Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68871

⸱

24 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Streszczenie

Pęcherzyk jajnika jest funkcjonalną jednostką jajnika, która produkuje hormony i gamety niezbędne do utrzymania funkcji rozrodczych i zdrowia kobiet. Zdolność do odtwarzania folikulogenezy, owulacji i luteinizacji in vitro ma szerokie zastosowanie podstawowe, translacyjne i kliniczne. Najbardziej zaawansowane systemy wzrostu pęcherzyków in vitro utrzymują trójwymiarową (3D) architekturę pęcherzyka, która jest kluczowa dla rozwoju mejotycznie kompetentnych oocytów metafazy II u ludzi. Niedawno opracowano i zweryfikowano metodę wolną od rusztowania wzrostu pęcherzyków wielowarstwowych myszy w metodzie in vitro . Do tego celu użyto niestandardowych form drukowanych 3D do mikrowzorowania agarozy z mikrowgłębiami umożliwiającymi objętościowe rozszerzanie mieszków włosowych. Pęcherzyki hodowane w tym środowisku wolnym od rusztowania wykazywały porównywalną produkcję hormonów i żywotność w porównaniu do dobrze ugruntowanych systemów wzrostu pęcherzyków in vitro (eIVFG) opartych na alginacie. Co ważne, mikrodoły agarozowe są metodą skalowalną, mniej wymagającą technicznie i wykazują poprawę wzrostu mieszków mieszkowych oraz tempo owulacji w porównaniu do eIVFG. Ta metoda pozwala na personalizację pleśni biokompatybilne z oocytem, komórką wysoce wrażliwą na wypłuki specyficzne dla materiału i inne zanieczyszczenia środowiskowe. Ponadto mieszki mieszkowe w tym układzie są hodowane w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co umożliwia obrazowanie i analizę w czasie rzeczywistym. Aby zwiększyć dostępność tego nowego podejścia, artykuł szczegółowo opisuje metody potrzebne do projektowania i druku 3D form głównych, tworzenia silikonowych form dla płytek z 24 lub 96 dołkami oraz hodowli izolowanych wielowarstwowych wtórnych pęcherzyków jajników w formach agarozowych. To rozwiązanie można również zintegrować z opłacalnym systemem obrazowania poklatkowego, umożliwiającym analizę morfokinetyczną. Ponadto pleśnie mogą być osadzane w parafinie do dalszych analiz histologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, ta przyjazna dla użytkownika metoda jest wszechstronnym narzędziem do hodowli mieszków mieszkowych i może być dodatkowo dostosowana, aby wspierać różnicowanie i dojrzewanie komórek rozrodczych w kontekście mieszków genetycznych, aby utrzymać kompletną gametogenezę in vitro .

Wprowadzenie

Oocyt, czyli gameta żeńska, dostarcza większość cytoplazmy i połowę materiału genetycznego do zarodka podczas zapłodnienia, co jest niezbędne dla rozwoju kolejnego pokolenia. Oogeneza rozpoczyna się podczas rozwoju embrionalnego, gdy pierwotne komórki rozrodcze wchodzą w mejozę i zatrzymują się w profazie I. Te oocyty znajdują się wewnątrz pierwotnych pęcherzyków i stanowią rezerwę jajnikową, skończoną i nieodnawialną pulę, z której są stopniowo pozyskiwane. Pęcherzyki rozwijają się w procesie zwanym folikulogenezą, którego celem jest ostatecznie wytworzenie dojrzałej gamety zdolnej do zapłodnienia 1,2,3,4,5. Rozwój pęcherzyków rozpoczyna się we wczesnej, niezależnej od gonadotropiny fazie, w której sygnalizacja parakryna jest niezbędna dla przeżycia i wzrostu pęcherzyka. W miarę dojrzewania pęcherzyków do stadium wtórnego stają się one zależne od gonadotropin, co oznacza przejście do sygnalizacji endokrynalnej. Kluczową cechą pęcherzyków wtórnych jest oocyt otoczony co najmniej dwiema pełnymi warstwami komórek ziarnistka sześciennego, wraz z nowo rozwiniętą warstwą teki. Komórki teki tworzą najbardziej zewnętrzną warstwę pęcherzyka, zapewniając androgeny i wsparcie strukturalne 6,7. Na koniec wypełniona płynem jama antralna tworzy się i pęka w odpowiedzi na wzrost hormonu luteinizującego (LH) podczas owulacji, uwalniając gametę zdolną do zapłodnienia zatrzymaną w mejozie II 2,8,9.

Oocyt osiąga kompetencje rozwojowe do zapłodnienia oraz zdolność wspierania wczesnego rozwoju zarodka przedimplantacyjnego, określanego jako dojrzewanie jądrowe i cytoplazmatyczne, podczas oogenezy i folikulogenezy 10,11,12. Dojrzewanie cytoplazmatyczne jest widoczne morfologicznie, ponieważ oocyty rozszerzają się w trakcie folikulogenezy. W wyniku proliferacji komórek somatycznych, w tym komórek teki, ziarnistka i mężczyźna, same mieszki mieszkowe doświadczają znacznej rozszerzalności objętościowej. U myszy średnica pęcherzyka rośnie pięciokrotnie od wczesnych pęcherzyków wtórnych do przedowulacyjnych. Dwukierunkowa komunikacja między oocytem a otaczającymi komórkami somatycznymi jest niezbędna dla oogenezy. W pęcherzykach pierwotnych zona pellucida powstaje z białek wydzielanych przez oocyt, a komunikacja między tymi przegrodami jest częściowo pośredniczona przez projekcje transzonalne, które zapewniają fizyczny kontakt między tymi dwoma przedziałami pęcherzyków13,14. Dlatego mikrośrodowisko pęcherzykowe jest niezbędne do prawidłowego zarządzania wzrostem oraz dojrzewaniem jądrowym i cytoplazmatycznym oocytu 2,5. Aby lepiej zrozumieć odrębne mechanizmy wspierające te procesy, potrzebne są zaawansowane i fizjologicznie istotne techniki hodowli in vitro. Możliwość hodowli mieszków in vitro ma szerokie zastosowania, w tym technologie wspomaganego rozrodu i zachowanie płodności 15,16,17,18, ochronę gatunków19,20, rozwój leków21 oraz przesiew toksykologiczny22,23.

Systemy hodowli pęcherzyków in vitro są również niezbędnym pośrednim krokiem pośredniczącym w zdolności do wytwarzania gamet z pluripotentnych komórek macierzystych, znanych również jako gametogeneza in vitro (IVG)24. Naukowcy wykorzystywali embrionalne komórki macierzyste, mezenchymalne komórki macierzyste oraz indukowane pluripotentne komórki macierzyste do rozwoju gamet u różnych gatunków, często polegając na komórkach somatycznych do odtworzenia rodzimego mikrośrodowiska pęcherzyka 25,26,27,28,29,30 . Chociaż dzięki tym metodom osiągnięto znaczące kamienie milowe potwierdzające koncepcję, nadal istnieje wyzwanie związane z niską jakością oocytów, co odzwierciedla się w niskim tempie rozwoju zarodków i żywych potomstwa po zapłodnieniu in vitro u myszy31,32. Nie dokonano jeszcze żywych urodzeń u innych gatunków, co podkreśla potrzebę dalszego udoskonalania protokołów, aby w pełni wspierać oogenezę i folikulogenezę.

