Ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro

Podsumowanie

Praca ta opisuje ustandaryzowany protokół in vitro służący do ilościowego określenia i porównania wskaźników fagocytozy ksenogenicznych (ludzkich) i allogenicznych (szczurów) czerwonych krwinek przez izolowane makrofagi szczurów.

Streszczenie

Transplantacja komórek ksenogenicznych często spotyka się ze znacznym odrzuceniem immunologicznym, nawet w modelach zwierzęcych o niedoborze odporności. Wśród pozostałych składników odpornościowych makrofagi mogą aktywnie fagocytozować przeszczepione ludzkie komórki, co stanowi wyzwanie dla długoterminowego przeszczepienia. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy standaryzowany test in vitro do ilościowego określenia fagocytozy ludzkiej i szczurskiej krwinki (RBC) pośredniczonej przez makrofagi. Makrofagi otrzewnowe szczurów zostały wyizolowane, hodowane i wystawione na działanie ludzkich lub szczurzych krwinek krwinkowych. Ludzkie krwinki zidentyfikowano za pomocą CD235a, natomiast u szczurów wirusy zostały wcześniej oznaczone DeepRed. Analiza cytometrii przepływowej została przeprowadzona przy użyciu CD163 w celu identyfikacji makrofagów i wykluczenia jodu propidium (PI) do komórek żywych bram. Wyniki wykazały istotną różnicę w aktywności fagocytycznej: 5,08% makrofagów pochłonęło ludzkie cyrbki, podczas gdy tylko 1,59% fagocytowało cyrbki szczurów, co daje względny wskaźnik fagocytozy 3,21. Protokół ten pozwala na ilościową ocenę zgodności immunologicznej i oferuje powtarzalną metodę oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w ksenotransplantacji. Ma potencjał do doskonalenia selekcji dawców i biorców oraz kierowania strategiami immunosupresyjnymi w badaniach translacyjnych.

Wprowadzenie

Wykorzystanie ksenogenicznych przeszczepów komórek, szczególnie wszczepianie ludzkich komórek do modeli zwierzęcych, jest kluczową strategią w badaniach biomedycznych¹. Umożliwia ocenę przeżycia komórek, przeszczepu oraz odpowiedzi immunologicznych w kontrolowanym środowisku in vivo . Chociaż modele myszy historycznie dominowały w tej dziedzinie ze względu na dobrze scharakteryzowaną genetykę i łatwość manipulacji, ich niewielki rozmiar stanowi istotne ograniczenie w badaniach wymagających dużych objętości krwi lub wysokiej wydajności komórek. Natomiast szczury oferują kilka zalet, w tym większą masę ciała, lepszą istotność fizjologiczną dla ludzkich organizmów oraz wyższą produkcję próbek biologicznych, takich jak makrofagi krwi lub otrzewnowne². W konsekwencji modele szczurów są coraz częściej wykorzystywane w badaniach nad hematopoezą i układem odpornościowym³.

Jednym z głównych wyzwań w transplantacji ksenogenicznej jest odrzucenie immunologiczne. Nawet w modelach niedoborczych immunonie, gdzie komórki T, B lub NK są genetycznie ablacowane, pozostałe komórki odporności wrodzonej, szczególnie makrofagi, pozostają aktywne⁴. Makrofagi pełnią rolę obrońców pierwszego wyboru układu odpornościowego gospodarza, rozpoznając i eliminując obce komórki poprzez fagocytozę⁵. Proces ten jest częściowo regulowany przez interakcję między białkiem regulatorem sygnału alfa (SIRPα) na makrofagach a CD47, sygnałem "nie jedz mnie" wyrażanym w większości typów komórek. Gdy CD47 z ludzkich komórek nie jest rozpoznawany przez gryzonia SIRPα, to niedopasowanie może prowadzić do zwiększonej fagocytozy. Nawet u tych permisywnych zwierząt o niedoborze odporności zjawisko to również występuje ^6,7.

Ilościowe określenie fagocytozy podsycanej przez makrofagi w tym kontekście jest kluczowe dla oceny prawdopodobieństwa przeżycia komórek oraz optymalizacji strategii transplantacji⁸. Chociaż opracowano różne metody in vivo i ex vivo do oceny odrzucenia odpornościowego, standaryzowane testy in vitro na fagocytozę makrofagów pozostają ograniczone. Tradycyjne metody oparte na mikroskopii są często pracochłonne i pozbawione ilościowej rzetelności. Cytometria przepływowa, w przeciwieństwie do tego, oferuje analizę opartą na pojedynczych komórkach oraz platformę ilościową zdolną do precyzyjnego rozróżniania typów komórek oraz pomiaru pobierania fagocytów poprzez wykrywanie markerów powierzchniowych.

