Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęcherzyk jajnika jest funkcjonalną jednostką jajnika, która produkuje hormony i gamety niezbędne do utrzymania funkcji rozrodczych i zdrowia kobiet. Zdolność do odtwarzania folikulogenezy, owulacji i luteinizacji in vitro ma szerokie zastosowanie podstawowe, translacyjne i kliniczne. Najbardziej zaawansowane systemy wzrostu pęcherzyków in vitro utrzymują trójwymiarową (3D) architekturę pęcherzyka, która jest kluczowa dla rozwoju mejotycznie kompetentnych oocytów metafazy II u ludzi. Niedawno opracowano i zweryfikowano metodę wolną od rusztowania wzrostu pęcherzyków wielowarstwowych myszy w metodzie in vitro . Do tego celu użyto niestandardowych form drukowanych 3D do mikrowzorowania agarozy z mikrowgłębiami umożliwiającymi objętościowe rozszerzanie mieszków włosowych. Pęcherzyki hodowane w tym środowisku wolnym od rusztowania wykazywały porównywalną produkcję hormonów i żywotność w porównaniu do dobrze ugruntowanych systemów wzrostu pęcherzyków in vitro (eIVFG) opartych na alginacie. Co ważne, mikrodoły agarozowe są metodą skalowalną, mniej wymagającą technicznie i wykazują poprawę wzrostu mieszków mieszkowych oraz tempo owulacji w porównaniu do eIVFG. Ta metoda pozwala na personalizację pleśni biokompatybilne z oocytem, komórką wysoce wrażliwą na wypłuki specyficzne dla materiału i inne zanieczyszczenia środowiskowe. Ponadto mieszki mieszkowe w tym układzie są hodowane w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co umożliwia obrazowanie i analizę w czasie rzeczywistym. Aby zwiększyć dostępność tego nowego podejścia, artykuł szczegółowo opisuje metody potrzebne do projektowania i druku 3D form głównych, tworzenia silikonowych form dla płytek z 24 lub 96 dołkami oraz hodowli izolowanych wielowarstwowych wtórnych pęcherzyków jajników w formach agarozowych. To rozwiązanie można również zintegrować z opłacalnym systemem obrazowania poklatkowego, umożliwiającym analizę morfokinetyczną. Ponadto pleśnie mogą być osadzane w parafinie do dalszych analiz histologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, ta przyjazna dla użytkownika metoda jest wszechstronnym narzędziem do hodowli mieszków mieszkowych i może być dodatkowo dostosowana, aby wspierać różnicowanie i dojrzewanie komórek rozrodczych w kontekście mieszków genetycznych, aby utrzymać kompletną gametogenezę in vitro .
Wprowadzenie
Oocyt, czyli gameta żeńska, dostarcza większość cytoplazmy i połowę materiału genetycznego do zarodka podczas zapłodnienia, co jest niezbędne dla rozwoju kolejnego pokolenia. Oogeneza rozpoczyna się podczas rozwoju embrionalnego, gdy pierwotne komórki rozrodcze wchodzą w mejozę i zatrzymują się w profazie I. Te oocyty znajdują się wewnątrz pierwotnych pęcherzyków i stanowią rezerwę jajnikową, skończoną i nieodnawialną pulę, z której są stopniowo pozyskiwane. Pęcherzyki rozwijają się w procesie zwanym folikulogenezą, którego celem jest ostatecznie wytworzenie dojrzałej gamety zdolnej do zapłodnienia 1,2,3,4,5.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury związane ze zwierzętami związane z tym protokołem zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) Uniwersytetu Northwestern i wykonane zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Dostosowanie wzoru wzorowego