Obecnie stosuje się kilka strategii hodowli mieszków mieszkowych. Technicznie najmniej wymagające i o najwyższej przepustowości podejścia to metody bez rusztowań, gdzie mieszki mieszkowe umieszcza się w plastikowej misce lub wkładce membranowej33,34. Tutaj komórki ziarniskowe przylegają do powierzchni hodowli, tracąc kontakt z oocytem33,34. Rozpad architektury mieszkowej ogranicza użyteczność i biologiczne znaczenie tych technik. Jednak hodowla wolna od rusztowania w płytkach o niskim przyczepie lub odwróconych kroplach pozwala pęcherzykowi zachować integralność strukturalną u kilku gatunków ssaków 35,36,37. Niestety, przy tych technikach trudno jest kontrolować interakcję między pęcherzykami i ilość wsparcia mechanicznego, jakie otrzymują. Dlatego, aby lepiej podsumować fizjologię in vivo, opracowano metody hodowli, w których pęcherzyki są otoczone w hydrożelach o określonym, regulowanym składzie chemicznym i/lub właściwościach mechanicznych 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Na przykład system wzrostu pęcherzyków in vitro z kapsułką alginatu może rekapitulować kluczowe sygnatury transkryptomiczne obserwowane in vivo21.

Pomimo sukcesu i wartości protokołów hodowli enkapsulowanych, istnieje kilka wad. Mogą być technicznie wymagające, pracochłonne, o niskiej przepustowości i niekompatybilne z automatycznymi metodami obrazowania. Ponadto metody hodowli w kapsułkach wymagają wieloetapowych metod dla większych gatunków ssaków ze względu na większe objętościowe rozszerzanie mieszka37. Ponadto techniki enkapsulowane zapewniają jednolite wsparcie we wszystkich kierunkach, a pęcherzyki muszą zostać uwolnione z hydrożelu przed owulacją. Nie dzieje się to in vivo, gdy pęcherzyk oddziałuje z otaczającym mikrośrodowiskiem jajnika, które zapewnia dynamiczne wsparcie biomechaniczne54. Na przykład sztywna kora jajnika utrzymuje spokój pierwotnych pęcherzyków, podczas gdy duże rosnące pęcherzyki zwykle występują w miękkim przedziale rdzeniowym55,56. Gdy pęcherzyk z kompetentnym oocytem osiągnie swój końcowy rozmiar, modyfikacje ściany pęcherzyka i powierzchni nabłonka jajnika umożliwiają owulację. Dlatego techniki hodowla, w których mieszki mieszkowe rosną w jednym kierunku z niewielkim oporem, mogą lepiej naśladować fizjologię in vivo.

W nowatorskim podejściu opracowano powtarzalną, skalowalną, technicznie mniej wymagającą i opłacalną metodę hodowli wielowarstwowych pęcherzyków wtórnych u myszy57. Tutaj wytwarza się mikrootwory z ultra-niską adhezją agarozową o precyzyjnie kontrolowanej geometrii (kształt, wymiary) i układzie przestrzennym (liczba, bliskość) przy użyciu przystępnych cenowo metod. Pęcherzyki w formach agarozowych podlegają mechanicznemu podparciu we wszystkich kierunkach poza jednym i są hodowane w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co umożliwia obrazowanie poklatkowe do zaawansowanej analizy morfokinetycznej. Stereolitografia (SLA) 3D była wykorzystywana jako przystępna metoda produkcji formy głównej, a następnie wykonywane są etapy formowania silikonu wolnego od wycieku do odlewania agarozy. Poprawa wzrostu pęcherzyków i wyników owulacji osiągnięto przy użyciu nowego systemu w porównaniu do tradycyjnego eIVFG, bez kompromisów w przeżyciu, dojrzewaniu czy luteinizacji pęcherzyków57. Niniejszy artykuł protokołu opisuje kroki niezbędne do personalizacji i produkcji agarozowych pleśni, jak zasiać i hodować wielowarstwowe wtórne pęcherzyki, przetwarzać oraz ostatecznie przeprowadzić analizę poklatkową (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami związane z tym protokołem zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) Uniwersytetu Northwestern i wykonane zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Dostosowanie wzoru wzorowego

Ta sekcja opisuje pierwsze kroki wykonywane podczas fazy projektowania (Rysunek 1), kiedy wprowadzane są niestandardowe mikrodoły w komputerowo wspomaganym projektowaniu (CAD) formy głównej dla płyt hodowlanych 24 dołków, zwanej projektem podstawy formy głównej z 24 dołkami (Plik uzupełniający 1). Wymiary mikrodołków decydują o ilości wsparcia i maksymalnym rozmiarze wzrostu pęcherzyków, natomiast liczba dołków określa maksymalną liczbę pęcherzyków na pleśń agarozową. Zmodyfikowany projekt formy głównej zostanie następnie wykorzystany w kolejnej sekcji do stworzenia biokompatybilnych form silikonowych do odlewania agarozy.

  1. Otwórz plik .step z 24-dołkami wzoru wzoru wzorowego za pomocą oprogramowania CAD (Rysunek 2A).
  2. Wybierz wewnętrzną powierzchnię obiektu, następnie przejdź do zakładki Solidy w przestrzeni roboczej Design i wybierz Create Sketch , aby wstawić pożądany projekt mikroformy (Rysunek 2Bi).
  3. Wprowadź pożądane wymiary xy i liczbę mikrowgłębień, a następnie wybierz szkic wykończenia na pasku narzędzi (Rysunek 2Bii).
    UWAGA: Dla wielowarstwowych pęcherzyków wtórnych wcześniej stosowano geometryczny kształt stadionowy o wymiarach 500 x 700 μm,57. Rozdzielczość druku może się różnić w zależności od żywic i używanych drukarek SLA; pozwalają na minimalne odstępy 400 μm między mikroodwierciami.
  4. Stwórz mikrootwory o głębokości 800 μm, używając funkcji ekstrudowania (kliknij Solid | Stwórz | Wyciągnij). Upewnij się, że wybrałeś operację cięcia , tworząc mikrodołek (rysunek 2Biii).
  5. Wybierz zaokrętowanie o promieniu 0,100 mm (kliknij na Design | Solid | Zmodyfikuj | Filet) na górze mikrootworów
    UWAGA: Aby stworzyć mikrodołek z okrągłym dnem, ponownie użyj operacji zaokrąglenia dla dna studni hodowli i nałóż wartość promienia równą promieniowi projektu mikrodołku. Na przykład, projektując otwory o wymiarach 500 μm x 700 μm, wybierz wartość promienia 0,250 mm (Rysunek 2Biv).
  6. Wyeksportuj kopię nowego projektu formy głównej w formacie .step (kliknij File | export).

2. Tworzenie silikonowych pojemników do form

UWAGA: Aby zapobiec wypłukiwaniu związków cytotoksycznych z części drukowanych w 3D, zostaną wykonane dwie biokompatybilne formy silikonowe. Ta sekcja opisuje ostatnie etapy fazy projektowania (Rysunek 1) i zaowocuje dwoma pojemnikami używanymi do formowania silikonowego. Tutaj wykorzystane zostaną trzy różne pliki CAD: nowy główny projekt formy utworzony na podstawie sekcji 1 oraz 24-dołkowe silikonowe pojemniki odlewane 1 i 2 (Rysunek 2Ci-ii oraz Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3, odpowiednio).

