Artykuł metodologiczny

Kompleksowa ocena narzędzi imputacji genotypów dla ultra-niskiej głębokości danych sekwencjonowania całego genomu

DOI:

10.3791/68879

⸱

12 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2Shenzhen Key Laboratory of Transomics Biotechnologies, BGI Research, 3State Key Laboratory of Genome and Multi-omics Technologies, BGI Research, 4The Innovation Centre of Ministry of Education for Development and Diseases, School of Medicine, South China University of Technology, 5Shanxi Medical University-BGI Collaborative Center for Future Medicine, Shanxi Medical University, 6State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy narzędzia imputacji – STITCH, QUILT2 i GLIMPSE2 – zostały porównane na różnych głębokościach sekwencjonowania i rozmiarach próbek, korzystając z paneli referencyjnych CKB i EAS. Wyniki stanowią praktyczne ramy do wyboru odpowiednich strategii imputacji w danych sekwencjonowania ultra-niskiej głębi, ułatwiając szeroko zakrojone badania genomowe i kompleksowe badania cech populacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie ultra-niskiej głębokości (ULDS) to opłacalna strategia dla szeroko zakrojonych badań genomowych, ale jej użyteczność zależy od dokładnej imputacji genotypu. Badanie to ocenia trzy narzędzia imputacji — STITCH, QUILT2 i GLIMPSE2 — na różnych głębokościach sekwencjonowania i wielkościach próbek, korzystając z paneli referencyjnych China Kadoorie Biobank (CKB) oraz The 1000 Genomes Project (1KGP) East Asian (EAS). Wykazano krytyczne różnice w wydajności: Czułość na wielkość próby: Dokładność STITCH znacznie wzrosła przy większych próbkach, podczas gdy QUILT2 i GLIMPSE2 wykazywały minimalną zależność od wielkości próby. Optymalizacja panelu referencyjnego: Populacyjnie specyficzny CKB znacząco zwiększył dokładność dla QUILT2 i GLIMPSE2, ale miał znikomy wpływ na STITCH, który opiera się na wewnętrznej wnioskacji haplotypowej. Progi głębokości: Wszystkie narzędzia osiągały solidną dokładność na umiarkowanych głębokościach sekwencjonowania (≥ 0,5x), ale STITCH osiągał drastycznie gorsze wyniki na ultra-niskich głębokościach (≤ 0,1x). GLIMPSE2 z CKB zapewniał najwyższą ogólną dokładność, podczas gdy QUILT2 równoważył precyzję i efektywność obliczeniową. W przypadku danych z nieinwazyjnych badań prenatalnych (NIPT) GLIMPSE2+CKB zachowało wystarczającą dokładność do analiz końcowych. Proponowany jest system decyzyjny, który priorytetowo traktuje panele dopasowane do populacji oraz narzędzia dostosowane do głębi, oferując praktyczne wytyczne dla optymalizacji ULDS-WGS w różnorodnych środowiskach badawczych. Te wnioski łączą postępy metodologiczne z praktyczną implementacją, umożliwiając opłacalne skalowanie badań genomowych bez obniżania jakości danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie ultra-niskiej głębokości (ULDS), definiowane jako pokrycie sekwencjonowania poniżej 1x, zyskało na popularności dzięki niskim kosztom, szerokiemu pokryciu genomu oraz kompatybilności z różnorodnymi typami próbek. Już wykazał wartość kliniczną w zastosowaniach takich jak nieinwazyjne badania prenatalne (NIPT)1, monitorowanie nowotworów2 oraz wykrywanie chromosomowej liczby kopii (CNV) 3,4. Poza diagnostyką kliniczną, malejące koszty sekwencjonowania oraz szybki postęp w bioinformatyce umożliwiły ULDS odgrywanie coraz większej roli w genomice populacyjnej i badaniach nad złożonymi cechami. Łącząc dane ULDS z panelami referencyjnymi haplotypów na skalę populacji, imputacja genotypów umożliwia odzyskiwanie informacji wariantów obejmujących cały genom na poziomie indywidualnym. W rezultacie ULDS stał się opłacalną alternatywą dla tradycyjnych układów polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) oraz sekwencjonowania całego genomu o dużej głębi (WGS)5, szczególnie w dużych badaniach, takich jak badania asocjacji całego genomu (GWAS) oraz analizy struktury populacji.

Wcześniejsze badania wykazały wykonalność przeprowadzania różnych badań genetycznych z wykorzystaniem danych sekwencjonowania NIPT, w tym wywoływania wariantów, rekonstrukcji historii populacji, wnioskowania o wzorcach infekcji wirusowych oraz GWAS6.