W tym artykule opracowaliśmy standaryzowany test in vitro , aby ocenić różnicową fagocytozę ludzkich i szczurzych czerwonych krwinek przez makrofagi otrzewnowe szczurów. Krwinki służą jako idealny model do testów fagocytozy ze względu na swoją prostą strukturę i ekspresję CD47, która działa jako "własny" sygnał hamujący klirens wywołany przez makrofagi⁹. W tym protokole makrofagi otrzewnej szczurów są pobierane przez płukanie otrzewnej, hodowane in vitro i wystawiane na działanie ludzkich krwinek lub allogenicznych krwinków szczurów oznaczonych DeepRed. Po współinkubacji cytometria przepływowa jest wykorzystywana do oceny internalizacji czerwonych krwinków przez makrofagi. Makrofagi identyfikowane są ekspresją CD163, ludzkie cyrtromby CD235a, a u szczurów fluorescencja DeepRed. Martwe komórki są wykluczane przez barwienie PI, co zapewnia, że analizowane są tylko żywotne makrofagi.

Takie podejście umożliwia dokładną, ilościową ocenę fagocytarnej aktywności allogenicznych i ksenogenicznych RBC in vitro, dostarczając wglądu w zakres immunologicznego oczyszczania pośredniczonego przez makrofagi. W naszych eksperymentach makrofagi szczurów wykazały istotnie wyższą fagocytozę ludzkich czerwonych krwinek (5,08%) w porównaniu do cyrocytozy szczurów (1,59%), co dało względny wskaźnik fagocytozy 3,21. Wyniki te podkreślają znaczenie wrodzonych mechanizmów odpornościowych w środowiskach ksenogenicznych oraz podkreślają wartość tego testu w walidacji modeli przedklinicznych.

Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół oferuje powtarzalną i efektywną metodę pomiaru fagocytozy makrofagów in vitro. Jest szczególnie przydatna dla badaczy pracujących w dziedzinach ksenotransplantacji, badań nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi oraz testów zgodności immunologicznej. Dzięki zapewnieniu ustandaryzowanych ram do ilościowej identyfikacji fagocytozy, ten test może przyczynić się do poprawy eksperymentalnej powtarzalności oraz lepszego zrozumienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelach przeszczepów międzygatunkowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt przeprowadzono zgodnie z politykami i procedurami etycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jiangsu (UJS-IACUC) (Nr zatwierdzenia UJS-IACUC-2021090102). Badanie to zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Jiangsu. Wszystkie próbki zostały pobrane od pacjentów, którzy wyrazili świadomą zgodę. Usunięty supernatant należy umieścić w dedykowanym zbiorniku na ciecz i przekazać do szpitalnego oddziału chorób zakaźnych.