  1. Otwórz plik 1.step z silikonowego kontenera z 24 dołkami i wstaw nowy główny projekt formy jako komponent zewnętrzny (przejdź do Solid | Wstaw | Wstaw komponent).
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na komponent i wybierz Przerwij link , aby usunąć powiązane odniesienie do nowego projektu formy głównej.
  2. Wycentruj nowy główny projekt formy na 24-dołkowy silikonowy odlew kontenera 1 , dbając o to, by była skierowana do środka.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na nowy główny obiekt projektu formy w przeglądarce i wybierz opcję przesunięcia/kopiowania .
    2. Wybierz operację Free Move w sekcji Typ ruchu i w razie potrzeby obróć obiekt o 180° wokół osi x.
    3. Wybierz operację Punkt-punkt w sekcji Typ Ruchu , z środkiem nowego głównego obiektu projektu formy jako punktem początkowym i środkiem powierzchni 24-dołkowego silikonowego kontenera 1 jako punktem docelowym.
    4. Wybierz OK , aby wyrównać obiekty.
  3. Wybierz operację cięcia z pojemnikiem jako ciałem docelowym, a formą główną jako projektem korpusu narzędzia (Rysunek 2Ciii). Tworzy to pojemnik do pierwszego etapu formowania silikonowego (rysunek 2Civ).
    UWAGA: Mikrostudnie zaprojektowane w pierwszej części są teraz mikrofilarami, które będą drukowane w 3D, jak opisano w sekcji 3. Druk SLA to metoda wytwarzania addytywnego; Dlatego drukowanie mikrofilarów poprawia rozdzielczość druku w porównaniu do mikrodołków druku.
  4. Zapisz i wyeksportuj powstałą nową 24-dołkową formę silikonową 1 jako pliki .stl i .step.

3. 3D druku silikonowych pojemników

UWAGA: Ta sekcja opisuje pierwsze kroki wykonywane podczas fazy produkcji (Rysunek 1), kiedy nowe projekty CAD z pożądanymi cechami mikrodołków są drukowane w 3D.

  1. Otwórz pliki .stl nowych 24-dołkowych silikonowych form form 1 oraz 24-dołkowego silikonowego odlewanego kontenera 2 za pomocą oprogramowania do przygotowania druku 3D.
  2. Ustaw wydruk tak, aby mikrofilary były skierowane do góry i użyj funkcji wiercenia , aby stworzyć otwór o szerokości 1 mm (Rysunek 2D). Upewnij się, że ten kanał jest otwarty z boku wydruku.
    UWAGA: Otwór w otworze, który zapobiega efektowi bańkowania podczas druku i można go wypełnić po druku, lub usunąć nadmiar materiału silikonowego po pierwszym formowaniu silikonowym.
  3. Wydrukuj oba wzory kontenerów na grubości warstwy 25 μm (Rysunek 3A).
    UWAGA: Drukuj każdy model w trzech egzemplarzach, aby uwzględnić niedoskonałości lub uszkodzenia podczas obróbki.
  4. Usuń formy z platformy drukarskiej i przemyj 95% izopropanolu zgodnie z instrukcjami producenta. Spryskaj fragment mikrofilaru obficie izopropanolem 95% (Rysunek 3B). Usuń resztki etanolu sprężonym powietrzem.
  5. Pozwól pozostałemu etanolowi odparować co najmniej 30 minut.
    UWAGA: Na tym etapie można uszczelnić kanał wiertniczy o szerokości 1 mm. Można to zrobić, nakładając na zewnątrz wydruku niewielką kroplę niepolimeryzowanej żywicy z końcówką pipety p200. Siły kapilarne wypełnią kanał.
  6. Utwardzaj wydruki 3D w 60 °C światłem ultrafioletowym przez 15 minut.
  7. Każdy wydruk obejrzyj za pomocą stereomikroskopu i wyrzuć wszelkie niedoskonałości 3D (rysunek 3C-F). Dokładnie sprawdź każdy odcisk, upewniając się, że wszystkie mikrofilary są rozdzielone i jednolite pod względem rozmiaru i wyglądu (Rysunek 3D). Usuń formy główne z wadami połączonymi mikrofilarami (Rysunek 3E).
    UWAGA: Częste problemy to uszkodzone mikrofilary lub mostki spowodowane pozostałością nieumytej żywicy (Rysunek 3Fi,ii).
  8. Okryj zewnętrzną stronę wydruku parafilmem, jeśli kanał wiertła nie jest wypełniony i przechowuj do dalszego użycia.

4. Produkcja form silikonowych

UWAGA: Ta sekcja opisuje ostatnie etapy fazy produkcji (Rysunek 1), podczas których odbędą się dwa etapy formowania silikonu. Jest to konieczne, aby zapobiec uwalnianiu toksycznych wypłuków przez części drukowane w 3D.

  1. Przygotuj silikon zgodnie z instrukcjami producenta, podsumowując:
    1. Dokładnie wymieszaj zawartość pojemników części A i B , umieść zlewkę na wadze i wlej do pojemnika w proporcji 1A:1B według wagi. Upewnij się, że masz nadmiar materiału.
    2. Dokładnie wymieszaj przez 3 minuty, uważnie zeskrobując boki i dół.
    3. Włóż materiał do próżniowego osuszacza i odstaw na 5 minut, aby wyeliminować uwięzione pęcherzyki powietrza. Powtórz odgazowanie do 2 razy, jeśli pozostaną pęcherzyki powietrza.
  2. Wlej mieszankę z równomiernym przepływem do silikonowego pojemnika do formy 1. Upewnij się, że poziom mieszanki jest na tym samym poziomie co na wydruku 3D lub nieco niższy, aby zapewnić płaskość formy silikonowej (rysunek 4Ai,ii).
    1. Usuń uwięzione powietrze za pomocą końcówki pipety p200 i w razie potrzeby użyj odgazowania próżniowego.
  3. Silikon utwardzaj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 godzin, najlepiej przez noc przed wyjmowaniem z formy.
  4. Usuń silikon z wydrukowanej formy 3D i wizualnie potwierdzić integralność mikroform za pomocą stereomikroskopu (rysunek 4Aiii,B). W razie potrzeby usuń nadmiar materiału z kanału wiertniczego (rysunek 4Aiv). Usuwaj formy z mostkami lub uszkodzonymi mikrootworami (rysunek 4C).
  5. Umieść silikonową formę w silikonowym pojemniku form 2 na drugi etap formowania silikonowego (rysunek 4Av). Pojemnik silikonowy nr 2 ma otwór o średnicy 1 mm w bocznej ściance, który zostanie przykryty po założeniu silikonowej formy.
  6. Delikatnie spryskaj silikonową formę olejem mineralnym bezpiecznym dla embrionów i usuń nadmiar oleju z mikrootworów. To działa jako środek uwalniający do rozdzielenia obu silikonowych części po utwardzeniu.
  7. Powtórz kroki mieszania opisane w kroku 4.1 i wlej mieszankę do silikonowego pojemnika do formy 2. Upewnij się, że poziom mieszanki jest poniżej lub na tej samej wysokości co wydruk 3D, aby zapewnić płaskość silikonowej formy (rysunek 4Avi).
  8. Pozwól silikonowi utwardzić się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 godzin, najlepiej przez noc, przed wyjmowaniem z formy.
  9. Usuń silikon z formy wydrukowanej w 3D i oddziel formy silikonowe 1 i 2 od siebie (rysunek 4Avii). Wizualnie potwierdzić integralność mikrofilarów za pomocą stereomikroskopu (rysunek 4D). Usuń pleśń, jeśli w mikrootworach były bąbelki lub nadmiar oleju (Rysunek 4E).
  10. Umyć silikonową formę z 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut w laminarnym okapu.
  11. Włóż do woreczka sterylizacyjnego i autoklaw, stosując cykl suchy do sterylizacji (ciśnienie w osłonie: 20 psi, temperatura komory: 250 °F, czas sterylizacji: 15 min).