Pomimo tych zalet, niezwykle oszczędna natura danych ULDS stwarza ze sobą wyjątkowe wyzwania. Na poziomie wariantów wiele miejsc jest całkowicie nieobserwowanych lub reprezentowanych tylko przez jeden allel na osobę, co prowadzi do niewystarczającej jakości danych do dalszych analiz. Imputacja genotypów jest zatem niezbędna, wykorzystując strukturę haplotypów z dużych paneli referencyjnych (np. 1000 Genomes7 lub zasobów specyficznych dla populacji) do statystycznego wnioskowania brakujących lub niepewnych genotypów. Wcześniejsze badania wykazały, że imputacja na podstawie danych NIPT może osiągnąć wysoką dokładność i zachować solidną moc statystyczną w GWAS do identyfikacji wariantów związanych z cechami8. Korzystając z algorytmu STITCH9 , dane NIPT (średnia głębokość ~0,15x) w kohorcie 20 900 chińskich kobiet w ciąży zostały pomyślnie inwestowane, co doprowadziło do identyfikacji locusów związanych z ciążą. Przypisane genotypy wykazywały silną zgodność z danymi WGS z dużej głębi w wynikach GWAS (Pearson R² > 0.8)10.

Sukces analiz opartych na ULDS w kluczowej mierze zależy od dokładności imputacji, na którą wpływają głębokość sekwencjonowania, jakość panelu referencyjnego i dopasowanie populacji, wydajność algorytmu imputacji, wielkość próby oraz spektrum częstotliwości alleli11. Spośród nich wybór panelu referencyjnego jest głównym czynnikiem determinującym dokładność imputacji. Powszechnie wykorzystywane panele obejmują globalnie reprezentatywne zasoby, takie jak 1000 Genomes Project (1KGP)7, TOPMed12 oraz Haplotype Reference Consortium (HRC)13, a także coraz częściej dostępne panele populacyjne lub regionalne specyficzne, takie jak Singapore 10,000 Genomes (SG10K)14, China Kadoorie Biobank (CKB)15. Kolejnym kluczowym czynnikiem wpływającym na wydajność imputacji jest wybór algorytmu. Opracowano kilka narzędzi, aby sprostać unikalnym wyzwaniom sekwencjonowania na niskiej głębokości, znacząco przyspieszając praktyczne wykorzystanie imputacji w szeroko zakrojonych badaniach genetycznych. Chociaż metody imputacji takie jak Beagle (v5+)16, Minimac417 i IMPUTE511 są szeroko stosowane dla danych SNP z tablicami i średniej i wysokiej głębokości WGS, często działają one suboptymalnie w ustawieniach ULDS. Ostatnio opracowano specjalistyczne narzędzia do radzenia sobie z tymi wyzwaniami. STITCH9 wnioskuje haplotypy bezpośrednio z odczytów sekwencjonowania na niskiej głębokości, co czyni go szczególnie odpowiednim dla dużych, jednorodnych kohort. QUILT218 wykorzystuje skompresowaną bibliotekę haplotypów oraz lokalizowany model wiarygodności, umożliwiając efektywną imputację z użyciem ogromnych paneli referencyjnych i oferując unikalne zastosowania w genomice prenatalnej. GLIMPSE219, rozszerzenie oryginalnego frameworka GLIMPSE, zapewnia dalsze poprawy zarówno w zakresie dokładności, jak i efektywności obliczeniowej.

Chociaż te narzędzia stanowią znaczący postęp, ich względna wydajność przy różnych projektach eksperymentalnych (np. głębokość sekwencjonowania, wielkość kohorty i wybór panelu referencyjnego) nie została systematycznie oceniona, co pozbawia badaczy jasnych wskazówek dotyczących wyboru najbardziej odpowiedniej strategii. Aby zniwelować tę lukę, trzy szeroko stosowane narzędzia imputacji ULDS — STITCH, QUILT2 i GLIMPSE2 — zostały systematycznie porównane pod różnymi głębokościami sekwencjonowania i wielkością próbek. Ich wyniki oceniano przy użyciu dwóch wschodnioazjatyckich paneli referencyjnych, które są bardzo istotne dla chińskiej populacji. Wyniki wskazują, że imputacja ULDS jest generalnie wiarygodna na głębokościach sekwencjonowania ≥0,5x, podczas gdy głębokości <0,1x wymagają znacznie większej liczby kohort, aby osiągnąć akceptowalną dokładność. Wybór panelu referencyjnego powinien być dostosowany do kontekstu badania, a panele dopasowane do populacji, takie jak CKG, poprawiają dokładność imputacji. Ponadto te podejścia są bezpośrednio stosowane do danych o ultra-małej głębi generowanych w dużych badaniach populacyjnych i NIPT. Badanie to ustanawia praktyczne ramy wyboru narzędzi w badaniach opartych na ULDS, dostarczając metodologicznego wytyczne dla przyszłych zastosowań w genetyce populacyjnej i analizach złożonych cech.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed udziałem. Badanie obejmujące szczegółowe dane WGS zostało przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową BGI (BGI-IRB 23058-T2), a zatwierdzenie na zbieranie zasobów genetycznych ludzkich uzyskano od Administracji Zasobów Genetycznych Chin ([2023] CJ0262). Badanie z udziałem danych ULDS z NIPT zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową Szpitala Dziecięcego w Wuhan (2021R062) oraz Komisję ds. Instytucjonalnego Przeglądu BGI (BGI-IRB 21088), z dodatkową aprobatą Chińskiej Administracji Zasobów Genetycznych ([2021] CJ2002).