1. Izolacja makrofagów

1. Przygotowanie: Przygotuj niezbędne materiały, w tym szczury eksperymentalne, pojemniki do znieczulenia, zlewki oraz izofluran jako środek znieczulający oraz wstępnie schładzaj wirówkę w temperaturze 4 °C.
2. Znieczulanie i uśpiewanie szczurów: Zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami, podczas eksperymentów znieczulaj zwierzęta inhalacją izofluranem, a po eksperymencie uśpień CO₂ .
3. Dezynfekcja alkoholowa i nacięcie: Dezynfekuj odwłok szczura etanolem i wykonaj niewielkie nacięcie w ścianie brzucha.
4. Wstrzykiwanie i mieszanie płynu brzusznego: Wstrzyknąć 50 ml lodowato zimnego, sterylnego PBS do jamy brzusznej wzdłuż linii środkowej za pomocą strzykawki. Delikatnie potrząśnij szczurem i masuj ścianę brzucha palcami, aby zapewnić dokładne wymieszanie płynu w jamie brzusznej. Masaż trwa 2-3 minuty.
5. Zbieranie płynu brzusznego: Lekko przechyl ciało i zasysaj płyn brzuszny strzykawką.
6. Wirowanie: Wiruj zebrany płyn w 500 x g przez 5 minut w 4 °C, a następnie wyrzucaj supernatant.
7. Liza krwinków: Dodaj 3-5 razy objętość osadu komórkowego buforu lizyjnego i delikatnie mieszaj przez 1-2 minuty.
   UWAGA: Na przykład, jeśli objętość granulek komórkowych wynosi 1 mL, dodaj 3-5 ml buforu lizy. Ten krok można wykonać w temperaturze pokojowej lub w 4 °C, po czym następuje wirowanie w 400-500 x g przez 5 minut. Bardziej efektywne jest wirowanie w temperaturze 4 °C. Z powodu ciśnienia osmotycznego antykrwinki ulgają lizie, a roztwór zmienia kolor na czerwony. Po wirowaniu usuń czerwony supernatant.
   1. Przepis buforu lizy czerwonych krwinek (RBC): Rozpuść 8,3 g NH4Cl, 1,0 g KHCO3 i 1,8 mL 5% EDTA w 800 mL destylowanego_H2O, a następnie przefiltrować przez filtr 0,2 μm, qs do 1000 mL z destylowanym H₂O i dostosować pH 7,2~7,4. Jeśli czerwony osad jest nadal widoczny, powtarzaj ten krok, aż roztwór stanie się przezroczysty i przejrzysty. Zazwyczaj niewielka ilość resztkowych czerwonych krwinek nie wpływa na kolejne testy (jeśli w pelletcie jest niewiele, ten krok można pominąć).
8. Mycie ogniw: Przemyj ogniwa dwukrotnie około 10 mL wcześniej schłodzonego medium RPMI 1640. Wiruj w 500 x g przez 5 minut w 4 °C i wyrzucaj supernatant.
9. Rezawisja i liczenie komórek: Ponownie zawiesić komórki w podłożu wstępnie schłodzonym o RPMI 1640 + 1% FBS + 1% PS, liczyć komórki za pomocą barwienia Trypan Blue i oceniać żywotność komórek.
10. Hodowla komórek: Jeśli hodowla jest konieczna, należy nasiewać komórki o gęstości 1× 10⁶/mL na 24-dołkowej płytce hodowlowej, z 1 mL RPMI 1640-10% FBS-1% PS na dołek. Po 2 godzinach inkubacji wymień podłoże i przemyj doły 1-2 razy podłożem RPMI 1640, aby usunąć nieprzylegające komórki.
    UWAGA: Komórki przylegające tworzą monowarstwę makrofagów. Jeśli potrzebna jest ekstrakcja RNA, należy dodać 1 mL Trizolu do pelletu komórkowego, pipetować wielokrotnie, aby rozbić komórki, i przenieść mieszaninę do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL w celu natychmiastowej ekstrakcji RNA lub przechowywania w temperaturze -80 °C. Do analizy FACS dostosuj liczbę komórek do 1 × 10⁶ na probówkę, dodaj 20 μL buforu FACS i przekonuj barwienie FACS. Bufor FACS: DPBS + 2% FBS, filtr sterylizowany przez filtr 0,22 μm, przechowywany w temperaturze 4 °C).

2. Zbieranie krwinek szczurów lub ludzi

1. Przygotowanie: Przedpłucz 15 mL rurki do wirówek i 10 mL strzykawki z heparyną.
2. Zbieranie krwi szczura z żyły ogonowej: Po znieczuleniu szczura, ostrożnie odetnij mały fragment ogona szczura nożyczkami i pobierz krew z żyły ogonowej. Na końcu eksperymentu uśpij szczura_CO2.
3. Pobieranie ludzkiej krwi: Pobieranie ludzkiej krwi za pomocą techniki wenipunkcji.
4. Mieszanie próbek krwi: Wymieszaj 1 mL PBS z 1 mL krwi żylnej lub szczurzej.
5. Separacja gęstości Ficoll: Dodaj 1,5 mL roztworu Ficolla o gęstości 1,077 do probówki wirówki o pojemności 15 mL dla ludzkiej krwi obwodowej; do 15 mL wirówki na krew szczurów należy dodać 1,5 mL roztworu Ficoll o gęstości 1,084 litra.
6. Warstwowanie próbek krwi: Powoli nakładaj rozcieńczone próbki krwi wzdłuż ściany rurki wirówki na odpowiedni roztwór gradientu gęstości.
7. Wirowanie: Wirówka w 400 x g przez 30 minut w temperaturze 18-20 °C.
8. Usunięcie warstw osocza i limfocytów: Usunięcie górnej warstwy osocza, warstwy limfocytów oraz warstwy roztworu Ficoll, pozostawiając jedynie dolną warstwę czerwonych krwinek.
9. Płukanie czerwonych krwinek: Przemyj krwinki raz 10 mL PBS.
10. Wirowanie i usuwanie supernatantu: Wirówka 400 x g przez 5 minut i odrzuć supernatant.
11. Resuspension i liczenie: Dodaj 1 mL podłoża RPMI 1640 do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, wymieszaj z odpowiednią ilością pelletu czerwonych krwinek i przeprowadź liczenie komórek.