5. Przygotowanie mediów kulturowych

UWAGA: Trawienie tkanki jajnika w celu izolacji i hodowli pęcherzyków, dojrzewania oocytów in vitro oraz luteinizacji wymagają sześciu typów mediów: pośrodku rozwarstwionego (DM), enzymatycznego (EM), podtrzymującego (MM), podtrzymującego (MM), żywiołu wzrostowego (GM), dojrzewania (IVM) oraz pośrodku luteinizacyjnego (LM). Przygotowanie tych mediów można znaleźć zgodnie z wcześniejszym opisem Converse i in.38 , wraz z wyjaśnieniem znaczenia różnych komponentów mediów analizowanych przez Simona i in.33, a ich cel jest krótko opisany w Tabeli 1.

  1. Przygotuj media z tygodniowym wyprzedzeniem i przechowuj w temperaturze 4 °C.

6. Odlewanie i przechowywanie indywidualnej kultury pleśni i mieszków mieszkowych agarozy

UWAGA: Ta sekcja opisuje, jak odlewać niestandardowe formy agarozowe do hodowli mieszków mieszkowych z form krzemowych powstałych w sekcji 4. Formy agarozowe można wykonać i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed hodowlą pęcherzyków.

  1. Umieść pleśnie w woreczku sterylizacyjnym i autoklawie, stosując cykl suchy zgodnie z sekcją 4.11. Pozwól formom ostygnąć przed użyciem.
  2. Roztwór agarozy przygotuj, rozpuszczając sterylny roztwór agarozy 1,5% (w/v) w soli fosforanowej (PBS) w mikrofalówce lub na gorącej płytce. Użyj sterylnej stożkowej rurki umieszczanej w zlewce z wodą, aby umożliwić bardziej równomierne nagrzewanie agarozy i spowolnić krzepnięcie roztworu ciekłej agarozy.
  3. Pipetować sterylny roztwór agarozy na krzemowe odlewy w laminarnym kapurze. Pipetuj powoli i płynnie, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków i upewnić się, że górna część formy jest płaska, a nie wypukła ani wklęsła. Góra podczas odlewania będzie dolną częścią formy podczas hodowli i powinna leżeć płasko. Do mikroformy z płytką 24-dołkową należy użyć około 600 μL agarozy i 85 μL do mikroformy mieszczącej się w płytce z 96 dołkami.
  4. Pozwól mikroformom ostygnąć przez ~3 minuty, aż się zastygną. Odlew krzem inwersyjny, aby wyrzucić mikroformy na szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
  5. Oceń mikroformy pod mikroskopem pod kątem deformacji, w tym pęknięć, łączenia mikrodołków lub niepełnych krawędzi. Umieść mikroformy w sterylnym PBS + 1% penicylin-streptomycyny i przechowuj w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed użyciem.
    UWAGA: Rób więcej form niż to konieczne, aby uwzględnić degradację z czasem lub uszkodzenia mikroform podczas przenoszenia między płytami.
  6. Wyrównuj mikroformy w 750 μL ośrodka podtrzymującego 2 razy przez co najmniej godzinę (łącznie dwie inkubacje) w dniu izolacji mieszków mieszkowych.
  7. Usuń wszystkie media podtrzymujące, dodaj 750 μL medium i umieść w inkubatorze na 1 godzinę.
  8. Zamień go na świeży i zrównoważony podłoże uprawy przed siewem.

7. Izolacja i hodowla późnych wtórnych pęcherzyków

UWAGA: Ta sekcja wyjaśnia, jak izolować i zasiewać pęcherzyki w mikroformach agarozowych do hodowli mieszków mieszkowych. Wielowarstwowe wtórne są hodowane przez 8 dni, muszą mieć ponad 80% żywotności i produkować dojrzałe oocyty. Izolacja i hodowla pęcherzyków wtórnych zostały szczegółowo opisane w innych miejscach38. Izolacja i selekcja mieszków mieszkowych do ustalonej enkapsulacji alginatów oraz do siewania w pleśniach agarozowych są spójne.

  1. Rozcinają jajniki myszy i usuwają je z tkanki tłuszczowej okołowojajnika oraz kaletki. Umieść jajniki w 2,5 ml podłoża enzymatycznego i inkubuj w orbitalnym wstrząsie w 37 °C przez 20 minut, jak opisano wcześniej57.
  2. Pipeta 2 mL mediów podtrzymujących w misce IVF i umieść w inkubatorze (37 °C, 5%CO2) przed izolacją mieszków mieszkowych.
  3. Reakcja wygaszania z 250 μL FBS. Po izolacji enzymatycznej wybierz późne pęcherzyki wtórne i przenieś je do poduszki IVF z DM.
  4. Przenieś mieszki mieszkowe do naczynia IVF z prerównoważonym medium podtrzymującym i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5%CO2) na 1 godzinę.
    UWAGA: Początkowy rozmiar późnych pęcherzyków wtórnych wynosi 150-180 μm, z więcej niż dwiema warstwami komórek ziarnistych.
  5. Dodaj 750 μL świeżego GMO do mikroform agarozowych i przechowuj w inkubatorze, aby przygotować się do siewu. Dodaj sterylny PBS do sąsiednich studni otaczających mikropleśnie agarozowe, aby utrzymać wilgotność i zminimalizować parowanie podłoża przez cały okres hodowli.
  6. Mieszki nasienne do agarozowych pleśni, które zostały wstępnie wyważone i zanurzone w GMO. Przenieś wysokiej jakości wielowarstwowe wtórne pęcherzyki do mikroform agarozowych pod mikroskopem za pomocą końcówki do usuwania 200 μm. Upewnij się, że 10 pęcherzyków zostanie przeniesionych do każdej mikroformy w płytkach z 24 dołkami, a każdy mieszek mieszkowy znajduje się w osobnej, ale sąsiedniej mikrodołce.
    1. Zgiąć końcówkę do usuwania pęcherzyka, aby umożliwić precyzyjniejszą manipulację i przeniesienie mieszków do mikrodołków.
    2. Szybko przeszczep mieszki mieszkowe, aby zminimalizować zmiany temperatury i pH, ponieważ MM i GM są buforowaneCO2 .
    3. Upewnij się, że mieszki mieszkowe w mikroformie mają podobny rozmiar początkowy po przeniesieniu wszystkich 10 pęcherzyków.
  7. Umieść zasiane mikroformy z powrotem do inkubatora na co najmniej godzinę, aby mieszki mieszkowe mogły się zregenerować przed badaniem obrazowym.
  8. Obrazuj mieszki mieszkowe z powiększeniem 4x i 10x co drugi dzień, aby ilościowo określić przeżywalność i wyniki wzrostu mieszków.
    UWAGA: Obrazowanie poklatkowe można również skonfigurować do pomiarów morfokinetycznych, które są szczegółowo opisane w sekcji 9.
  9. Zmieniać 50% mediów kulturowych co drugi dzień.
  10. Szybko zamroz zużyte podłoże suchym lodem, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C. Użyj tego podłoża kondycjonowanego do oceny produkcji hormonów za pomocą estradiolowych ELISA.
    UWAGA: Jeśli GMO jest wytwarzane w dniu siewu (początku okresu hodowli), podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C i używać przez cały okres hodowli.
  11. Usuń i zamroz wszystkie podłoża wzrostu (750 μL) w dniu 8 hodowli.
  12. Zamień podłoże do wzrostu podłożem IVM, aby umożliwić owulację in vitro .
    UWAGA: Owulacja może również zachodzić podczas obrazowania poklatkowego w celu oceny momentu i cech pęknięcia.
  13. Usuń kompleksy męczno-jajkowe (COC) 14-16 godzin po dodaniu ośrodka IVM i ocenij status dojrzewania.
    1. Status dojrzewania można zdefiniować następująco: zidentyfikować MII przez wytłaczenie pierwszego ciała polarnego (oczekiwany wynik dla zdrowych oocytów), GVBD/MI przez brak ciała polarnego lub pęcherzyka zarodkowego (opóźniona dojrzałość), GV przez jądro sferyczne widoczne w centrum oocytu (brak progresji mejotycznej) lub oocytu spłaszczonego i/lub przyciemnionego przez zwyrodnienie.
  14. Opcjonalnie: Ponieważ parametry wrzecionowe oocytów MII, w tym wyrównanie, kształt i objętość chromosomów, są ściśle skorelowane z jakością oocytów i wynikami zarodków 58,59, wykorzystaj je do oceny skuteczności oogenezy in vitro. Aby ocenić morfologię wrzecion, utrwalić i barwić jaja MII za pomocą immunocytochemii pełnej mocy.
    1. Fiksacja: Utrwal jaja w 3,8% PFA z 0,1% Triton X-100 w 37 °C przez 20 minut. Przemyj jaja 3 razy w buforze blokującym (PBS z wapniem i magnezem (PBS +/+) z 10% Tween-20 i 0,3% BSA).
    2. Barwienie wrzeciona:
      1. Inkubuj jaja w buforze permeabilizacyjnym (PBS +/+ z 0,1% Triton X-100 i 0,3% BSA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej
      2. Przepłucz 2 razy w buforze blokującym.
      3. Inkubuj jaja w antyalfa-tubulinie sprzężonej z Alexa Fluor 488 w stężeniu 1 μg/mL na bujace owiniętej folią przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
      4. Umyj jaja przez 3 x 20 minut w buforze blokującym przed montażem na szkiełkach mikroskopowych z nośnikiem montażowym zawierającym DAPI.
      5. Aby obserwować cytoszkielet oocytu, należy uwzględnić faloidynę rodaminową w stosunku 1:50 podczas barwienia.
    3. Próbki obrazów na mikroskopie konfokalnym za pomocą obiektywu 63x z stosem z z-stackiem o szerokości 1,0 μm na całym wrzecionie.

