Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model glejaka krążącego do badań nad terapią limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym

410 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

17 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół ustanawia model krążącego glejaka przez wstrzyknięcie do komory bocznej w celu zbadania efektu terapeutycznego terapii limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym in vivo.

Streszczenie

Krążące komórki nowotworowe w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) są istotnym czynnikiem nawrotu guza i przerzutów wewnątrzczaszkowych w glejaku. Wiele badań ma na celu zidentyfikowanie skutecznych strategii celowania i eliminowania krążącego guza w płynie mózgowo-rdzeniowym. Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) jest często stosowana w przypadku różnych krążących nowotworów. Jednak badania są ograniczone ze względu na brak odpowiedniego modelu krążącego glejaka. W tym miejscu opracowano model krążącego glejaka, który został zastosowany w badaniach nad terapią limfocytami T CAR. Model ten został skonstruowany przy użyciu iniekcji do komory bocznej, która jest szeroko stosowana w miejscowym leczeniu choroby wewnątrzczaszkowej. Komórki glejaka wstrzyknięto do komory bocznej, tworząc wewnątrzczaszkowy guz pierwotny. Guzy, które zostały wyrzucone z komory bocznej, wykorzystano do wskazania krążącego guza w płynie mózgowo-rdzeniowym. Model jest łatwy do zbudowania i może być stosowany w różnych badaniach nad terapią krążącego glejaka za pomocą limfocytów T CAR. W rezultacie, model krążącego glejaka zapewnia unikalny model przerzutów glejaka do skutecznych badań nad terapią limfocytami T CAR krążącego guza.

Wprowadzenie

Glejak jest najczęstszym pierwotnym złośliwym nowotworem mózgu u dorosłych 1,2. Obecne metody leczenia, w tym chirurgia, radioterapia i chemioterapia, wykazują ograniczoną skuteczność, a mediana przeżycia wynosi zaledwie 14-15 miesięcy 3,4,5. Krążące komórki glejaka w płynie mózgowo-rdzeniowym odgrywają kluczową rolę w nawrocie guza i przerzutach wewnątrzczaszkowych 6,7. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania skuteczniejszych strategii leczenia w celu wyeliminowania krążących komórek glejaka.

Ostatnie badania nad glejakiem koncentrowały się głównie na pierwotnych guzach wewnątrzczaszkowych 8,9. Jednak najważniejszym problemem, którym należy się zająć w klinice, jest sposób celowania i eliminowania krążących komórek glejaka. Dlatego badania nad krążącym glejakiem przed lub po operacji wymagają większej uwagi. Terapia limfocytami T z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR) jest najczęstszą strategią stosowaną w badaniach nad krążącymi komórkami nowotworowymi10,11. Jednak ze względu na szczególną budowę anatomiczną guzów wewnątrzczaszkowych trudno jest opracować odpowiedni model glejaka krążącego, co ma kluczowe znaczenie dla badania glejaka krążącego 12,13,14,15,16.