3. Test fagocytozy in vitro

1. Izolacja i hodowla makrofagów: Izoluj makrofagi i zasiewaj je z gęstością 1× 10^{6 komórek} /dołek na płytce hodowli z 12 dołkami. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%_CO2 przez 2 godziny, aby komórki mogły się przykleić.
2. Usuwanie komórek nieprzywierających: Po 2 godzinach inkubacji ostrożnie usuń komórki nieprzywierające i delikatnie przemyj go w podłożu RPMI 1640.
3. Kontynuacja hodowli: Kontynuuj hodowlę przylegających makrofagów przez maksymalnie 2 godziny, aby zapewnić całkowite przyleganie do dolnej części płytki.
4. Leczenie głodzeniem: Po 2 godzinach zastąpić podłoże bezsurowicowym RPMI 1640 i inkubować w warunkach głodzenia przez 2 godziny, aby zwiększyć aktywność fagocytów makrofagów.
5. Dodawanie ludzkich komórek: Dodaj ludzkie komórki wstępnie zabarwione DeepRed do płytki hodowlowej i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%_CO2 przez 2 godziny, aby makrofagi mogły fagocytozować ludzkie komórki.
6. Podsumowanie i analiza: Po badaniu fagocytozy obserwuj aktywność fagocytów pod mikroskopem lub ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej (FACS).

4. Cytometria przepływowa

1. Przygotowanie komórek: Trawić komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i zatrzymać trawienie za pomocą podłoża RPMI 1640 zawierającego 10% FBS. Wirówka komórek, odrzuć supernatant, ponownie zawiesić komórki w buforze FACS i liczyć je. Przygotuj 1 × 10^{6 komórek} na probówkę w dwóch probówkach. Dodatkowo przygotuj jedną probówkę ludzkich czerwonych krwinek i jedną tubkę z krwinkami szczurów.
2. Przygotowanie probówki z pojedynczym barwnikiem: Dodaj przeciwciało CD163 przeciw myszy do jednej probówki, przeciwciało antyludzkie CD235a u myszy do rurki z czerwonymi krwinkami u człowieka oraz DeepRed do rurki krwinek szczura.
   1. Inkubuj te rurki na lodzie, chronione przed światłem, przez 30 minut, mieszając co 10 minut. Dodaj 1 mL buforu FACS, aby zmyć niezwiązane przeciwciała, przewijdź w wirówkę i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesijcie komórki w 500 μL buforu FACS.
3. Przygotowanie próbki: Dodaj mys-anty-rat CD163, mys-anty-human CD235a oraz DeepRed do probówek. Inkubuj na lodzie, chronionym przed światłem, przez 30 minut, mieszając co 10 minut. Dodaj 1 mL buforu FACS do każdej probówki, aby zmyć niezwiązane przeciwciała, wiruj i usuwaj supernatant. Ponownie zawiesijcie komórki w 500 μL buforu FACS.
4. Analiza: Wykluczenie adhezji komórek poprzez gatowanie FSC-H w porównaniu z FSC-A. Użyj lamp z pojedynczym barwnikiem, aby dostosować odpowiednie napięcie i ustawienia kompensacji przed analizą próbek (Rysunek 1). Analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo v10.8.1.
   UWAGA: Do ustawienia kompensacji użyto pojedynczych kontrolek CD163-FITC i PI z barwionymi barwami.

Wyniki

Dzięki analizie cytometrii przepływowej możemy wywnioskować wskaźnik fagocytozy makrofagów szczurów wobec ludzkich i szczurzych krwinek. Martwe komórki są najpierw wykluczane za pomocą PI. Makrofagi z CD163-dodatnimi ekspresją CD235a wskazują na fagocytozę ludzkich czerwonych krwinek. Odsetek makrofagów posiadających fagocytozowane hRBC definiuje się jako wskaźnik fagocytozy makrofagów szczurów wobec ludzkich czerwonych krwinek. Podobnie obliczono odsetek fagocytozy w czerwonych krwinkach szczurów. Komórki podwójnie doda...

Dyskusja

Badanie to ustanowiło solidny i powtarzalny test in vitro do oceny fagocytozy pośredniczonej przez makrofagi zarówno ksenogenetycznych, jak i allogenicznych czerwonych krwinek. W tym badaniu ludzkie czerwone krwinki zostały oznaczone CD235a-BV421, natomiast u szczurów barwione barwnikiem DeepRed. Gdy makrofagi fagocytują oznakowane czerwone krwinki, sprzężone przeciwciała (CD235a-BV421) lub barwnik (DeepRed) są internalizowane razem. W rezultacie same makrofagi wykazują odpowiadającą fluorescencję. W tych warunk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna-EDTA	ThermoFisher	25300062
Deep Red Cell Tracker	ThermoFisher	C34565	Proszek (15 μ g) został rozwiązany w DMSO (20 μ L)
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Sigma	D2650
Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	C10010500BT
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144002
Ficoll-Paque PREMIUM	Cytiva	17544602
Mysie przeciwciało antyludzkie CD235a BV421	BD Biosciences	562938
Mysie przeciwciało anty-rat CD163 FITC	BIO-RAD	MCA342F
Białko K	Sigma	P2308
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093