8. Dalsze zastosowania niestandardowych form agarozowych

UWAGA: Mikroformy agarozowe mogą być wykorzystywane do analizy histologicznej, umożliwiając ilościową i lokalizację różnych genów lub białek interesujących. Mikroformy tworzą mikromacierz mieszków mieszków, która pozwala na jednoczesne barwienie wielu pęcherzyków. Optyczna tomografia koherencyjna (OCT) może być również wykonywana bez konieczności przenoszenia mieszków włosowych (Rysunek 1, Zastosowanie). Optyczna tomografia koherencyjna to technika obrazowania umożliwiająca rekonstrukcję próbek w 3D i cechuje się większą głębokością penetracji oraz rozdzielczością w porównaniu z mikroskopią konfokalną, co pozwala na lepsze obrazowanie próbek 3D, takich jak pęcherzyki hodowane in vitro60.

  1. W zastosowaniach histologicznych przygotuj roztwór agarozy (1,5% w/v), jak opisano w kroku 6.2.
    1. Usuń wszystkie media otaczające mikroformy agarozowe w dołku i ostrożnie usuń media z wnęki mikroformy, używając pipety p200 w narożnikach wnęki.
    2. Ostrożnie pipetować 100 μL płynnego roztworu agarozy, aby wypełnić i uszczelnić mikrodołki i jamkę bez poruszania mieszków mieszkowych; upewnij się, że góra jest płaska. Usuń wszelkie pęcherzyki sterylną końcówką pipety P10.
    3. Pozwól agarozie zastygnąć w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Upewnij się, że mikroforma jest całkowicie zamknięta pod mikroskopem.
    4. Utrwalaj mikroformy na noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc w 750 μL utrwalacza (zmodyfikowany roztwór Davidsona lub 3,8% paradehydu paraformalnego).
    5. Aspiruj utrwalacz i myj szczelnie zamknięte mikroformy w rosnących stężeniach etanolu, zaczynając od 50% i ostatecznie 70% EtOH.
    6. Przetwarzaj z użyciem zautomatyzowanego przetwarzacza tkankowego wykorzystującego standardowe protokoły (Tabela 2) i osadzaj w wosku parafinowym. Podczas osadzania zwróć uwagę na orientację mikroform. Upewnij się, że przed i po próbce podczas procesu osadzania się znajduje wosk, aby zminimalizować utratę tkanek podczas sekcjonowania.
    7. Sekcjonowanie seryjne osadza próbki o grubości 5 μm i umieszcza je na szkiełkach mikroskopowych ładowanych.
    8. Wykonaj barwienie H&E za pomocą automatycznego barwnika i zabezpiecz medium mocującym przed obrazowaniem.
  2. Podczas wykonywania OCT umieść mikroformę z pęcherzykami w misce o średnicy 50 mm zawierającej nośnik IVM.
    1. Aby wykonać procedurę generowania reprezentatywnych obrazów OCT, obraz wykonany jest za pomocą specjalnie zbudowanego systemu OCT działającego w zakresie spektralnym światła widzialnego z rozdzielczością osiową 1,3 μm i rozdzielczością boczną 9,4 μm61,62.
    2. Skanuj mieszki mieszkowe w polu widzenia 1,58 x 1,58 mm2 , składającym się z 512 linii A i 512 skanów B, powtarzanych 2 razy na każdy skan B i 3 razy na objętość.
    3. Przetwarzaj obrazy OCT za pomocą ImageJ, aby zobrazować trójwymiarową strukturę mieszków mieszkowych i ilościowo określić objętości.
      1. Przesyłaj obrazy do ImageJ jako stos Z, przeciągając pliki do otwartej aplikacji.
      2. Wizualizuj stos z-stack jako obraz 3D, przechodząc do Plugins|3D|Volume Viewer. Obróć obraz 3D, aby zobaczyć różne kąty w różnych punktach czasowych.
      3. Przejdź do Plik| Zapisz jako |Tiff, aby zapisać obraz w wybranym miejscu.

9. Analiza poklatkowa hodowli mieszków mieszkowych za pomocą poklatku czasowego

UWAGA: Mieszki wyhodowane w systemie hodowli bez rusztowania znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej i są kompatybilne z obrazowaniem poklatkowym w inkubatorze. Obrazowanie poklatkowe można rozpocząć po zasiewaniu mieszków mieszkowych w kroku 7.7 (Rysunek 1, Zastosowanie).

Upewnij się, że wszystkie zmiany są dokładne przez cały timelapse. Dlatego po każdym kroku przejdź przez cały stos, aby upewnić się, że nie ma rozbieżności w pomiarach.