W ramach tego badania opracowano unikalny model krążącego glejaka oparty na wstrzyknięciu do komory bocznej. W tym modelu komórki glejaka są wstrzykiwane do komory bocznej, a wewnątrzczaszkowy guz pierwotny i guz krążący w płynie mózgowo-rdzeniowym są wykrywane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i analizy cytometrii przepływowej w dniu 10. Terapię CAR-T rozpoczęto, gdy obciążenie guza u myszy z krążącym glejakiem osiągnęło około 6,5 × 105p / s. Masę guza monitorowano co 5 dni w celu oceny efektu terapeutycznego komórek CAR-T. Model ten naśladuje stan złuszczania komórek nowotworowych u pacjentów z glejakiem i może być stosowany w różnych badaniach nad krążącym glejakiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone i nadzorowane przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną i Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (IACUC-1905048). Do niniejszego badania wykorzystano samice myszy C57BL/6J w wieku 6-8 tygodni. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Trzymaj myszy w barierze, 12 godzin/12 godzin cyklu światła/ciemności, temperatura otoczenia 24 °C i wilgotność względna 50% klatki.
  2. Zważ myszy i znieczul je (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 50 mg/kg pentobarbitalu sodu i 10 mg/kg ksylazyny17.
    UWAGA: Połączenie pentobarbitalu sodu i ksylazyny jest szeroko stosowane w procedurach wstrzykiwań stereotaktycznych u myszy. Prawidłowe znieczulenie zostało potwierdzone brakiem reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, co sprawiło, że zwierzę przed operacją było całkowicie nieprzytomne. Aby zapobiec wysuszeniu i uszkodzeniu rogówki, podczas znieczulenia na oczy nakładano weterynaryjną maść okulistyczną.
  3. Usuń włosy z głowy myszy za pomocą golarki laboratoryjnej dla zwierząt i przymocuj głowę i kończyny myszy do aparatu stereotaktycznego.
  4. Wysterylizuj głowę myszy za pomocą jodoforu bawełnianym wacikiem, a resztę ciała myszy przykryj sterylnym ręcznikiem chirurgicznym.
  5. Odetnij skalpelem skórę głowy około 1 cm wzdłuż linii środkowej na czubku prawego czoła.
    UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być odpowiednio wysterylizowane przed użyciem, aby zapobiec infekcji. Należy zachować ostrożność przy obchodzeniu się z narzędziami, aby uniknąć obrażeń, a wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnym środowisku.
  6. Wyreguluj klips nosowy i pręt douszny, upewniając się, że różnica wysokości osi Z między szwem lambda a bregmą jest mniejsza lub równa 0.05 mm.

