Ocena pobudliwości pierwotnej kory ruchowej oraz modulacji pobudliwości poprzez połączenie przezczaszkowej stymulacji magnetycznej z elektromiografią

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół opisujący metodologię oceny pobudliwości i modulacji pobudliwości pierwotnej kory ruchowej za pomocą przezczaszkowej stymulacji magnetycznej (TMS) w połączeniu z elektromiografią (EMG).

Abstract

Opisujemy protokół oceniający pobudliwość kory ruchowej i jej modulację poprzez parowe użycie elektromiografii (EMG) oraz powtarzalnej przezczaszkowej stymulacji magnetycznej (TMS) pierwotnej kory ruchowej (M1). Nagrania EMG wykorzystują specjalnie zaprojektowany system, a elektrody powierzchniowe umieszczane są nad prawym pierwszym mięśniem grzbietowym śródkostnym (FDI), z elektrodą uziemiającą na lewym łokciu. TMS wykonywany jest za pomocą stymulatora magnetycznego z cewką w kształcie ósemki, prowadzonego przez system neuronawigacyjny. Hotspot silnika dla FDI jest identyfikowany przez systematyczne stosowanie pojedynczych impulsów TMS podczas regulacji rozmieszczenia cewek i służy jako cel dla wszystkich procedur TMS. Próg spoczynkowy ruchowy (rMT) definiuje się jako minimalną intensywność wymaganą do wywołania potencjałów motorycznych (MEPs) ≥ 50 μV w zapisie EMG, w co najmniej 5 z 10 badań, natomiast aktywny próg ruchowy (aMT) to minimalna intensywność potrzebna do wywołania MEP ≥ 200 μV w co najmniej 5 z 10 impulsów, podczas gdy uczestnik utrzymuje 10-20% maksymalnej dobrowolnej aktywacji mięśni. Podstawowa pobudliwość korowa definiowana jest jako średnia amplituda MEP uzyskana z 40 pojedynczych impulsów TMS zastosowanych przy 120% rMT, z impulsami dostarczanymi w losowych odstępach (6-10 s). Modulacja pobudliwości kory ruchowej osiąga się za pomocą protokołu przerywanej stymulacji theta-burst (iTBS) (triplety impulsów 50 Hz, 80% aMT, 5 Hz przez 2 sekundy włączenia/8 sekund wyłączone, powtarzane 20 razy; łącznie 600 impulsów). Modulację pobudliwości ocenia się poprzez powtórzenie pomiarów amplitudy MEP w czterech punktach po stymulacji: natychmiastowym (T0), 10-minutowym (T10), 20-minutowym (T20) i 30-minutowym (T30). Protokół ten zapewnia precyzyjną i powtarzalną ocenę pobudliwości kory ruchowej oraz rejestruje szczyt efektów modulacyjnych wynikających z iTBS.

Introduction

Przezczaszkowa stymulacja magnetyczna (TMS) to nieinwazyjna technika neurostymulacji, która indukuje pole magnetyczne zdolne przeniknąć skórę głowy i czaszkę, wywołując aktywność neuronalną po dotarciu do tkanki korowej¹. TMS umożliwia in vivo ocenę neurofizjologii ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u ludzi ^2,3,4. Gdy TMS jest dostarczany w powtarzalnych pociągach (powtarzalny TMS, rTMS) do określonych obszarów korowych, TMS może wywołać zmiany pobudliwości celu korowego, które wykraczają poza czas trwania stymulacji, w zależności od parametrów zastosowanego protokołu⁵. Pojedynczy impuls TMS jest powszechnie stosowany do pomiaru pobudliwości korowej, a po zastosowaniu TMS przed i po rTMS pozwala na ilościowe określenie modulacji pobudliwości kory indukowanej przez TMS ^2,3,4. Kora ruchowa pierwotna (M1) była jednym z głównych celów takich protokołów, ponieważ jej funkcjonalne wyniki można łatwo zmierzyć za pomocą nagrań elektromiograficznych (EMG) ^6,7. W porównaniu z innymi technikami neurofizjologii i obrazowania, takimi jak elektroencefalografia (EEG) czy funkcjonalna rezonans magnetyczny (fMRI), TMS-EMG oferuje większe korzyści w zastosowaniu klinicznym. EEG wymaga rozbudowanego montażu elektrod, starannego zarządzania artefaktami i zaawansowanego przetwarzania sygnałów⁸, podczas gdy fMRI wiąże się z wyższymi kosztami, ograniczoną dostępnością i zapewnia mniejszą rozdzielczość czasową⁹. TMS-EMG opiera się na stosunkowo prostych nagraniach EMG na powierzchni, a analiza koncentruje się na prostych i obiektywnych wskaźnikach, takich jak amplituda potencjału wywołanego przez silnik (MEP) i opóźnienia. Ta prostota pozyskiwania i przetwarzania, połączona z krótszymi czasami konfiguracji i mniejszymi wymaganiami infrastrukturalnymi, sprawia, że TMS-EMG jest szczególnie odpowiedni do zastosowania w praktyce klinicznej, gdzie wymagane są szybkie, niezawodne i powtarzalne biomarkery¹⁰.