UWAGA: Badanie to obejmowało dwa typy danych WGS. Pierwszy typ składał się z dogłębnych danych WGS (30xx) uzyskanych z próbek krwi 500 osób zrekrutowanych z naturalnej kohorty populacyjnej w Shenzhen. Dane te zostały wykorzystane do stworzenia wysokiej jakości zestawu danych potwierdzających fakty terenowe oraz do późniejszych próbek i oceny dokładności. Drugi typ obejmował dane ULDS pochodzące z NIPT obejmującego 10 000 kobiet w ciąży z rejonu Wuhan.

1. Szczegółowe dane sekwencjonowania całego genomu

  1. Pobierz 500 próbek krwi obwodowej (po 5 mL każda) od grupy ogólnej po świadomej zgodzie. Przechowuj próbki w probówkach EDTA i transportuj je w temperaturze 2-8 °C.
  2. Wirować krew w dawce 1 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby oddzielić osocze i białą powłokę. Ostrożnie zbieraj płaszcz buffy i przechowuj go w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji DNA.
  3. Wyodrębnij genomowe DNA z Buffy coat za pomocą zestawu z koralikami magnetycznymi, zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Ilościowo określ stężenie DNA za pomocą testu fluorometrycznego i oceń integralność DNA za pomocą elektroforezy żelu agarozowego. Wybieraj próbki o łącznej wydajności DNA ≥1 μg, stężeniu ≥12,5 ng/μL, długości fragmentu >20 kb bez widocznej degradacji do przygotowania bibliotecznego.
  5. Ścinanie 80-200 ng wysokiej jakości DNA genomowego do średniej wielkości 350-400 bp przez ultradźwięk.
  6. Wykonaj naprawę końcową w 20 °C przez 30 minut, ligację adaptera w 20 °C przez 15 minut oraz cyrkularyzację w 37 °C przez 30 minut, aby stworzyć biblioteki wolne od PCR. Generuj nanokulki DNA (DNB) za pomocą amplifikacji koła toczącego się (RCA). Sekwencyjne biblioteki parowane (PE100, długość odczytu 100 bp) na platformie DNBSEQ do docelowej głębokości ~30x (średnio 100 Gb na próbkę). Przechowuj surowe odczyty sekwencjonowania w formacie FASTQ do dalszej analizy.
    UWAGA: Obsługa wszystkich próbek pochodzących od człowieka w warunkach laboratoryjnych BSL-2. Unikaj powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania, aby zapobiec degradacji DNA. Utylizacja materiałów pochodzących z krwi jako odpady biologicznie niebezpieczne; Utylizacja odczynników chemicznych zgodnie z wytycznymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych instytucji.

2. Dane NIPT o ultra-niskiej głębokości (~0,1x WGS)

  1. Pobierz 10 000 próbek krwi matki (po 5 ml każda) do rutynowych nieinwazyjnych badań prenatalnych (NIPT). Używaj rurek EDTA i transportuj w temperaturze 2-8 °C; przetwarza plazmę w ciągu 8 godzin od zebrania.
  2. W przypadku stabilizowanych krążących rurek DNA (rurek K lub G-tubes), transportuj w temperaturze 6-35 °C za pomocą nośników o kontrolowanej temperaturze i przetwarzaj w ciągu 96 godzin, zgodnie ze standardowymi procedurami produkcyjnymi producenta.
  3. Wiruj krew w dawce 1 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby oddzielić osocze. Ostrożnie zbieraj górną warstwę plazmy, nie naruszając białej powłoki ani granulki komórkowej pipetą i przenieś ją do nowej rurki. Ponownie wiruj odzyskaną plazmę w dawce 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć pozostałości komórek lub zanieczyszczenia. Ostrożnie przełóż klarowizowany supernatant (osocza wolna od komórek) do świeżej probówki w celu ekstrakcji DNA.
  4. Ekstrakt krążącego DNA wolnego od komórek (cfDNA) z osocza za pomocą zestawu do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Wykonaj naprawę końcową w 20 °C przez 30 minut, podwiązywanie adaptera w 20 °C przez 15 minut oraz amplifikację PCR (12 cykli, denaturacja 98 °C 10 s, wyżarzanie 60 °C 30 s, wydłużenie 72 °C 30 s).
  5. Oczyść produkty PCR i obiegać biblioteki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Generuj DNB przez RCA. Sekwencyjne biblioteki jednokierunkowe (SE35, długość odczytu 35 bp) na platformie BGISEQ-500. Przechowuj surowe dane sekwencjonowania w formacie FASTQ.
    UWAGA: Traktować próbki osocza jako potencjalnie zakaźny materiał w warunkach BSL-2. Minimalizuj cykle zamrożenia i rozmrażania, aby zmniejszyć degradację cfDNA. Utylizacja odpadów plazmowych i plastikowych materiałów zużywalnych jako materiały biologicznie niebezpieczne.

