisher Naukowy151030515
Płytka wielodołkowa do hodowli zawiesiny, 24-dołkowaGreiner Bio-one662102
NikotynamidR& D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526BFolia uszczelniająca
Pipety Pasteura (szkło borokrzemianowe)Fisher Naukowy13-678-20 mld
PBS Gibco (firma Gibco)10010-023
Penicylina Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco (firma Gibco)15140122
Rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu mięśnia łosiaR& D2028-EG
Wirówka z chłodzeniemBeckman CoulterBE-AX15R
SB202190 R& D1264
TiazowiwinaR& D3845
Wkładka do hodowli komórkowych ThinCert na płytkę 24-dołkową, 0,4 μ mGreiner Bio-one662641
Trypsyna-EDTA (0,25%)Fisher Naukowy25200114
Czynnik martwicy nowotworu alfa rekombinowany człowiekR& DNumer katalogowy 10291-TA-100
Y-27632 dichlorowodorek Tocris powiedział:TB1254-GMP (Protokół GMP)

Bibliografia

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy jelitoweFITC dekstranprzepuszczalno transepithelialnabariera nab onkowaintegralno barierymodel organoidowy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.