  1. Ustawienie timelapse:
    1. Załóż na ręczny mikroskop nasadkę z ogniskowym ogniskiem/koncentratorem.
    2. Włóż ręczny mikroskop z uchwytem do inkubatora i podłącz do laptopa z zainstalowanym oprogramowaniem.
    3. Umieść i wyrównuj posiew pod mikroskopem oraz dostosuj wysokość i ostrość mikroskopu, aby wszystkie mieszki były ostre. Używając automatycznego balansowania bieli (AWB), wybierz optymalne warunki oświetlenia za pomocą LED Control, wyłącz automatyczną ekspozycję ( AE) i wybierz optymalny czas naświetlania.
      UWAGA: Upewnij się, że wyrównanie formy jest takie samo przed i po każdej zmianie medium; W przeciwnym razie analiza będzie musiała być przeprowadzana osobno na każde 2 dni hodowli.
    4. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe, wybierając czas trwania 8 dni i interwał 30 minut. Wybierz zdjęcie i wyłącz diodę LED, gdy nie robisz zdjęć.
  2. Określ, które pomiary zostaną zapisane w oknie dialogowym zestawu pomiarów (kliknij Analizuj | zestaw pomiarów) przed analizą ImageJ.
    UWAGA: Więcej informacji na temat możliwych pomiarów wprowadzonych do oprogramowania ImageJ można znaleźć w przewodniku użytkownika, podsekcja 30.763.
  3. Umieść wszystkie obrazy w osobnym folderze analizy, aby rozpocząć analizę.
  4. Przeciągnij i upuść folder analizy do oprogramowania ImageJ, aby otworzyć timelapse jako stos. Upewnij się, że nazwy sortowania są wybierane numerycznie , a jeśli sekwencje obrazów nie mieszczą się w pamięci RAM komputera, wybierz stos wirtualny.
  5. Użyj narzędzia do wyboru prostokątnego, aby wybrać obszar, w którym obecne są wszystkie mieszki mieszkowe podczas timelapse. Do tego użyj ostatniego obrazu i przewiń stos, aby upewnić się, że żaden z mieszków nie zostanie odcięty. Następnie przytnij zaznaczenie (przejdź do Obraz | Przyciąć lub Ctrl+Shift+X, rysunek 5Ai,ii).
  6. Ustaw pasek skali dla stosu timelapse (Analizuj | Ustaw skalę). Wykorzystaj obraz dnia 0 wykonany za pomocą obrazowca i zmierz trzy rozpoznawalne cechy, takie jak mieszki mieszkowe lub mikrodoły. Użyj tego samego obrazu z dnia 0 ze stosu timelapse i zdefiniuj skalę dla jednego z pomiarów; Użyj pozostałych dwóch pomiarów, aby potwierdzić, że skala jest ustawiona dokładnie.
  7. Wyrównaj wszystkie obrazy za pomocą wtyczki SIFT (przejdź do Wtyczki | Rejestracja | Liniowe wyrównanie stosu z SIFT (rysunek 5Bi,ii). Użyj następujących standardowych ustawień, które można regulować indywidualnie: Liniowe wyrównanie stosu z SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 najbliższych/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation= Interpolacja sztywna.
  8. Przekonwertowanie stosu na 8-bitową skalę szarości (Obraz | Typ | 8 bitów).
  9. Usuń tło za pomocą odejmowania tła z toczącej się kuli (kliknij Proces | Odejmij tło, rysunek 5Ci,ii) przy użyciu następujących ustawień, które można regulować w zależności od przypadku: Promień kuli toczącej się = 70,0 pikseli; Wybierz wyłącz wygładzanie.
  10. Określ próg obrazu (przejdź do Obraz | Dostosuj | Threshold), aby podzielić obrazy timelapse na dwie klasy pikseli, używając następujących ustawień: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convert to Mask", "method=Intermodes background=Dark calculate black").
  11. Zmierz każdy pęcherzyk osobno, używając wyboru prostokąta, a następnie wybierz funkcję analizy cząstek (kliknij Analizuj | Analizuj cząstki). Użyj następujących ustawień: Analizuj cząstki... ", "size= 8000-Infinity display exclude include include summaryze overlay add composite stack (Rysunek 5Di,ii).
    1. Przed zapisem wyników poupewnij się, że zwrot z inwestycji dla każdego zdjęcia jest dokładny (rysunek 5Ei,ii). Zapisz podsumowanie i wyniki w . Format CSV.
    2. Powtórz to dla wszystkich pozostałych mieszków włosowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ustalić, czy przeżywalność i wzrost mieszków były wspierane dzięki tej nowej technologii opisanej w sekcji 7 protokołu, wyizolowano i hodowano równolegle w mikroformach agarozowych lub otoczono w 0,5% alginacie. Reprezentatywne obrazy mieszków mieszkowych z każdego innego dnia hodowli wykazały prawidłowy rozwój, wzrost i tworzenie jamy antralnej przez cały okres hodowli (Rysunek 6A). Wcześniej opublikowane wyniki wykazały, że przeżywalność mieszków nie wykazuje istotnych różnic między me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Gametogeneza in vitro i dojrzewanie to kluczowe technologie dla fundamentalnego zrozumienia biologii oocytów, z potencjalnymi zastosowaniami w technologii wspomaganego rozrodu, zachowaniu płodności oraz ochronie gatunków. Metody wspierające IVG często opierają się na współhodowli z komórkami somatycznymi, aby stworzyć zrekonstruowane jajniki30. Znaczenie tych komórek wspierających jest dobrze znane in vivo, gdzie mikrośrodowisko somatyczne pęcherzykowe jest kluczowe dla zdrowego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te były finansowane przez National Institutes of Child Health and Human Development (R01HD105752 dla F.E.D i T32HD094699 dla E.J.Z) oraz program SenNet NIH Common Fund (U54AG075932 i UH3CA268105 dla F.E.D.) oraz grant Bill & Melinda Gates Foundation (INV-003385 dla F.E.D.). Na podstawie warunków przyznania grantu Fundacji Billa i Melindy Gatesów, licencja Creative Commons Attribution 4.0 została już przypisana wersji Autor Accepted Manuscript, która może wyniknąć z tego zgłoszenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały i chemikalia