2. Budowa modelu glejaka krążącego

  1. Zaznacz punkt 1,5 mm po prawej stronie linii środkowej i 1,1 mm po tylnej stronie bregmy za pomocą bawełnianego wacika nasączonego fioletem gencjanowym (współrzędne: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm od bregmy).
  2. Za pomocą miniaturowego wiertła czaszkowego o średnicy 0,5 mm wywierć otwory w współrzędnych docelowych, aby odsłonić oponę twardą.
  3. Spłucz solą fizjologiczną, aby usunąć resztki kości.
  4. Pobrać 5 μl zawiesiny komórek nowotworowych za pomocą mikrostrzykawki z korkiem ograniczającym głębokość (GL261-Luc-Gfp, 1×105 komórek/μL w PBS zawierającym 0,1% BSA).
  5. Wprowadzić igłę z szybkością 0,2 mm/s na głębokość 3,0 mm i cofnąć igłę o 0,5 mm, zrobić przerwę na 10 s, aby ustabilizować ciśnienie w tkance.
  6. Wstrzykiwać komórki z prędkością 1 μl/min za pomocą skalibrowanej pompy do mikroiniekcji, z 10-minutowym czasem przebywania po wstrzyknięciu, aby zminimalizować przepływ wsteczny.
  7. Powoli wyjmować mikrostrzykawkę, uciskać miejsce wstrzyknięcia sterylnym wacikiem przez 30-60 sekund.
  8. Zszyj skórę głowy wchłanialnym szwem chirurgicznym (6-0) i ponownie zdezynfekuj nacięcie jodoforem.
  9. Umieść mysz na precyzyjnie sterowanej poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C w celu rozgrzania i monitorowania jej stanu zdrowia.
  10. Umieść mysz z powrotem w czystej klatce po wykazaniu trwałego odruchu prostowania i spontanicznej lokomocji.
  11. Wyobraź sobie mysz za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (IVIS Spectrum) w celu wykrycia przeszczepionego guza w 10 dniu po łożysku guza.
  12. Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo sól potasową D-lucyferyny (150 mg/kg).
    UWAGA: Rozcieńczyć sól potasową D-Lucyferyny za pomocą sterylnego D-PBS.
  13. Wywołać znieczulenie za pomocą 2% izofluranu w 1 l/minO2 podczas 10-minutowego okresu oczekiwania.
    UWAGA: Izofluran powinien być stosowany w wentylowanym kapturze chemicznym, aby zminimalizować narażenie na opary środka znieczulającego. Ma to na celu zapewnienie bezpieczeństwa zarówno zwierzętom, jak i badaczom podczas zabiegu.
  14. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5% izofluranu przez stożek nosowy.
  15. Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne przy użyciu IVIS Spectrum.
  16. Wykonaj pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego, nakłuwając spłuczkę móżdżkowo-szpikową u myszy.
    UWAGA: Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrano przez nakłucie spłuczki móżdżkowo-szpikowej u myszy w znieczuleniu izofluranem. Wszystkie procedury, w tym znieczulenie, ekspozycja chirurgiczna i pobieranie próbek, zostały wykonane w warunkach SPF, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia i infekcji. Myszy umieszczono w pozycji leżącej na stereotaktycznej ramie, a cisterna magna ostrożnie naświetlono pod mikroskopem preparacyjnym. Igła strzykawki Hamiltona o wadze 27 g została użyta do nakłucia spłuczki i pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą techniki wolnej ręki. Z każdej myszy uzyskano około 5-10 μl przezroczystego płynu mózgowo-rdzeniowego. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko infekcji, miejsce operacji zostało wysterylizowane Iodophorem przed nakłuciem, a wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały autoklawowane. Po pobraniu płynu mózgowo-rdzeniowego miejsce nakłucia zostało delikatnie ściśnięte sterylną bawełną, aby zatrzymać wyciek płynu. Myszy umieszczono następnie na podkładce rozgrzewającej i stale monitorowano, aż do pełnego wyzdrowienia ze znieczulenia. Pooperacyjne leki przeciwbólowe podawano w celu złagodzenia dyskomfortu. Zwierzęta obserwowano codziennie przez co najmniej trzy kolejne dni, aby upewnić się, że nie występują objawy neurologiczne lub oznaki infekcji.
  17. Wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć komórki nowotworowe w płynie mózgowo-rdzeniowym. Populacja GFP+ reprezentuje komórki nowotworowe.
    UWAGA: Linia komórkowa glejaka mysiego GL261 została zaprojektowana do przenoszenia lucyferazy (Luc). Gdy wartość fluorescencji osiągnie ~5 × w płynie mózgowo-rdzeniowym wykrytych zostanie 105komórek nowotworowych p/piasek, procedura kończy się sukcesem. Użyto oprogramowania do obrazowania Living Image 4.5.2, a parametry obrazowania ustawiono na Luminescencyjny.
  18. Wybierz myszy z pomyślnym łożyskiem nowotworu, aby ocenić skuteczność terapeutyczną komórek CAR-T.