Miary modulacji pobudliwości korowej są uważane za pośrednie wskaźniki neuroplastyczności, definiowane jako zdolność mózgu do ulegania zmianom funkcjonalnym i strukturalnym w odpowiedzi na bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne^11,12. Zmiany w neuroplastyczności są powiązane z różnymi schorzeniami neuropsychiatrycznymi, takimi jak wielka depresja (MDD)13,14,15,16. Biorąc pod uwagę możliwość badania mechanizmów neuroplastycznych in vivo oraz praktyczne zastosowanie w kontekstach klinicznych, ocena modulacji pobudliwości korowej pochodzącej z TMS-EMG została przebadana jako potencjalny biomarker dla zaburzeń neuropsychiatrycznych 17,18,19. Te miary mogą być obiecujące zarówno jako diagnostyczny biomarker¹⁸, jak i jako predyktor wyników leczenia^14,15. TMS z pojedynczym lub parowym impulsem jest zwykle dostarczany z intensywnością wyrażoną jako procent progu ruchowego spoczynku (rMT), czyli minimalnej intensywności potrzebnej do wygenerowania odpowiedzi motorycznej (rMT; zwykle 110-130% rMT), a protokoły często wykorzystują 20-40 impulsów do wiarygodnej oceny pobudliwości korowo-rdzeniowej oraz kilkaset impulsów do oceny modulacji przed i po interwencji, w różnych punktach^{czasowych 20}. Inter-pulse intervaly (IPI) powinny zazwyczaj wynosić >4 s, aby zminimalizować efekty przeniesienia i zapewnić niezależność kolejnych MEPs²¹. W przypadku modulacji pobudliwości korowej protokoły najczęściej opierają się na niskoczęstotliwościowym rTMS (rTMS; ≈ 1 Hz, 600-1800 impulsów) lub ciągłej stymulacji theta-burst (cTBS; 3 impulsy o częstotliwości 50 Hz, powtarzane co 200 ms, ciągłe przez 40 s), aby wywołać efekty hamujące. Aby ułatwić pobudliwość korową, protokoły najczęściej opierają się na wysokoczęstotliwościowym rTMS (rTMS; ≥ 5 Hz, zazwyczaj 5-20 Hz, 600-2000 impulsów) lub przerywanej stymulacji theta-burst (iTBS)²². iTBS zazwyczaj składa się z 600 impulsów dostarczanych jako serie 3 bodźców o częstotliwości 50 Hz, powtarzanych przy 5 Hz przez 2 s, z pociągami przerywanymi co 10 s, przy intensywności około 80% aktywnego progu motorycznego (aMT). Ten wzór stał się najszerzej stosowany zarówno do celów eksperymentalnych, jak i klinicznych, ze względu na swoją wydajność, krótszy czas trwania oraz solidne ułatwianie plastyczności kory^23,24.

Jednak użyteczność kliniczna pozostaje ograniczona przez nierozwiązane wyzwania metodologiczne. Wysiłki mające na celu rozwiązanie tych wyzwań — głównie poprzez analizę i poprawę wiarygodności pomiarów — przyniosły niespójne wyniki 25,26,27,28,29. Te niespójności można przynajmniej częściowo przypisać znacznym pułapkom metodologicznym i heterogeniczności w różnych badaniach, w tym zmienności parametrów rTMS, gdzie na przykład liczby impulsów wahają się od 20 do 1800 impulsów w paradygmatach niskiej częstotliwości²² oraz od pociągów iTBS o 600 impulsach do zmodyfikowanych wersji 1200 impulsów³⁰. Ponadto badania bez neuronawigacji wykazały zmienność amplitudy MEP i niższe efekty modulacyjne protokołu rTMS w porównaniu z protokołami neuronawigacji³¹. Wielkość prób w opublikowanych badaniach również była stosunkowo niewielka, często od 10 do 25 uczestników, co ogranicza moc statystyczną³². Ponadto zastosowano ograniczone podejścia statystyczne do oceny wiarygodności, przy czym niektóre badania opierają się na miarach innych niż współczynnik korelacji wewnątrzklasowy (ICC)^24,33, który jest powszechnie uważany za najbardziej odpowiedni wskaźnik wiarygodności testów i ponownych testów²⁶.

Protokoły pozyskiwania pobudliwości korowej i analizy z użyciem paradygmatów TMS-EMG mogą również przyczyniać się do dodatkowej zmienności. Specyficzne czynniki metodologiczne, takie jak liczba podanych impulsów TMS, mogą prowadzić do niskiej wiarygodności, przy szacunkach na podstawie mniej niż 20 MEP, podczas gdy średnia ≥30 MEPs zapewnia stabilną miarę pobudliwości korowo-rdzeniowej. Podobnie, wykazano, że IPI wpływa na pobudliwość przy interwałach 2 s lub mniej, wywołując zmiany pobudliwości korowej z powodu skumulowanych efektów stymulacji, podczas gdy bardziej zachowawcze przedziały powyżej 4 s zmniejszają te zakłócenia²¹. Techniki pozyskiwania EMG^34,35 mogą również wpływać na wiarygodność pomiarów, na przykład konfiguracja dwubiegunowa zapewnia lepszą selektywność przestrzenną i zmniejsza zanieczyszczenie spowodowane aktywnością pobliskich mięśni w porównaniu do konfiguracji monopolarnej^34,35. Standaryzacja protokołów akwizycji i przetwarzania danych jest zatem niezbędna do poprawy oceny modulacji pobudliwości korowej oraz określenia jej stabilności – co jest kluczową cechą każdego wiarygodnego biomarkera³⁶.

Dlatego, aby wykorzystać miary modulacji pobudliwości kory jako kandydatów do oceny neurobiologicznej oraz potwierdzić ich wiarygodność do zastosowań klinicznych, przedstawiamy protokół wynikający z systematycznego podejścia opartego na najlepszych dostępnych dowodach w tej dziedzinie, aby zminimalizować potencjalny wpływ heterogeniczności metodologicznej oraz zapewnić dokładny i powtarzalny pomiar pobudliwości kory ruchowej i jej modulacji^{37, 38}. Obejmowało to wdrożenie odpowiednich protokołów nabycia EMG³⁴, wykorzystanie systemów neuronawigacyjnych³⁹, zebranie wystarczającej liczby MEP²⁰, zastosowanie odpowiednich IPI²¹ oraz kompleksowe raportowanie procedur pozyskiwania i metod przetwarzania sygnałów³⁴. Nasze wyniki wykazały poprawę stabilności sygnału w porównaniu z dotychczasowymi najlepszymi praktykami w literaturze, co przyczyniło się do rzetelności metodologicznej niezbędnej do opracowania solidnego neurofizjologicznego biomarkera.