  Rurki do wirówek polistyrenowych o pojemności 50 mLGlobe Scientific941-11017-CS
Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mLFisher ScientificMCT-150Aby szybko zamrozić i przechować materiały
Talerz 100 mm, nieimpregnowanyFisher Scientific08-757-100D Do produkcji i przechowywania mikroform agarozowych
100% etanolMercedes Scientific1200Przetwarzanie tkanek
1000 &mikro; L  Końcówki pipety, niska retencjaMIDSCIPR-1000BKWskazówki dotyczące kultury 
200 & mikro; L  Końcówki pipety, niska retencjaMIDSCIPR-200BKWskazówki dotyczące kultury 
Płytka z 24 dołkamiCorning353047Kultura
Talerze 35 mmFalcon351008Izolować jajniki i inkubować w ośrodku enymtycznym
95% etanoluMercedes Scientific1210Przetwarzanie tkanek
AgaroseHoeferGR140Mikroformy
BioXtra olej mineralny, lekki olej, odpowiedni do hodowli komórek zarodków myszySigma-AldrichM5310-500MLStosowany jako biokompatybilny środek do wyjmowania z formy
Albumina z surowicy/nbsp;MP Biomedicals103700Medium wzrostu
Sprzątacze do czyszczenia, 10 oz., opakowanie 6Office Depot 110284Sprężone powietrze
Przezroczysta żywica V4 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-04Żywica do druku 3D
Corning Plastik wielorazowego użytku, niskoformowa zlewka 100 mL, polipropylen, stopniowanaCorning1000P-100Zlewka do mieszania elementów silikonowych 
DNAse IQiagen79254Ośrodki enzymatyczne
Ecoflex 00-45 Near ClearSmooth-On, IncB09M8Y9PTVMateriał silikonowy
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Medium wzrostu
Fetuin bydła płodowaSigmaF-3385Medium wzrostu
Serum bydła płodu (FBS)Serum szczytuPS-FB2Medium do rozwarstwienia, ośrodka enzymatycznego itdnbsp; Materiały konserwacyjne i materiały Ośrodek dojrzewania
Fisherbrand  Sakiewki sterylizacyjneFisher Scientific01-812-50 Sakiewki sterylizacyjne
Hormon stymulujący pęcherzyki (FSH)EMD Serono, Inc.Tylko Gonal-F Rx & nbsp;Media wzrostu i materiały Ośrodek dojrzewania
Gibco   DPBS, wapń, magnezFisher Scientific14-040-182 i nbsp;Sól fizjologiczna Dulbecco z buforem fosforanowym
Gonadotropina ludzka kosmówkowa (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLOśrodek dojrzewania
Insulina-transferyna-selen (ITS)ThermoFisher41400045Medium wzrostu
Sondy molekularne invitrogen, Rhodamina falloidynaFisher ScientificR415Plama cytoszkieletu jajowego
Naczynia IVFThermo Scientific150260Aby izolować, wybrać i prerównoważyć pęcherzyki
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064Dissection Media & Ośrodki enzymatyczne
LiberaseSigma Aldrich5401119001Ośrodki enzymatyczne
MEM? + GlutaMAXGibco32561-037Materiały konserwacyjne i Media wzrostu i materiały Ośrodek dojrzewania
Czynnik wzrostu naskórka myszy (EGF)BD Biosciences354010Ośrodek dojrzewania
Nalgene Przezroczysty Poliwęglanowy Klasyczny OsuszaczThermo Scientific5311-0250Odkurzacz próżniowy  
ParafinaFisher Scientific83-30Przetwarzanie tkanek i Osadzanie
Penicylina-streptomycynaGibco15140-122Ośrodki do rozwarstwiania, ośrodki enzymatyczne i ośrodki enzymatyczne Materiały konserwacyjne
Końcówki do stripperaOrigioMXL3-200Kultura
VECTASHIELD PLUS Medium Montażowe Antifade z DAPILaboratoria VectorH-2000Barwienie jądra jajowego
KsylenMercedes Scientific9840Przetwarzanie tkanek
α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)Technologia sygnalizacji komórkowej5063SPlama tubulinowej jajka
Sprzęt
Zbuduj platformę 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 Komponent drukarki 3D
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLObrazowanie do ustawienia timelapse
Zbiornik żywiczny Form 3 V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-01Komponent drukarki 3D
Drukarka 3D Form 3B +Formlabs, IncF3B-P-PRINTERDrukarka 3D stereolitografii (SLA) firmy Formlabs
Forma utwardzenia Formlabs, IncFH-CU-01Platforma do utwardzania 
Formowe płukanieFormlabs, IncFH-WA-01Platforma myjąca
Butelka z rozpylaczem z pompą do parowaniaVWR0309-3005Aby nałożyć środek do wyjmowania formy
Nasadka ogniskowania/koncentratora światła dla serii Edge (z wyłączeniem modeli T5, T8)Dino-LiteN3C-RKomponent obrazowania do konfiguracji timelapse
Pakiet uchwytu montażowego łączący rack RK-10 oraz przedłużenie ramienia RK-10-EXDino-LiteRK-10AKomponent obrazowania do konfiguracji timelapse
Osadzenie tkanekLeicaHistoCore ArcadiaOsadzanie mikroform
Procesor tkanekLeicaTP1020Do przetwarzania mikroform
211DS Inkubator Drżący (Orbital Shaker)Labnet InternationalI-5211-DSInkubacja jajników w podłożu enzymatycznym w celu uwalniania pęcherzyków
Software 
Autodesk FusionAutodesk, IncOprogramowanie do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Autodesk oferuje bezpłatny dostęp edukacyjny w ramach programu edukacyjnego Autodesk.
DinoCapture 3.0 wersja 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJNarodowe Instytuty ZdrowiaAnaliza obrazów OCT i pomiar mieszków mieszkowych
PreFormFormlabs, IncDarmowe oprogramowanie do przygotowania druku zaprojektowane do pracy z drukarkami stereolitograficznymi (SLA) firmy Formlabs. 