3. Potok wstępnego przetwarzania danych

  1. Aby systematycznie ocenić wydajność narzędzi imputacji genotypów przy różnych głębokościach sekwencjonowania, należy przeprowadzić standaryzowany proces wstępnego przetwarzania zarówno na oryginalnych danych WGS o wysokiej głębi (30x), jak i na ultra-niskich głębokościach danych NIPT (<0,1x), w tym symulowane próbkowanie w dóle, kontrola jakości, wyrównanie odczytu, usuwanie duplikatów oraz rekalibracja bazowego wyniku jakości (BQSR).
    UWAGA: Kroki od tego punktu do oceny dokładności imputacji stanowią główny protokół (Rysunek 1) tego badania. Konkretny kod można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 1.
  2. Zmniejszanie próbkowania
    1. Wygeneruj serię downsamplowanych zbiorów danych z oryginalnych 30x próbek sekwencjonowania o dużej głębi. Zastosuj dwie strategie, aby realistycznie odwzorować cechy sekwencjonowania danych NIPT, opisane poniżej.
    2. Losowe podpróbowanie: Użyj seqtk v1.5 (https://github.com/lh3/seqtk) z ustalonym losowym seedem 100, aby stworzyć cztery poziomy danych o niskiej głębokości (0,05x, 0,1x, 0,5x i 1,0x).
    3. Symulacja struktury odczytu podobna do NIPT: Zachowuj tylko pierwszy odczyt (R1) każdego czytania parowanego końca i obcinaj wszystkie zachowane odczyty do 35 bp z seqtk trimfq -L 35, zgodnie z typowym charakterem sekwencjonowania NIPT z pojedynczym końcem i krótkim odczytem.
  3. Kontrola jakości
    1. Przetwarzaj wszystkie surowe pliki FASTQ w fastp v0.23.420. Użyj następujących parametrów: --qualified_quality_phred=5 (próg jakości bazy), --unqualified_percent_limit=50 (maksymalny dozwolony procent baz niskiej jakości), --n_base_limit=10 (maksymalna liczba baz na odczyt) oraz usuń niestandardowy adapter z --adapter_sequence=AAGTCGGCCAAGGGGTGTTAG
      GAAGACAA (R1) oraz --adapter_sequence_r2=AAGTCGGATCGTAGCC
      ATGTCGTTCTGTGAG
      CCAAGGAGTTG (R2).
    2. Wyłącz przycinanie ogonów Poly-G (--disable_trim_poly_g) i generuj raporty zarówno w formatach JSON, jak i HTML dla każdej próbki.
  4. Wyrównanie i usuwanie duplikatów
    1. Dopasuj wysokiej jakości odczyty do ludzkiego genomu referencyjnego GRCh38 (hg38)21 używając BWA v0.7.16a-r118122.
    2. Wykonaj wyrównanie algorytmem aln (-e 10 -t 4 -i 5 -q 0), a następnie samse dla wyrównania na jednym końcu z odczytanymi informacjami grupowymi.
    3. Przekonwertuj powstałe pliki SAM na BAM, posortuj (samtools sort -@ 8) i usuń duplikaty za pomocą SAMtools v1.323 (samtools rmdup). Indeksuj wszystkie pliki BAM.
  5. Rekalibracja wyniku podstawowego (BQSR)
    1. Wykonaj BQSR używając GATK v4.0.4.024. Trenuj model kalibracji na trzech wysoko pewnych zestawach danych wariantów: dbSNP build 14625, Mills i 1000G gold standardindels 21 oraz plik GATK resource bundle24 znanych indels dla GRCh38. Pliki pakietów używane odnoszą się do oficjalnego przykładu GATK (https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json). Łącznie pobierz trzy pliki oraz odpowiadające im pliki indeksowe.
    2. Uruchom BaseRecalibrator, a następnie ApplyBQSR, aby wygenerować ponownie skalibrowane pliki BAM. Indeksuj wszystkie BAM-y za pomocą SAMtools v1.3.
      UWAGA: Wszystkie symulowane zbiory danych przeszły identyczne etapy wstępnego przetwarzania – zmniejszanie próbki, kontrola jakości, wyrównanie, usuwanie duplikatów oraz BQSR – aby zapewnić spójność i porównywalność w kolejnych ocenach wydajności imputacji.