Protocol

Opisane tutaj procedury zostały opracowane w celu zebrania danych przedstawionych przez Seyberta i ^in.37 oraz Faro Viana i ^in.38. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed udziałem, wyjaśniając cel badania, procedury, ryzyka oraz prawo do wycofania się w dowolnym momencie. Protokół został zatwierdzony przez Komitety Etyki Centrum Nieznanego w Champalimaud i przeprowadzony zgodnie z Deklaracją Helsińską. Stosowanie tego protokołu w innych badaniach lub lokalizacjach powinno nastąpić tylko po uzyskaniu zgody odpowiednich lokalnych Komitetów Etyki i/lub innych właściwych organów. Przed TMS należy stosować ustandaryzowaną listę kontrolną bezpieczeństwa, aby zminimalizować ryzyko niepożądanych skutków ubocznych, wykorzystując międzynarodowe wytyczne^40,41 jako ramy referencyjne, które można dostosować do konkretnych środowisk badawczych. Protokół został zaprojektowany na ~1 godzinę i 15 minut (Rysunek 1).

1. Wymagania dotyczące instalacji i przygotowanie

1. Upewnij się, że dwóch techników jest dostępnych do optymalnego przeprowadzenia sesji, gdzie jeden zastosuje procedury TMS, a drugi zapewni wsparcie w dodatkowych etapach.
2. Upewnij się, że dostępny jest następujący sprzęt: system neuronawigacji; wygodne krzesło; urządzenie EMG z odpowiednimi stykami i elektrodami; stymulator TMS z cewką w kształcie 8, umożliwiający wprowadzanie iTBS, protokoły pojedynczego impulsu oraz połączenie z neuronawigacją i systemem EMG. Upewnij się, że dostępne są jeden lub dwa komputery, umożliwiające jednoczesną obserwację oprogramowania EMG i oprogramowania neuronawigacyjnego. Upewnij się, że komputer ma receptor sygnału Bluetooth do odbioru sygnału EMG.
3. Upewnij się, że dostępne są następujące materiały zużywalne: alkohol i gazowe okłady; papier ścierny wodą do czyszczenia skóry tam, gdzie będą umieszczane elektrody żelowe; czapkę pływacką dla uczestnika; oraz zatyczki do uszu zarówno dla uczestników, jak i techników.
4. Rozpocznij przygotowania do konfiguracji około 30 minut przed przybyciem uczestnika, aby właściwie skonfigurować system neuronawigacyjny, tablicę EMG i urządzenie TMS oraz oprogramowanie potrzebne do zbierania danych fizjologicznych.
5. Przygotuj system EMG.
   1. Upewnij się, że tablica EMG jest w pełni naładowana – jeśli to możliwe – i przygotuj odpowiednie styki – jedną jako odniesienie (unipolarne – do umieszczenia na lewym łokciu), a drugą na docelowym mięśniu do rejestracji (dwubiegunowe – do umieszczenia na prawym pierwszym grzbietowym śródkostnym). Potrzebny jest dodatkowy kabel do synchronizacji sygnału impulsu TMS z sygnałem EMG, łącząc urządzenie TMS z płytą EMG.
   2. Podłącz elektrody medycznej jakości do styków (Ag/AgCl) (3 elektrody). Podłącz też kabel z maszyny TMS do płyty EMG, aby wyprowadzić sygnał wyzwalający każdego impulsu TMS.
   3. W przypadku wewnętrznego urządzenia EMG zdejmij rzep do stabilnej powierzchni. Podłącz styki do urządzenia EMG w odpowiednich punktach wejścia.
   4. W jednym z monitorów/komputerów otwórz oprogramowanie^{BONSAI 42} oraz odpowiedni skrypt do akwizycji danych EMG. Naciśnij przycisk start , tylko gdy będziesz gotowy do akwizycji danych (szczegóły w Pliku Uzupełniającym 1, krok 1).
6. Przygotuj urządzenie TMS.
   1. Zdefiniuj protokół oceny pobudliwości w urządzeniu TMS. Składa się ona z 40 pojedynczych impulsów, przy 120% rMT, z losowym IPI co najmniej 6 s, aby uniknąć efektów przenoszonych z poprzednich bodźców.
   2. Włóż protokół iTBS zgodnie z danymi parametrami stymulacji a priori w urządzeniu: triplety impulsów 50 Hz, 80% aMT, 5 Hz przez 2 s włączone/8 s wyłączone, powtórzone 20 razy, łącznie 600 impulsów.
   3. Przymocuj paski papieru we wszystkich częściach ekranu maszyny TMS, gdzie widoczna jest maksymalna moc stymulacji (MSO - %), aby technik był oślepiony podczas oceny rMT i aMT (szczegóły można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 1, krok 2).
7. Przygotuj neuronawigacyjny system ANT Neuro pod TMS.
   1. Złóż wymagane komponenty sprzętowe. Należą do nich kamera śledząca na podczerwień, opaska na głowę uczestnika z markerami refleksyjnymi, narzędzie wskaźnikowe, tablica kalibracyjna (dla cewki TMS) oraz tracker cewek (okrągłe urządzenie mocowane do cewki do śledzenia pozycji w czasie rzeczywistym).
   2. Ustaw kamerę na statywie i umieść ją w pozycji tak, aby miała wyraźny widok na wszystkie inne elementy neuronawigacyjne przez całą sesję.
   3. Umieść tracker kalibracji cewki i płytkę na cewce TMS.
   4. Otwórz oprogramowanie systemu neuronawigacyjnego, wstaw identyfikator uczestnika i skalibruj komponenty neuronawigacyjne (szczegóły można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 1, krok 3).