Ta sekcja opisuje pierwsze kroki wykonywane podczas fazy projektowania (Rysunek 1), kiedy wprowadzane są niestandardowe mikrodoły w komputerowo wspomaganym projektowaniu (CAD) formy głównej dla płyt hodowlany....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ustalić, czy przeżywalność i wzrost mieszków były wspierane dzięki tej nowej technologii opisanej w sekcji 7 protokołu, wyizolowano i hodowano równolegle w mikroformach agarozowych lub otoczono w 0,5% alginacie. Reprezentatywne obrazy mieszków mieszkowych z każdego innego dnia hodowli wykazały prawidłowy rozwój, wzrost i tworzenie jamy antralnej przez cały okres hodowli (Rysunek 6A). Wcześniej opublikowane wyniki wykazały, że przeżywalność mieszków nie wykazuje istotnych różnic między me.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Gametogeneza in vitro i dojrzewanie to kluczowe technologie dla fundamentalnego zrozumienia biologii oocytów, z potencjalnymi zastosowaniami w technologii wspomaganego rozrodu, zachowaniu płodności oraz ochronie gatunków. Metody wspierające IVG często opierają się na współhodowli z komórkami somatycznymi, aby stworzyć zrekonstruowane jajniki30. Znaczenie tych komórek wspierających jest dobrze znane in vivo, gdzie mikrośrodowisko somatyczne pęcherzykowe jest kluczowe dla zdrowego .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Prace te były finansowane przez National Institutes of Child Health and Human Development (R01HD105752 dla F.E.D i T32HD094699 dla E.J.Z) oraz program SenNet NIH Common Fund (U54AG075932 i UH3CA268105 dla F.E.D.) oraz grant Bill & Melinda Gates Foundation (INV-003385 dla F.E.D.). Na podstawie warunków przyznania grantu Fundacji Billa i Melindy Gatesów, licencja Creative Commons Attribution 4.0 została już przypisana wersji Autor Accepted Manuscript, która może wyniknąć z tego zgłoszenia.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały i chemikalia | |||
| Rurki do wirówek polistyrenowych o pojemności 50 mL | Globe Scientific | 941-11017-CS | |
| Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL | Fisher Scientific | MCT-150 | Aby szybko zamrozić i przechować materiały |
| Talerz 100 mm, nieimpregnowany | Fisher Scientific | 08-757-100D | Do produkcji i przechowywania mikroform agarozowych |
| 100% etanol | Mercedes Scientific | 1200 | Przetwarzanie tkanek |
| 1000 &mikro; L Końcówki pipety, niska retencja | MIDSCI | PR-1000BK | Wskazówki dotyczące kultury |
| 200 & mikro; L Końcówki pipety, niska retencja | MIDSCI | PR-200BK | Wskazówki dotyczące kultury |
| Płytka z 24 dołkami | Corning | 353047 | Kultura |
| Talerze 35 mm | Falcon | 351008 | Izolować jajniki i inkubować w ośrodku enymtycznym |
| 95% etanolu | Mercedes Scientific | 1210 | Przetwarzanie tkanek |
| Agarose | Hoefer | GR140 | Mikroformy |
| BioXtra olej mineralny, lekki olej, odpowiedni do hodowli komórek zarodków myszy | Sigma-Aldrich | M5310-500ML | Stosowany jako biokompatybilny środek do wyjmowania z formy |
| Albumina z surowicy/nbsp; | MP Biomedicals | 103700 | Medium wzrostu |
| Sprzątacze do czyszczenia, 10 oz., opakowanie 6 | Office Depot | 110284 | Sprężone powietrze |
| Przezroczysta żywica V4 1 L | Formlabs, Inc | RS-F2-GPCL-04 | Żywica do druku 3D |
| Corning Plastik wielorazowego użytku, niskoformowa zlewka 100 mL, polipropylen, stopniowana | Corning | 1000P-100 | Zlewka do mieszania elementów silikonowych |
| DNAse I | Qiagen | 79254 | Ośrodki enzymatyczne |
| Ecoflex 00-45 Near Clear | Smooth-On, Inc | B09M8Y9PTV | Materiał silikonowy |
| F-12 + GlutaMAX | Gibco | 31765-035 | Medium wzrostu |
| Fetuin bydła płodowa | Sigma | F-3385 | Medium wzrostu |
| Serum bydła płodu (FBS) | Serum szczytu | PS-FB2 | Medium do rozwarstwienia, ośrodka enzymatycznego itdnbsp; Materiały konserwacyjne i materiały Ośrodek dojrzewania |
| Fisherbrand Sakiewki sterylizacyjne | Fisher Scientific | 01-812-50 | Sakiewki sterylizacyjne |