4. Imputacja genotypu

  1. Przygotowanie danych
    1. Konfiguracja zestawu danych imputacji: Skonstruuj wiele zestawów danych ewaluacyjnych do systematycznego benchmarku narzędzi imputacji genotypów na różnych głębokościach i wielkościach próbek, jak opisano poniżej. Łącznie powstaje dziewięć kombinacji na podstawie różnych wielkości próbek i głębokości sekwencjonowania wymienionych powyżej. Pliki wejściowe składają się z list plików BAM danych sekwencjonujących (bamlist.txt) dla wyżej wymienionych dziewięciu podzbiorów po kontroli jakości, przechowywanych w odpowiadających im plikach bamlist.txt. Inne pliki wejściowe to ludzki genom referencyjny (GRCh3821) oraz mapa genetyczna z projektu 1000 Genomes7.
      1. Zmniejszone dane WGS z dużej głębi: Losowo wybierz dwa podzbiory (200 i 500 próbek) spośród 500 osobników sekwencjonowanych na 30x głębokości. Zmniejszyć próbkę każdego podzbioru do czterech głębokości (1x, 0,5x, 0,1x i 0,05x), aby uzyskać osiem warunków eksperymentalnych.
      2. Zbiór danych ULDS oparty na NIPT: Połącz 10 000 próbek NIPT z ultra-niskiej głębokości (średnia głębokość 0,102x, rysunek 2) z 50 próbkami z dużej głębokości zredukowanymi do 0,1x.
    2. Specyfikacja regionu analizy: Ogranicz wszystkie analizy do regionu chromosomu 1 chr1:150,500,000-160,500,000 (10 Mb), z buforem 500 kb do imputacji, aby zapewnić bezpośrednią porównywalność między narzędziami.
    3. Wybór panelu referencyjnego: Użyj dwóch paneli referencyjnych (Tabela 1): panelu CKGB, skonstruowanego na podstawie danych populacyjnych Chin, oraz panelu 1KGP-EAS, pochodzącego z podzbioru Azji Wschodniej projektu 1000 Genomów.
      UWAGA: Panel referencyjnyCKB 15 został skonstruowany na podstawie wysoko dogłębnych (~15x) danych sekwencjonowania całego genomu od 9 964 dorosłych Chińczyków w biobanku China Kadoorie, dużym prospektywnym badaniu kohortowym. Próbki te pochodzą z naturalnej populacji o minimalnym uprzedzeniu fenotypowym, jednorodnym pochodzeniu Han i spójnej strukturze populacji, co czyni je szczególnie odpowiednimi do imputacji genotypów w chińskich kohortach. Yu i in. 15 wykazali, że w rzeczywistym fenotypowym GWAS dla wysokości imputacja za pomocą panelu CKB potroiła liczbę wykrytych SNP i podwoiła liczbę istotnych wariantów obejmującym cały genom. Projekt 1000 Genomów (1KGP)7,26, najczęściej stosowany referencyjny genom, obejmuje 585 osobników w swojej wschodnioazjatyckiej (EAS) podzbiorze fazy 3. Ten podzbiór obejmuje pięć populacji Azji Wschodniej, które mają głębokość sekwencyjną około 30 razy, w tym Han Chińczyków w Pekinie (CHB), południowych Han Chińczyków (CHS), chińskich Dai w Xishuangbanna (CDX), Kinh w Ho Chi Minh City w Wietnamie (KHV) oraz Japończyków w Tokio (JPT).
  2. Narzędzia imputacji
    1. Ocenić trzy algorytmy imputacji, wybrane ze względu na ich unikalne strategie modelowania oraz zastosowanie do danych sekwencjonowania ultra-niskiej głębokości (ULDS).
      1. STITCH: STITCH (wersja 1.6.6) to algorytm imputacji oparty na haplotypach bez odniesień, który opcjonalnie może włączać zewnętrzne haplotypy referencyjne. Uwzględnij listy BAM, ludzki genom referencyjny (GRCh38) jako pliki wejściowe. Przygotuj pliki paneli referencyjnych (hap/legend/pos) podczas wykonywania imputacji opartej na referencjach. Uwzględnij następujące kluczowe parametry: metoda=diploid, bufor=500 kb, K=10 haplotypów przodków oraz nGen=4x wielkość próby/K (zgodnie z zaleceniami w dokumentacji STITCH). Generuj pliki wyjściowe zawierające dawki genotypów SNP dla wszystkich osób.
        UWAGA: Zgodnie z oficjalną dokumentacją STITCH, K to liczba haplotypów przodków w modelu. Większe K poprawia dokładność imputacji dla większych próbek i większego zasięgu, ale także wydłuża czas obliczeń, a dokładność może spaść przy mniejszym pokryciu.
      2. QUILT2: QUILT2 stosuje bayesowskie podejście oparte na referencjach zoptymalizowane pod kątem danych ULDS. Wykonaj przygotowanie panelu referencyjnego, korzystając z dostarczonego skryptu prepare_reference, określając mapę genetyczną i współrzędne regionu. Uruchom tryb diploidalny imputacji z tym samym rozmiarem bufora (500 kb) i ustawieniem nGen co STITCH, aby zapewnić porównywalność.
      3. GLIMPSE2: GLIMPSE2 to narzędzie imputacji oparte na HMM, oparte na odniesieniach, zaprojektowane dla dużych i bardzo niskogłębokich zbiorów sekwencjonowania. Wykonaj imputację z GLIMPSE2_phase_static, określeniem listy wejściowej BAM, panelu VCF referencyjnym dla człowieka, mapy genetycznej, regionu wejściowego = chr1:150,000,000-161,000,000, regionu wyjściowego = chr1:150,500,000-160,500,000 (aby utrzymać bufor 500 kb). Plik listy BAM wprowadzony tutaj musi zawierać dwie kolumny: jedna to ścieżka BAM, a druga kolumna to nazwa próbki. Jeśli druga kolumna nie zostanie wprowadzona, każda nazwa pliku BAM zostanie użyta jako próbna nazwa w wyjściowym pliku VCF.