3. Leczenie krążącego glejaka przez wstrzyknięcie komórek CAR-T do komory bocznej

  1. Gdy rozmiar guza u krążących myszy z glejakiem osiągnie ~ 6,5 × 105 p / s, wybierz te myszy do leczenia CAR-T.
  2. Zważyć myszy modelowe krążącego glejaka i znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg / kg pentobarbitalu sodu i 50 mg / kg ksylazyny.
  3. Powtórz proces kroków 1.3−1.5.
  4. Oddziel skórę głowy i czaszkę i precyzyjnie wskaż otwór wykonany podczas budowy modelu krążącego glejaka i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.2-2.3.
  5. Odessać 10 μl zawiesiny komórek CAR-T za pomocą mikrostrzykawki, ostrożnie wprowadzić igłę do bocznej komory myszy, wyregulować głębokość wstrzyknięcia za pomocą aparatu stereotaktycznego i powoli podawać roztwór komórek CAR-T.
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku wstrzyknięcia komórek GL261, komórki CAR-T wstrzyknięto do prawej bocznej komory (współrzędne: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm od bregmy), przy głębokości wstrzyknięcia 2,5 mm.
  6. Trzymać igłę przez 10 minut, a następnie powoli wyjąć igłę i lekko docisnąć miejsce wstrzyknięcia jałową gazą, aby zapobiec krwawieniu po zakończeniu wstrzyknięcia. Zszyj skórę głowy wchłanialnym szwem chirurgicznym (6-0) i zdezynfekuj nacięcie.
  7. Umieść mysz na precyzyjnie sterowanej poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C w celu rozgrzania i monitorowania jej stanu zdrowia.
  8. Umieść mysz z powrotem w czystej klatce po wykazaniu trwałego odruchu prostowania i spontanicznej lokomocji.
  9. Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne in vivo , aby monitorować wzrost guzów u myszy. Obrazowanie optyczne pozwala na ocenę skuteczności terapeutycznej komórek CAR-T.
  10. Waż myszy co drugi dzień i wykonuj obrazowanie BLI co 5 dni, aby dokładniej śledzić wzrost guza, aż do osiągnięcia końcowego punktu końcowego.
  11. Poddaj mysz eutanazji i utrwal tkankę mózgową w 4% paraformaldehydzie przez 24-48 godzin.
  12. Zanurz tkanki w parafinie i pokrój je na plastry o grubości 5 μm.
  13. Odparafinować skrawki, ponownie nawodnić za pomocą stopniowanych alkoholi, wybarwić hematoksyliną, wybarwić przeciwstawnie eozyną i zamontować skrawki za pomocą szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: W niniejszym badaniu końcowym punktem końcowym był dzień 30, a myszy zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Tusze myszy zostały przekazane do Medycznego Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycznego w Nankinie w celu utylizacji. Wyrzucone igły umieszczono w pojemniku na ostre przedmioty i przekazano do Wydziału Zarządzania Laboratorium i Sprzętem Uniwersytetu Medycznego w Nankinie w celu scentralizowanej utylizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat ideowy modelu krążącego glejaka do terapii CAR-T przedstawiono na rycinie 1. Komórki CAR-T wstrzyknięto do komory bocznej za pomocą mikrostrzykawki, aby zademonstrować ich działanie terapeutyczne. Metoda ta umożliwia bezpośrednie dostarczanie komórek CAR-T do mózgu, celując w krążące komórki glejaka. Zabieg iniekcji wykonano w 11 dniu, po implantacji komórek GL261 w bocznej komorze myszy. W różnych punktach czasowych (15, 20, 25 i 30) odpowiedź guza m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model krążącego glejaka ustalony w tym badaniu przy użyciu wstrzyknięcia komory bocznej zapewnia znaczny postęp, oferując kilka zalet w porównaniu z istniejącymi modelami. Technika iniekcji do komór bocznych jest wysoce powtarzalna, co umożliwia spójne modelowanie guza w stosunkowo krótkim czasie. To sprawia, że jest to cenne narzędzie dla badaczy chcących zbadać rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych do płynu mózgowo-rdzeniowego i ocenić skuteczność terapii, takich jak komórki CAR-T. W przeciwieństwie do tradycyjn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Badanie to zostało sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82230059), Chiński Program Rozwoju Kluczowych Badań Naukowych w prowincji Jiangsu (BE2022770).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wchłanialny szew chirurgicznyShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdCzynnik R611
SAMOCHÓD-TKreatywne laboratoria biologiczne
Sól potasowa D-lucyferynyMCE (Certyfikat MCE)HY-12591B
GL261-Luc-GfpSzanghaj Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.Zobacz materiał ZQ0932 powiedział:
System obrazowania bioluminescencyjnego in vivoTanonTanon ABL X6
Laboratoryjna golarka dla zwierzątBeyotime BiotechnologiaDrukarka FS600
MyszyPlacówka Animal Core Uniwersytetu Medycznego w Nankinie
Pompa do mikroiniekcjiRWDCzynnik chłodniczy R462
MikrostrzykawkaHamilton87943
Mini wiertarka czaszkowaRWD78001
Pentobarbital sodowy ChemSrc powiedział:57-33-0
Aparatura stereotaktycznaRWD68043
KsylazynaChemSrc powiedział:7361-61-7

Bibliografia

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Terapia CAR Tguz w p ynie m zgowo rdzeniowymprzerzut glejakainiekcja do komory bocznejguz wewn trzczaszkowynawr t nowotworukr ce kom rki nowotworoweprzerzut wewn trzczaszkowy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.