2. Przygotowanie uczestnika

1. Po przybyciu uczestnika oceń bezpieczeństwo zastosowania TMS poprzez kwestionariusz i/lub ustrukturyzowany wywiad oparty na opublikowanych wytycznych^40,41. Zawiera informacje dotyczące historii zaburzeń psychiatrycznych i neurologicznych, utraty przytomności, upośledzenia słuchu, a także obecności implantów metalowych lub magnetycznych, prowadzenia leków oraz statusu ciąży. Postępuj zgodnie z protokołem tylko wtedy, gdy nie zgłaszasz żadnych obaw o bezpieczeństwo.
2. Usiądź uczestnika na wygodnym krześle, gdzie oba przedramiona można ustawić w pozycji spoczynkowej. Upewnij się, że uczestnik jest pod odpowiednim kątem, aby cewka była wygodnie umieszczona na głowie.
3. Poproś pacjenta o zdjęcie wszelkich okularów, spinek do włosów lub spinek, kolczyków lub innych urządzeń metalowych i/lub elektronicznych. Zapewnij zatyczki do uszu i upewnij się, że są prawidłowo i stabilnie umieszczone. Polec uczestnikowi pozostać przytomnym, milczącym i zrelaksowanym. Upewnij się, że uczestnik jest cały czas przytomny, aby jak najbardziej ograniczyć wahania sygnału fizjologicznego.
4. Aby poprawić jakość interfejsu elektroda-skóra oraz przewodzenie sygnału elektrycznego, oczyść skórę na zewnątrz, delikatnie szorując obszar papierem ściernym water, a następnie szybko spłukać gazą³⁵ z alkoholem. Powtórz ten zabieg nad łokciem przeciwległym. Gdy skóra jest sucha, umieści elektrodę uziemiającą nad łokciem, aby zapewnić punkt odniesienia przy zerowym napięciu, a elektrodę zapisującą na przeciwległej ręce nad FDI, z centrum około 2,5 cm w kierunku ścięgna mięśniowego (patrz Rysunek 2).
5. Załóż na głowę uczestników czapkę pływacką, aby narysować odniesienia do lokalizacji miejsca stymulacji TMS:
   1. Załóż na głowę uczestnika czapkę pływacką w orientacji przedniej-tylnej. Upewnij się, że czapka jest wyrównana z linią brwi uczestnika z przodu oraz z nasadą helisy uszu po obu stronach. Nałóż go na skórę głowy, zostawiając uszy wolne i odkryte.
   2. Narysuj linię strzałkową przyśrodkową oraz linię intertragus na czapie, aby uzyskać punkt przecięcia na wierzchołku (Rysunek 3A, B).
   3. Od punktu przecięcia zmierz 5 cm w lewo na linii intertragus i z przodu na linii strzałkowej, aby zdefiniować 2 dodatkowe punkty (rysunek 3C, D).
   4. Narysuj linię ukośną, aby połączyć punkt boczny z punktem przyśrodkowym przednim (Rysunek 3E).
   5. Zaczynając od punktu bocznego, zmierz 2,5 cm w kierunku przednim i środkowym na linii ukośnej, aby zaznaczyć początkową szacunkę hotspotu silnika (rysunek 3F).
   6. Zaznacz 4 punkty w promieniu 0,5 cm wokół tego początkowego szacunku, aby zapewnić dodatkowe punkty testowe dla hotspotu silnika. Zaznacz obszar rozważany dla hotspotu silnika (czerwona linia) (rysunek 3E, F).
6. Ustaw system neuronawigacyjny dla uczestnika.
   1. Załóż elastyczną opaskę na głowę uczestnika, dbając o to, by pasek markera był skierowany w stronę kamery i wygodny, ponieważ musi pozostać na miejscu przez całą sesję.
   2. Użyj wskaźnika, aby zdefiniować kluczowe anatomiczne punkty orientacyjne na głowie uczestnika (nasion, lewy i prawy tragus oraz punkty kształtu głowy), co pozwoli systemowi wyrównać i śledzić cele stymulacji względem anatomii głowy uczestnika (nasion, tragus, punkty orientacyjne na skórze głowy i kształt głowy), jeśli używasz standardowej przestrzeni MNI oraz dalszych aspektów anatomii, w tym anatomii mózgu, jeśli stosuje się indywidualne badania MRI. Zapewnia to dokładne pozycjonowanie cewek względem indywidualnej anatomii podczas procedury TMS (szczegóły można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 1, krok 3).