| Hormon stymulujący pęcherzyki (FSH) | EMD Serono, Inc. | Tylko Gonal-F Rx & nbsp; | Media wzrostu i materiały Ośrodek dojrzewania |
| Gibco DPBS, wapń, magnez | Fisher Scientific | 14-040-182 i nbsp; | Sól fizjologiczna Dulbecco z buforem fosforanowym |
| Gonadotropina ludzka kosmówkowa (hCG) | Sigma Aldrich | C1063-1VL | Ośrodek dojrzewania |
| Insulina-transferyna-selen (ITS) | ThermoFisher | 41400045 | Medium wzrostu |
| Sondy molekularne invitrogen, Rhodamina falloidyna | Fisher Scientific | R415 | Plama cytoszkieletu jajowego |
| Naczynia IVF | Thermo Scientific | 150260 | Aby izolować, wybrać i prerównoważyć pęcherzyki |
| Leibovit'z 15 (L15) | Gibco | 11415-064 | Dissection Media & Ośrodki enzymatyczne |
| Liberase | Sigma Aldrich | 5401119001 | Ośrodki enzymatyczne |
| MEM? + GlutaMAX | Gibco | 32561-037 | Materiały konserwacyjne i Media wzrostu i materiały Ośrodek dojrzewania |
| Czynnik wzrostu naskórka myszy (EGF) | BD Biosciences | 354010 | Ośrodek dojrzewania |
| Nalgene Przezroczysty Poliwęglanowy Klasyczny Osuszacz | Thermo Scientific | 5311-0250 | Odkurzacz próżniowy |
| Parafina | Fisher Scientific | 83-30 | Przetwarzanie tkanek i Osadzanie |
| Penicylina-streptomycyna | Gibco | 15140-122 | Ośrodki do rozwarstwiania, ośrodki enzymatyczne i ośrodki enzymatyczne Materiały konserwacyjne |
| Końcówki do strippera | Origio | MXL3-200 | Kultura |
| VECTASHIELD PLUS Medium Montażowe Antifade z DAPI | Laboratoria Vector | H-2000 | Barwienie jądra jajowego |
| Ksylen | Mercedes Scientific | 9840 | Przetwarzanie tkanek |
| α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Technologia sygnalizacji komórkowej | 5063S | Plama tubulinowej jajka |
| Sprzęt | |||
| Zbuduj platformę 2 | Formlabs, Inc | BP-F3-02-01 | Komponent drukarki 3D |
| Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0 | Dino-Lite | AF4915ZTL | Obrazowanie do ustawienia timelapse |
| Zbiornik żywiczny Form 3 V2.1 | Formlabs, Inc | RT-F3-02-01 | Komponent drukarki 3D |
| Drukarka 3D Form 3B + | Formlabs, Inc | F3B-P-PRINTER | Drukarka 3D stereolitografii (SLA) firmy Formlabs |
| Forma utwardzenia | Formlabs, Inc | FH-CU-01 | Platforma do utwardzania |
| Formowe płukanie | Formlabs, Inc | FH-WA-01 | Platforma myjąca |
| Butelka z rozpylaczem z pompą do parowania | VWR | 0309-3005 | Aby nałożyć środek do wyjmowania formy |
| Nasadka ogniskowania/koncentratora światła dla serii Edge (z wyłączeniem modeli T5, T8) | Dino-Lite | N3C-R | Komponent obrazowania do konfiguracji timelapse |
| Pakiet uchwytu montażowego łączący rack RK-10 oraz przedłużenie ramienia RK-10-EX | Dino-Lite | RK-10A | Komponent obrazowania do konfiguracji timelapse |
| Osadzenie tkanek | Leica | HistoCore Arcadia | Osadzanie mikroform |
| Procesor tkanek | Leica | TP1020 | Do przetwarzania mikroform |
| 211DS Inkubator Drżący (Orbital Shaker) | Labnet International | I-5211-DS | Inkubacja jajników w podłożu enzymatycznym w celu uwalniania pęcherzyków |
| Software | |||
| Autodesk Fusion | Autodesk, Inc | Oprogramowanie do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Autodesk oferuje bezpłatny dostęp edukacyjny w ramach programu edukacyjnego Autodesk. | |
| DinoCapture 3.0 wersja 1.1.1.3 | Dino-Lite | ||
| ImageJ | Narodowe Instytuty Zdrowia | Analiza obrazów OCT i pomiar mieszków mieszkowych | |
| PreForm | Formlabs, Inc | Darmowe oprogramowanie do przygotowania druku zaprojektowane do pracy z drukarkami stereolitograficznymi (SLA) firmy Formlabs. |
Bibliografia
- Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
- Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