5. Ocena dokładności imputacji

  1. Definicja zbioru prawdy
    1. Wybierz 50 osób sekwencjonowanych na 30 razy głębokości jako zbiór danych z faktów podstawowych. Włącz te próbki do eksperymentalnych warunków downsamplingu, aby zapewnić porównywalność.
    2. Wykonaj wywołanie wariantów dla zestawu prawdy, korzystając z następującego potoku: SOAPnuke27 dla QC, BWA dla wyrównania, Picard dla znaczenia duplikatów, GATK v4.0.4.0 BQSR i HaplotypeCaller dla wywołań wariantów, DPGT (https://github.com/BGI-flexlab/DPGT) dla wywołań łącznych oraz BCFtools v1.1123 dla filtrowania jakości wariantów.
    3. Zachowuj tylko warianty PASS o wysokiej pewności, aby wygenerować benchmark VCF. Ogranicz ocenę do chr1:150,500,000-160,500,000, zgodnie z imputowanymi zbiorami danych.
  2. Harmonizacja i filtrowanie danych
    1. Przetwarzaj imputowane pliki VCF ze wszystkich narzędzi za pomocą PLINK2.028. Wyodrębnij dane dawkowania i przekonwertuj je do formatu pgen.
    2. Zastosuj kontrolę jakości na poziomie SNP z następującymi filtrami: częstotliwość alleli mniejszych (MAF) ≥ 0,05 (--maf 0,05), równowaga równowagi Hardy'ego-Weinberga (HWE) wartość p ≥ 1e-6 (--hwe 1e-6), tylko dwualleliczne SNP (--max-allele 2).
    3. Warianty eksportujące przekazują QC do formatu traw do porównania w dalszej fazie rozwoju.
  3. Metryki dokładności
    1. Porównaj dawki przypisane z dawkami prawdziwymi dla każdego SNP. Obliczaj współczynniki korelacji Pearsona (R) na zasadzie SNP po SNP, zachowuj tylko strony wspólne dla obu zbiorów danych i obliczaj średnią kwadratu współczynników korelacji (R²) dla wszystkich ocenionych SNP, aby ilościowo określić dokładność imputacji dla każdego warunku.
    2. Użyj tej metryki dokładności, aby uchwycić zgodność szacunków dawkowania genotypów między imputowanymi a prawdziwymi genotypami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ wielkości próby na dokładność imputacji
Zwiększenie wielkości próby z N = 200 do N = 500 poprawiło dokładność imputacji STITCH, szczególnie w warunkach o niskim pokryciu. Na przykład, przy panelu referencyjnym CKB przy 1x pokryciu, STITCH osiągnął R2> wynoszący 0,916 (N=500) w porównaniu do 0,882 (N=200), co oznacza wzrost o 3,4% (Rysunek 3; Plik uzupełniający 2). Podobnie, przy 0,5x pokryciu jego dokładność wzrosła z 0...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to systematycznie oceniało wydajność trzech szeroko stosowanych narzędzi imputacji genotypów dla ULDS, przy czym wysokogłębokie WGS stanowiły złoty standard. Kluczową siłą metodologiczną jest wdrożenie jednolitego procesu wstępnego przetwarzania — obejmującego dopasowanie, kontrolę jakości oraz rekalibrację bazowego wyniku jakości — który minimalizuje efekty wsadowe i zapewnia porównywalność między narzędziami i warunkami. Poprzez redukcję głęboko sekwencjonowanych próbek, dane z ultraniskiej głębokości były symu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez Shenzhen Medical Research Fund (B2404004), Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2023YFC2605400, 2022YFC2502402), Program Nauki i Technologii w Shenzhen (SYSPG20241211173852024), otwarty projekt badawczy w Państwowym Kluczowym Laboratorium Homeostazy i Przebudowy Naczyń (Uniwersytet Pekiński) (2025-SKLVHR-013) oraz Program Badań i Rozwoju Kluczowych Obszarów prowincji Guangdong (2023B0303040001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Data
10 000 próbek NIPT z niskiej głębokościTen artykułDane sekwencjonowania całego genomu o ultra-niskiej głębokości wykorzystywane do benchmarku imputacji.
500 próbek WGS z dużej głębiTen artykuł30 razy; Wysokogłębokie WGS używane jako złoty standard/zestaw prawdy.
Panel Referencyjny