Bibliografia

  1. Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
  2. Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annu Rev Physiol. 79 (1), 237-260 (2016).
  3. Baerwald, A. R., Adams, G. P., Pierson, R. A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review. Hum Reprod Updat. 18 (1), 73-91 (2012).
  4. American Society for Reproductive Medicine. Testing and interpreting measures of ovarian reserve: a committee opinion. Fertil Steril. 114 (6), 1151-1157 (2020).
  5. Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
  6. Young, J. M., McNeilly, A. S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).
  7. Liu, T., Qin, Q. Y., Qu, J. X., Wang, H. Y., Yan, J. Where are the theca cells from: the mechanism of theca cells derivation and differentiation. Chin Med J. 133 (14), 1711-1718 (2020).
  8. Abbara, A., Clarke, S. A., Dhillo, W. S. Novel concepts for inducing final oocyte maturation in in vitro fertilization treatment. Endocr Rev. 39 (5), 593-628 (2018).
  9. Conti, M., Franciosi, F. Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo: integrated nuclear and cytoplasmic events. Hum Reprod Updat. 24 (3), 245-266 (2018).
  10. Williams, C. J., Erickson, G. F. Morphology and physiology of the ovary. , (2000).
  11. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. T., Castrillon, D. H., Felici, M. D., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  12. Jiang, Y., He, Y., Pan, X., Wang, P., Yuan, X., Ma, B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. Int J Mol Sci. 24 (10), 9059(2023).
  13. Clarke, H. J. Regulation of germ cell development by intercellular signaling in the mammalian ovarian follicle. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (1), (2018).
  14. Hsueh, A. J. W., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. J. M. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocr Rev. 36 (1), 1-24 (2015).
  15. Smitz, J., et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Updat. 16 (4), 395-414 (2010).
  16. Resetkova, N., Hayashi, M., Kolp, L. A., Christianson, M. S. Fertility preservation for prepubertal girls: update and current challenges. Curr Obstet Gynecol Rep. 2 (4), 218-225 (2013).
  17. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W., Anderson, R. A. Fertility preservation in pre-pubertal girls with cancer: the role of ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 105 (1), 6-12 (2016).
  18. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. Nat Rev Endocrinol. 9 (12), 735-749 (2013).
  19. Cabeza, J. P., Gambini, A. Advancements and challenges in in vitro reproductive technologies for the conservation of equine species. Theriogenology Wild. 2, 100036(2023).
  20. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reprod Fertil. 2 (1), 35-46 (2021).
  21. Zhang, J., et al. An ex vivo ovulation system enables the discovery of novel ovulatory pathways and nonhormonal contraceptive candidates. Biol Reprod. 108 (4), 629-644 (2023).
  22. Gal, A., Gedye, K., Craig, Z. R., Ziv-Gal, A. Propylparaben inhibits mouse cultured antral follicle growth, alters steroidogenesis, and upregulates levels of cell-cycle and apoptosis regulators. Reprod Toxicol. 89, 100-106 (2019).
  23. Zhou, H., Shikanov, A. Three-dimensional hydrogel-based culture to study the effects of toxicants on ovarian follicles. Methods Mol Biol. 1758, 55-72 (2018).
  24. Silber, S. J., Goldsmith, S., Castleman, L., Hayashi, K. In vitro maturation, in vitro oogenesis, and ovarian longevity. Reprod Sci. 31 (5), 1234-1245 (2024).
  25. Tian, C., et al. Functional oocytes derived from granulosa cells. Cell Rep. 29 (13), 4256-4267 (2019).
  26. Zolfaghar, M., et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 6 (10), e04992(2020).
  27. Psathaki, O. E., et al. Ultrastructural characterization of mouse embryonic stem cell-derived oocytes and granulosa cells. Stem Cells Dev. 20 (12), 2205-2215 (2011).
  28. Malik, H. N., Singhal, D. K., Saini, S., Malakar, D. Derivation of oocyte-like cells from putative embryonic stem cells and parthenogenetically activated into blastocysts in goat. Sci Rep. 10 (1), 10086(2020).
  29. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  30. Saitou, M., Hayashi, K. Mammalian in vitro gametogenesis. Science. 374 (6563), eaaz6830(2021).
  31. Yoshino, T., et al. Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells. Science. 373 (6552), (2021).
  32. Hikabe, O., et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature. 539 (7628), 299-303 (2016).
  33. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  34. Green, L. J., Shikanov, A. In vitro culture methods of preantral follicles. Theriogenology. 86 (1), 229-238 (2016).
  35. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction. 127 (6), 669-677 (2004).
  36. Nation, A., Selwood, L. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial. Reproduction. 138 (2), 247-255 (2009).
  37. Xiao, S., Zhang, J., Romero, M. M., Smith, K. N., Shea, L. D., Woodruff, T. K. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5 (1), 17323(2015).
  38. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2022).
  39. Tomaszewski, C. E., DiLillo, K. M., Baker, B. M., Arnold, K. B., Shikanov, A. Sequestered cell-secreted extracellular matrix proteins improve murine folliculogenesis and oocyte maturation for fertility preservation. Acta Biomater. 132, 313-324 (2021).
  40. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  41. Xu, Y., Duncan, F. E., Xu, M., Woodruff, T. K. Use of an organotypic mammalian in vitro follicle growth assay to facilitate female reproductive toxicity screening. Reprod Fertil Dev. 28 (9), 1295-1306 (2015).
  42. West, E., Shea, L., Woodruff, T. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  43. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 84 (4), 689-697 (2011).
  44. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biol Reprod. 73 (5), 942-950 (2005).
  45. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  46. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142 (2), 309-318 (2011).
  47. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  48. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 103 (2), 378-386 (2009).
  49. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Mol Hum Reprod. 28 (10), gaac033(2022).
  50. Brito, I. R., et al. Alginate hydrogel matrix stiffness influences the in vitro development of caprine preantral follicles. Mol Reprod Dev. 81 (7), 636-645 (2014).
  51. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  52. Amorim, C. A., Langendonckt, A. V., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  53. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  54. Thorne, J. T., Segal, T. R., Chang, S., Jorge, S., Segars, J. H., Leppert, P. C. Dynamic reciprocity between cells and their microenvironment in reproduction. Biol Reprod. 92 (1), 25(2015).
  55. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Biomed Eng. 16 (1), 29-52 (2014).
  56. Berkholtz, C., Shea, L., Woodruff, T. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  57. Zaniker, E. J., Hashim, P. H., Gauthier, S., Ankrum, J. A., Campo, H., Duncan, F. E. Three-dimensionally printed agarose micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  58. Fluks, M., Milewski, R., Tamborski, S., Szkulmowski, M., Ajduk, A. Spindle shape and volume differ in high- and low-quality metaphase II oocytes. Reproduction. 167 (4), (2024).
  59. Tomari, H., et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 17 (3), 268-274 (2018).
  60. Popescu, D. P., et al. Optical coherence tomography: fundamental principles, instrumental designs and biomedical applications. Biophys Rev. 3 (3), 155(2011).
  61. Fang, R., et al. Robotic visible-light optical coherence tomography visualizes segmental Schlemm's canal anatomy and segmental pilocarpine response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 47(2025).
  62. Kim, D., et al. In vivo quantification of anterior and posterior chamber volumes in mice: implications for aqueous humor dynamics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 18(2025).
  63. ImageJ user guide - IJ 1.46r | Analyze menu. , https://imagej.net/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.7 (2012).
  64. Takashima, T., Fujimaru, T., Obata, Y. Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. Reproduction. 162 (4), 307-318 (2021).
  65. Xu, J., Zelinski, M. B. Oocyte quality following in vitro follicle development. Biol Reprod. 106 (2), 291-315 (2021).
  66. Li, A., et al. Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum-free culture of secondary follicles in vitro. J Cell Physiol. 236 (7), 5352-5361 (2021).
  67. Jin, S. Y., Lei, L., Shikanov, A., Shea, L. D., Woodruff, T. K. A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse. Fertil Steril. 93 (8), 2633-2639 (2010).
  68. Xiao, S., Duncan, F. E., Bai, L., Nguyen, C. T., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Size-specific follicle selection improves mouse oocyte reproductive outcomes. Reproduction. 150 (3), 183-192 (2015).
  69. Pepling, M. E., Sundman, E. A., Patterson, N. L., Gephardt, G. W., Medico, L., Wilson, K. I. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  70. Canning, J., Takai, Y., Tilly, J. L. Evidence for genetic modifiers of ovarian follicular endowment and development from studies of five inbred mouse strains. Endocrinology. 144 (1), 9-12 (2003).
  71. Hirshfeld-Cytron, J. E., Duncan, F. E., Xu, M., Jozefik, J. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Animal age, weight and estrus cycle stage impact the quality of in vitro grown follicles. Hum Reprod. 26 (9), 2473-2485 (2011).
  72. Tingen, C. M., Bristol-Gould, S. K., Kiesewetter, S. E., Wellington, J. T., Shea, L., Woodruff, T. K. Prepubertal primordial follicle loss in mice is not due to classical apoptotic pathways. Biol Reprod. 81 (1), 16-25 (2009).
  73. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  74. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  75. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), e13259(2020).
  76. Umehara, T., Richards, J. S., Shimada, M. The stromal fibrosis in aging ovary. Aging (Albany NY). 10 (1), 9-10 (2018).
  77. Pietroforte, S., Plough, M., Amargant, F. Age-associated increased stiffness of the ovarian microenvironment impairs follicle development and oocyte quality and rapidly alters follicle gene expression. bioRxiv. , (2024).
  78. McElhinney, K. L., Rowell, E. E., Laronda, M. M. Encapsulation of bovine primordial follicles in rigid alginate does not affect growth dynamics. Bioengineering. 11 (7), 734(2024).
  79. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB J. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  80. Sosa, E., et al. Reconstituted ovaries self-assemble without an ovarian surface epithelium. Stem Cell Rep. 18 (11), 2190-2202 (2023).
  81. Rogers, H. B., et al. Dental resins used in 3D printing technologies release ovo-toxic leachates. Chemosphere. 270, 129003(2021).
  82. de Almeida Monteiro Melo Ferraz, M., et al. Potential health and environmental risks of three-dimensional engineered polymers. Environ Sci Technol Lett. 5 (2), 80-85 (2018).
  83. Bomba-Warczak, E. K., et al. Exceptional longevity of mammalian ovarian and oocyte macromolecules throughout the reproductive lifespan. eLife. 13, RP93172(2024).
  84. Rajendran, S., et al. Automatic ploidy prediction and quality assessment of human blastocysts using time-lapse imaging. Nat Commun. 15 (1), 7756(2024).
  85. Bori, L., Meseguer, F., Valera, M. A., Galan, A., Remohi, J., Meseguer, M. The higher the score, the better the clinical outcome: retrospective evaluation of automatic embryo grading as a support tool for embryo selection in IVF laboratories. Hum Reprod. 37 (6), 1148-1160 (2022).
  86. Merces, G. O. T., Kennedy, C., Lenoci, B., Reynaud, E. G., Burke, N., Pickering, M. The incubot: a 3D printer-based microscope for long-term live cell imaging within a tissue culture incubator. HardwareX. 9, e00189(2021).
  87. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  88. Pernodet, N., Maaloum, M., Tinland, B. Pore size of agarose gels by atomic force microscopy. Electrophoresis. 18 (1), 55-58 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroformy agarozowehodowla bezrusztowianowap cherzyki jajnikoweformy drukowane w 3Dobrazowanie time lapsewielowarstwowe p cherzyki wt rnewykonanie formy silikonowejfolikulogeneza in vitrooptyczna tomografia koherentna
Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.