3. Ocena fizjologii TMS-EMG

1. Zacznij uruchamiać skrypt^{BONSAI 42} do akwizycji danych EMG. Podczas nagrania obserwuj uczestnika pod kątem oznak skurczu twarzy, ruchu kończyn, niezamierzonego przesuwania czapki lub innych zachowań, które mogą wpływać na fizjologię i pozyskiwanie danych fizjologicznych.
2. Zmierz hotspot silnika.
   1. Umieść cewkę TMS styczną do skóry głowy uczestnika, z uchwytem skierowanym do tyłu pod kątem 45° względem linii środkowej strzału, a jej środek nad zaznaczonym miejscem w kroku 2.5 – ta pozycja będzie stosowana we wszystkich procedurach TMS.
   2. Stosuj impulsy na poziomie 30% MSO powyżej początkowego szacowanego hotspotu silnika.
   3. Zwiększać intensywność stymulacji krokami o 5-10% MSO, aż zaobserwujemy spójną odpowiedź motoryczną.
   4. Stosuj pojedyncze impulsy przy początkowej szacunku oraz w kilku okolicznych miejscach, aby określić miejsce, które najbardziej konsekwentnie prowadzi do wyższych amplitudowych MEP i, jeśli to możliwe, gdzie widoczne ograniczenie ograniczało się do FDI – jest to hotspot silnikowy dla FDI (MH).
   5. W oprogramowaniu systemu neuronawigacyjnego wybierz impuls, który wyznaczał poziom MH, aby kierować dalszą stymulacją.
3. Ustalić rMT.
   1. Użyj systemu neuronawigacyjnego, aby naprowadzić cewkę do MH znalezionego w kroku 3.2 – rMT to minimalny % MSO potrzebny do wywołania MEP co najmniej 50 μV w kontralateralnym FDI w co najmniej 5 z 10 pojedynczych impulsów TMS dostarczonych tutaj, oddzielonych mniej więcej 5-sekundowym interbodziem.
   2. Zaczynając od % MSO używanego do definicji MH, stopniowo zmniejszaj intensywność o 2%, aż mniej niż 5 z 10 pojedynczych impulsów TMS wywoła odpowiedź co najmniej 50 μV w kontralateralnym FDI.
   3. Stopniowo zwiększać MSO w 1% krokach, aż co najmniej 5 z 10 pojedynczych impulsów TMS wywoła odpowiedź co najmniej 50 μV w kontralateralnym FDI.
   4. Zarejestruj % MSO dla rMT.
4. Określ maksymalną dobrowolną aktywację mięśni.
   1. Instruuj pacjenta, aby wywołał maksymalną dobrowolną aktywację mięśnia pierwszego mięśnia grzbietowego śródkostnego (FDI) poprzez utworzenie kształtu koła, naciskając paznokieć wskazujący na brzuch kciuka z maksymalną siłą.
   2. Około 2 sekundy po zainicjowaniu skurczu mięśnia przez uczestnika należy zapisać odpowiedni punkt czasowy, naciskając spację na komputerze uruchamiającym skrypt BONSAI, pomijając początkowy wzrost aktywności i skoki wynikające z ruchu elektrody.
   3. Powtórz ten proces trzy razy, każdy skurcz oddzielony 1-minutowym okresem odpoczynku, aby zapobiec zmęczeniu i zapewnić regenerację.
5. Ustalić aMT.
   1. Użyj systemu neuronawigacyjnego, aby naprowadzić cewkę do poziomu MH znalezionego w kroku 3.2 – aMT to minimalny % MSO, które generuje MEP o częstotliwości co najmniej 200 μV szczytowo-pikowej amplitudzie w co najmniej 5 z 10 pojedynczych impulsów TMS dostarczanych tutaj, podczas lekkiego dobrowolnego skurczu.
   2. Poproś uczestnika o utrzymanie submaksymalnego skurczu od 10% do 20% MViC, korzystając z EMG do monitorowania trwającego skurczu i udzielania informacji zwrotnej w czasie rzeczywistym (szczegóły można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 1, krok 1).
   3. Zaczynając od procentu MSO dla rMT, zmniejszaj intensywność stopniowo o 2%, aż MEP o co najmniej 200 μV zostaną wyprodukowane w mniej niż 5 na 10 pojedynczych impulsów TMS.
   4. Zwiększanie MSO stopniowo po 1%, aż w co najmniej 5 na 10 pojedynczych impulsów TMS zostaną wyprodukowane MEP o co najmniej 200 μV.
   5. Zarejestruj % MSO dla aMT.
6. Zdefiniuj podstawową pobudliwość korową.
   UWAGA: Ta faza ma na celu ustalenie bazowej amplitudy uczestnika MEP, służąc jako punkt odniesienia do kolejnych porównań.
   1. Użyj systemu neuronawigacyjnego, aby precyzyjnie ustawić cewkę nad hotspotem silnika, zgodnie z definicją w kroku 3.2.
   2. Potwierdź, że elektrody EMG powierzchniowe są prawidłowo umieszczone nad docelowym mięśniem (np. pierwszy grzbietowy mięsień międzykostny) oraz zweryfikować jakość sygnału (minimalny szum i wyraźne MEP)
   3. Załaduj protokół stymulacji pojedynczego impulsu na urządzeniu TMS.
   4. Wstaw wcześniej zdefiniowany rMT i rozpocznij protokół (parametry stymulacji opisane w kroku 1.6.1).
   5. Oceń bazową pobudliwość korową, uśredniając amplitudy szczytowe do szczytowe 40 MEP.
      UWAGA: Amplituda szczyt-szczyt definiowana jest jako różnica napięcia między minimalnym a maksymalnym punktem każdego pojedynczego przebiegu MEP. Do dalszych analiz amplitudy MEP mogą być normalizowane do wartości wyjściowych, aby kontrolować zmienność międzyosobową, zgodnie z procedurami opisanymi w wcześniejszej literaturze³².
7. Zastosuj protokół modulacji pobudliwości korowej .
   UWAGA: Ten etap polega na dostarczeniu protokołu iTBS w celu modulowania pobudliwości korowej.
   1. Załaduj protokół iTBS na urządzeniu TMS.
   2. Włóż wcześniej zdefiniowany aMT i rozpocznij protokół (parametry stymulacji opisane w kroku 1.6.2).
   3. Bezpośrednio po zakończeniu protokołu iTBS zacznij monitorować stoper po stymulacji.
8. Oceń modulację pobudliwości korowej.
   1. T0, czyli bezpośrednio po zakończeniu protokołu modulacji pobudliwości korowej ponownie zastosuj protokół stymulacji pojedynczego impulsu z użyciem 120% rMT, jak opisano w kroku 3.6.
   2. Zweryfikować dokładność neuronawigacji, umieszczając wskaźnik na nosze i weryfikując ustawienie w oprogramowaniu systemu neuronawigacyjnego. Upewnij się, że odchylenie przestrzenne wynosi < 5 mm. Zanotuj wartość.
   3. T10, T20 i T30, czyli 10, 20 i 30 minut po protokole modulacji pobudliwości korowej – powtórz protokół stymulacji pojedynczego impulsu jak w kroku 3.8.1. Ponownie zweryfikowaj dokładność neuronawigacji zgodnie z krokiem 3.8.2.
   4. Po zakończeniu ostatniego bloku stymulacyjnego przerwij stosowanie skryptu BONSAI. Zakończ sesję neuronawigacji w oprogramowaniu. Plik "bin." jest generowany z pozyskiwania danych bonsai.
   5. Oceń pobudliwość korową w punktach po modulacji (T0, T10, T20 i T30), stosując tę samą procedurę co na bazie, czyli uśredniając amplitudy szczyt-pik 40 MEP zarejestrowanych w każdym punkcie czasowym. Pozwala to porównać zmiany pobudliwości względem poziomu wyjściowego po protokole modulacji.
   6. Obliczanie modulacji pobudliwości korowej: Określ modulację pobudliwości korowej indukowanej przez protokół stymulacyjny poprzez obliczenie delta MEP (ΔMEP), zdefiniowanej jako różnica między średnią amplitudą MEP zarejestrowanych w każdym punkcie po interwencji (T0, T10, T20, T30) a średnią amplitudą MEP zarejestrowanych na bazie, znormalizowaną przez średnią amplitudę MEP zarejestrowanych na bazie. Ten pomiar pozwala ocenić wielkość i czas trwania zmian pobudliwości kory wywołanej przez protokół iTBS.
       