Panel referencyjny 1KGP-EASProjekt 1000 Genomów (Azja Wschodnia)Podzbiór 1KGP dla imputacji specyficznej dla Azji Wschodniej.
Panel referencyjny CKBChina Kadoorie BiobankNiestandardowy panel specyficzny dla populacji do imputacji genotypu.
oprogramowanie i algorytmy
BCFtools v1.11GitHub (samtools/bcftools)Używany do łączenia i sortowania wyników na poziomie chromosomów oraz filtrowania wariantów.
BQSR zestawu narzędzi GATK 4.0.4.0Instytut BroadWykorzystywany do kalibracji bazowego wyniku jakości (BQSR).
BWA-MEM .7.16a-r1181Heng Li / GitHubDo wyrównywania odczytów surowych do GRCh38.
DPGT (Narzędzie genetyki populacji rozproszonej)BGIRozproszone narzędzie analizy genetyki populacyjnej, które umożliwiło wspólne wywoływanie milionów próbek WGS. Dostępne na [GitHub - BGI-flexlab/DPGT](https://github.com/BGI-flexlab/DPGT)
fastp.0.23.4Open-source (Chen i in., 2018)Do kontroli jakości i przycinania adaptera.
GLIMPSE2Uniwersytet OksfordzkiSzybkie fazowanie genotypów i imputacja dla WGS o niskim pokryciu
Oryginalny kod analizTen artykułSupplementary File 1 Oryginalny kod do analiz
Zestaw narzędzi PicardaInstytut BroadUżywany do oznaczania duplikatów i konwersji formatów plików.
Plink 2.0C. Chang, S. Purcell / Instytut BroadaDo konwersji formatu genotypowego i analizy asocjacji.
Python 3.8Python Software FoundationWykorzystywane do skryptowania, automatyzacji i analizy danych.
QUILT2Oxford Big Data InstituteImputacja oparta na HMM z wykorzystaniem zewnętrznych paneli referencyjnych
R 4.1.3Fundacja RUżywa się do prowadzenia STITCH, QUILT2 oraz do wykresów/statystyki.
SAMtools v1.3GitHub (samtools/samtools)Do manipulacji plikami SAM/BAM.
Seqtk-1.5GitHub (lh3/seqtk)Zestaw narzędzi do przetwarzania sekwencji w formatach FASTA/Q. Dostępne na [GitHub - lh3/seqtk](https://github.com/lh3/seqtk)
SOAPnukeBGIDo kontroli jakości danych NGS i filtrowania.
STITCH v1.6.6Uniwersytet OksfordzkiNarzędzie imputacji zoptymalizowane do sekwencjonowania ultra-niskiego zasięgu
tabixGitHub (samtools/tabix)Używany do indeksowania i zapytań o pliki VCF z bgzipem.
Inne materiały
Pliki pakietów GATKGATKDostępne pod adresem [https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json]
Mapa genetyczna dla 1000G (GRCh38)Projekt Oxford / 1000 GenomesWymagane dla narzędzi fazowania/imputacji
GRCh38Konsorcjum Referencyjne GenomuUżywany do wyrównywania odczytu i wywoływania wariantów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., et al. Non-invasive prenatal testing for trisomies 21, 18 and 13: clinical experience from 146,958 pregnancies. Ultrasound Obstet Gynecol. 45 (5), 530-538 (2015).
  2. Heitzer, E., et al. Tumor-associated copy number changes in the circulation of patients with prostate cancer identified through whole-genome sequencing. Genome Med. 5 (4), 30(2013).
  3. Hyblova, M., et al. Validation of Copy Number Variants Detection from Pregnant Plasma Using Low-Pass Whole-Genome Sequencing in Noninvasive Prenatal Testing-Like Settings. Diagnostics (Basel). 10 (8), (2020).
  4. Kucharik, M., Budis, J., Hyblova, M., Minarik, G., Szemes, T. Copy Number Variant Detection with Low-Coverage Whole-Genome Sequencing Represents a Viable Alternative to the Conventional Array-CGH. Diagnostics (Basel). 11 (4), (2021).
  5. Li, J. H., Mazur, C. A., Berisa, T., Pickrell, J. K. Low-pass sequencing increases the power of GWAS and decreases measurement error of polygenic risk scores compared to genotyping arrays. Genome Res. 31 (4), 529-537 (2021).
  6. Liu, S., et al. Genomic Analyses from Non-invasive Prenatal Testing Reveal Genetic Associations, Patterns of Viral Infections, and Chinese Population History. Cell. 175 (2), 347-359.e14 (2018).