9. Zapytaj uczestnika o ewentualny dyskomfort i zapewnij możliwość kontaktu, jeśli po sesji pojawią się jakiekolwiek potrzeby lub pytania.

Results

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby zapewnić wiarygodną i powtarzalną ocenę pobudliwości korowo-rdzeniowej, jednocześnie pozostając uogólnialnym na różne systemy EMG i układy TMS. Wybraliśmy konwencjonalną procedurę poszukiwania progów, ponieważ jest szeroko zweryfikowana, powtarzalna i porównywalna w różnych badaniach, przy jednoczesnym uznaniu, że alternatywne metody są również dobrze ugruntowane (np. metody poszukiwania progów oparte na szacowaniu parametrów testami sekwencyjnymi)^43,44. Zebranie łącznie 40 pojedynczych impulsów TMS gwarantuje, że zarejestrowana jest wystarczająca liczba MEP, aby wiarygodnie oszacować amplitudę MEP, nawet gdy niektóre impulsy nie wywołują odpowiedzi²⁰. Odstępy między impulsami są losowo generowane z minimum 6 sekundami, aby zapobiec przeniesieniu efektów z poprzednich bodźców²¹ oraz uczynić sekwencję impulsów nieprzewidywalną, zmniejszając przedaktywację mięśni antycypacyjnych. Stosowanie intensywności TMS na poziomie 120% rMT w pojedynczym impulsie jest dobrze ugruntowanym standardem, który pozwala wywoływać mierzalne MEP, jednocześnie rejestrując zmiany plastyczności wywołane przez iTBS u uczestników w zależności od uczestników. Offline przetwarzanie EMG, w tym filtrowanie, usuwanie artefaktów oraz monitorowanie aktywności tła mięśni, zapewnia, że zmierzone MEP odzwierciedlają prawdziwą pobudliwość korowo-rdzeniową, a nie szum, i nie są wpływane przez przedaktywację mięśni (szczegóły w Pliku Uzupełniającym 1, krok 4). Chociaż możliwe jest uzyskanie MEP po iTBS przez ponad 30 minut przy użyciu tego protokołu, zdecydowaliśmy się zakończyć akwizycję danych na T30 po iTBS, co jest zgodne z dowodami na to, że plastyczność podobna do LTP wynikająca z tego protokołu występuje głównie w tym oknie³². Ogólnie protokół kładzie nacisk na powtarzalność, niezawodność i koncepcyjną uogólnialność, niezależnie od konkretnych urządzeń czy oprogramowania.

Wszyscy pracownicy uczestniczący w sesjach TMS powinni być przeszkoleni w zakresie instytucjonalnych protokołów bezpieczeństwa, aby zapewnić dobrostan uczestników. Podczas sesji, jeśli uczestnik zgłasza łagodne objawy, takie jak zawroty głowy, należy ją przerwać, podać wodę i/lub położyć się z nogami uniesionymi, jeśli jest to konieczne. W razie potrzeby należy skontaktować się z pielęgniarką lub lekarzem. Bóle głowy mogą pojawiać się podczas lub krótko po sesji. Uczestnicy powinni być poinformowani, że jest to oczekiwane i mogą przyjmować proste leki przeciwbólowe dostępne bez recepty, jeśli zajdzie taka potrzeba. Jeśli bóle głowy się utrzymają, należy skontaktować się z zespołem badawczym. W rzadkich przypadkach napadu sesja musi zostać natychmiast przerwana, a procedury awaryjne należy rozpocząć zgodnie z protokołami instytucjonalnymi.

Dane od 47 zdrowych ochotników zostały zebrane według uporządkowanego i standaryzowanego protokołu opisanego tutaj. Ta metodologia, zaprojektowana w celu zwiększenia wiarygodności ocen pobudliwości korowej, rzeczywiście przyniosła spójne wyniki w dwóch ocenach przeprowadzonych w odstępie 6 tygodni od³⁷ tygodni. Istotną modulację pobudliwości lewej kory ruchowej, ocenianą na podstawie zmiany amplitudy MEP (ΔMEP) po iTBS, zaobserwowano przy T0, T10 i T20 przy pierwszej ocenie, podczas gdy efekt przy T30 nie osiągnął istotności (T0: W = 259, p < 0,01, r = 0,42; T10: W = 320, p < 0,01, r = 0,51; T20: W = 291, p < 0,01, r = 0,46; T30: W = 190, p = 0,06, r = 0,32), a punkty łącznie 6 tygodni później (T0: W = 293, p < 0,01, r = 0,48; T10: W = 278, p < 0,01, r = 0,46; T20: W = 315, p < 0,01, r = 0,52; T30: W = 275, p < 0,01, r = 0,45), co wskazuje na odporną modulację pobudliwości w czasie (rysunek 4A). Stabilność modulacji pobudliwości przy T0 została dodatkowo potwierdzona przez ICC na poziomie 0,67 (95% CI = 0,31-0,85; p < 0,01), co świadczy o umiarkowanej do dobrej niezawodności ponownego testowania w początkowych momentach po iTBS (rysunek 4B). Niemniej jednak nie zaobserwowano czasowej niezawodności pobudliwości korowej w T10, T20 i T30, co sugeruje ograniczenia stosowania tego protokołu do oceny zjawisk podobnych do plastyczności w późniejszych momentach. Ponadto kluczowe parametry neurofizjologiczne, w tym aMT, rMT i wyjściowa amplituda MEP, pozostawały stabilne przez cały okres badania, co dodatkowo podkreśla wewnętrzną spójność i wiarygodność proceduralną protokołu. Na koniec systematycznie oceniono wpływ potencjalnych czynników zakłócających – w tym ograniczoną liczbę rąk, lęk stanu, oczekiwania co do efektów TMS, płci i wieku. Nie znaleziono istotnych powiązań między tymi zmiennymi a modulacją pobudliwości korowej, co wspierałoby odporność obserwowanych efektów i protokołu na poszczególnych cechach, jak opisano w Seybert i ^in.37.

Rysunek 1: Pobudliwość lewego M1 i jej ocena modulacji – przegląd protokołu eksperymentalnego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ustawienie elektrod do rejestracji EMG nad pierwszym mięśniem grzbietowym śródkostnym (FDI). (a) palcem wskazującym; (b) obszar ścięgien; (c) mięśniowy brzuch FDI; (d) Kciuk. Elektroda aktywna jest umieszczona na brzuchu FDI, a druga elektroda jest ustawiona około 2,5 cm dystalnie w kierunku ścięgna. Elektroda referencyjna powinna znajdować się na przeciwległym kolanie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Procedura oznaczania kapsy. (A,B) Identyfikacja linii odniesienia anatomicznego: linii strzałkowej przyśrodkowej i linii międzykrokowej oraz określenie wierzchołka; (C,D) Od wierzchołka wyznacza się dwa punkty odniesienia, mierząc cm bocznie wzdłuż linii intertragus (po lewej) i 5 cm z przodu wzdłuż linii strzałkowej; (E) Konstrukcja prostej diagonalnej łączącej punkt boczny z punktem przednim. Wzdłuż przekątnej punkt jest oznaczony 2,5 cm w kierunku przed-przyśrodkowym od punktu bocznego, co reprezentuje początkową szacunkowość hotspotu motorycznego. Uprecyzowanie estymacji hotspotu poprzez zaznaczenie czterech dodatkowych punktów w promieniu 0,5 cm od początkowego oszacowania, tworząc klaster miejsc stymulacji do określenia progu motorycznego; (F) Ustanowienie hotspotu silnika i odpowiednie oznaczenie na osłonie (czerwona linia). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki badania. (A) Modulacja pobudliwości lewej kory ruchowej po iTBS, odzwierciedlona przez zmiany amplitudy MEP (ΔMEP) w T0, T10 i T20 podczas sesji wyjściowej i kontrolnej; (B) Niezawodność testów ponownych na T0 wskazywana przez współczynnik korelacji wewnątrzklasowej (ICC) wynoszący 0,67 (95% CI: 0,31-0,85; p < 0,01), wspierający umiarkowaną do dobrej spójności modulacji pobudliwości. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Plik uzupełniający 1: Dodatkowe szczegóły protokołu. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Przedstawiamy tutaj kompleksowy i rygorystycznie ustrukturyzowany protokół opisujący metodologię oceny pobudliwości korowej i modulacji pobudliwości M1 za pomocą TMS połączonej z EMG. Szczegółowo opisuje wszystkie niezbędne kroki do optymalnego przeprowadzenia sesji eksperymentalnej, w tym przygotowanie konfiguracji eksperymentalnej i kalibracji systemu neuronawigacyjnego, konfigurację sprzętu TMS i EMG oraz ustandaryzowane procedury identyfikacji MH, rMT i aMT. Te etapy przygotowawcze protokołu są niezbędne do ostatecznej sekwencji kroków, w tym oceny podstawowej pobudliwości korowej, neuromodulacji za pomocą iTBS oraz ponownej oceny pobudliwości korowej w celu ilościowego określenia powstałej modulacji.

Kluczową siłą tej metodologii jest wysoki stopień standaryzacji i rygoru, która rozwiązuje wiele ograniczeń znalezionych w poprzednich badaniach. Dotychczasowe prace w tej dziedzinie często cierpiały na niespójność metodologiczną, ograniczony opis metod oraz wysoką zmienność wewnątrz- i międzypodmiotową³⁵. Zmienność metodologiczna obejmuje liczbę zebranych europosłów²⁰, IPI²¹ oraz metody filtrowania EMG, które mogły zagrozić powtarzalności wyników³⁴. Opisany tutaj protokół unika pułapek metodologicznych, wprowadzając neuronawigację zapewniającą precyzyjne umieszczenie cewek³⁹, stosując zweryfikowane procedury EMG³⁴ oraz przyjmując ustalone najlepsze praktyki stymulacji i pozyskiwania sygnału⁴⁵. Chociaż konkretny wkład każdej z tych procedur nie został zmierzony ilościowo, wspólne zastosowanie tych elementów skutkowało poprawą stabilności i wiarygodnością obserwowanych efektów w porównaniu z wcześniejszymi badaniami 25,26,27,28,29,30.

Chociaż rygor metodologiczny i standaryzacja stanowią podstawę wiarygodnych pomiarów, praktyczne aspekty przygotowania uczestników i zarządzania sesją należą do najważniejszych kroków protokołu, które wpływają na jakość pozyskanych danych. Prawidłowe czyszczenie skóry przy umieszczaniu elektrud, zapewnienie bezpiecznego i solidnego umieszczenia elektrod obok siebie oraz potwierdzenie, że opaska na głowie nawigacyjnej leży wygodnie, ale pewnie, są kluczowe dla minimalizowania zmienności między sesjami. Przez całą sesję konieczne jest ciągłe monitorowanie stanu uczestników — w tym czujności, ruchu rąk i stabilności elektrod — aby zapobiegać artefaktom i utrzymywać wysokiej jakości nagrania. W przypadku problemów z pozyskiwaniem danych TMS-EMG ważne jest natychmiastowe dostosowanie ustawień cewek lub parametrów stymulacji. Regularna weryfikacja jakości sygnału EMG jest niezbędna do rozwiązania typowych problemów technicznych, takich jak zanik sygnału, odłączenie elektrod czy drobne dryfy nawigacyjne. Subtelne przesunięcie cewki, zapewnienie stabilnego kontaktu elektrody lub ponowna kalibracja systemu neuronawigacyjnego często przywraca jakość sygnału i utrzymuje spójność. Ważne jest również, aby zauważyć, że pewne wahania w sygnałach lub zmienności związanej z uczestnikami mogą być nieuniknione mimo wszelkich starań. W takich przypadkach, zamiast rezygnować z integralności danych, lepiej jest wstrzymać sesję, powtórzyć krytyczne pomiary lub nawet przełożyć termin, aby uzyskać wiarygodne i łatwe do interpretacji wyniki.