  7. The 1000 Genomes Project Consortium. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  8. Liu, S., et al. Utilizing non-invasive prenatal test sequencing data for human genetic investigation. Cell Genom. 4 (10), 100669(2024).
  9. Davies, R. W., Flint, J., Myers, S., Mott, R. Rapid genotype imputation from sequence without reference panels. Nat Genet. 48 (8), 965-969 (2016).
  10. Xiao, H., et al. Genetic analyses of 104 phenotypes in 20,900 Chinese pregnant women reveal pregnancy-specific discoveries. Cell Genom. 4 (10), 100633(2024).
  11. Rubinacci, S., Ribeiro, D. M., Hofmeister, R. J., Delaneau, O. Efficient phasing and imputation of low-coverage sequencing data using large reference panels. Nat Genet. 53 (1), 120-126 (2021).
  12. Taliun, D., et al. Sequencing of 53,831 diverse genomes from the NHLBI TOPMed Program. Nature. 590 (7845), 290-299 (2021).
  13. McCarthy, S., et al. A reference panel of 64,976 haplotypes for genotype imputation. Nat Genet. 48 (10), 1279-1283 (2016).
  14. Wu, D., et al. Large-Scale Whole-Genome Sequencing of Three Diverse Asian Populations in Singapore. Cell. 179 (3), 736-749.e15 (2019).
  15. Yu, C., et al. A high-resolution haplotype-resolved Reference panel constructed from the China Kadoorie Biobank Study. Nucleic Acids Res. 51 (21), 11770-11782 (2023).
  16. Browning, B. L., Zhou, Y., Browning, S. R. A One-Penny Imputed Genome from Next-Generation Reference Panels. Am J Hum Genet. 103 (3), 338-348 (2018).
  17. Das, S., et al. Next-generation genotype imputation service and methods. Nat Genet. 48 (10), 1284-1287 (2016).
  18. Li, Z., Albrechtsen, A., Davies, R. W. Rapid and accurate genotype imputation from low coverage short read, long read, and cell free DNA sequence. bioRxiv. , (2024).
  19. Rubinacci, S., Ribeiro, D. M., Hofmeister, R. J., Delaneau, O. Efficient phasing and imputation of low-coverage sequencing data using large reference panels. Nat Genet. 53 (1), 120-126 (2021).
  20. Chen, S. Ultrafast one-pass FASTQ data preprocessing, quality control, and deduplication using fastp. Imeta. 2 (2), e107(2023).
  21. Zheng-Bradley, X., et al. Alignment of 1000 Genomes Project reads to reference assembly GRCh38. Gigascience. 6 (7), 1-8 (2017).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), 8(2021).
  24. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinfo. 43 (1110), 11.10.1-11.10.33 (2013).
  25. Sherry, S. T., et al. dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucleic Acids Res. 29 (1), 308-311 (2001).
  26. Byrska-Bishop, M., et al. High-coverage whole-genome sequencing of the expanded 1000 Genomes Project cohort including 602 trios. Cell. 185 (18), 3426-3440 (2022).
  27. Chen, Y., et al. SOAPnuke: a MapReduce acceleration-supported software for integrated quality control and preprocessing of high-throughput sequencing data. Gigascience. 7 (1), 1-6 (2018).
  28. Chang, C. C., et al. Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets. Gigascience. 4 (7), 8(2015).
  29. Marchini, J., Howie, B. Genotype imputation for genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 11 (7), 2796(2010).
  30. Zeng, J., et al. Protocol for genetic analysis of population-scale ultra-low-depth sequencing data. STAR Protoc. 6 (1), 579(2025).
  31. Naito, T., Okada, Y. Genotype imputation methods for whole and complex genomic regions utilizing deep learning technology. J Hum Genet. 69 (10), 481-486 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ultra Low Depth SequencingReference Panel OptimizationPopulation Specific PanelsSample Size SensitivityNon Invasive Prenatal TestingSequencing Depth ThresholdsComputational Efficiency

Powiązane artykuły