Wyniki uzyskane przy użyciu tego protokołu wykazały, że pobudliwość korowa w lewym M1 została istotnie modulowana po zastosowaniu iTBS. Ta modulacja była podobnie widoczna 6 tygodni później, gdy wskaźnik modulacji pobudliwości ujawnił stabilność wewnątrz jednostki dopiero po ocenie bezpośrednio po iTBS, co sugerowało czasowo specyficzne okno stabilności. Co istotne, efekty pobudliwości nie były konsekwentnie utrzymywane w późniejszych punktach czasowych, co mogło być spowodowane wzrostem zmienności w czasie^25,27. Ta obserwacja wzmacnia tezę, że czas pomiarów pobudliwości korowej jest kluczowy, zwłaszcza w kontekście potencjalnej roli biomarkera w celach diagnostycznych lub predykcyjnych. Rzeczywiście, pomimo długoletniego zainteresowania wykorzystaniem pobudliwości kory ruchowej i modulacji pobudliwości kory ruchowej (ΔMEP) jako markera klinicznego, jego zastosowanie ogranicza niska niezawodność i wysoka zmienność. Podczas gdy niektóre badania zgłaszały umiarkowaną powtarzalność, wiele innych stwierdziło, że ΔMEP nie ma stabilności niezbędnej do zastosowania klinicznego^18,19. Obecny protokół bezpośrednio rozwiązuje ten problem, dostarczając replikowalne ramy do konsekwentnego mierzenia pobudzalości. Solidna metodologia TMS-EMG dostarcza również cennych informacji na temat mechanizmów neurobiologicznych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie, ułatwiając wiarygodną ocenę zjawisk podobnych do neuroplastyczności w ludzkiej korze ruchowej. Konkretnie, uważa się, że iTBS angażuje procesy podobne do długotrwałej potencjacji, indukując wzrost skuteczności synaptycznej zależnej od receptora NMDA, modulując interneurony hamujące oraz promując deinhibicję korową, które łącznie zwiększają amplitudy MEP po stymulacji²⁴. Ta interpretacja jest zgodna z dowodami z modeli zwierzęcych. U gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi wykazano, że TBS indukuje długotrwałą potencjację pobudliwości korowo-rdzeniowej i siły synaptycznej, wykazując mechanizmy podobne do plastyczności u gatunku¹². W związku z tym zmiany obserwowane u MEPs po iTBS u ludzi prawdopodobnie odzwierciedlają procesy nerwowe związane z plastycznością o silnym uziemieniu translacyjnym.

Poza oceną protokołów neuromodulacyjnych, takich jak iTBS, ustandaryzowana metodologia TMS-EMG opisana tutaj daje nadzieję na różnorodne zastosowania. W paradygmatach uczenia się motorycznego zmiany w pobudliwości korowo-rdzeniowej mogą pełnić rolę biomarkerów dla przyswajania umiejętności i neuroplastyczności. Na przykład badania wykazały, że uczenie się wizuomotoryczne zwiększa pobudliwość korowo-rdzeniową, co odzwierciedla podstawowe adaptacje nerwowe⁴⁶. W rehabilitacji po udarze ocena pobudliwości korowo-rdzeniowej może wpłynąć na strategie terapeutyczne, a neurofeedback TMS służy do zwiększenia pobudliwości w uszkodzonej korze ruchowej, co potencjalnie pomaga w powrocie do zdrowia⁴⁷. Farmakologicznie oceny TMS-EMG mogą wykrywać zmiany pobudliwości korowej wywołane substancjami, dostarczając informacji o ich efektach na OUN⁴⁸. Dodatkowo udokumentowano różnice związane z wiekiem w pobudliwości korowo-rdzeniowej, przy czym starsi często wykazują zmniejszoną pobudliwość, co może wpływać na sprawność motoryczną i uczenie^{się 49}. Rozszerzając zastosowanie tego ustandaryzowanego protokołu na te obszary, badacze mogą uzyskać pełniejsze zrozumienie dynamiki korowo-rdzeniowej w różnych kontekstach i populacjach.

Dlatego proponujemy, że protokół ten stanowi cenną podstawę dla przyszłych badań mających na celu ustalenie wiarygodnych biomarkerów plastyczności kory. W szczególności badania powinny dążyć do powielania tych efektów w większych i bardziej zróżnicowanych populacjach, w tym w grupach klinicznych. Przyszłe badania powinny ocenić, czy pobudliwość korowa mierzona bezpośrednio po iTBS może konsekwentnie rozróżniać profile zdrowe od klinicznych, aby zrozumieć wrażliwość diagnostyczną oraz właściwości prognostyczne, na przykład w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie. Podsumowując, opisana tutaj metodologia stanowi istotny postęp w standaryzacji oceny pobudliwości korowej. Poprzez ograniczenie powszechnych źródeł zmienności i nacisk na precyzję w projektowaniu eksperymentów, protokół ten zapewnia solidne i powtarzalne podejście do badania zjawisk podobnych do plastyczności kory oraz ich potencjalnych zastosowań klinicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oprogramowanie BONSAI do pozyskiwania danych fizjologicznych ("MT_ACQ.bonsai" scipt)	Bonsai	https://bonsai-rx.org/
Elektromiografia (EMG) opracowana przez Scientific Hardware Development Platform w Fundacji Champalimaud	Badania Champalimaud	https://www.cf-hw.org/home	Strona internetowa Scientific Hardware and Software Development Platform: https://www.cf-hw.org/home
Stymulator MagPro X100 z cewką Cool-B65 w kształcie ósemki	Magventure	Stymulator: 9016E0731;   coil:9016E0491
System neuronawigacji Visor2	ANT Neuro		Oprogramowanie i sprzęt tej samej firmy